專利名稱：用于lhrh拮抗劑合成的中間體,它們的生產方法和lhrh拮抗劑的生產方法
技術領域：
本發明涉及用于LHRH拮抗劑合成的中間體，涉及生產這些中間體的方法，涉及生產LHRH拮抗劑的方法。
背景技術：
促黃體激素釋放激素，LHRH，控制促卵泡激素(FSH)和促黃體生成激素(LH)的分泌。LHRH拮抗劑是能夠阻滯FSH和LH分泌的化合物。它們一般是九肽和十肽(但也可以是較短的或較長的)，包含LHRH的部分或全部結構，其中一個或幾個氨基酸已經換成其它天然的氨基酸和/或自然界中不存在的氨基酸。
合成的LHRH拮抗劑可用來避孕并可用于前列腺的良性增生、乳腺和卵巢的激素依賴性的腫瘤、痛經、子宮內膜異位、和其它病況的治療。這些合成的LHRH拮抗劑具有以下通式Ac-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-Ser-X-NH2，其中，X是5-6個天然的和/或合成的氨基酸殘基。更具體地，它們具有上述的通式，其中X是AA1-AA2-Leu-AA3-Pro-D-Ala，特別是其中AA1是天然的或合成的氨基酸，AA2是天然的或合成的氨基酸或是零，AA3是天然的或合成的氨基酸。
雖然在本領域中已知有許多制備LHRH類似物的合成方法，但還是需要改進，因為從已知方法得到的LHRH類似物的總產率不高，此外，產物還需要深度的純化。而且，本領域已知的合成LHRH類似物的方法是很費錢的。
美國專利5710246公開的用于合成十肽或九肽LHRH拮抗劑的合成策略包含中間體三肽(代表氨基酸殘基1-3，從肽的氨端開始計算)與七肽或六肽(分別代表氨基酸殘基4-10和4-9)偶合。在美國專利5710246A中公開的中間體三肽是個酯，Boc-D-2Nal-D-4ClPhe-D-2Pal-O-Me，或相應的芐基或烯丙基酯。
本發明目的本發明目的是提供用于LHRH類似物的3+7和3+6合成的三肽中間體，其中產物的產率和/或純度得到改善。
本發明的另一個目的是提供用于生產該三肽中間體的的方法。
本發明的又一個目的是提供用來生產LHRH類似物方法，其中將三肽與七肽或六肽偶合。
本發明的其它目的將從以下的本發明概要、優選實施方案、和所附的專利權利要求書的敘述而變得明顯。
定義與縮寫在本申請中使用的定義與縮寫是在本發明領域中一般接受的，可參考美國專利5710246A。
本發明的概要本發明提供代表LHRH拮抗劑氨基酸1-3的三肽，其末端氨基是Boc-或Ac-保護的，其末端羧基(即第三號氨基酸的末端)是未保護的。
本發明公開三肽(I)Ac-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH(I)它在合成通式(II)的LHRH拮抗劑的方法中是有用的中間體Ac-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-Ser-X-NH2(II)其中，X是5-7個天然的和/或合成的氨基酸殘基，更優選AA1-AA2-Leu-AA3-Pro-D-Ala，特別是其中AA1是天然的或合成的氨基酸，AA2是天然的或合成的氨基酸或是零，AA3是天然的或合成的氨基酸。
更為優選的是三肽(I)在通式(IIa)的肽的合成中的用途Ac-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-Ser-AA1-AA2-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2(IIa)，其中，AA1和AA2如上定義，特別是式(III)的LHRH拮抗劑Ac-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-Ser-MeTyr-D-Lys(Nic)-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2(III)或者，還要優選的是，式(IIIa)的LHRH拮抗劑
Ac-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-Ser-MeTyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2(IIIa)。
