專利名稱：重組幽門螺桿菌外膜蛋白15的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及幽門螺桿菌，特別是一種重組幽門螺桿菌外膜蛋白15。
背景技術：
幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)感染是慢性胃炎和消化性潰瘍的主要病因，與胃腺癌、胃黏膜相關性淋巴樣組織(MALT)惡性淋巴瘤的發(fā)生亦密切相關。此外，血清流行病學研究表明Hp感染與循環(huán)、呼吸、胃十二指腸外消化系統(tǒng)疾病以及自身免疫疾病的發(fā)生也有關。
既然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胃十二指腸潰瘍是傳染病，治療目的之一就是用抗生素消除病原體。然而，用各種抗生素(阿莫西林、硝基呋喃、furazolidin紅霉素a.o)進行單獨治療已被證實并不令人滿意，因為甚至在這種情況下僅有0-15％病例會根除細菌。目前，把酸阻斷劑(Ompeprazol)和抗生素(阿莫西林)結(jié)合使用達到最成功的治療效果，這種療法使清除率達80％(Malfertheiner，1994)。但用抗生素治療消除幽門螺桿菌并不是有前途的長期治療方案，因為細菌會迅速產(chǎn)生對抗生素的耐性。
受幽門螺桿菌感染會導致胃粘膜的慢性炎癥反應(胃炎)。另外，誘發(fā)對幽門螺桿菌抗原的特異性全身免疫反應；不過，分泌性抗體(sIgA)在胃中的形成尚未得到無可爭議的闡述。發(fā)炎的結(jié)果是在胃粘膜和亞粘膜中存在多種免疫細胞，例如多形核白細胞、單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和漿細胞(Blaser，1992)。此外，幽門螺桿菌在體外激活嗜中性白細胞、單核細胞和巨噬細胞(Mai等，1991)。用特異性抗體和補體進行的實驗表明，在體外嗜中性白細胞使幽門螺桿菌迅速失活。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種運用PCR技術克隆幽門螺桿菌外膜蛋白15基因，并構建載體對其進行序列分析和蛋白表達分析，可高效保護抗幽門螺桿菌粘附于胃粘膜上皮細胞的基因重組幽門螺桿菌外膜蛋白15。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列號1中所示的核苷酸序列，(b)在遺傳密碼簡并性的范圍內(nèi)與(a)中序列相應的核苷酸序列，或，(c)在嚴格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列；和(a)載體含有DNA分子的至少一個拷貝，(c)細胞被載體所轉(zhuǎn)化；及(a)序列號1所示的核苷酸序列，或，(b)與(a)中序列發(fā)生免疫交叉反應的核苷酸序列。
除了序列號1所示核苷酸序列和在遺傳密碼簡并性范圍內(nèi)與該序列相應的核苷酸序列之外，本發(fā)明還包括在嚴格條件下與這些序列之一雜交的DNA序列。本發(fā)明包括在些洗滌條件下與序列號1所示核苷酸序列之一雜交或與在遺傳密碼簡并性范圍內(nèi)的相應核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
本發(fā)明的DNA分子最好編碼能粘附到人細胞上、特別是人胃上皮細胞上的多肽。此外，本發(fā)明的DNA分子最好在核苷酸水平上與序列號1所示核苷酸序列有至少70％、特別優(yōu)選至少90％的同源性。而且，該DNA分子的長度最好至少為45個核苷酸，優(yōu)選至少50個核苷酸。
本發(fā)明的又一個目的是含本發(fā)明DNA分子的至少一個拷貝的載體。該載體可以是最好在表達信號(啟動子、操縱基因、增強子等)控制下本發(fā)明DNA分子位于其上的任何原核或真核載體。原核體的例子有象噬菌體(例如λ噬菌體)這樣的染色體載體以及象質(zhì)粒這樣的染色體外載體，而環(huán)狀質(zhì)粒載體是特別優(yōu)選的。
