干擾素和免疫球蛋白Fc片段雜合體的制作方法

專利名稱：干擾素和免疫球蛋白Fc片段雜合體的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有一與一免疫球蛋白Fc片段共價連接的干擾素蛋白的蛋白質雜合體，其包括具有連接干擾素蛋白和免疫球蛋白Fc片段的肽連接體的雜合體。
背景技術：
干擾素，包括干擾素-α(″IFNα″)及干擾素-β(″IFNβ″)，其屬于第一批通過重組DNA技術生產的細胞因子。經證明IFNα對例如發狀細胞白血病和炎癥及病毒性疾病(包括B型肝炎)等病癥具有治療價值。已批準IFNβ用于治療多發性硬化癥。
包括IFNα在內的大多數細胞因子具有相當短的循環半衰期，其原因是其在體內產生，僅局部起作用且作用時間短暫。為將IFNα用作一種有效的系統治療藥物，需要相當大的劑量及頻繁投藥。如此頻繁投藥很不方便且很疼痛。另外，與施與IFNα相關的毒性副作用相當嚴重，以致某些癌癥患者不能忍受這種治療。這些副作用很可能與高劑量投藥有關。
為克服這些缺點，可修飾該分子以增加其循環半衰期或修飾該分子的調配物以延長其釋放時間。于是可減少劑量和降低投藥頻率，從而提高效力。人們已努力建構一具有延長保留時間的重組IFNα-明膠雜合體(Tabata，Y.等人，Cancer Res.515532-8，1991)。亦將一種脂質包膠IFNα調配物在動物體內進行試驗，且在腹膜內實現蛋白質的延長釋放(Bonerti，A.及kim，S.CancerChemother Pharmacol.33258-261，1993)。
IgG及IgM免疫球蛋白屬于人體血液中最豐富的蛋白質。它們的循環半衰期在7天到2 1天范圍內。已發現當IgG用于形成重組雜合體時可增加幾種配體結合蛋白質(受體)的半衰期，這些受體包括可溶性CD4分子、LHR及IFN-γ受體(Mordenti J.等人，Nature，337525-31，1989；Capon，D.J.及Lasky，L.A.，美國專利第5,116,964號；Kurschner，C.等人，J.Immunol.1494096-4100，1992)。
已證明，多種連接體皆對產生蛋白質雜合體有用。1998年3月3日頒予Chang等人的美國專利第5,723,125號(名稱為″通過一非免疫原肽連接在一起的干擾素-α和免疫素蛋白Fc雜合體(Hybrid with interferon-alpha and animmunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide)″)及1999年6月1日頒予Chang等人的美國專利第5,908,626號(名稱為″通過一肽連接體連接在一起的干擾素-β和免疫素蛋白Fc雜合體(Hybrid with interferon-.beta.and an immunoglobulin Fc joined by a peptide linker)″，)揭示由通過一包含序列Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly GlyGly Ser的肽連接體將人類干擾素及人類免疫球蛋白Fc片段連接在一起組成的雜合重組蛋白質。
考慮到使用干擾素治療患者所存在的問題，有必要改進將干擾素施予患者的組合物及方法，同時延長體內半衰期并減少不利的副作用。

發明內容
因此，本發明的一個目標是提供其體內半衰期長于干擾素的干擾素雜合體。
本發明的另一目標是提供其投藥頻率低于干擾素的干擾素雜合體。
本發明的再一目標是提供可有效消除或消退腫瘤或延遲腫瘤發展的干擾素雜合體。
