專利名稱：雜合的干擾素/干擾素Tau蛋白、組合物和使用方法
技術領域：
本發明涉及由干擾素-τ的C-末端區和另一個干擾素的一個區組成的雜合干擾素蛋白。
參考文獻Akiyama，K.等人(1993)重組牛干擾素α1控制小牛呼吸道疾病的臨床試驗.J.Vet.Med.Sci.553，449-452.
Ausubel，F.M.等人(1992)見現代分子生物學方法。
Babiuk，L.A.(1987)應用重組牛α干擾素減少由1型牛皰疹病毒引起的呼吸道疾病.Antimicrob.Agents Chemother.315，752-757.
Bacila等人主編(1978)酵母的生物化學和遺傳學.
Balzarini，J，等人，Biochem.Biophys.Res.Common.178563-569(1991).
Bartol，F.F.等人，Biol.Reprod.33745-759(1985).
Bayne，M.L等人，Gene66235-244(1988).
Bazer，F.W.和Johnson，H.M.，Am.J.Reprod.lmmunol.2619-22(1991).
Bazer，F.W.等人，PCT出版物WO/94/10313，1994年5月11日出版.
Beames等人，Biotechniques11378(1991).
Benvegnu，L.等人，Cancer83901-909(1998).
Berenguer M.等人.Adv.Gastroenterol.Hepatol.Clin.
Nutr._12-21(1996).
Bitter等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.815330-5334.
Brake，A.J.等人(1984)成熟的外源蛋白在釀酒酵母中α-因子引導的合成和分泌.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 814642-4646.
Breitling，R等人(1989)由鏈激酶信號引導的人干擾素α基因在大腸桿菌和枯草桿菌中的分泌性表達.Mol.Gen.Genet.2172-3，384-91.
Brierley，R.A.(1998)重組人胰島素-樣生長因子1(IGF-1)的分泌.
Methods Mol.Biol.103，149-177.
Brocca，S.等人(1998)編碼主要工業脂酶的rugos念珠菌lip1基因的設計、總合成和功能性過度表達.Protein Sci.7，1415-1422.
Cereghino，J.L和Cregg，J.M.(2000)雜合蛋白在甲基營養型酵母Pichia pastoris中的表達.FEMS Microbiology Reviews 24，45-66.
Charlier，M.等人，Mol.Cell Enotocnnol.76161-171(1991).
Cheng等人(1997)通過IFN-α1和中藥制劑治療B型肝炎肝纖維化的臨床研究.Chung Kuo Chung His I Chieh Ho Tsa Chih 178，453-455.
Choo，Q.-L等人.Science244，359-362(1989).
Choo，Q.-L等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88，2451-2455(1991).
Clarke，B.E.，Baillieres Best Pract.Res.Clin.Gastroenterol.
14293-305(2000).
Cohen等人(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 771078.
Cotler，S.J.等人，J.Viral Hepatitis7211-217(2000).
Crawford-Miksza，L.和David Schnurr，D.(1994)表征腺病毒的定量比色微量中和法試驗，J.Clinical Microbiology 32(9)2331-2334.
Cregg，J.M.和Madden，K.R.(1989)使用位點特異的重組以再生可選擇的標記物.Mol.Gen.Genet.219，320-323.
Cregg，J.M.和Russell，K.A.(1998)轉化方法.Mol.Biol.103，27-39.
Cregg，J.M.等人(1985)Pichia pastoris作為轉化的宿主系統.Mol.
Cell.Biol.5，3376-3385.
Cregg，J.M.等人(1988)開發甲基營養型酵母，Pichia pastoris，作為生產外源蛋白的宿主系統.Dev.Ind.Microbiol.23，33-41.
Cregg，J.M.等人(1989)來自酵母Pichia pastoris的兩個醇氧化酶基因的功能特性.Mol.Cell.Biol.5，111-1121.
Cregg，J.M.等人(1993)在Pichia pastoris中表達外源基因的新近進展.Bio/Technology 11905-910.
Clare，J.J.等人(1991)在酵母中生產小鼠表皮生長因子采用含多基因拷貝的Pichia pastoris株高水平地分泌.Gene 105，205-212.
Cross，J.C.和Roberts，R.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA863817-3821(1991).
Dayhoff等人(1978)見蛋白序列和結構圖譜集(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.).
De Maeyer，E.等人(1982)化學合成的人α1干擾素基因的表達.
Proc.Natl.Acad.Sci.USA7914，4256-4259.
Deutscher，(1990)Methods in Enz.182.
Di Bisceglie，A.M.等人，Hepatology16649-654(1992).
Dieperink，E.等人，Am.J.Psychiatry157-876(2000).
Ecker，D.J.等人，J.Biol.Chem.2647715-7719(1989).
Elliott等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 807080-7084Ellis，S.B.等人(1985)從酵母Pichia pastoris中分離醇氧化酶和兩個甲醇可調節的其它基因.Mol.Cell.Biol.9，1316-1323.
Feher，Z.等人，Curr.Genet.16461(1989).
Fernandez H.等人，Eur.J.Epidemiol.21-14(1986)，Godkin，J.D.等人，J.Reprod.Fertil.65141-150(1982).
Gnatek，G.G.等人，Biol.Reprod.41655-664(1989).
Henikoff等人(1981)Nature 283835.
Higgins，D.R.等人(1998)以直接多拷貝選擇基于藥物抗性顯性的小表達載體.Methods Mol.Biol.103，41-53.
Hitzeman，R.A.等人，美國專利4,775,622號，于1988年10月4日發布.
Helmer，S.D.等人，J.Reprod.Fert.7983-91(1987).
Hollenberg等人(1981)Curr.Topics Microbiol.Immunol.96119.
Horiike N.等人，C Oncol.Rep.51171-1174(1998).
Houglum，Clin.Pharm.220-28(1983).
Imakawa，K.等人，Nature330377-379(1987).
Imakawa，K.等人，Mol.Endocrinol.3127(1989).
Jarpe，M.A.等人，Protein Engineering7-.863-867(1994).
Jimenez-Saenz，M.等人，J.Gastroenterology and Hepatology15567-569(2000).
Jin，X.Y.(1992)rHulFNa-1治療單純皰疹病毒角膜炎的臨床研究.
Chung Hua Yen Ko Tsa Chin 283，134-137.
Julius等人(1983)Cell32839-852Klemann，S.W.等人，Nuc.Acids Res.186724(1990).
Koskinas J.等人.，J.Med.Virol.4529-34(1995).
Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82488-492.
Kunkel等人(1987)Methods Enzymol.154367-382.
Lechner，F.等人.J.Exp.Med.1911499-1512(2000).
Liu，H.等人(1992)Pichia pastoris過氧物酶體缺陷突變體的有效篩選.J.Bacteriol.174，4943-4951.
Liu，H.等人(1995)PER3，Pichia pastoris中過氧物酶體生物發生所需的基因，編碼涉及蛋白輸入的過氧化物酶膜蛋白.J.Biol.Chem.270，10940-10951.
Ludwig，D.L，等人，Gene13233(1993).
Magrin，S.等人，Hepatology19，273-279(1994).
Maniatis，T.等人，見分子克隆實驗室手冊，Cold Sprina HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY(1982).
Martal，J.等人，J.Reprod.Fertil.5663-73(1979).
Martin，E.W.，見藥物配制制劑和藥學產品配制實用手冊(MackPublishing Co.，Easton，PA)，1976.
Mercereau-Puigalon等人(1980)Gene 11163.
Mullis，K.B.，美國專利4,683,202號，1987年7月28日發布.
Mullis，K.B.等人，美國專利4,683,195號，1987年7月28日發布.
Noisakran，S.和Carr，D.J.J.(2000)編碼IFN-α1的質粒DNA經CD4+和CD8+T淋巴細胞抗1型單純皰疹病毒性眼感染.Journal ofImmunology164(12)6435-43.
Noisakran，S.等人(1999)編碼IFN-α1的DNA在角膜中的異常表達防護小鼠患1型單純皰疹病毒引起的腦炎.J Immunology162(7)4184-90.
Oeda，K.等人，美國專利4,766,068號，1988年8月23日發布.
0tt，T.L，等人，J.IFN Res.11357-364(1991).
Panthier等人(1980)Curr.Genet.2109.
Pawlotsky，J-M.等人.，J.Interferon and Cytokine Res.15857-862(1995).
Pearson，W.R.和Lipman，D.J.，PNAS852444-2448(1988).
Pearson，W.R.，Methods in Enzymology18363-98(1990).
Pontzer C.H.等人(1995)干擾素測定.Meth.Neurosci.243-9.
Raemaekers，R.J.M.等人(1999)Pichia pastoris中表達的功能性植物凝集素(PHA)和雪花 凝集素(GNA)正確的N-末端加工和采用PHA-E信號肽分泌表達的異源蛋白.Eur.J.Biochem.65，394-403.
Reilly，P.R.等人.桿狀病毒表達載體實驗室手冊，1992.
Riesenberg，D.等人(1990)表達人干擾素α1的重組大腸桿菌的高細胞密度發酵.Appl.Microbiol.Biotechnoi.341，77-82.
Roberts，R.M.等人，Endocrin.Rev.13432-452(1992).
Rose and Harrison，主編(1987)酵母(第二版).
Rutter，W.J.等人，美國專利4,769,238號，1988年9月6日發布.
Saito，H.等人，J.Viral Hepatitis764-74(2000).
Sambrook，J.等人(1989)分子克隆實驗室手冊.Spring Harbor，NYCold Spring Harbor Laboratory Press.
Scopes，(1982)蛋白純化原理和實踐.Springer-Verlag，New York.
Sears，I.B.等人(1998)結構和調節基因在Pichia pastoris中表達的多用載體系列.Yeast14，783-790.
Shaw，K.J，等人，DNA7117(1988).
Shen，L.P.等人，Sci.Sin.，29856(1986).
Shen，S.等人.(1998)控制外源基因在酵母Pichia pastoris中表達的強氮源調節的啟動子.Gene216，93-102.
Shepherd，等人(1998)雙劑量水平的干擾素α和疊氮胸苷治療人免疫缺陷病毒感染伴隨的卡波濟氏肉瘤的前瞻性隨機化試驗加拿大HIV臨床試驗Netword研究.J.Clin.Oncol.165，1736-1742.
