專利名稱：水蛭素突變體的一種編碼基因與高效表達菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域中水蛭素突變體的一種編碼基因與高效表達菌株，特別涉及一種大腸桿菌分泌型水蛭素突變體編碼基因與高效表達菌株。
背景技術：
在我國，水蛭是一種傳統的中藥，一千八百年前《神農本草經》中就有記載。中醫認為它有破血、逐瘀、通經的療效，主要用于治療瘕癥、痞塊、血瘀、閉經和跌打損傷。西方也常用水蛭吸血以治療某些疾病。從水蛭及其唾液腺中已提取出多種活性成分，水蛭素(Hirudin)是其中活性最顯著并且研究最多的一種。水蛭素是由65-66個氨基酸組成的小分子蛋白質(多肽)，對凝血酶有極強的抑制作用，是迄今為止所發現的最強凝血酶天然特異抑制劑。動物試驗與臨床研究表明，水蛭素能高效抗凝血、抗血栓形成以及阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反應等進一步血瘀現象。此外，它還能抑制凝血酶誘導的成纖維細胞增殖和凝血酶對內皮細胞的刺激。與肝素相比，它不僅用量少，不會引起出血，也不依賴于內源性輔助因子，有較好的療效。
水蛭素是一類很有前途的抗凝化瘀藥物，可用于治療各種血栓疾病，尤其是靜脈血栓、彌漫性血管內凝血和腦血栓的治療；也可用于外科手術后預防動脈血栓的形成，預防溶栓后或血管再造后血栓的形成，以及用于腦外傷的治療；改善體外血液循環和血液透析過程。在顯微外科手術中常因為吻合處血管栓塞而導致失敗，采用水蛭素可促進傷口愈合。研究還表明，水蛭素在腫瘤治療中也能發揮作用。它能阻止腫瘤細胞的轉移，如纖維肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、黑素瘤、淋巴瘤和白血病細胞等。水蛭素配合化學治療和放射治療，促進腫瘤中的血流，增強療效。
動物試驗和臨床研究證明，靜脈或皮下注射水蛭素均無明顯毒副作用。無論急性、亞急性的毒性試驗，血壓、心率、血相、出血時間和血液化學成分均不受影響，呼吸系統也沒有影響，無過敏反應，一般無特異抗體發現。半致死劑量LD50＞50mg/kg，遠大于治療所用的劑量(0.25mg/kg)。尤其是，水蛭素可以口服，這給用藥帶來很大方便。水蛭素比較穩定，加熱、酸堿溶液、以及一定條件下胰蛋白酶和糜蛋白酶反應并不破壞其活性；而且水蛭素的某些水解片斷仍有抑制凝血酶的作用。
水蛭素具有重要開發價值，但水蛭的來源有限，所以國內外醫藥界均著重研究通過基因工程獲得重組水蛭素。1986年后，重組水蛭素已在大腸桿菌和酵母菌中分別表達成功。與天然水蛭素相比，重組水蛭素在第63位氨基酸(酪氨酸)上未硫酸酯化，活性略低，其余性質基本相同。在治療的劑量下靜脈注射無毒副反應。1999年底重組水蛭素首先在德國和英國上市，為粉針劑，商品名是脈管通(Revasc)，其有效成分為酵母細胞制造的重組水蛭素(去硫水蛭素，Desirudin)。目前臨床主要用于手術后防止血栓形成，以及對深靜脈血栓、冠狀動脈再狹窄、心肌梗塞、不穩定心絞痛等的治療。
我國有許多抗栓中成藥以水蛭為主要成分，如腦血康口服液、抗血栓片、活血通脈膠囊等。含水蛭素的新藥也在不斷研究和推出。利用基因工程生產重組水蛭素可以取代藥源有限的水蛭，而且還能開發出更有效的藥物。重組水蛭素類多肽藥物的研制和生產有巨大的社會效益和經濟效益。
當前，水蛭素突變體有數十種之多，研究表明，將水蛭素第47位天冬酰胺(Asn)改變成賴氨酸(Lys)的水蛭素突變體HV2-Lys47(序列表中的序列2，由65個氨基酸殘基組成。)可以顯著提高水蛭素抗凝血酶的活性，達到天然63位含硫酸酯水蛭素同樣高的活性水平。目前，該種水蛭素突變體在酵母表達系統中生產，產率較低。
發明內容
本發明的目的是提供一種適于在大腸桿菌中表達，編碼水蛭素突變體HV2-Lys47的基因。
編碼水蛭素突變體HV2-Lys47的基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質，能在大腸桿菌中表達的DNA序列。
所述SEQ ID №1由198個堿基組成，其編碼框為自5’端第1位至第195位核苷酸。
水蛭素突變體HV2-Lys47基因是采用大腸桿菌偏愛密碼子，用遞歸PCR方法合成的。
含有水蛭素突變體HV2-Lys47編碼基因的表達載體及細胞系，均屬本發明所要求保護的范圍，特別是包含有在水蛭素突變體HV2-Lys47基因上連接有外膜蛋白信號肽編碼序列的表達載體具有重要意義，這樣的表達載體可以使水蛭素突變體HV2-Lys47分泌至胞外。利用現有分子生物學的方法可以得到不同的表達載體，如pBH-2重組質粒，其物理圖譜如圖1所示。
本發明的另一個目的是提供一種高效表達水蛭素突變體HV2-Lys47的菌株。
將本發明的突變體HV2-Lys47基因導入到大腸桿菌中，可以得到高效表達水蛭素突變體HV2-Lys47的菌株，熱誘導分泌型高效表達水蛭素的菌株是大腸埃希氏菌(Escherichia coli)pBH2，已于2003年03月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC №0908。
大腸埃希氏菌(Escherichia coli) pBH2 CGMCC №0908是通過將重組質粒pBH-2導入到大腸桿菌中得到的。大腸埃希氏菌(Escherichia coli) pBH2 CGMCC №0908在LB平板培養基上呈光滑、濕潤、全緣的菌落形態，其最適生長溫度為30℃，最適pH值是7.0。
本發明的又一個目的是提供一種生產水蛭素突變體HV2-Lys47的方法。