通過使用一包含一其C-末端共價連接到一免疫球蛋白Fc片段N-末端的干擾素蛋白的蛋白質雜合體或一包含一其C-末端共價連接到一肽連接體(該肽連接體的C-末端共價連接到一免疫球蛋白Fc片段的N-末端)的N-末端的干擾素蛋白的蛋白質雜合體，可實現這些及其他目標。較佳連接體為一由具有大約2到大約40個氨基酸的Gly Ser重復單位組成的免疫惰性肽。連接體也可為T細胞惰性氨基酸序列或任何非免疫原氨基酸序列。本發明的雜合體可有效治療腫瘤患者以消除腫瘤、消退腫瘤或延遲腫瘤發展。
所屬領域的技術人員將容易地了解本發明的其他及更多的目標、特點及優點。
序列表概述SEQ ID NO1為一IFN-α-Fc雜合體的核苷酸及氨基酸序列。
SEQ ID NO2為SEQ ID NO1中所示的一IFN-α-Fc雜合體的氨基酸序列。
SEQ ID NOS3-9為用于將一重鏈γ4 Fc片段的N-末端結合到一IFN-β蛋白質的C-末端的各種長度肽連接體的氨基酸序列。
SEQ ID NO10為一用于將一重鏈γ1 Fc片段的N-末端結合到一下述測試法所用IFN-α蛋白質的C-末端的連接體的氨基酸序列。
SEQ ID NO11為一用于將一重鏈γ4 Fc片段的N-末端結合到一IFN-α蛋白質(其分子后來用于下述體外細胞病變效應分析中)的C-末端的連接體的氨基酸序列。


圖1所示為對一IFN-β-Fc雜合體中各種連接體的病毒誘導細胞病變效應抑制作用分析。
圖2所示為對一IFN-α-Fc雜合體中兩種不同連接體的病毒誘導細胞病變效應抑制作用分析。
具體實施例方式
本發明提供一包含一其C-末端共價連接到一免疫球蛋白Fc片段N-末端的干擾素蛋白的蛋白質雜合體。
該干擾素蛋白可以是任一種包括干擾素-α、干擾素-β、干擾素-ω、干擾素-δ及干擾素-τ在內的I型干擾素或包括干擾素-γ在內的II型干擾素。較佳地，該干擾素蛋白為一干擾素-α或干擾素-β，最佳地為一干擾素-α2a或干擾素-α2b。
該免疫球蛋白Fc片段可以是來自包括IgA、IgD、IgE、IgG或IgM在內的任一類免疫球蛋白的一個片段。較佳地，該Fc片段為一人類免疫球蛋白Fc片段，最佳為一IgG4(γ4)亞類的IgG Fc片段。γ4鏈優于γ1鏈，因為前者經證明具有很少或不具有抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)或補體激活能力，且在人體循環中很穩定。
本發明亦提供一蛋白質雜合體同型二聚體，其包含兩個其C-末端共價連接到一免疫球蛋白Fc片段(較佳地為一γ4 Fc片段)的兩個N-末端中每一個的干擾素蛋白。
本發明亦提供一包含一以其C-末端共價連接到一肽連接體(其C-末端共價連接到一免疫球蛋白Fc片段的N-末端)N-末端的干擾素蛋白的蛋白質雜合體。
干擾素蛋白與Fc片段通過一T細胞免疫惰性肽連接，較佳通過具有Gly Ser重復單位的肽連接。因為這些肽為免疫惰性，所以在融合點插入這些肽可消除任何當直接將干擾素和Fc片段連接在一起時可能會出現的新抗原性。
肽連接體較佳地為由具有約2到約40個氨基酸的Gly Ser重復單位組成的免疫惰性肽。該些肽連接體的典型氨基酸序列示于SEQ ID NOS 3、4、5、6、7、8及9中。此等連接體具有連接干擾素和Fc片段而不對干擾素的生物活性產生顯著不良影響的獨特能力。盡管在本發明中所有長度的連接體皆有效，但某些連接體比另一些略微有效一些，即具12或更多個氨基酸的連接體比短一些的連接體活性略微大一些。較佳地，肽連接體具有12到15個氨基酸或約17到40個氨基酸。
不含連接體的IFNα-Fc雜合體的完整核苷酸序列示于SEQ ID NO1中，且其氨基酸序列示于SEQ ID NO2中。如果存在連接體，則其位于第188(Glu)和189(Glu)位氨基酸殘基之間。所有經證明在體外具有大約相同細胞病變效應的大量合適連接體的序列示于SEQ ID NOS 3、4、5、6、7、8及9中。