Shindo，M.等人，Hepatology9715-719(1989)Singh等人(1983)Nucleic Acids Res.114049-4063Singh，A.等人(1984)在酵母中合成、分泌和加工α-因子干擾素融合蛋白.Nucleic Acids Res.1223，8927-8938.
Smith等人(1985)Science 2291219-1229.
Skinner等人主編(1980)酵母的生物學和活性(Soc.App.Bacteriol.Symp.Series No.9).
Stewart，H.J.等人，Mol.Endocrinol.265(1989).
Strathern等人主編(1981)酵母菌屬酵母的分子生物學.
Thill，G.P.等人(1990)多拷貝整合的表達載體對Pichia pastoris中蛋白表達的正性和負性作用.見第六屆國際微生物遺傳學討論會論文集(Heslot，H.等人編輯)，第2卷，477-490頁。Societe Francaise deMicrobiologie，Paris.
Trepo，C.，J.Viral Hepatitis7250-257(2000).
Tyring，等人，干擾素原理和醫學應用，第1版，V111節，399-408頁，1992.
Tschopp，J.F.等人(1987).Pichia pastoris中來自兩個甲醇調節的啟動子的LacZ基因表達.Nucleic Acids Res.15，3859-3876.
Vallet，J.L，等人，Biol.Reprod.371307(1987).
Van Heeke，G.等人(1996)綿羊妊娠識別激素干擾素-τ在Pichiapastoris中的高產量表達和分泌.J.Interferon and Cytokine Res.16119-126.
Walker和Gaastra主編(1983)，分子生物學技術(MacMillan PublishingCompany，New York).
Walter，M.R.等人(1998)在發現干擾素40周年之際回顧重組α干擾素分子特征的新近進展.Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals133，143-154.
Waterham，H.R.等人(1996).Pichia pastoris PER6基因產物是過氧物酶體生物發生必要的過氧化物酶的整合膜蛋白，與Zeilweger綜合癥蛋白PAF-1具有序列相似性.Mol.Cell.Biol.16，2527-2536.
Waterham，H.R.，等人(1997)Pichia pastohs甘油醛-3-磷酸鹽脫氫酶基因的分離和調節及其啟動子的使用.Gene 186，37-44.
Whaley，A.E.，等人，J.Biol.Chem.26910864-10868(1994).
White，C.E.，等人(1995)小片段血栓調節素的大規模表達、純化和定性第六功能區和蛋氨酸388的作用.Protein Eng.8,1177-1187.
Wu.D.A.，等人.DNA10201(1991).
背景技術：
干擾素(IFNs)是對多種細胞類型的生長和功能具有多效性作用的一族結構和功能相關的蛋白。自從1957年發現其作為抗病毒劑以來，IFNs已顯示具有多種有力的免疫調節作用，包括自然殺傷細胞活性調節和主要組織相容性抗原表達的調節，以及抗惡性細胞的抗增殖活性(Walter等人，1998).
IFN的主要類型是IFN-α、-β、-τ和-ω，它們也叫做I型(酸穩定的)，IFN-γ被命名為II型(酸不穩定的)。下面的表1總結了主要類型IFNs的情況。
表1干擾素概觀
現在已知蛋白的IFN-α家族由至少14個基因組成，包括一個假基因和兩個編碼相同蛋白的基因。因此，由14個基因產生有12種單獨的IFNα蛋白。各種IFN-α亞型在氨基酸序列水平具有大約80％的同一性。
干擾素α-1(IFNα1)，也通稱干擾素α-D(IFNαD)，是被廣泛研究和有臨床興趣的I型干擾素。新近的報告顯示了重組IFNαD在人和動物中治療各種病毒性疾病的有效性(Noisakran和Carr，2000；Noisakran等人，1999)。出于對人IFNαD的臨床和研究目的，已開發和使用了不同的表達系統。
重組人IFNαD(rHulFNαD)的表達在1982年描述為馬德普制劑甲基營養系統和大腸桿菌系統，均使用lac啟動子(De Maeyer，1982)。1984年，Genentech科學家報告了釀酒酵母系統，其中IFNαD基因與α-因子prepro信號序列融合產生了具有相對低生物學活性的分泌的IFNαD蛋白(Singh，1984)。幾年后，1989年，形成了采用鏈激酶異源表達-分泌信號在大腸桿菌和枯草桿菌(B.subtilis)中分泌性表達人干擾素基因(Breitling，1989)。在這些研究中，只有B.subtilis系統而非大腸桿菌系統能夠分泌rHulFNaD進入培養基。rHulFNαD在大腸桿菌中細胞內表達的顯著改進報道于1990年，通過在發酵過程中使用限定成分的培養基以成批飼養的模式，使得以減少的特異性生長速率在大腸桿菌中更有效地表達蛋白。但是，在過去的11年中，人IFNαD的生產沒有其他的顯著改進。
第一個被鑒定的IFN-τ是綿羊IFN-τ(OvIFN-τ)，為18-19kDa的蛋白。在孕體(胚胎及周圍的膜)勻漿中鑒定了幾個異構體(Martal等人，1979)。隨后，釋放進孕體培養基的低分子量蛋白被純化并顯示是熱不穩定且對蛋白酶敏感的(Godkin等人，1982)。OvIFN-τ最初被稱為綿羊滋養層細胞蛋白-1(oTP-1)，因為它是主要的分泌性蛋白，最初在羊母性識別的關鍵時期由羊孕體滋養外胚層產生。后來的實驗確定，OvIFN-τ是妊娠識別激素，對于建立反芻動物如羊和牛的妊娠生理反應是必要的(Bazer和Johnson，1991)。
用代表N-末端氨基酸序列(Imakawa等人，1987)的合成寡核苷酸探測羊胚泡庫獲得了IFN-τcDNA，其預測的氨基酸序列與人、小鼠、大鼠和豬的IFN-α45-55％同源，與牛IFN-αll70％同源，現稱作IFN-Ω。已經報道，幾個cDNA序列可表現不同的異構體(Stewart等人，1989；Klemann等人，1990；和Charlier，M.等人，1991)。所有均大約1kb，具有585個堿基的開放閱讀框，編碼23個氨基酸的引導序列和172個氨基酸的成熟蛋白。預測的IFN-τ結構為與氨基和羧基末端并列的4個螺旋狀束，進一步支持其分類為I型IFN(Jarpe等人，1994)。
雖然IFN-τ顯示許多典型地I型IFNs相關的活性(見上面的表1)，但其與其它I型IFNs之間存在相當大的不同。最突出的不同是其在妊娠中的作用，詳見上。還不同的是病毒誘導作用。所有I型IFNs，除IFN-τ外，都容易地被病毒和dsRNA誘導(Roberts等人，1992)。誘導的IFN-α和IFN-β表達是短暫的，持續大約數小時。相反，IFN-τ的合成，一旦誘導則維持幾天(Godkin等人，1982)。以每個細胞為基礎，IFN-τ比其它I型IFNs多產生300倍以上(Cross和Roberts，1991)。
其它不同可存在于IFN-τ基因的調控區。例如，用牛IFN-τ基因轉染人滋養層細胞細胞系JAR引起抗病毒活性而用牛IFN-Ω基因轉染則不能。這暗示有獨特的處理因子涉及IFN-τ的基因表達。與此一致的觀察是，雖然IFN-τ與IFN-α和IFN-β的近端啟動子區(從126至轉錄啟始位點)高度同源；但-126至-450區不同源并僅增強IFN-τ的表達(Cross和Roberts，1991)。因此，與其它I型IFNs相比，IFN-τ的表達顯示有不同的調控因子參與。
IFN-τ的表達在種屬之間也可以不同。例如，盡管IFN-τ的表達在反芻動物限于孕體發育的特定階段(主要在13-21天)(Godkin等人.1982)，但初步研究提示，人型IFN-τ在整個妊娠過程中結構性表達(Whaley等人，1994)。
顯著地，干擾素類的效用被其毒性所限。在癌癥和病毒性疾病的治療中應用干擾素類引起了嚴重的副作用。IFN-α在美國于1991年、在日本于1992年被引入慢性C型肝炎的治療(Saito等人，2000)。但是，應用足以產生臨床功效的IFN-α劑量(即，大約1×106單位/治療劑量及以上)通常伴有″流感樣″綜合癥，其特征為發熱、頭痛、無力、關節痛和肌痛(Tyring等人，1992)。在5-10×106單位/治療劑量及以上時，更經常出現其它毒性如惡心、嘔吐、腹瀉和食欲減退。也有報道伴隨IFN-α的治療有神經精神癥狀(Dieperink等人，2000)。此外，一些研究提示，IFN-α的治療功效不是劑量依賴的(Saito等人，2000)，在腫瘤或病毒性肝炎患者中用IFN-α治療與自體免疫紊亂的形成和惡化相關(Jimenez-Saenz等人，2000)。
因此，需要一種具有高抗病毒活性和低細胞毒性的干擾素蛋白。本發明意圖滿足這些需求。
發明概述因此，在一個方面，本發明的目的是提供干擾素/干擾素-τ雜合蛋白，包括其C-末端區被干擾素-τ的C-末端區置換的干擾素蛋白。在一個實施例中，本發明提供了非-τ干擾素/干擾素-τ雜合蛋白，即包括非-τ干擾素蛋白，其中所述非-τ干擾素蛋白的C-末端區被干擾素-τ的C-末端區置換。在另一個實施例中，干擾素蛋白是I型干擾素蛋白。I型干擾素蛋白可以是干擾素-α。優選地，干擾素-α是人干擾素-α。在一個實施例中，人干擾素-α是人干擾素-αD。而在另一個實施例中，干擾素蛋白是干擾素-β。