本發明還公開具有相同用途的三肽(IX)Boc-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH(IX)而且，本發明公開制備式(I)三肽Ac-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH(I)或(IX)的方法Boc-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH(IX)，為了制備(I)，該方法包含以下的連續步驟(a)使Boc-D-4ClPhe-OH與HONSu反應，形成Boc-D-4ClPhe-Osu(VII)；(b)使Boc-D-4ClPhe-Osu(VII)與H-D-3Pal-OH反應，形成Boc-D-4ClPhe-D-3-Pal-OH(VIII)；(c)使Boc-D-4ClPhe-D-3-Pal-OH(VIII)與由Boc-D-2Nal-OH與HONSu反應制備的Boc-D-2Nal-Osu反應，形成Boc-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH(IX)；(d)使Boc-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH(IX)與乙酸反應，形成Ac-D-2Nal-4ClPhe-D-3Pal-OH(I)；或者為了制備(IX)，包含(a)-(c)的連續步驟。
本發明制備LHRH拮抗劑的方法包含將三肽(I)與通式(IV)的七肽偶合的步驟P1-Ser(P2)-AA1-AA2-Leu-Lys(iPr，P4)-Pro-D-AlaNH2(IV)，其中P4是氫或氨基保護基如Boc，其中AA1和AA2的定義如上述，為了制備LHRH拮抗劑Ac-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-Ser-MeTyr-D-Lys(Nic)-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2(III)，特別是與通式為P1-Ser(P2)-NMeTyr(P3)-D-Lys(Nic)-Leu-Lys(iPr，P4)-Pro-D-AlaNH2(V)的七肽(V)偶合，其中，P1選自氫或氨基保護基，P2和P3獨立選自H和-OH保護基團，P4的意義如上，為了制備LHRH拮抗劑MeTyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2(III)，更特別地與通式為P1-Ser(P2)-NMeTyr(P3)-D-Asn-Leu-Lys(iPr，P4)-Pro-D-AlaNH2(Va)的七肽(Va)偶合，其中，P1選自氫或氨基保護基，P2和P3獨立選自H和-OH保護基團，P4的意義同上。
七肽(V)在美國專利5710246A中敘述。通式(IV)的七肽包括七肽(Va)，可通過(V)的合成的常規改良來合成，或通過在肽合成儀(Beckman Model 990)上偶合相應的Boc-氨基酸來合成，如在WO 94/40757中敘述的，該專利也公開了LHRH拮抗劑(III)。
或者，本發明制備LHRH拮抗劑的方法包含以下步驟使三肽(IX)Boc-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH(IX)與通式(IV)的七肽P1-Ser(P2)-AA1-AA2-Leu-Lys(iPr，P4)-Pro-D-AlaNH2(IV)，偶合，其中，P1，P2，P4，AA1和AA2的意義如上，特別與通式(V)的七肽偶合P1-Ser(P2)-NMeTyr(P3)-D-Lys(Nic)-Leu-Lys(iPr，P4)-Pro-D-AlaNH2(V)或者，還要優選的，與通式(Va)的七肽偶合P1-Ser(P2)-NMeTyr(P3)-D-Ash-Leu-Lys(iPr，P4)-Pro-D-AlaNH2(Va)，其中，P1選自氫或氨基保護基，P2和P3獨立選自H和-OH保護基團，P4的意義同上，接著用酰基特別是乙酰基取代N-末端Boc基團。
更具體地，通式(V)的七肽是七肽(VI)H-Ser(tBu)-NMeTyr-D-Lys(Nic)-Leu-Lys(iPr，Boc)-Pro-D-AlaNH2(VI)，或者，還要優選的，是七肽(VIa)H-Ser(tBu)-NMeTyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr，Boc)-Pro-D-AlaNHa(VIa)。
本發明方法的特殊的優點是起始材料H-D-Pal-OH.2HCl比較便宜，可用來代替酯H-Pal-OR.2HCl；起始材料的保護基可不必脫除。因此，本發明的合成要短一步，并可避免在附加的一步中材料的損失。另一個優點是避免了在皂化步驟中雜質的形成。這種雜質的形成是公知的。例如，在酯水解步驟中的堿性條件會造成D-Pal的部分消旋化。另一種現有技術的脫除酯基的替代方法是催化氫化(在烯丙基或芐基酯的情況下)，但要冒從4ClPhe失去Cl產生Phe的風險。雖然烯丙基基團還可以用其它試劑脫除，但完全的脫除是難以控制的。