本發(fā)明的載體也可以是真核載體例如酵母載體或者是適于高等細胞的載體(例如，質(zhì)粒載體、病毒載體、植物載體)。
本發(fā)明的又一目的是用本發(fā)明載體轉(zhuǎn)化的細胞。在一優(yōu)選實施方案中，該細胞是原核細胞、優(yōu)選革蘭氏陰性的原核細胞、特別優(yōu)選大腸桿菌細胞。不過，另一方面，本發(fā)明的細胞也可以是真核細胞，例如真菌細胞(如酵母)、動物或植物細胞。
本發(fā)明還涉及由本發(fā)明DNA分子編碼的多肽。該多肽最好能粘附人細胞，并且包括(a)序列號1所示氨基酸序列，或(b)與(a)中序列發(fā)生免疫交叉反應的氨基酸序列。
本發(fā)明的多肽最好與序列號1所示核苷酸序列有至少90％的同源性。
本發(fā)明的多肽最好通過下述方法生產(chǎn)用本發(fā)明的DNA分子或載體轉(zhuǎn)化一種細胞，在多肽能得以表達的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細胞，從細胞或/和培養(yǎng)物上清液中分離多肽。該方法中可獲得融合多肽以及非融合多肽形式的本發(fā)明多肽。
本發(fā)明的多肽也可用作免疫原來產(chǎn)生抗體。因此，本發(fā)明還涉及抗本發(fā)明多肽的抗體。
本發(fā)明另一方面涉及一種藥用組合物，它包含作為活性物質(zhì)的本發(fā)明的DNA分子、本發(fā)明的多肽或本發(fā)明的抗體，選擇性地含有常見藥用輔助物質(zhì)、稀釋劑、添加劑和載體。
一方面，本發(fā)明的藥用組合物可用于診斷幽門螺桿菌感染。
另一方面，該藥用組合物也可用于防止或治療幽門螺桿菌感染。對治療應用而言，將多肽或其片斷用于產(chǎn)生主動疫苗，或?qū)⒖贵w用于產(chǎn)生被動疫苗。
本發(fā)明具有運用基因工程技術制備幽門螺桿菌外膜蛋白15，用于幽門螺桿菌疫苗成分的優(yōu)點。
圖1是序列表。
具體實施例方式
下面將結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的作進一步的詳述如圖1～3所示，DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列號1中所示的核苷酸序列，(b)在遺傳密碼簡并性的范圍內(nèi)與(a)中序列相應的核苷酸序列，或，(c)在嚴格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列；在核酸水平上它與序列號1中所示核苷酸序列有至少90％的同源性；它的長度至少為45個核苷酸；(a)載體含有DNA分子的至少一個拷貝，(b)細胞被載體所轉(zhuǎn)化；多肽，它由DNA分子所編碼，它包括(a)序列號1所示的核苷酸序列，或，(b)與(a)中序列發(fā)生免疫交叉反應的核苷酸序列。產(chǎn)生多肽的方法，載體轉(zhuǎn)化一種細胞，在多肽得以表達的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細胞，并從細胞或/和培養(yǎng)物上清液中分離出多肽。多肽作為免疫原產(chǎn)生抗體的應用和多肽的抗體。藥用組合物，(a)它包含作為活性物質(zhì)的DNA分子、多肽或者抗體，選擇性地包含常見藥用輔助物質(zhì)、稀釋劑、添加劑和載體，(b)藥用組合物用來診斷幽門螺桿菌感染的應用，(c)藥用組合物用于生產(chǎn)防止或治療幽門螺桿菌感染用的藥劑的應用。
Hp基因組中含有34個外膜蛋白(Outer Membrane Protein，OMP)基因，本發(fā)明采用基因克隆方法制備重組蛋白OMP15。
從Hp陽性及陰性病人外周血中分離淋巴細胞，并應用T細胞系Jurkat和Cem-C7與重組OMP15共孵育后發(fā)現(xiàn)，該蛋白不但不能刺激人T細胞增殖，還具有強烈誘導T細胞凋亡的作用。
體外試驗也證實該蛋白具有弱的誘導Th2細胞表型的作用。