在一個實施例中，雜合蛋白能夠顯示相對于天然干擾素較低的毒性，如干擾素-α的檢測，包括在含有至少2000抗病毒單位/ml雜合體的培養基中孵育第一個PBMCs樣本7天；在具有相同抗病毒單位/ml天然IFN-α的培養基中孵育第二個PBMCs樣本7天；比較第一和第二個樣本中殘存的活細胞百分比，由此較高百分比的活細胞預示著培養基中IFN種類的相對較低毒性。
在本發明的一個實施例中，干擾素蛋白沒有任何C-末端區的置換，而是干擾素-τ的C-末端區加在全長干擾素蛋白上。因此，干擾素蛋白可能有0個氨基酸的C-末端被置換。在另一個實施例中，干擾素蛋白中大約1-30個氨基酸之間的C-末端被置換。而在另一個實施例中，干擾素蛋白中大約1-10個氨基酸之間的C-末端被置換。優選地，干擾素蛋白的最后4個氨基酸的C-末端被置換。在相關的實施例中，人干擾素-αD的C-末端區對應于跨度163-166殘基的序列。
在一個實施例中，雜合蛋白包括干擾素-τ的C-末端區，對應于干擾素-τ的跨度163-172殘基的序列。優選地，干擾素蛋白是人干擾素-αD，人干擾素-αD的C-末端區跨度殘基163-166，及干擾素-τ的C-末端區對應于跨度干擾素-τ163-172殘基的序列。
在一個實施例中，雜合蛋白相對于干擾素或非-τ干擾素蛋白的細胞毒性低。在另一個實施例中，雜合蛋白相對于干擾素或非-τ干擾素蛋白具有增加的抗病毒活性。在相關的實施例中，雜合蛋白在MDBK/VSV抗病毒系統中具有至少大約1×108抗病毒單位/mg的抗病毒活性。在另一個相關的實施例中，雜合蛋白在MDBK/VSV抗病毒系統中具有至少大約2×108抗病毒單位/mg的抗病毒活性。
本發明設想干擾素-τ蛋白是反芻動物干擾素-τ。在一個實施例中，干擾素-τ是綿羊或牛干擾素-τ。本發明還設想上述的任何雜合蛋白可以是長效的(pegylated)。
在另一個方面，本發明包括編碼上述任何雜合蛋白的核酸分子。而在另一個方面，本發明包括制造干擾素雜合蛋白的方法。實施本方法中涉及的步驟包括將上述的任何核酸分子置入重組表達系統中；影響核酸分子的表達以產生雜合蛋白；回收雜合蛋白。在一個實施例中，重組表達系統包括P.pastoris。
而在另一個方面，本發明包括藥物組合物，含有如上所述制備的雜合蛋白，以及藥學可接受的載體。組合物還可含有病毒唑。
在一個方面，本發明還包括在感染病毒的細胞中抑制病毒復制的方法。該方法包括將細胞與可有效抑制病毒在細胞內復制的劑量的雜合蛋白接觸。
還設想了抑制腫瘤細胞生長的方法。該方法包括使腫瘤細胞與有效抑制其生長的劑量的雜合蛋白接觸。
本發明的另一個方面包括治療患者自體免疫疾病的方法。該方法包括以有效治療該疾病的劑量給予患者任何如上所述制備的雜合蛋白。
而發明的另一個方面包括治療患者慢性炎癥的方法。該方法包括以有效治療炎癥的劑量給予患者任何如上所述制備的雜合蛋白。
還在發明的另一個方面，包括治療對干擾素有反應的疾病狀態的方法。該方法包括以有效治療該疾病狀態的劑量給予患者任何如上所述制備的雜合蛋白。
在上述任何方法中，可以通過以下給藥方法進行給藥口服、局部、吸入、經鼻和注射。
本發明的這些和其它目的和特征在結合附圖閱讀以下的發明詳述時會更充分地理解。
附圖的簡要描述
圖1顯示用于產生HVV片段1的寡核苷酸序列和最終連接產物；圖2顯示用于產生HVV片段2的寡核苷酸序列和最終連接產物；圖3顯示用于產生HVV片段3的寡核苷酸序列和最終連接產物；圖4顯示用于產生HVV片段4的寡核苷酸序列和最終連接產物；圖5A-5C顯示HVV-pPICZ-α構建物的序列和選擇的限制性位點；圖6A-6B顯示了已選擇的HVV蛋白資料；圖7是用1％甲醇誘導72小時后P.pastoris HVV重組體培養上清的SDS-PAGE凝膠；圖8是顯示來自P.pastoris上清的HVV蛋白部分純化的SDS-PAGE凝膠。
圖9圖示流式細胞儀分析的PBMC細胞特異性細胞死亡的百分比。
圖10顯示了已選擇的干擾素蛋白的氨基酸序列排列。
發明的詳細描述I.定義除非另有說明，這里所用的所有技術和科學術語具有與本發明領域技術人員所用相同的含意。從業者特別地關注于Sambrook等人，1989，和Ausubel FM等人，1993，中本領域的定義和術語。應當理解，此發明不限于所描述的特定方法學、方案和試劑，因為這些是可變化的。
為了描述和公開可能與本發明聯合使用的組合物和方法學，所有這里引用的出版物和專利均特別地在此合并為參考文獻。
″雜合″核酸構建物或序列含有的一部分序列是表達其的細胞非固有的。就調控序列而言，雜合是指調控序列(即啟動子或增強子)對其目前調節的相同基因的表達在天然情況下沒有調節作用。通常，雜合核酸序列不是它們存在的細胞內源的或基因組的一部分，并通過感染、轉染、微注射、電穿孔或類似方法被加入細胞中。″雜合″核酸構建物可包含調控序列/DNA編碼序列組合，與天然細胞中發現的調控序列/DNA編碼序列組合相同或不同。
如這里所用的，術語″載體″是指為在不同宿主細胞間傳遞而設計的核酸構建物。″表達載體″是指能夠在異源細胞中摻入和表達異源DNA片段的載體。許多原核的和真核的表達載體可從商業渠道獲得。適合表達載體的選擇在本領域技術人員的知識范圍內。
如這里所用的，″表達基因盒″或″表達載體″是由一系列可在靶細胞或體外轉錄特定核酸的特異性核酸元件重組地或合成地產生的核酸構建物。重組表達基因盒可被插入質粒、染色體、線粒體DNA、質體DNA、病毒或核酸片段中。典型地，在其它序列中，表達載體的重組表達基因盒部分包括要轉錄的核酸序列和啟動子。
如這里所用的，術語″質粒″是指用作克隆載體的雙鏈(ds)環狀DNA構建物，它在許多細菌和某些真核細胞中形成染色體外的自我-復制遺傳元件。
如這里所用的，術語″編碼可選擇標記物的核苷酸序列″是指能夠在宿主細胞中表達的核苷酸序列，其中可選擇標記物的表達賦予含表達基因的細胞在有相應選擇劑的情況下生長的能力。
如這里所用的，術語″啟動子″和″轉錄啟始子″指作用于引導下游基因轉錄的核酸序列。啟動子通常將適合于要表達靶基因的宿主細胞。啟動子與其它轉錄和翻譯調節核酸序列(也稱作″調控序列″)一起對于指定基因的表達是必要的。大體上，轉錄和翻譯調控序列包括但不限于，啟動子序列、核糖體結合位點、轉錄啟始和終止序列、翻譯啟始和終止序列，以及增強子或活化子序列。
″嵌合基因″或″異源核酸構建物″，如這里所定義，是指可由不同基因部分，包括調控元件組成的非天然基因(即，已被導入宿主的)。轉化宿主細胞的嵌合基因構建物典型地由與異源蛋白編碼序列可操作連接的轉錄調控區(啟動子)組成，或在可選擇標記物的嵌合基因中可操作地與可選擇標記物基因相連，該基因編碼的蛋白為轉化的宿主細胞賦予抗生素抗性。本發明典型的轉化進宿主細胞的嵌合基因包括結構性或可誘導的轉錄調控區，蛋白編碼序列和終止子序列。如果需要分泌靶蛋白，嵌合基因構建物還可包括編碼信號肽的第二個DNA序列。
當核酸被置于與另一個核酸序列功能相關時，即是″可操作地連接″。例如，如果多肽以參與多肽分泌的前蛋白被表達，那么編碼分泌性引導子的DNA可操作地與多肽DNA相連；如果啟動子或增強子影響序列的轉錄，那么它們可操作地與編碼序列相連；或如果為促進翻譯安置核糖體結合位點，那么它可操作地與編碼序列相連。一般地，″可操作地連接″是指要連接的DNA序列是相鄰的，就分泌性引導子來說是相鄰和在閱讀相內。但增強子不一定是相鄰的。通過在方便的限制性位點連接完成結合。如果不存在這種位點，按常規慣例使用合成的寡核苷酸接合器或連接子。
如這里所用的，術語″基因″是指與產生多肽鏈相關的DNA片段，它可包括或不包括編碼區前和后的區域，如5’非翻譯區(5’UTR)或″引導子″序列和3’UTR或″拖尾″序列，以及在單個編碼片段(外顯子)之間的插入序列(內含子)。
如這里所用的，就細胞或載體而言，″重組″包括通過導入異源核酸序列而被修飾，或來自如此修飾的細胞。因此，例如，重組細胞表達在天然(非重組)形式的細胞中沒有發現相同形式的基因，或另外地作為人為干預的結果，天然基因異常表達、表達不足或完全不表達。
術語″導入″在將核酸序列插入細胞的情況下，是指″轉染″或″轉化″或″轉導″，包括涉及將核酸序列插入真核或原核的細胞，其中核酸序列可插入細胞基因組(例如染色體、質粒、質體或線粒體DNA)，轉換成自發復制子，或短暫地表達(例如轉染的mRNA)。
如這里所用的，術語″表達″是指根據基因的核酸序列產生多肽的過程。該過程包括轉錄和翻譯。
術語″信號序列″是指蛋白N-末端部分的氨基酸序列，它促進成熟型蛋白分泌出細胞。成熟型的細胞外蛋白缺少信號序列，后者是在分泌過程中分裂開的。
術語″宿主細胞″是指含有載體并支持表達構建物復制、和/或轉錄或轉錄和翻譯(表達)的細胞。用于本發明的宿主細胞可以是原核細胞如大腸桿菌，或真核細胞如酵母、植物、昆蟲、兩棲動物或哺乳動物細胞。
如這里所用的，術語″活性″和″生物學活性″是指與特定靶蛋白相關的生物學活性，如酶活性。因而斷定，指定蛋白的生物學活性是指被本領域技術人員典型地歸因于該蛋白的任何生物學活性。
″C型肝炎病毒或HCV″是指一些病毒種屬，其致病型導致非A非B型肝炎(NANBH)，以及指從那里來源的減毒型或有缺陷的干擾顆粒。HCV基因組由RNA組成。含RNA的病毒類具有相當高的自發突變率，據報道每個插入的核苷酸在10-3至10-4的數量級。由于基因型異質性和流動性是RNA病毒固有的，在HCV種屬中有多個類型/亞型，它們可以是有病毒性或無病毒性的。各種HCV類型或游離體的繁殖、鑒定、檢測和分離記錄在文獻中。
″治療″病癥是指給予治療物質有效地減少病癥的癥狀和/或減輕病癥的嚴重性。
″口服″是指涉及通過口腔給藥或直接胃或腸內給藥包括胃用藥的任何途徑。
″OAS水平″是指血液中2’，5’-寡腺苷酸合成酶(OAS)蛋白的濃度或活性。