現在本發明要通過參考優選的實施方案更詳細地進行解釋。
本發明優選的實施方案的敘述Ac-D-2Nal-4ClPhe-D-3Pal-OH(I)的合成實施例1Boc-D-4ClPhe-Osu
Boc-D-4ClPhe-OH(299.75g；1.0eq.)和HONSu(184.1g；1.6eq)溶解在2-丙醇(4.5L)中。混合物冷卻到0℃，加入DIC(164.1g；1.3eq.)。混合物攪拌16小時，同時溫熱到室溫。過濾出產物，用2-丙醇(1.5L)洗滌，干燥。產率85％。HPLC純度98.8％。
實施例2Boc-D-4ClPhe-D-3Pal-OHH-D-3Pal-OH，2HCl(251.1g；1.05eq.)和Boc-D-4ClPhe-Osu(396.8g；1.0eq.)溶解在DMSO(3.33L)中，加入NMM(318.8g；3.15eq.)。混合物在室溫攪拌16小時。加入水(17L)，pH調節到4-4.5，使產物沉淀。過濾混合物，產物用水(3×5L)洗滌，以除去痕量的DMSO、H-D-3Pal-OH和Boc-D-4ClPhe-OH。干燥產物。產率80％。HPLC純度97.8％。
實施例3Boc-D-2Nal-OsuBoc-D-2Nal-OH(315.4g；1.0eq.)在-10℃溶解于2-丙醇(6.8L)中，加入IBC(157g；1.15eq.)和NMM(116g；1.15eq.)。攪拌5-10分鐘后，加入HONSu(230.1g；2.0eq.)在2-丙醇(1，4L)中的混合物。加入另外的NMM(10.1g；0.1eq.)。半小時后，將水(0.82L)加入，以溶解沉淀的NMM.HCl。過濾分離產物，用2-丙醇(1L)洗滌，干燥。產率90％。HPLC純度98.3％。
實施例4Boc-D-Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH(a)脫保護。在OoC，將Boc-D-4ClPhe-D-3Pal-OH(447.93g；1.0eq.)溶解在乙酸乙酯(3.4L)、乙酸(675mL)和MSA(454mL；7.0eq.)的混合物中，并在此溫度保持2小時。加入TEA(1669mL；12eq.)。
(b)縮合。Boc-D-Nal-OSu(412.4g；1.0eq.)在室溫中和的脫保護混合物中。反應混合物在此溫度保持2-4小時。加入25％氨水(154mL；2.0eq.)以淬滅殘存的羥基琥珀酰亞胺酯。加入1-丁醇(4.5L)以防止下一步萃取中產生沉淀。
(c)純化與分離。反應混合物在pH6萃取2次(2×4.5L水)以除去TEA，在pH9(4.5L水)萃取以除去MSA，最后在pH7(4.5L水)萃取。萃取在40-45oC進行，以防止出現沉淀。在有機相中加入乙酸(4.5L；1vol.)，混合物真空濃縮，并與乙酸(4.5L)共濃縮，得到固體。
實施例5Ac-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-ONa
(d)脫保護。向固體的Boc-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH加入水(90mL)、乙酸(1.8L)和MSA(454mL；7.0eq.)，混合物在室溫攪拌1-2小時。將混合物冷卻到0℃，用TEA(1071mL；7.7eq.)中和。溶液真空濃縮，與甲苯(2×2.5L)共濃縮2次得到油狀產物。
(e)乙酰化。從脫保護步驟得到的油溶解在甲苯(2.0L)中，加入乙酰咪唑(132.14g)。混合物室溫攪拌1小時，然后加入水(100mL)以淬滅殘留的乙酰咪唑。
(f)純化。乙酰化的混合物加熱到30-35℃加入1-丁醇(4.5L)以阻止沉淀。混合物在pH5萃取2次(2×2.6L水)，用NaOH調節pH到11，在pH11萃取2次(2×2.6L水)。將甲醇(2.25L)加入最后的兩次萃取中以阻止沉淀。將NaCl(130g)加入第一和最后的萃取中使得產物在水相中的損失降低到最低。