本發明所提供的生產水蛭素突變體HV2-Lys47的方法，是在將培養溫度自25℃-32℃升高到40℃-43℃的熱誘導條件下，培養大腸埃希氏菌(Escherichia coli) pBH2CGMCC №0908，產生水蛭素突變體HV2-Lys47。優選的熱誘導條件為培養溫度從30℃升高到42℃；并對所得到的水蛭素進行分離純化。
大腸埃希氏菌(Escherichia coli) pBH2熱誘導分泌型表達水蛭素突變體產率可高達350mg/L，生產周期短、成本低；水蛭素突變體在細胞內被正確加工，并且全部分泌到培養基中，大大簡化了分離純化的工藝。大腸埃希氏菌(Escherichia coli) pBH2穩定，易于操作，要求的設備條件相對較低。
圖1為表達載體pBH-2的物理圖譜。
具體實施例方式
實施例1、水蛭素的生產培養大腸埃希氏菌(Escherichia coli) pBH2 CGMCC №0908至菌體濃度為OD600達到15以上時，將培養溫度由30℃升高到42℃，水蛭素突變體HV2-Lys47即誘導產生，培養15小時產量達到最高值，水蛭素突變體HV2-Lys47被分泌到胞外；收集培養液，除去菌體，水蛭素突變體HV2-Lys47存在于上清液中；然后通過離子交換柱，純化水蛭素突變體HV2-Lys47；最后經超濾，去鹽和濃縮，并凍干成粉末。產率為350mg/L。
實施例2、原藥動物試驗1、鼠急毒試驗取小鼠30只，每只靜脈注射實施例1得到的水蛭素突變體HV2-Lys47 1300mg/kg，觀察小鼠的反應，結果小鼠均未見異常，說明本發明的水蛭素突變體HV2-Lys47無毒副作用。
2、長期毒性試驗取大鼠30只，每只每天靜脈注射實施例1得到的水蛭素突變體HV2-Lys47 2mg/kg，連續給藥二個月，觀察大鼠的反應，結果大鼠均未見異常，說明本發明的水蛭素突變體HV2-Lys47無毒副作用。
序列表<160>2<210>1<211>198<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1attacttaca ctgattgtac agaatcgggt caaaatttgt gcctctgcga gggaagcaat60gtttgcggta aaggcaataa gtgcatattg ggttctaatg gaaagggcaa ccaatgtgtc120actggcgaag gtacaccgaa gcctgaaagc cataacaacg gcgatttcga agaaattcca180gaagaatatt tacaataa198<210>2<211>65<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>2Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu15 10 15Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu20 25 30Gly Ser Asn Gly Lys Gly Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr35 40 45Pro Lys Pro Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro50 55 60Glu Glu Thr Leu Gln6權利要求
1.水蛭素突變體HV2-Lys47的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質，能在大腸桿菌中表達的DNA序列。
2.根據權利要求1所述的基因，其特征在于所述水蛭素突變體HV2-Lys47的編碼基因是序列表中的SEQ ID №1。
3.根據權利要求2所述的基因，其特征在于所述SEQ ID №1的編碼框為自5‘端第1至第195個堿基。
4.含有權利要求1所述基因的表達載體和細胞系。
5.根據權利要求4所述的表達載體，其特征在于所述載體中的水蛭素突變體HV2-Lys47基因連接有外膜蛋白信號肽編碼序列。
6.根據權利要求5所述的表達載體，其特征在于所述表達載體為pBH-2重組質粒。
7.大腸埃希氏菌(Escherichia coli)pBH2 CGMCC №0908。
8.一種生產水蛭素突變體HV2-Lys47的方法，是在將培養溫度自25℃-32℃升高到40℃-43℃的熱誘導條件下，培養大腸埃希氏菌的熱誘導條件下，培養大腸埃希氏菌(Escherichia coli)pBH2 CGMCC №0908，產生水蛭素突變體HV2-Lys47。
9.根據權利要求8所述的方法，所述熱誘導條件為培養溫度從30℃升高到42℃。
全文摘要
本發明公開了水蛭素突變體的一種編碼基因與高效表達菌株，目的是提供一種適于在大腸桿菌中表達，編碼水蛭素突變體HV2－Lys47的基因。本發明提供的水蛭素突變體基因是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質，能在大腸桿菌中表達的DNA序列。本發明還提供了水蛭素突變體和產生水蛭素突變體的工程菌—大腸埃希氏菌(Escherichia coli)pBH2CGMCC №0908。本發明可用于高效地生產水蛭素突變體HV2－Lys47。
文檔編號C07K14/815GK1536082SQ0310924
公開日2004年10月13日 申請日期2003年4月7日 優先權日2003年4月7日
發明者朱圣庚 申請人:北京大學