″酵母″意指產子囊酵母類(內孢霉目)，擔子孢子屬酵母和屬于不完全菌綱(芽孢綱)的酵母。產子囊酵母被分成兩個家族，Spermophthoraceae和Saccharomycetaceae。后者由4個亞家族組成，裂殖酵母菌(如，裂殖酵母菌屬)、Nadsonioideae、Lipomycoideae和Saccharomycoideac(如畢赤屬，克魯維酵母屬和酵母菌屬)。擔子孢子屬酵母包括白冬孢酵母屬、紅冬孢酵母屬、Sporidiobolus、絲狀擔子屬和線狀黑粉菌屬。屬于不完全菌綱的酵母分成兩個家族，Sporobolomycetacea(如，孢子全霉菌屬，布勒擲孢酵母屬)和隱球菌科(如念珠菌屬)。本發明特別感興趣的是以下種屬畢赤屬，克魯維酵母屬，酵母菌屬，裂殖酵母菌屬和念珠菌屬。特別感興趣的是畢赤屬P.pastoris。由于酵母的分類在將來可能改變，對此發明來說，酵母應當限定為Skinner等人所描述。除前述以外，本領域普通技術人員估計對酵母生物學和酵母遺傳學操作是熟悉的。見例如Bacila等人，Rose和Harrison；Strathern等人，在此合并為參考文獻。
本發明的核苷酸序列當可操作地與酵母啟動子連接時，可用于在酵母宿主細胞中產生有生物學活性的成熟目的異源蛋白。以此方式，編碼本發明的雜合前體多肽的核苷酸序列在導入進酵母宿主細胞的表達基因盒中提供。這些表達基因盒將包含與編碼雜合前體多肽的核苷酸序列相連的轉錄啟始區。這種表達基因盒提供了多個限制位點以插入需要調控區轉錄調節的核苷酸序列。表達基因盒可另外含有可選擇的標記物基因。
克隆或表達載體可含有另外的組成部分，例如，表達載體可有兩個復制系統，因而使它可以在兩個生物體中操作，例如在人或昆蟲細胞中表達和在原核宿主中克隆和擴增。
克隆和表達載體均含有核酸序列，使載體能夠在一個或多個選擇的宿主細胞中復制。此外，為整合表達載體，表達載體含有至少一個與宿主細胞基因組同源的序列，優選地兩個與表達構建物側面相接的同源序列。整合載體可通過選擇適合的同源序列含入載體來定向于宿主細胞的特定位置。整合載體的構建為本領域熟知。
克隆和表達載體典型地將含有可選擇的標記物。典型的可選擇標記物基因編碼的蛋白可以(a)賦予對抗生素或其它毒素的抗性，例如氨比西林、新霉素、甲氨喋呤、zeocin或四環素，(b)補足營養缺陷的不足，或(c)提供不能從復合培養基中獲得的關鍵營養素，例如，編碼細菌D-丙氨酸消旋酶的基因。
″IFN-τ″是指干擾素蛋白家族任何之一，與美國專利5,939,286顯示的IFN-τ序列具有超過70％，或優選地超過大約80％，或更優選地超過大約90％，以及更優選地超過大約95％的氨基酸同源性，該專利特別地在此整體合并為參考文獻，或與圖10給出的IFN-τ和綿羊IFN-τ序列同源。氨基酸同源性可以采用例如ALIGN程序，用默認參數測定。此程序見于FASTA1.7版序列比較程序組(Pearson和Lipman，1988；Pearson，1990；程序可獲取自William R.Pearson，Department ofBiological Chemistry，Box440，Jordan Hall，Charlottesville，VA)。
″IFN-α″是指包括圖10所示的IFN-αD氨基酸序列的干擾素蛋白家族任何之一，以及指具有氨基酸取代和改變的蛋白，如不顯著影響蛋白活性的中性氨基酸取代。優選地，該序列包括圖10的IFN-αD序列和具有與其超過大約70％，或優選地超過大約80％，或更優選地超過大約90％，以及更優選地超過大約95％氨基酸序列同源性的蛋白。同源性可以采用例如ALIGN程序，用默認參數如上所述測定。
如這里所用的，術語″IFN表達″是指上述IFN基因的轉錄和翻譯，其產物包括前體RNA、mRNA、多肽、翻譯后加工的多肽及其衍生物。根據實例，IFN表達的檢測包括標準的細胞病變保護試驗。Western和Northern印跡分析及逆轉錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測IFN mRNA。
如這里所用的，術語″IFN的生物學活性″和″生物學上有活性的IFN″指與IFN或任何片段、IFN衍生物或類似物相關的任何生物學活性，如酶活性，特別地包括可以采用標準的細胞病變保護試驗檢測的抗病毒活性。
如這里所用的，術語″修飾”形式，相對于IFN相關蛋白是指天然蛋白的衍生物或變異體。即，″修飾”形式的蛋白具有含至少一個氨基酸取代、刪除或插入的衍生多肽序列，其中氨基酸取代是特別優選的。氨基酸取代、插入或刪除可出現在多肽序列中的任何殘基上，它干擾蛋白的生物學活性。因此，編碼變異體或衍生蛋白的相應核酸序列被認為是″變異的″或″修飾″形式的基因或編碼序列，并包括在本發明的范圍內。
″變異體″意指通過以下方法從天然多肽衍生的多肽通過在天然蛋白的N-末端和/或C-末端刪除(所謂的截斷)或添加一個或多個氨基酸；在天然多肽的一個或多個位點上刪除或添加一個或多個氨基酸；或在天然多肽的一個或多個位點上取代一個或多個氨基酸。這種變異體可起因于例如遺傳多態性，或由于人工操縱。這種操縱的方法通常為本領域已知。
例如，多肽的氨基酸序列變異體可以通過任何雜合IFNs的編碼克隆DNA序列的突變而制備。誘變和核苷酸序列改造的方法是本領域熟知的。見例如，Walker和Gaastra，主編(1983)；Kunkel(1985)；Kunkel等人.(1987)；和Sambrook等人(1989)。關于不影響目的蛋白生物學活性的適合氨基酸取代的指導可見于Dayhoff等人(1978)的模型，在此合并為參考文獻。可以優選保守性取代，如用另一個具有相似特性的氨基酸交換一個氨基酸。保守性取代的實例包括但不限于，Gly<＝>Ala，Val<＝>lle<＝>Leu，Asp<＝>Glu，Lys<＝>Arg，Asn<＝>GIn，和Phe<＝>Trp<＝>Tyr。
在構建雜合IFN的變異體時，可以進行修飾使變異體繼續具有所需的活性。明顯地，對編碼變異體蛋白的DNA所做的任何突變不必置序列于閱讀框外，優選地將不產生能夠引起二級mRNA結構的互補區。
因此，本發明的蛋白包括雜合IFN/IFN-T蛋白及其變異體。這些變異體將實質上與天然蛋白同源，在功能上與天然蛋白相當。當天然蛋白變異體的氨基酸序列與天然蛋白的氨基酸序列至少大約80％、更優選地至少大約90％、最優選地至少大約95％相同時，它們是″實質上同源″的。變異體可少至1、2、3或4個氨基酸不同。″功能上相當″意指變異體序列限定的鏈產生與天然IFN具有實質上相同的生物學活性的蛋白。這種含有實質上序列變化的功能上相當的變異體也包含在本發明中。因此，雜合IFN蛋白的功能上相當的變異體具有的生物學活性將足以作為治療應用。″治療應用″意指在獲得治療目標上是有效的，例如防護1型單純皰疹病毒引起的腦炎。
測定功能等效的方法在本領域可以得到。生物學活性可以采用為檢測IFN蛋白活性而特別設計的試驗測定，包括本發明描述的試驗和美國專利No.6,204,022描述的試驗，在此特別地整體合并為參考文獻。另外，產生的抗具有生物學活性的天然蛋白的抗體可因其與功能相當變異體的結合能力而被檢測，有效的結合表示該蛋白具有的構造與天然蛋白相似。
II.雜合干擾素融合蛋白本發明對由IFN-τ的C-末端區引起的毒性降低進行了一些觀察，以支持嵌合DNA構建物，該構建物用來產生具有來自IFN-τ的C-末端部分和來自非-τ干擾素I型多肽的N-末端的雜合干擾素融合蛋白。這樣的非-τ干擾素I型多肽的實例包括IFN-β和各種亞型的IFN-α。
根據圖10，這樣的雜合干擾素融合蛋白或多肽HW，由嵌合的核酸分子編碼或通過天然的化學連接反應產生，它具有的N-末端包括IFN-αD的氨基酸1位至氨基酸163位，C-末端包括IFN-τ的氨基酸163位至氨基酸172位。N-末端片段含有非-τ干擾素多肽的N-末端氨基酸序列，它由嵌合核酸分子的5’端片段編碼。C-末端片段含有IFN-τ多肽的C-末端氨基酸序列，它由嵌合核酸分子的3’端片段編碼。
使用IFN-τ(163-172)內或延伸其外的更長或更短的區域所對應的肽或編碼肽的DNA序列，結合在此描述的功能試驗，如在實例5中描述的抗病毒實驗，和在實例6中描述的毒性實驗，通過上述的方法可鑒定最佳的連接或氨基酸殘基位置，在其上游，序列與非-τ干擾素對應，在其下游，對應于IFN-τ。要考慮的，例如含有人IFN-αD的氨基酸1-166和IFN-τ的10個最后C-末端氨基酸的本發明雜合或嵌合干擾素具有與干擾素τ有關的低毒性，以及與IFN-α有關的生物學活性或通常被認為是IFN-α的生物學活性。例如，IFN-α/IFN-τ雜合體可降低IFN-a的毒性，但不干擾，或甚至增加IFN-α的抗病毒特性。
本發明優選的實施方案是一些融合蛋白，其中N-末端片段來自人IFN-αD，C-末端片段來自羊IFN-τ。其他合適的IFN序列可從GenBank或其他公共序列庫中獲得。
如在上面所指出的，要考慮的本發明雜合干擾素融合蛋白組合物的一個很重要優點是與天然非τ1型干擾素有關的成分的毒性降低了，例如該成分已經被批準為治療藥物。雜合的組合物具有與已批準的非τI型IFN相同的生物學活性，具有降低的IFN-τ細胞毒性。
III.雜合干擾素蛋白的產生在一個方面，發明包括一種產生非-τ干擾素/干擾素-τ雜合蛋白的方法。已經發現當P.pastoris表達宿主被含有正確核酸分子序列的載體轉化時，可能產生大量相對純的和功能活性的非-τ干擾素/干擾素-τ雜合蛋白。下面所考慮的是實施本發明的步驟。