應用OMP15 50ng/鼠加免疫佐劑霍亂毒素10ng，隔日一次共三次口服免疫小鼠，三周后應用幽門螺桿菌感染小鼠，繼之二周后處死動物觀察。發(fā)現(xiàn)可完全預防60％的小鼠感染幽門螺桿菌，而且與對照相比，可降低另外40％小鼠的細菌定植量，保護率可達100％。但部分保護的強度低于OMP25。重組OMP15與免疫小鼠脾細胞共孵育后，發(fā)現(xiàn)不能刺激后者增殖，說明其免疫保護作用可能不依賴于細胞免疫機制。
利用基因克隆技術對外膜蛋白15的基因進行了克隆和表達并研究了其免疫防治作用。
1材料與方法1.1質(zhì)粒和菌株菌株BL21(DE3)、質(zhì)粒pET-22b(+)和幽門螺桿菌SS1為第一軍醫(yī)大學南方醫(yī)院消化研究所保存。
1.2工具酶及試劑限制性內(nèi)切酶NotI、NcoI及T4DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶購自New England Biolabs公司，Taq DNA聚合酶、DNA分子量標準λDNA/EcoRI+Hind III購自華美生物工程公司，瓊脂糖、dNTPs、DNA快速純化試劑盒購自Promega公司，測序質(zhì)粒純化試劑盒購自美國Qiagen公司，其它試劑為國產(chǎn)分析純。
1.3 Hp染色體DNA的提取從固體培養(yǎng)基上刮取生長良好的Hp菌落，按基因組DNA小量制備法制備，詳見參考文獻[1]。
1.4質(zhì)粒的提取及純化質(zhì)粒的快速抽提及大量制備均采用堿變性法，詳見參考文獻[2]。
1.5目的基因的PCR擴增設計引物，在其5′端加上合適的限制性酶切位點，由博亞公司合成。
序列如下外膜蛋白1515′-TG GCC ATG GAT ATG GAA TTT ATG AAA AAG-3′NcoI外膜蛋白1525′-AG TGC GGC CGCTTA AAA AGT GTA GTT AT-3′NotI熱啟動法進行PCR，95℃變性30s，55℃退火50s，72℃延伸90s，35個循環(huán)后再延伸10min。0.8％瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增結(jié)果。
1.6DNA片段的酶切、連接、轉(zhuǎn)化和陽性克隆的鑒定質(zhì)粒和目的基因DNA經(jīng)NotI和NcoI雙酶切，玻璃奶回收酶切片段，T4連接酶作用下16℃連接12h，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)，雙酶切鑒定篩選出陽性克隆。
1.7序列測定及分析堿裂解法大量抽提經(jīng)雙酶切鑒定的重組克隆質(zhì)粒，用自動測序儀進行序列分析。
1.8誘導表達和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳外膜蛋白15陽性克隆經(jīng)IPTG誘導表達后，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。
1.9動物實驗對已經(jīng)感染幽門螺桿菌的小鼠通過黏膜途徑給予外膜蛋白15，觀察治療作用。對未感染幽門螺桿菌的小鼠先通過黏膜途徑給予外膜蛋白15，然后再用幽門螺桿菌進行攻擊，觀察保護作用。
2結(jié)果2.1外膜蛋白15基因的擴增PCR結(jié)果電泳分析發(fā)現(xiàn)成功地擴增了OMP15基因，大小與預計相符。
2.2重組質(zhì)粒的構建及酶切鑒定將PCR產(chǎn)物經(jīng)NotI和NcoI雙酶切后，定向插入經(jīng)同樣雙酶切的pET-22b(+)載體中，獲得重組質(zhì)粒命名為pET-22b(+)/外膜蛋白15。經(jīng)NotI和NcoI雙酶切后的重組質(zhì)粒電泳結(jié)果與預計相符。
2.3外膜蛋白15基因片段的序列分析直接以重組質(zhì)粒pET-22b(+)/外膜蛋白15為模板進行測序，得到了克隆片段的DNA序列，自動測序儀序列分析結(jié)果見后。