本發明較佳實施例為一包含一其C-末端共價連接到一免疫球蛋白Fc片段N-末端的干擾素蛋白的蛋白質雜合體。然而，本發明亦包括一包含一其C-末端共價連接到一干擾素蛋白N-末端的免疫球蛋白Fc片段的蛋白質雜合體。此等蛋白質可直接連接或通過一本文所述肽連接體連接。
本發明亦提供一包含兩個其C-末端共價連接到一免疫球蛋白Fc片段(較佳為一γ4 Fc片段)的兩個N-末端中每一個的干擾素蛋白的蛋白質雜合體同型二聚體，或一包含兩個其C-末端共價連接到一肽連接體(該肽連接體的C-末端共價連接到一免疫球蛋白Fc片段的兩個N-末端中的每一個)N-末端的干擾素蛋白的蛋白質雜合體同型二聚體。這些連接體可含有相同數量的氨基酸或不同數量的氨基酸。
如果該Fc片段選自另一條鏈，例如μ鏈，則因為Fc片段會形成具有十個可能結合位點的五聚物，所以該雜合體可能包含干擾素及1至10種細胞因子(包括多種干擾素)。可在本發明中起作用的合適細胞因子包括但不限于介白素、集落刺激因子及腫瘤壞死因子。
在另一實例中，一干擾素蛋白直接或通過一連接體連接到一免疫球蛋白Fc片段的兩個N-末端中的一個上，且另一細胞因子直接或通過一連接體連接到一免疫球蛋白Fc片段的兩個N-末端中的另一個上。
本發明的雜合體的一個顯著優于天然細胞因子的地方是該雜合體已證明可消除動物模型的腫瘤。已批準使用IFNα治療某些腫瘤及B型肝炎。該些雜合體在治療感染性疾病及各種腫瘤方面可能比IFNα更為有效。
IFNαcDNA可通過逆轉錄和PCR得到，使用從表達IFNα的細胞中提取的RNA，在提取后進行逆轉錄并在一標準表達系統中表達。有幾種體外表達該重組蛋白質的方法，包括在大腸桿菌(E.coli)、桿狀病毒(baculovirus)、酵母、哺乳動物細胞或其他表達系統中表達。原核系統E.coli不能進行轉錄后修飾，例如糖基化。此可能是這些系統的一個問題，由于這一原因哺乳動物表達可較佳，因為它能提供其他在簡化純化方面的優點。
現有幾種用于測量IFNα生物活性的分析方法，包括抗病毒分析。根據體外實驗結果可得出，本發明的雜合體在體內比天然IFNα具有更長的半衰期。即使比活性低一些，該些雜合體在臨床使用上仍然優于天然IFNα。這是因為，由于半衰期更長，根據體外實驗結果可得出其Cxt(濃度時間曲線下面積)比天然IFNα更大。這意味著同等摩爾劑量的天然IFNα及雜合體，后者將提供增加幾百倍的IFNα接觸時間，使劑量相同且投藥頻率減少的情況下效力大大增加。
在本發明中有用的免疫球蛋白Fc片段可通過熟習此項技術者所熟知的常見方法得到。
在本發明中有用的肽連接體可通過熟習此項技術者所熟知的常見方法得到，包括使用干擾素和Fc片段對連接體進行化學合成及重組表達。
本發明的IFNα-Fc雜合體比天然IFNα具有更長的體內半衰期。細胞因子通常為半衰期相當短的小蛋白質。它們通常快速消散在各組織中，包括不希望的位點。據信少量的某些細胞因子可穿過血腦屏障及進入中樞神經系統并造成嚴重的神經毒性。本發明的IFN-Fc雜合體尤其適于治療腫瘤，包括淋巴瘤及白血病，因為該些產品在脈管系統內將有很長保留時間，且不會進入不希望的位點。
因此，本發明的雜合體可用于治療腫瘤患者以消除腫瘤、消退腫瘤或延遲腫瘤發展。該雜合體以可有效治療腫瘤患者的量投藥。該劑量的確定涵蓋在基于患者大小、腫瘤大小、腫瘤類型及相似參數的本項技術的技藝范圍內。
IFN-Fc雜合體可以一包括合適賦形劑及添加劑的藥物調配物形式施與。可容易地通過從動物數據推斷(需補償動物大小差別)并通過臨床試驗中的常規試驗來確定適合人體的劑量。
現在將參照實例及實驗結果對本發明予以闡述，然而應該理解，除非另有說明，否則所包括的這些實例僅用于舉例說明目的而非意欲限制本發明的范圍。