在本發明中可使用的序列，方法和組合物可見美國專利第5,958,402，1999年9月28日發布；5,942,223，1999年8月24日發布；5,738,845，1998年4月14日發布；5,939,286，1999年8月17日發布；6,204,022，2001年3月20日發布；5,906,816，1999年5月25日發布；6,060,450，2000年5月9日發布；和6,372,206，2003年5月16日發布；每一個在此整體合并為參考文獻。在本發明中可使用的其他序列，方法和組合物可見審查中的美國專利申請號第09/910,406，于2001年7月19日歸檔；和10/137,127，2002年5月日歸檔，每一個在此整體合并為參考文獻。
A.P.pastoris宿主細胞選擇表達非τ干擾素/干擾素-τ雜合蛋白的宿主將優選酵母。用于本發明方法中的酵母包括在畢赤酵母屬內。特別感興趣的是畢赤酵母屬P.pastoris。P.pastoris株的一個實例是X-33。
P.pastoris能夠通過誘導產生乙醇氧化酶代謝甲醇，因為它是其唯一碳源(Cregg，1993)。大多數P.pastoris表達株具有一種或多個營養缺陷型的突變株，可在轉化中允許選擇含有合適可篩選標記物基因的表達載體。在轉化前，這些菌株生長在復合培養基中，但在限制性培養基中生長需要添加合適的營養物。本發明的P.pastoris株包括那些以野生型(Mut+)的速率生長在甲醇中的菌株，也包括那些根據利用甲醇的能力而變化的菌株，因為缺失了一個或兩個AOX基因。也可考慮的是蛋白酶缺陷的菌株，它可有效的減少外源蛋白的降解(Brierley，1998；和W等人，1995)。
為實施本發明選擇合適的酵母和其他微生物宿主包含在本領域專業技術人員的范圍內。當選擇表達的酵母宿主時，合適的宿主尤其包括那些顯示良好的分泌能力，較低的蛋白分解活性，和良好活力的菌株。酵母和其他微生物一般可從許多來源獲得，包括Yeast Genetic StockCenter，生物物理學和醫學物理學系，加利福尼亞大學(Berkeley，CA)；American Type Culture Collection(Manassas.VA)；NorthernRegional Research Laboratories(Peoria，IL)；和供應商如Invitrogen(San Diego，CA)。
B.酵母表達載體用于本發明的表達載體含有achimeric基因(或表達基因盒)，設計在酵母中操作，在表達基因盒的上游和下游有伴隨序列。伴隨序列可以是質粒或病毒來源的，可對載體提供必須的特性，使載體能夠將DNA從細菌轉移至所需的酵母宿主中。合適的轉化載體如下所述。表達質粒的合適成分，包括轉錄和翻譯起始密碼子，信號序列，雜合IFN的編碼序列，和合適的轉錄和翻譯終止密碼子也在下面討論。一個實例構建物是在圖5A-5C中顯示的pPICZα-HVV質粒序列。
i.轉錄&翻譯起始密碼子本發明的核苷酸序列當可操作地連接于酵母啟動子時，可用于在酵母宿主細胞中產生生物學活性的成熟的目的異源蛋白。以這種方式，提供了編碼發明的雜合前體多肽的核苷酸序列以表達基因盒的方式導入進酵母宿主細胞中。這些表達基因盒含有與編碼雜合前體多肽連接的轉錄起始區。這樣一種表達基因盒提供了多個限制性位點以在調控區的轉錄調控下插入核苷酸序列。
轉錄起始區，酵母啟動子提供了RNA聚合酶的結合位點以啟動編碼序列的下游(3’)翻譯。啟動子可以是結構性或誘導性啟動子，可以特殊酵母宿主天然的或類似的或外源性的或異源性的。另外，啟動子可以是天然的序列或可選擇性的是合成序列。關于外源意指在被導入了轉錄起始區的目的天然酵母中未發現轉錄起始區。
合適的天然酵母啟動子包括但不限于，野生型α因子啟動子，在下面詳述，以及其他酵母啟動子。優選啟動子選自下面所列的，包括P.pastoris甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAP)，甲醛脫氫酶(FLD1)，過氧化酶基質蛋白(PEX8)，和編碼YPT1啟動子的GTP酶。更優選的啟動子是乙醇氧化酶AOX1啟動子。
a.AOX1啟動子盡管畢赤編碼兩個乙醇氧化酶基因AOX1和AOX2，AOX1基因對于酵母細胞中大多數乙醇氧化酶活性是很重要的(Tschopp等人，1987；Ellis等人，1985；和Cregg等人，1989)。AOX1基因的表達嚴格地受AOX1啟動子轉錄的水平控制。在甲醇中生長的細胞中，約5％poly(A)+RNA來自AOX1；但在生長在大多數其他碳源中的細胞中，無法檢測到AOX1的信息(Cregg等人，1988)。
AOX1基因的調控似乎涉及兩個機制抑制/脫抑制機制以及誘導機制，類似于釀酒酵母GAL1基因的調節。不象GAL1的調節，缺少抑制的碳源，如培養基中的葡萄糖，不能引起AOX1的實際轉錄。甲醇的存在對誘導高水平轉錄是很必要的(Tschopp等人，1987)。
b.GAP啟動子Northern和報告子活化的結果均表明P.pastoris GAP基因啟動子可在葡萄糖中提供很強的結構性表達，其水平可與AOX1啟動子所觀察到的相比(Waterham等人，1997)。在甘油和甲醇生長細胞中GAP啟動子活性水平大約分別為葡萄糖中所觀察到的水平的三分之二和三分之一。使用GAP啟動子的優勢是對于誘導甲醇是不需要的，在從一種碳源至另一種的培養變換中也是不需要的，使菌株的生長更為順利。但因為GAP啟動子是結構性表達的，可能不是產生對酵母有毒性的蛋白的很好的選擇。
c.FLD1啟動子FLD1基因編碼谷胱甘肽依賴的甲醛脫氫酶，它是某些甲基化胺作為氮源和甲醇作為碳源的代謝所需的關鍵酶(Shen等人，1998)。FLD1啟動子的誘導可以甲醇作為單一碳源(和硫酸銨作為氮源)或甲胺作為單一氮源(和葡萄糖作為碳源)。用甲醇或甲胺誘導后，PFLD1能夠表達β-內酰胺酶報告子基因的水平類似于AOX1啟動子用甲醇誘導后獲得的水平。FLD1啟動子使用甲醇或甲胺，一種便宜的非毒性氮源，對誘導高水平的表達提供了一定的靈活性。d.PEX8和YPT1啟動子對于一些P.pastoris株，AOX1，GAP，和FLD1啟動子可以是非常強的，可以非常高的水平表達基因。有證據表明，對某些外源基因，來自PAOX1的高水平表達可超過細胞的翻譯后加工，導致顯著比例的外源蛋白未被折疊，未被加工或未被定位(Thill等人，1990；Brierley，1998)。對于這些和其他的應用，需要適度表達的啟動子。對于這種目標，可使用P.pastoris PEX8和YPT1啟動子。PEX8基因編碼過氧化物酶生物合成過程中很重要的過氧化物酶基質蛋白(Liu等人，1995)。它以很低但非常明顯的水平在葡萄糖中表達，并當細胞轉移至甲醇中時被適度誘導。YPT1基因編碼參與分泌的GTP酶，其啟動子可提供在含有葡萄糖，或甲醇或甘露醇作為碳源的培養基中較低但基本水平的表達(Sears等人，1998)。
e.可選擇的啟動子含有可提供誘導性表達的一種酵母啟動子的上游激活物序列和另一種酵母啟動子的轉錄活化區的合成雜合啟動子也可在酵母宿主中作為功能性啟動子。
酵母識別啟動子也可包括天然非酵母啟動子，它與酵母RNA聚合酶結合，并啟動編碼序列的翻譯。這樣的啟動子在本領域中是可以獲得的。見，如Cohen等人(1980)；Mercereau-Puigalon等人(1980)；Panthier等人(1980)；Henikoff等人(1981)；和Hollenberg等人(1981)，每一篇文獻在此合并為參考文獻。
ii.信號序列和引導序列除了編碼目的蛋白，表達基因盒的嵌合基因可編碼信號肽，后者適當時可加工和易位雜合的IFN蛋白。
為了本發明的目的，信號肽是一種前體序列，它是一種酵母分泌蛋白成熟形式的前體多肽的N末端序列。當編碼雜合前體多肽的核苷酸序列在被轉化的酵母宿主細胞中表達時，信號肽序列的功能是含有成熟異源目的蛋白的雜合前體多肽進入內質網(ER)中。移動進入內質網腔內代表進入了酵母宿主細胞的分泌通路的起始步驟。發明的信號肽可以是酵母宿主細胞異源的或天然的。發明的信號肽序列可以是已知的天然信號序列或如上所述的不反向影響信號肽功能的其任何變異體。
在進入ER的過程中，信號肽在加工的位點被切斷為前體多肽。加工的位點含有在體內可被酵母蛋白水解酶識別的任何肽序列。這種加工位點可以是信號肽的天然加工位點。更優選的是，天然加工位點可被修飾，或加工位點可以是合成來源的，以便稱為優選的加工位點。就所要獲得的“優選的加工位點”而言，在體內被酵母蛋白水解酶切斷的加工位點較天然位點更為有效。優選的加工位點的實例包括但不限于二元肽，特別是兩種堿性殘基Lys和Arg的任何組合，即Lys-Lys，Lys-Arg，Arg-Lys，或Arg-Arg，更優選Lys-Arg。這些位點可被P.pastoris KEX2基因編碼的肽鏈內切酶切斷(Julius等人(1983)。其結果是KEX2肽鏈內切酶將在肽序列內部切斷獲得成熟的目的異源蛋白，可使用其他優選的加工位點，這樣目的肽序列仍然是完整的(見如Sambrook等人(1989))。
功能性信號肽序列對異源蛋白從酵母細胞的細胞外分泌是非常重要的。另外，雜合的前體多肽可含有酵母分泌蛋白的分泌前導肽序列以進一步加速這種分泌過程。當存在時，前導肽一般立即定位在信號肽序列加工位點的3’。就要獲得的“分泌前導肽序列”而言，可引導前體多肽移動的肽，對于本發明的目的來說，是含有要被分泌的成熟異源蛋白的雜合前體多肽，從ER移動至高爾基體，從那里在移動至分泌小泡中，使其經過細胞膜分泌至細胞壁區域中和/或生長培養基中。前導肽序列對酵母宿主細胞來說可以是天然的或異源的。
本發明的前導肽序列可以是可作為信號肽序列來源的同一酵母分泌蛋白的天然序列，不同的酵母分泌蛋白的天然序列，或合成的序列，或不反向影響前導肽功能的任何其變異體。
a.釀酒酵母α-因子prepro肽為了本發明的目的，當存在時，前導肽序列優選來自可作為信號肽序列來源的同一酵母分泌蛋白，更優選是來自α因子蛋白。大量編碼前體α-因子蛋白的基因已經被克隆，其組合的信號-前導肽序列也已被鑒定。見，例如Singh等人(1983)。α-因子信號-前導肽序列已經被用來在酵母中表達異源蛋白。見，例如Elliott等人(1983)；Bitter等人(1984)；和Smith等人(1985)。