(g)分離。向劇烈攪拌的從萃取步驟得到的有機相加入庚烷(15L)，得到的懸浮液在室溫攪拌至少1小時。過濾混合物，產物用庚烷(2×3.5L)洗滌2次，干燥。產率75％(從Boc-D-4ClPhe-D-3Pal-OH計算)。HPLC純度92％。氨基酸分析2Nal1.1；4ClPhe1.0；3Pal0.9.MSMW 586.Na4.6％實施例6Ac-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH.DCHA(a)脫保護。向固體的Boc-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH加入水(90mL)、乙酸(1.8L)和MSA(454mL；7.0eq.)，混合物在室溫攪拌1-2小時。將混合物冷卻到0℃，用TEA(1071mL；7.7eq.)中和。溶液真空濃縮，與甲苯(2×2.5L)共濃縮2次得到油狀產物。
(b)乙酰化。從脫保護步驟得到的油溶解在甲苯(2.0L)中，加入乙酰咪唑(132.14g)。混合物室溫攪拌1小時，然后加入水(100mL)以淬滅殘留的乙酰咪唑。
(c)純化。乙酰化的混合物加熱到30-35℃加入1-丁醇(4.5L)以阻止沉淀。混合物在pH7萃取2次(2×2.6L水)，在pH9-9.5萃取1次(2.6L水)，在pH7萃取1次(2.6L水)。加入DCHA(二環己基胺)，混合物真空濃縮。在50℃將產物懸浮在1-丁醇(4.5L)中，緩慢加到劇烈攪拌的庚烷(27L)中。混合物在0℃攪拌過夜，過濾，產物用1-丁醇/庚烷(1∶3；2×4.8L)洗滌2次，用庚烷(2×4.5L)洗滌2次。
產率65％(從Boc-D-4ClPhe-D-3Pal-OH計算)。HPLC純度94.2％。氨基酸分析2Nal1.1；4ClPhe1.0；3Pal0.9.MSMW 586(游離肽)。
實施例7Ac-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH(a)脫保護。向固體的Boc-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH加入水(90mL)、乙酸(1.8L)和MSA(454mL；7.0eq.)，混合物在室溫攪拌1-2小時。將混合物冷卻到0℃，用TEA(1071mL；7.7eq.)中和。溶液真空濃縮，與甲苯(2×2.5L)共濃縮2次得到油狀產物。
(b)乙酰化。從脫保護步驟得到的油溶解在甲苯(2.0L)中，加入乙酰咪唑(132.14g)。混合物室溫攪拌1小時，然后加入水(100mL)以淬滅殘留的乙酰咪唑。
(c)純化。乙酰化的混合物加熱到30-35℃加入1-丁醇(4.5L)以阻止沉淀。混合物在pH7萃取2次(2×2.6L水)，在pH9-9.5萃取1次(2.6L水)，在pH7萃取1次(2.6L水)。混合物真空濃縮，得到油，將它溶解于乙酸(750mL)，濃縮，再溶解于乙酸(750mL)，緩慢加到劇烈攪拌的庚烷/乙酸乙酯(3∶1；3.6L)中。混合物在0℃攪拌過夜，過濾，產物用乙酸乙酯/庚烷(1∶3；2×3.6L)洗滌2次，用庚烷(2×3.6L)洗滌2次。
產率70％(從Boc-D-4ClPhe-D-3Pal-OH計算)。HPLC純度93.9％。氨基酸分析2Nal1.1；4ClPhe1.0；3Pal0.9.MSMW 586(游離肽)。
權利要求
1.制備式(I)三肽，包括其鹽，Ac-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH(I)或式(IX)三肽，包括其鹽，Boc-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH(IX)，的方法，其特征在于，為了制備(I)，該方法包含如下的連續步驟(a)使Boc-D-4ClPhe-OH與HONSu反應，形成Boc-D-4ClPhe-OSu(VII)；(b)使Boc-D-4ClPhe-OSu(VII)與H-D-3Pal-OH反應，形成Boc-D-4ClPhe-D-3Pal-OH(VIII)；(c)使Boc-D-4ClPhe-D-3Pal-OH(VIII)與Boc-D-2Nal-OSu(通過Boc-D-2Nal-OH與HOSu反應制備)反應，形成Boc-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH(IX)；(d)使Boc-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH(IX)與乙酸反應，形成Ac-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH(I)；或者，為了制備(IX)，包含(a)-(c)的連續步驟。
2.三肽Ac-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH(I)或其鹽。