實例1與天然IFNα相比，IFNα-Fc雜合體的半衰期大大延長美國專利第5,723,125號(其以引用方式并入本文中)的揭示內容闡述制備一含有一具有序列Gly Gly Ser Gly Gly Ser(SEQ ID NO10)的連接體的IFNα-Fc(γ1)雜合體。此雜合體比活性用Daud i細胞在體外測試為7.7×108單位/微摩爾，用同樣方法測得的未經修飾的干擾素-α的比活性為15.4×108單位/微摩爾。在后來進行的細胞病變效應抑制分析中，該雜合體顯示的抗病毒比活性為2.2×108IU/微摩爾，低于未經修飾干擾素-α的3.8×109IU/微摩爾。為嘗試增加雜合體的比活性，延長該連接體以增加彈性及減少空間位阻。使用一具序列Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly GlyGly Ser(SEQ ID NO11)的連接體。新雜合體的另一區別是其Fc部分為γ4 Fc，而不是γ1 Fc。
體外對病毒誘導細胞病變效應的抑制作用分析結果顯示，該新雜合體抗病毒比活性為1.1-2.2×109IU/皮摩爾，是舊雜合體的5至10倍。然而，仍然為未經修飾干擾素α的1/2至1/3，未經修飾干擾素α在同樣分析中比活性為3.8×109IU/皮摩爾。但在靈長類體內進行的藥代動力學研究中，所提出申請的新雜合體的血清半衰期約為未經修飾干擾素的40倍。該雜合體在皮下(s.c.)投藥后的清除半衰期亦幾乎為未經修飾干擾素的120倍。該雜合體皮下投藥時亦可很好吸收。新雜合體AUC(曲線下面積)的大幅度增加意味著盡管其比活性比較低，但很可能比天然干擾素-α具有更高的效力。
然后實施下述實驗測定不同長度連接體對細胞病變活性的影響。
實例2不同連接體對IFN-Fc細胞病變活性影響的研究比較IFN-α(16)Fc及IFN-α-Ala-Fc通過比較IFN-α(16)Fc和IFN-α-Ala-Fc來測試肽連接體的效果。IFN-α(16)Fc含有通過SEQ ID NO11中所示十六氨基酸肽連接體(氨基酸序列如下GlyGlySerGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)連接到人類IgG4Fc片段的鉸鏈區域的IFNα。IFN-α-Ala-Fc構筑體含有通過一個在兩個區域之間的氨基酸(Ala)連接到人類IgG1 Fc片段的鉸鏈區域的IFN-α。將編碼IFN-α(16)Fc及IFN-α-Ala-Fc的DNA片段分別插入到pcDNA3表達質粒的多克隆位點上。然后通過電穿孔使用純化的質粒DNA轉染NS0細胞。在存在G418的條件下選擇穩定轉化的細胞系。然后在旋轉培養燒瓶內培養表達這些連接體變體的細胞系。收集使用過的培養上清液，用蛋白質A親和管柱來制備純化蛋白質。將純化蛋白質用于實例1所述的病毒誘導細胞病變效應抑制作用分析。IFN-α-Ala-Fc和IFN-α(16)Fc二者顯示出同樣的活性(圖1)。
IFNβ-Fc連接體變體的構筑體為確定連接體長度對IFNβ-Fc雜合體活性的影響，構建干擾素-β連接到一Fc(″IFNβ-Fc″)上的許多不同構筑體。這些構筑體的氨基酸序列列于下面的表1中。
表1多種IFNβ-Fc的翻譯后氨基酸序列

IFNβ-Fc連接體變體的表達將含有不同IFNβ-Fc連接體變體的DNA序列分別插入到pcDNA3表達質粒的多克隆位點。然后通過電穿孔使用純化的質粒DNA轉染NS0細胞。在存在G418的條件對穩定轉化的細胞系進行初步選擇。然后，使表達這些連接體變體的細胞系在不存在G418的條件下生長。收集使用過的培養上清液，并將其用0.22μm的膜過濾。IFNβ-Fc濃度用純化的IFNβ-Fc蛋白質作為標樣通過PCFIA來估測。含有具2、8、12、18、23、30及40個氨基酸的肽連接體的IFNβ-Fc變體的培養上清液濃度分別估計為5.4、22.5、15.9、5.7、10.2、5.5及4.5μg/ml。將這些上清液用于下面的體外細胞病變效應實驗中。