α-因子，大約長度為11個殘基的雜交了信息素的寡肽，可從更大的前體多肽中產生，其長度為大約100和200個殘基之間，更典型是大約120-160個殘基。這種前體(pre)多肽含有信號序列，大約19-23(更典型地20-22個殘基)，前導序列(pro)，大約60-66個殘基，典型地是成熟的信息素序列的2-6個串聯重復區。盡管可使用信號肽序列和全長的α因子前導肽序列，發明也可考慮縮短的α因子前導肽序列，當兩種元件均存在于雜合前體分子中時可與信號肽一起使用。
這種信號序列的加工涉及三個步驟。第一個步驟是通過內質網中的信號肽酶去掉pre信號。第二步，Kex2肽鏈內切酶在pro前導序列的Arg-Lys之間切斷。如果存在，則通過Stel3蛋白迅速切斷Glu-Ala重復區(Brake等人，1984)。
當本發明的雜合前體多肽序列含有前導肽序列時，如α因子前導序列，就有一個與前導肽序列的3’末端緊緊相鄰的加工位點。當存在目的成熟異源蛋白時，這個加工位點可使酵母宿主細胞固有的蛋白水解酶從其天然N末端前肽序列的5’末端，或從成熟的異源雜合IFN的肽序列5’末端切掉酵母分泌前導肽序列。加工位點可含有在體內可被酵母蛋白水解酶識別的任何肽序列，這樣目的成熟異源蛋白可被正確地加工。這個加工位點的肽序列可以是前導肽序列天然加工位點的天然肽序列。更優選的，天然加工序列可被修飾，或加工位點可通過合成獲得，以便稱為如上所述的優選加工位點。
b.可選擇的信號序列適合的信號序列也包括P.pastor/s酸性磷酸酶(PHO1)和來自植物凝集素菜豆凝集素的PHA-E(Cereghino和Cregg，2000；和Raemaekers等人，1999)。另外，信號序列可以通過合成獲得，或采用本領域已有的雜交探針技術從基因組或cDNA文庫中確定(見Sambrook等人，(1989)。
根據上面所述的發明，酵母信號肽和分泌前導肽序列代表了發明的雜合前體多肽的一些部分，這些部分可引導成熟的異源IFNαD的序列通過酵母宿主細胞的分泌通路。
iii.雜合IFN肽編碼序列雜合IFN編碼序列的實例在表2-HVV中顯示。編碼序列的起始點在實例1中討論，在圖1-4中說明。
合適時，編碼雜合IFN肽的核苷酸序列和任何其他的目的核苷酸序列可被優化以增加在轉化酵母中的表達。即，為提高表達這些序列可采用酵母優選的密碼子合成核苷酸序列。本領域中有許多適合合成酵母優選的核苷酸目的序列的方法(見，如美國專利第5,219,759和5,602,034，在此整體合并為參考文獻)。
其他的序列修飾已知可在酵母宿主中增強核苷酸編碼序列的表達。這些包括消除編碼假多腺苷酸化信號，外顯子-內含子剪接位點信號，轉座子樣重復區的序列和其他類似特性的對基因表達不利的序列。序列的G-C含量可被調整至特定細胞宿主的平均水平，可根據宿主細胞中表達的已知基因的參照來計算。可能時，核苷酸編碼序列可被修飾以避免預計形成的發夾二級mRNA結構。
iv.轉錄和翻譯終止子表達基因盒的終止調控區可以是轉錄起始區所固有的，或來自其他來源，如果它可被酵母宿主識別。終止區可以是天然α因子轉錄終止序列的，或是另一個酵母識別終止序列的，如上面提到的酶的區域。可選擇轉錄終止區，特別是為了mRNA的穩定性，以增強表達。
優選轉錄終止子是Mat-α(α-因子)轉錄終止子。更優選的轉錄終止序列是如圖1所示的AOX1轉錄終止區。
v.可選擇的標記物可選擇的標記物包括來自P.pastoris或S.cerevisiae的生物合成通路基因HIS4，來自S.cerevisiae的ARG4，和來自Streptoalloteichus hindustanus的Sh ble基因，可賦予對博來霉素相關藥物Zeocin的抗性(Cregg等人，1985；Cregg和Madden，1989；和Higgins等人，1998)。最近開發的一系列生物合成標記物包括P.pastoris ADE1(PR-氨基咪唑琥珀酰咪唑羧酰胺合成酶)，ARG4(精氨酰琥珀酸鹽裂解酶)，和URA3(乳清酸核苷5'-磷酸脫羧酶)基因。
vi.構建轉化載體對于異源雜合IFN蛋白的情況，在雜合前體多肽中存在的每種其他元件可以是已知的天然多肽序列或可通過合成獲得，包括如在此所述的不反向影響元件功能的任何其變異體。就“反向影響”而言，是指相對于含有元件天然形式的雜合前體多肽，含有元件變異體形式可導致分泌的目的成熟異源蛋白的生物活性降低。
在制備表達基因盒的過程中，可操作多個核苷酸序列片段，以便以正確的方向，適當時，在正確的可讀框架內提供序列。為了這個目標，可使用接頭或連接子來連接核苷酸片段或其他操作，涉及提供方便的限制性位點，去掉多余的核苷酸，去掉限制性位點，或類似操作。為此目的，可涉及體外誘變，引物修復，限制，復性，再取代，如轉換和顛換。特別地參見Sambrook等人(1989)。
本發明的表達基因盒可被連接進復制子中(如，質粒，粘粒，病毒，微小染色體)，因此形成了能在體內自我DNA復制的表達載體。優選的復制子是質粒。這樣的質粒可在一套或多套復制系統中保留，優選兩套復制系統，可使原核細胞宿主中獲得穩定的生存以進行克隆，在酵母宿主細胞中整合以進行表達。
另外，質粒表達載體可以很高或很低的質粒拷貝數目被整合。含有多個已整合拷貝的表達基因盒的菌株有時可較單一拷貝菌株產生更多的異源蛋白(Clare等人，1991)。
B.轉化酵母細胞酵母細胞用上述的表達構建物轉化，使用多種標準的技術包括但不限于，電穿孔，微粒轟擊，原生質球生產法，或整細胞的方法，如涉及氯化鋰和聚乙二醇的方法(Cregg等人，1985；Liu等人，1992；Waterham等人，1996；和Cregg和Russell，1998)。
C.培養和獲得分泌的雜合IFN蛋白轉化株生長在合適的營養基中，適當時，可在選擇的壓力下維持生長以保證保留內源DNA。當表達是誘導性的時候，酵母宿主生長產生高密度的細胞，然后誘導表達。實例的雜合IFN蛋白，HVV的重組產生在實例2中描述。HVV的部分純化在實例3中描述。
本發明的一個重要的方面，已經發現轉化的P.pastoris能夠表達和分泌雜合的IFN蛋白，它的特異活性如在實例4中所公開的在大約2.75×108U/mg至大約3×108U/mg之間。特異活性的測定可通過本領域專業技術人員已知的抗病毒試驗來進行。抗病毒試驗的實例在實例5中進行描述。另一個抗病毒試驗的描述見Pontzer和Johnson，1985，在此整體合并為參考文獻。
D.分離分泌的人IFNαD作為畢赤pastoris中的一種分泌蛋白，表達rHulFNαD的主要優勢之一是畢赤酵母分泌至培養基中的污染天然蛋白的水平非常低。組合使用具有很低蛋白含量的最小限制畢赤酵母培養基，可引起有生物學活性的rHulFNαD有效地分泌，它構成了培養基中總蛋白的絕大部分。
實質上，這種分泌表達系統的真正特性僅可使蛋白分泌至培養基中，作為純化過程中的第一步。這樣形成了直接和簡單的步驟以進一步使用如分子篩和離子交換色譜，電泳，透析，溶劑-溶劑提取，和類似方法進行純化。這種方法在本領域中是已知的，其描述例如見Deutscher，1990和Scopes，1982。
如在實例3中所述，經過一輪分子篩色譜實質上可消除高分子量的污染蛋白，留下非常純的雜合IFN(圖8)，具有非常高的抗病毒活性。
IV.應用本發明的雜合IFN蛋白發現可用于治療多種癌癥和病毒疾病包括以前其他干擾素顯示有活性的那些疾病。見，例如美國專利第4,885,166,4,975,276,和5,939,286，每一篇在此都整體合并為參考文獻。本發明考慮治療的病毒疾病的一個實例是丙型肝炎病毒(HCV)。
HCV是一種主要的公共健康難題，影響全世界估計1.7億人，以及一些國家超過10％的人群(Lechner等人，2000)。HCV基本通過輸注已感染的血液和血液制品而被傳播(Cuthbert，等人，1994；Mansell等人，1995)。疾病控制和預防中心估計在美國每年有160,000個急性肝炎新發病例是HCV引起的。因此，對有效的抗HCV藥物仍存在著急迫的醫療需求。
HCV是一種黃病毒家族的正義鏈，脂質包被的RNA病毒，長度大約為10000個核苷酸(Choo等人，1989)。不象乙型肝炎病毒，HCV沒有DNA中間體，因此不能被整合進宿主基因組中(Berenguer等人，1996)。盡管HCV已經被克隆，氮病毒仍然很難在體外培養(Trepo，2000)。HCV幾乎是持久存在的，在被感染的個體中產生85％的慢性感染，盡管其持久性的機制還未知(Trepo，2000)。
治療HCV主要著重于減少炎癥和肝細胞損害，因此可防止肝硬變和肝細胞癌(Horiike等人，1998；Benvegnu等人，1998)。目前對于HCV可使用的治療方法僅對小部分已感染病人的亞群有效(Magrin等人，1994；Choo等人，1991；Choo等人，1989)。在美國1991年IFN-α被介紹用于慢性丙型肝炎的治療，日本是在1992年(Saito等人，2000)。但如上所述，使用產生臨床效應的足夠劑量的IFN-a(即，其量為大約1×106單位/治療和上述的量)通常與大量的嚴重副作用有關。
本發明雜合蛋白的更低的細胞毒性決定了它們可作為治療如HCV的疾病的引人注目的侯選者。
V.藥物組合物本發明的雜合干擾素融合蛋白可根據已知的方法配制以制備可應用的藥物組合物。含有干擾素或干擾素樣化合物的劑型以前已經有所描述。通常，本發明組合物的配制是有效量的雜合干擾素與合適的載體組合在一起以促進組合物的有效給藥。