2.4外膜蛋白15基因在大腸桿菌中的表達將外膜蛋白15陽性克隆株在LB培養(yǎng)液(含100ug/ml氨芐青霉素)中37℃過夜培養(yǎng)，然后按1％轉(zhuǎn)接至含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)至D值為0.6～0.8，加IPTG至終濃度為0.1mmol/L，誘導表達3h，離心收集菌體，取其周質(zhì)的滲透休克液、菌體超聲后的上清以及沉淀進行10％SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)誘導后表達外膜蛋白15。
2.5動物實驗外膜蛋白15的治療和保護有效率均為100％。
參考文獻[1]Sambrook J，F(xiàn)ritsch EF，Maniatis T.Molecular cloninga laboratorymanua 1.2nded.New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989.35。
Ausubel FM，Brent R，Kingston RE，et al.顏子穎，王海林譯。精編分子生物學指南。北京科學出版社，1998.39。
權利要求
1.DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列號1中所示的核苷酸序列(b)在遺傳密碼簡并性的范圍內(nèi)與(a)中序列相應的核苷酸序列，或(c)在嚴格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列。
2.如權利要求1的DNA分子，其特征在于在核酸水平上它與序列號1中所示核苷酸序列有至少90％的同源性。
3.權利要求1或2的DNA分子，其特征在于它的長度至少為45個核苷酸。
4.權利要求1～3之一的DNA分子，其特征在于(a)載體含有DNA分子的至少一個拷貝，(b)細胞被載體所轉(zhuǎn)化。
5.多肽，其特征在于它由權利要求1～4之一的DNA分子所編碼。
6.權利要求5的多肽，其特征在于它包括(a)序列號1所示的核苷酸序列，或(b)與(a)中序列發(fā)生免疫交叉反應的核苷酸序列。
7.產(chǎn)生權利要求5～6之一的多肽的方法，其特征在于用權利要求1～3之一的DNA分子或權利要求4的載體轉(zhuǎn)化一種細胞，在多肽得以表達的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細胞，并從細胞或/和培養(yǎng)物上清液中分離出多肽。
8.權利要求5～6之一的多肽作為免疫原產(chǎn)生抗體的應用和多肽的抗體。
9.藥用組合物，其特征在于(a)它包含作為活性物質(zhì)的權利要求1～3之一的DNA分子、權利要求5～6之一的多肽或者權利要求8或9的抗體，選擇性地包含常見藥用輔助物質(zhì)、稀釋劑、添加劑和載體，(b)藥用組合物用來診斷幽門螺桿菌感染的應用，(c)藥用組合物用于生產(chǎn)防止或治療幽門螺桿菌感染用的藥劑的應用。
全文摘要
重組幽門螺桿菌外膜蛋白15，DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列號1中所示的核苷酸序列，(b)在遺傳密碼簡并性的范圍內(nèi)與(a)中序列相應的核苷酸序列，或，(c)在嚴格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明具有運用PCR技術克隆幽門螺桿菌外膜蛋白15基因，構建載體對其進行序列分析和蛋白表達，進一步通過粘膜治藥免疫防治幽門螺桿菌感染的優(yōu)點。
文檔編號C07H21/00GK1654470SQ0310988
公開日2005年8月17日 申請日期2003年4月17日 優(yōu)先權日2003年4月17日
發(fā)明者白楊, 張亞歷, 王繼德, 陳燁, 賴卓勝, 林煥健, 張振書, 周殿元 申請人:南方醫(yī)院