用IFNβ-Fc變體進行的體外細胞病變效應分析將人類肺癌A549細胞用含5％FBS的DMEM以100μl/孔(含5×104個細胞)的量鋪涂在96-孔板上。將培養板在37℃于5％CO2培養箱中培養24小時。稀釋含有IFNβ-Fc連接體變體的培養上清液。然后將這些溶液用含5％FBS的DMEM在96孔板中進行2倍系列稀釋。每孔中加入100微升稀釋樣品，將培養板置于培養箱中在37℃再培養24小時。移走培養上清液，以100μl/孔加入腦心肌炎(EMC)病毒(病毒自病毒儲液用含5％FBS的D15以1∶200稀釋)。將培養板在37℃于5％CO2培養箱中培養48小時。移走培養物上清液，用PBS洗滌各孔2次。然后將細胞用低聚甲醛固定，用姬姆沙(giemsa)染料染色，然后于室溫放置5分鐘。此后，用自來水輕輕沖洗培養板數次。向各孔中加入甲醇，用Dynatech MR5000ELISA讀數儀在630nm處對各孔進行讀數。
如圖2所示的IFNβ-Fc雜合體的幾次實驗結果及如實例2所示的兩種不同IFNα-Fc雜合體的實驗結果顯示，不管使用哪種連接體，細胞病變效應均無顯著變化。IFNα-(16)Fc雜合體之一的進一步體內實驗如下所述進行。
實例3動物腫瘤模型在小鼠中引發腫瘤雌性CB17/scid小鼠(Charles River Laboratories；七周半齡)右肋腹下部皮下(s.c.)接種總量為100μl的Daudi Burkitt淋巴瘤細胞。在各組的五只動物中對四種不同細胞密度進行檢測(表2)。接種后一天監測注射位點，然后在接種后三周每天進行監測。
用卡鉗測量可觸及腫瘤。測定腫瘤體積并用方程式V＝4 xyz/3計算，其中2x、2y及2z為腫瘤的三個正交直徑，且為兩次測量的平均值。
對于接種，將細胞在體外用含10％胎牛血清的D15培養基在100ml旋轉瓶中培養至生存力為94％且密度為0.6×106/ml。通過300g離心10分鐘收集細胞，用冷PBS洗滌兩次，以所需密度重新懸浮于PBS中。細胞計數及Tryptan Blue染色確認細胞密度及生存力。
表2細胞密度及接種途徑

1.25×107組接種后四周在接種位點可檢測出人類腫瘤異種移植物。一周后腫瘤發生率達到80％，且在整個初步研究期內保持該水平。大約需要三周(2.5至3.5周)一可觸及腫瘤長至動物體重的10至15％。2.5×106及0.5×106組在九個半周末發生率達到60％。這些腫瘤不會殺死小鼠且沒有轉移跡象。因此，可得出以下結論，皮下接種1.25×107 Daudi Burkitt淋巴瘤細胞將在大約四周時獲得約80％的腫瘤發生率。
體內抗增殖研究每日給藥實驗三十二只接種有12.5×106 Daudi Burkitt淋巴瘤細胞的小鼠隨機分配給表3所示四個治療組之一。腫瘤接種后當天開始用Roferon A(IFN-α-2a，Hoffmann LaRoche，Nutley，NJ)及IFN-α(16)-2a-Fc(含有SEQ ID NO11中所示連接體)治療。所有動物在頸背部每日皮下給藥，且治療繼續連續進行八周。在治療期間，每3至4天監測一次腫瘤發展，并如上測量腫瘤大小。在治療期后，對停止治療時無腫瘤的動物繼續每周觀察一次，再觀察六個月。
在最后一次給藥24小時后及終止IFN-α-2a-Fc治療后一周、二周和四周或終止Roferon A治療后一周、二周和三周自眼窩后采血。血清干擾素水平用ELISA測定。
表3劑量、途徑及給藥程序表