3.三肽Boc-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH(IX)或其鹽。
4.制備LHRH拮抗劑或其藥學上可接受的鹽的方法，其特征在于，包含將三肽Ac-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH(I)與以下通式的七肽(IV)偶合，P1-Ser(P2)-AA1-AA2-Leu-Lys(iPr，P4)-Pro-D-AlaNH2(IV)，其中，P1選自H或氨基保護基團，P2是H或-OH保護基團，P4是H或氨基保護基團如Boc，AA1是天然的或合成的氨基酸，AA2是天然的或合成的氨基酸或者是零。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，通式(IV)的七肽是以下通式(V)的七肽P1-Ser(P2)-NMeTyr(P3)-D-Lys(Nic)-Leu-Lys(iPr，P4)-Pro-D-AlaNH2(V)其中P3是H或-OH保護基團。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，通式(IV)的七肽是以下通式(Va)的七肽P1-Ser(P2)-NMeTyr(P3)-D-Asn-Leu-Lys(iPr，P4)-Pro-D-AlaNH2(Va).其中P3是H或-OH保護基團。
7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，通式(V)的七肽是下式(VI)的七肽H-Ser.(tBu)-NMeTyr-D-Lys(Nic)-Leu-Lys(iPr，Boc)-Pro-D-AlaNH2(VI).
8.如權利要求6所述的方法，其特征在于，通式(VI)的七肽是下式(VIa)的七肽H-Ser(tBu)-NMeTyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr，Boc)-Pro-D-AlaNH2(VIa).
9.制備LHRH拮抗劑或其藥學上可接受的鹽的方法，其特征在于，包含將三肽Boc-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH(IX)與以下通式的七肽(IV)偶合，P1-Ser(P2)-AA1-AA2-Leu-Lys(iPr，P4)-Pro-D-AlaNH2(IV)，其中，P1選自H或氨基保護基團，P2是H或-OH保護基團，P4是H或氨基保護基團如Boc，AA1是天然的或合成的氨基酸，AA2是天然的或合成的氨基酸或者是零。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，通式(IV)的七肽是以下通式(V)的七肽P1-Ser(P2)-NMeTyr(P3)-D-Lys(Nic)-Leu-Lys(iPr，P4)-Pro-D-AlaNH2(V)其中P3是H或-OH保護基團。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，通式(V)的七肽是下式(VI)的七肽H-Ser(tBu)-NMeTyr-D-Lys(Nic)-Leu-Lys(iPr，Boc)-Pro-D-AlaNH2(VI).
12.如權利要求9所述的方法，其特征在于，通式(IV)的七肽是以下通式(Va)的七肽P1-Ser(P2)-NMeTyr(P3)-D-Asn-Leu-Lys(iPr，P4)-Pro-D-AlaNH2(Va)，接著用酰基，特別是乙酰基，取代Boc基團。
13.如權利要求12所述的方法，其特征在于，通式(IV)的七肽是下式(VIa)的七肽H-Ser(tBu)-NMeTyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr，Boc)-Pro-D-AlaNH2(VIa)，接著用酰基，特別是乙酰基，取代N-末端Boc基團。
全文摘要
新穎的三肽Ac－D－2Nal－D－4ClPhe－3Pal－OH和Boc－D－2Nal－D－4ClPhe－3Pal－OH是在合成LHRH中有用的中間體，通過與適當的七肽偶合，特別是與七肽P
文檔編號C07K5/08GK1622954SQ02828381
公開日2005年6月1日 申請日期2002年12月23日 優先權日2001年12月29日
發明者J·H·拉斯姆森, P·H·拉斯姆森, W·O·瓦克斯, S·漢森, J·弗姆斯加德 申請人:多肽實驗室聯合股份有限公司