用于這些治療中的組合物也可以各種形式。例如包括固體，半固體和液體劑量形式，如片劑，丸劑，粉末，液體溶液或懸液，脂質體，栓劑，可注射的和可輸注的溶液。優選的形式依賴于所需要的給藥和治療應用模式。組合物也優選包括本領域專業技術人員已知的傳統的藥物學可接受的載體和佐劑。優選，發明的組合物可以單位劑量的形式，通常以一天一次或多次的方式給與病人。
雜合的干擾素融合多肽或相關多肽，可以任何藥物學可接受的形式給與病人，如口服攝取，吸入，鼻內噴霧，靜脈，肌肉，病灶內或皮下注射。特別的是，用于其他干擾素化合物的組合物和方法可用于輸送這些化合物。
但本發明化合物的一個根本的優勢是，發明的雜合IFN蛋白的極低的細胞毒性。因為其低的細胞毒性，可能使用雜合干擾素組合物的濃度要高于通常其他干擾素化合物所應用的濃度(如，IFNα)。因此，考慮本發明的雜合干擾素組合物給藥的速度從大約5×104至2×107單位/天至大約5×107單位/天，或優選至大約1×108單位/天，或更為優選的至大約1×1010單位/天。在另一個實施例中，本發明的雜合干擾素組合物使用的劑量為大約5×1011單位/天，或優選大約5×1012單位/天。
優選高劑量用于全身用藥。當然，應該理解的是本發明的組合物和方法可與其他療法組合應用，例如利巴韋林。
利巴韋林(1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-咪唑羧酰胺)是一種嘌呤核苷類似物，已經發現可干擾病毒mRNA的合成，并在體內和體外抑制很寬范圍的RNA和DNA病毒的復制(Fernandez等人，1986；Balzarini等人，1991)。利巴韋林已經顯示可有效的使轉氨酶水平正常化，但對慢性丙型肝炎病人中血清HCV RNA滴度的活性很小(DiBisceglie等人，1992)。
但利巴韋林的有效作用是短暫的(Clarke，2000；Koskinas等人，1995)，并因為其嚴重的副作用，利巴韋林和IFN-α的聯合應用是很難被耐受的(Cotler等人，2000)。因此，利巴韋林和本發明的雜合IFN蛋白聯合應用是優于利巴韋林和天然IFN-α的聯合應用。
一旦病人的狀態發生改善，如果需要可以給予維持劑量。然后，以癥狀為函數，劑量或給藥的頻率或兩者都可減少至維持改善狀態的水平。當癥狀緩解至所需的水平，治療應該終止。但病人長時間內以任何疾病復發的癥狀為基礎，需要間歇療法。
從前面可以發現已滿足了發明的多種目的和特點。
VI.表2支持本發明所提供的序列
VII.實施例下面的實施例進一步說明了在此所述的發明，并不以任何方式來限制本發明的范圍。
實施例1HVV克隆策略HVV分子是一種雜合分子，它含有HulFNαD分子，C末端最后4個氨基酸被來自羊IFN-τ的10個6C末端氨基酸取代。得到的氨基酸編碼序列用于產生相應的DNA編碼序列，其密碼子選擇為在畢赤pastoris中表達已被優化。DNA編碼序列的構建可通過將寡核苷酸片段(長度大約為150個堿基對；圖1-4)連續克隆進稱為G2(Operon Technologies.Alameda，CA)的細菌載體中而被合成。4個150個堿基對片段的每一個(HVV Fragments 1-4)都通過連接重疊合成的寡核苷酸(長度<40bp)而被創建，所述的寡核苷酸設計具有特殊限制性酶5’或3’懸突以簡化克隆進載體的過程。
A.克隆步驟#1要切割的載體G2用酶切斷Xbal和BamHI連接的片段 片段1(圖1)
新載體的名稱G2HVV1 F1B.克隆步驟#2要切割的載體G2HW1 F1用酶切斷EcoRI和BamHI連接的片段 片段2(圖2)新載體的名稱G2HVV1 F2C.克隆步驟#3要切割的載體G2HVV1 F2用酶切斷Sac I和BamHI連接的片段 片段3(圖3)新載體的名稱G2HVV1 F3D.克隆步驟#4要切割的載體G2HVV1 F3用酶切斷EcoRI和BamHI連接的片段 片段4(圖4)新載體的名稱G2HVV1 F4E.最終檢查用酶切斷Sac IIHVV基因從G2HVV1F4載體中被切除，并連接進入pPICZ-α□載體(Invitrogen，San Diego)中，使用質粒上的Xhol和NotI位點。HVV-pPICZ-α構建物的序列在圖5A-5中描述。
實施例2P.pastoris中重組產生HVV已選擇的陽性P.pastoris HVV轉化株在BMGY培養基中生長過夜，然后細胞在BMMY含甲醇的培養基中被誘導，使用的OD600為2。培養物使用1ml 10％甲醇在誘導后24和48小時進行培養。培養72小時后，收獲整個培養上清液，無菌過濾，通過14％Tris-甘氨酸SDS-PAGE分析，用膠體金考馬斯染色(Novex，San Diego，CA)。來自pPICZα對照質粒轉化株的上清液用作陰性對照。結果在圖7中顯示，表明克隆HVV-6可產生最強的HVV表達。
實施例3HVV的純化圖8舉例說明了從P.pastoris上清液中部分純化HVV蛋白。培養上清液(20ml體積)用10mM Tris，150mM NaCI緩沖交換，并在負載至aHiPrep Sephacryl 26/60S-100尺寸分離柱之前濃縮至終體積2ml(Pre-fraction)。以1ml/min的速度收集在注射標本后的第一個120ml流出物，稱為餾分1。收集3個餾分，每個20ml，分別稱為餾分2，3和4。餾分2，3和4被濃縮至1，并在14％SDS-PAGE凝膠上泳動，用Novex膠體金蘭染色試劑盒染色。
實施例4HVV抗病毒特異活性HVV蛋白如實施例3所述，從HVV克隆16(圖7)P.pastoris重組培養上清液中使用尺寸分離凝膠色譜部分純化。來自4個不同的純化試驗中的餾分3(圖8)(標本IDS-0018；S-0019；S-0063；和S-0064)每個都濃縮至1ml，如下面實施例5所述測定每個標本的總蛋白濃度和抗病毒活性。結果在下面的表3中顯示。
表3HVV-16抗病毒特異活性
實施例5定量抗病毒試驗Madin Darby牛腎(MDBK)細胞在96孔變平底培養板中使用添加了10％胎牛血清(FBS)和抗生素的Eagle’s MEM生長至匯合。一旦細胞匯合，測定的培養基是添加了2％FBS和抗生素的Eagle’s MEM。VSV的激發病毒制劑預先對數連續稀釋液中進行檢測以測定最佳的工作稀釋度，在單獨孵育病毒過夜后(即16-24小時)對匯合的MDBK細胞得到100％CPE。VSV稀釋度的范圍是從10-1至10-6每50μl/孔，每個稀釋度使用4個重復的孔，在96孔板中的最終總體積為200μl/孔。根據可建立100％CPE的病毒的稀釋度，測定TCID50。現在，使用的種病毒具有106.5TCID50/ml。在測定中使用的感染病毒顆粒的實際數字是103.5TCID50/孔。
為了檢測干擾素，在去掉生長培養基之前，MDBK細胞生長至匯合，細胞用無菌PBS沖洗一次。然后加入作為對照的含有干擾素或沒有干擾素標本的培養基三份，使用上述的試驗培養基以100μI/孔，使用連續10倍的稀釋液(如10-1至10-10)。然后細胞在37℃孵育18小時。重組HulFNαA(Biosource Intl.，Camarillo，CA)可用作標準的干擾素對照。干擾素孵育步驟后，在向每孔加入100μl預定的病毒稀釋液@103.5TCID50/孔之前，細胞用PBS沖洗兩次。向干擾素處理的檢測孔和未處理的孔中加入病毒，并在37℃另外孵育16-24小時。然后從每孔中去到100μl培養基，用100μl0.2％中性紅溶液(Gibco-BRL)替代，在37℃孵育1小時。去掉所有培養基，在加入100μl酸性酒精(50％乙醇，1％乙酸)之前，輕輕用PBS沖洗2次。溶解染料的A550用Bio-Kinetics讀數儀(Bio-Tek Instruments，Winooski VT)讀數。采用下列的公式計算保護的百分比
1個抗病毒單位(U)被定義為50％的保護。干擾素效價(單位/ml)將以代表保護50％細胞單層的稀釋度(每0.1ml標本)的倒數進行讀數，乘以因子10。
一旦使用10倍稀釋范圍測定了干擾素的抗病毒單位/ml，這個數據被用來測定試驗中干擾素兩倍稀釋范圍(最大10倍稀釋)的起始稀釋度。這將使被檢測的干擾素獲得更準確的抗病毒單位/ml值。注意這種比色法是Crawford-Miksza and(1994)發表的測定法的一種改進。
實施例6在外周血單核細胞中體外毒性測定中檢測IFNα類似物HulFNα，OvIFNτ和IFN雜合蛋白的體外毒性可采用外周血單核細胞(PBMC)來比較。全血的淺黃色表層部分用PBS稀釋1∶4，并覆蓋在Nycoprep 1.077(Nycomed Pharma，Oslo，Norway)上。在20℃600×g離心20分鐘后，可在界面上形成帶的，使用吸管去掉。然后細胞用PBS沖洗1次，以5×105細胞/孔的濃度接種在96孔板中。接種后，細胞用2000U/ml至128,000U/ml的IFNα，IFNτ或IFN雜合蛋白處理，重復三次。孵育12天后，細胞可準備使用Annexin V測定(Pharmingen)進行檢測。注意這些測定是常規在實驗室中使用的，可給我們一致的，可信的定量結果。
Annexin V測定Annexin V是一個35-36kD的Ca2+依賴的磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸(PS)具有很高的親和性。在凋亡細胞中，細胞膜PS是從漿膜的內側轉位至外側小葉上。Annexin V結合的細胞正在經歷凋亡的早期，其膜PS是暴露的。因此，用Annexin V結合一種活力染料，亞丙基染色可鑒定早期的凋亡細胞。這種測定并不能區分已經經歷凋亡的細胞和壞死引起的已經死亡的細胞。