IFN-α對腫瘤發生率及腫瘤進展的影響不同治療小組腫瘤的發展示于表4。在對照組動物中，在接種后24天檢測到最早的腫瘤，且在此后6天內7/8(87.5％)的動物已發展腫瘤。腫瘤檢測的平均時間為25.1±2.3天(在第75天出現腫瘤的小鼠不包括在內)。在Roferon A治療動物中，最早的腫瘤在接種后32天變得可檢測到。在又兩周后，87.5％發展成腫瘤。平均腫瘤檢測時間為39.6±4.7天(t＞t 0.05(12)，P＜0.05)。Roferon A延遲腫瘤發展大約兩周。兩種劑量的IFN-α-2a-Fc治療在整個給藥期間均完全阻止Daudi淋巴瘤的發展。在低劑量中，兩只小鼠在中止治療后2及19天上出現可檢測到的腫瘤。然而1×106IU/天組的所有小鼠及1×105IU/天組余下的六只小鼠治療后六個月仍無腫瘤發生。(表4)。重復此實驗一次，仍得到相似的結果，如表4所示。
表4


*C表示對照*R表示以1×106IU/天來施與Roferon AIFN-α對腫瘤生長率的影響一旦腫瘤生長到約為小鼠體重的1％，對照與Roferon A治療動物的腫瘤生長率變得非常接近。對照動物平均腫瘤體積在兩周內增加到原來的10倍，而RoferonA治療小鼠顯示增加到原來的9倍。
表5不同治療組的腫瘤發生率

定量分析血清IFN-α水平IFN-α及IFN-α-2a-Fc的血清濃度用ELISA法測定。在Roferon A治療小鼠中，在最后一次給藥后24小時檢測不到IFN-α-2a。在IFN-α-2a-Fc治療小鼠中，在終止治療后22天1×106IU/天組的血清IFN-α-2a-Fc濃度為3.5μg/ml，1×105IU/天組的為0.7μg/ml(表6)。在治療結束后的1和22天之間血清濃度降低。數據指出，皮下注射1×106 IU/天IFN-α-2a-Fc，其在小鼠中的半衰期大約為一周，注射1×105 IU/天時，大約為8周。
表6血清IFN-α-2a水平(μg/ml)

給藥間隔增加的實驗在該實驗中，每3天給與一次Roferon A 1×106IU，每3天及每周給與一次1×106IU IFN-α-2a-Fc。結果示于表7。在8周治療期間，和對照組比較，在腫瘤體積及腫瘤發展平均時間上，3天給與Roferon A 1×106IU未能顯示任何防止腫瘤形成的保護作用，而每3天及每周給與1×106IU IFN-α-2a-Fc可有效抑制腫瘤形成。這種抑制作用延長到治療周期后7周。
表7給藥間隔增加的動物的腫瘤發展


對已建立的Daudi Burkitt淋巴瘤的初步研究兩只已建立Daudi Burkitt淋巴瘤5周的小鼠用IFN-α-Fc 106IU/天治療。十天后在兩只動物中均見到完全消退(表8)。另兩只已建立Daudi Burkitt淋巴瘤6.5周的小鼠每三天用106IU Roferon A治療，共治療八周。后面的小鼠腫瘤體積在前兩周快速減小，從2.7cm3及4.6cm3減小到0.3cm3，減少89％到94％。未能達成完全消退。
表8對照小鼠的腫瘤消退

概要及結論通過在雌性CB17/scid小鼠(六周半齡)的右肋腹下部皮下接種總體積為100μl的1.25×107 Daudi Burkitt淋巴瘤細胞已建立一鼠人腫瘤異體移植物模型。Roferon A 1×106IU/天治療可使Daudi B細胞淋巴瘤的發展延遲兩周(t＞t 0.05(12)，P＜0.05)。IFN-α-2a-Fc 1×106IU/天在整個給藥期間完全抑制腫瘤形成，且這種抑制可延長到終止治療后六個月。在用1×105IU/天IFN-α-2a-Fc治療的小鼠中亦顯示部分至完全的抑制作用。
Roferon A 1×106IU/3天治療未能顯示任何防止腫瘤發展的保護作用，而IFN-α-Fc 1×106IU/3天或IFN-α-2a-Fc 1×106IU/周治療均能完全抑制DaudiBurkitt淋巴瘤，且抑制作用在中止治療后至少持續七周。
初步數據證明，建立5周的Daudi Burkitt淋巴瘤在用IFN-α-2a-Fc 106IU/天治療十天時可完全消退。在用IFN-α-2a-Fc開始治療前用106IU Roferon A/3天治療七周亦可在2周內使腫瘤體積減小90％。