PBMC從3個孔中收獲，并如Pharmingen測定手冊中所規定的制備進行Annexin V測定。與Annexin V檢測試劑盒一起提供了所有細胞染色所需的試劑。獲得染色的細胞，使用Becton Dickinson FACScan和CellQuest軟件分析。重要的是要注意在PBMC群中有一定基礎水平的凋亡(Annexin V陽性，亞甲基陰性)和壞死(Annexin V和亞甲基均陽性)，每個供體這種個水平有輕微的不同。因此，未處理的細胞群用來確定凋亡和死亡細胞的基礎水平。每個標本的數據以特異細胞死亡百分比來表示(Annexin V+或亞甲基+)，使用下面的公式從獲得的總共10,000細胞進行計算
*注意當根據亞甲基染色計算％特異細胞死亡時，用亞甲基的值來替代Annexin V值。
實施例7用rHulFN□或rolFN□以1.5×105抗病毒U/ml孵育人PBMC(5×105/孔)12天。然后用AnnexinV-FlTC和亞甲基雙重染色。特異細胞死亡百分比采用下列的公式進行計算[(對照孔中％AV+或PI+細胞)/(處理孔中％AV+或PI+細胞)×100]。
表4以Annexin V陽性細胞為基礎的特異細胞死亡百分比
表5以亞丙基陽性細胞為基礎的特異細胞死亡百分比
實施例8通過流式細胞儀分析特殊細胞死亡的百分比圖9顯示了通過流式細胞儀分析的特異細胞死亡百分比。用rHulFNα或rolFNτ以1.5×105抗病毒U/ml孵育人PBMC(5×105/孔)9，10和12天，然后用AnnexinV-FITC和亞甲基雙重染色。使用下列公式計算特異細胞死亡百分比[(對照孔中％AV+或PI+細胞)/(未處理孔中％AV+或PI+細胞)×100]。圓柱和符號分別表示Annexin V和亞甲基的計算值。
在此說明書中所提到的所有出版物和專利申請均代表了發明所屬領域專業技術人員的水平。在此所有出版物和專利申請合并為參考文獻，其程度與每個單獨的出版物或專利申請被特別地和個別地指明作為參考文獻是相同的。
盡管本發明已經根據特殊的實施例進行了描述，但本領域專業技術人員應該理解的，各種改變和修飾是不背離本發明的精神的。
序列表<110>派普根公司<120>雜合的干擾素/干擾素Tau蛋白、組合物和使用方法<130>556008008WO00<140>Not Yet Assigned<141>Filed Herewith<150>US 60/311,866<151>2001-08-12<160>2<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>172<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>雜合干擾素<400>1Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met1 5 10 15Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser Pro Ser Ser Cys Leu Met Asp20 25 30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe35 40 45Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Ile50 55 60Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp65 70 75 80Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu85 90 95Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met100 105 110Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr
115 120 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val130 135 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu145 150 155 160Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn Ser Pro165 170<210>2<211>519<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>雜合干擾素<400>2tgtgatttgc cagagactca ctctttggac aacagaagaa ctttgatgct tttggcccaa60atgtctagaa tctctccatc ctcttgtttg atggatagac acgatttcgg tttcccacaa 120gaagaatttg acggtaacca attccaaaag gctcctgcta tttctgtttt gcacgagttg 180attcaacaaa ttttcaactt gttcaccact aaggactctt ctgctgcctg ggacgaagac 240ttgttggaca agttctgtac tgagctttac caacaattga acgacttgga ggcttgtgtt 300atgcaagagg agagagtcgg tgagacccca ttgatgaacg ctgattccat cttggctgtc 360aagaagtact tcagaagaat taccttgtac ttgaccgaaa agaagtactc cccatgtgcc 420tgggaagtcg ttagagccga aatcatgaga tctttgtcct tgtccactaa cttgcaagag 480agacttacca agatgggtgg agacttgaac tctccataa 519
權利要求
1.一種干擾素/干擾素-τ雜合蛋白，包括干擾素蛋白，其中所述干擾素蛋白的C-末端區被干擾素-τ的C-末端區置換，其中，雜合蛋白相對于干擾素蛋白具有較低的細胞毒性。
2.權利要求1中的雜合蛋白，其中所述的干擾素蛋白是I型干擾素蛋白。
3.權利要求2中的雜合蛋白，其中所述的I型干擾素蛋白是干擾素-α。
4.權利要求3中的雜合蛋白，其中所述的干擾素-α蛋白是人干擾素-α。
5.權利要求4中的雜合蛋白，其中所述的人干擾素-α是人干擾素-αD。
6.權利要求1中的雜合蛋白，其中所述的干擾素蛋白中大約0-30個氨基酸之間的C-末端被置換。
7.權利要求6中的雜合蛋白，其中所述的干擾素蛋白中大約0-10個氨基酸之間的C-末端被置換。
8.權利要求7中的雜合蛋白，其中所述的干擾素蛋白的最后4個氨基酸的C-末端被置換。
9.權利要求5中的雜合蛋白，其中所述的所述人干擾素-αD的C-末端區對應于跨度163-166殘基的序列。
10.權利要求1中的雜合蛋白，其中所述的干擾素-τ的C-末端區對應于跨度干擾素-τ163-172殘基的序列。
11.權利要求1中的雜合蛋白，其中所述的干擾素蛋白是人干擾素-αD，所述人干擾素-αD的所述C-末端區跨度163-166殘基，所述干擾素-τ的C-末端區對應于跨度干擾素-τ163-172殘基的序列。
12.權利要求1中的雜合蛋白，其中所述的雜合蛋白相對于干擾素蛋白具有較低的細胞毒性。
13.權利要求1中的雜合蛋白，其中所述的雜合蛋白在MDBK/VSV抗病毒系統中具有至少大約1×108抗病毒單位/mg的抗病毒活性。
14.權利要求1中的雜合蛋白，其中所述的I型干擾素是干擾素-β。
15.權利要求1中的雜合蛋白，其中所述的干擾素-τ是羊或牛干擾素-τ。
16.權利要求1中的雜合蛋白，其中所述的雜合蛋白是長效的(pegylated)。
17.編碼按照權利要求1-16中任一項的雜合蛋白的核酸分子。
18.制造干擾素雜合蛋白的方法，包括將按照權利要求17的核酸分子置于重組表達系統中；影響核酸分子的表達以產生雜合蛋白；和回收雜合蛋白。
19.權利要求18中的方法，其中所述的重組表達系統包括P.pastoris。
20.一個藥物組合物，包括按照權利要求1的雜合蛋白，和藥學上可接受的載體。
21.權利要求20中的組合物，其中所述的組合物進一步含有病毒唑。
22.一種在感染病毒的細胞中抑制病毒復制的方法，包括將細胞與按照權利要求1的雜合蛋白以有效抑制病毒在細胞內復制的劑量接觸。
23.一種抑制腫瘤細胞生長的方法，包括將細胞與按照權利要求1的雜合蛋白以有效抑制其生長的劑量接觸。
24.一種治療患者自體免疫疾病的方法，包括以有效治療該疾病的劑量給予患者按照權利要求1的雜合蛋白。
25.一種治療患者慢性炎癥的方法，包括以有效治療炎癥的劑量給予患者按照權利要求1的雜合蛋白。
26.一種治療對干擾素有反應的疾病狀態的方法，包括以有效治療該疾病狀態的劑量給予患者按照權利要求1的雜合蛋白。
27.權利要求22-26中的任何方法，其中所述的給藥通過以下給藥方法進行口服、局部、吸入、經鼻和注射。
全文摘要
本發明涉及由干擾素－α蛋白組成的雜合干擾素融合蛋白，其中干擾素－α蛋白的C－末端區被干擾素－τ的C－末端區置換。還描述了編碼干擾素融合蛋白的核酸序列，含這種序列的表達載體，和干擾素融合蛋白的治療應用。治療應用包括抗病毒、抗細胞增殖和抗炎應用。本發明的干擾素融合多肽的一個優勢是在用于治療細胞時具有較低的細胞毒副作用。
文檔編號C07K19/00GK1568369SQ02819937
公開日2005年1月19日 申請日期2002年8月12日 優先權日2001年8月12日
發明者L·H·維拉雷特, J·坎波斯, W·李 申請人:派普根公司