當在皮下施與IFN-α-2a-Fc 1×106IU/天或1×105IU/天八周時，其半衰期大約為一周。
應該理解，本文所用術語及表達僅作為例證而非限制，且本發明的范圍僅由隨附權利要求來界定，其包括彼等權利要求的標題物的所有等效項。
序列表<110>唐納士公司<120>干擾素和免疫球蛋白Fc片段雜合體<130>TNX9502PCT<160>11<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1254<212>DNA<213>人類<220>
<221>CDS<222>(1)..(1254)<223>
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1.一種蛋白質雜合體，其包含一共價連接到一免疫球蛋白Fc片段的干擾素蛋白。
2.如權利要求1所述的蛋白質雜合體，其包含一其C-末端共價連接到一免疫球蛋白Fc片段N-末端的干擾素蛋白。
3.如權利要求1或2所述的蛋白質雜合體，其進一步包含一在所述干擾素蛋白和所述免疫球蛋白Fc片段之間的肽連接體，其中所述干擾素蛋白的C-末端共價連接到所述肽連接體N-末端，且所述肽連接體的C-末端共價連接到所述免疫球蛋白Fc片段N-末端。
4.如權利要求3所述的蛋白質雜合體，其中所述連接體包含Gly Ser重復單位。
5.如權利要求4所述的蛋白質雜合體，其中所述Gly Ser重復單位包含2到40個氨基酸。
6.如權利要求4所述的蛋白質雜合體，其中所述Gly Ser重復單位包含12到15個氨基酸。
7.如權利要求4所述的蛋白質雜合體，其中所述Gly Ser重復單位包含17到40個氨基酸。
8.如權利要求3所述的蛋白質雜合體，其中所述連接體包含一T細胞惰性氨基酸序列或一非免疫原氨基酸序列。
9.如權利要求1、2或3所述的蛋白質雜合體，其中所述干擾素蛋白選自由干擾素-α和干擾素-β組成的群組。
10.如權利要求1、2或3所述的蛋白質雜合體，其中所述干擾素蛋白為干擾素-α。
11.如權利要求9所述的蛋白質雜合體，其中所述干擾素蛋白選自由干擾素α2a或干擾素α2b組成的群組。
12.如權利要求1、2或3所述的蛋白質雜合體，其中所述Fc片段為一IgGFc片段。
13.如權利要求1、2或3所述的蛋白質雜合體，其中所述Fc片段為一IgGγ4鏈Fc片段。
14.如權利要求1、2或3所述的蛋白質雜合體，其進一步包含另一其C-末端共價連接到所述免疫球蛋白Fc片段另一條鏈N-末端的細胞因子，由此形成一同型二聚體。
15.如權利要求1 4所述的蛋白質雜合體，其中所述細胞因子為一干擾素。
16.一種蛋白質雜合體，其包含一其C-末端共價連接到一肽連接體的N-末端的干擾素蛋白，所述肽連接體的C-末端共價連接到一免疫球蛋白Fc片段的N-末端，其中所述肽連接體包含具有2到15及17到40個氨基酸的Gly Ser重復單位。
17.一種治療腫瘤患者以消除腫瘤、消退腫瘤或延遲腫瘤發展的方法，其包含以有效量施予患者如權利要求1到16任一項所述的蛋白質雜合體以消除腫瘤、消退腫瘤或延遲腫瘤發展。
全文摘要
本發明提供用于消除或消退腫瘤或延遲腫瘤發展的干擾素－免疫球蛋白Fc融合蛋白(″IFN－Fc雜合體″)。IFN－Fc雜合體較佳包括在IFN及Fc片段之間的肽連接體。此等連接體為T細胞惰性序列或任何非免疫原序列，較佳為Gly－Ser重復單位。較佳Fc片段為人類免疫球蛋白Fc片段，較佳為γ4鏈。
文檔編號C07K14/555GK1684704SQ02829592
公開日2005年10月19日 申請日期2002年8月7日 優先權日1999年10月15日
發明者張榭文, 余利明 申請人:唐納士公司