在真核細胞中生產重組蛋白的方法

專利名稱：在真核細胞中生產重組蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及培養真核細胞的方法和在這種細胞的大規模或工業規模培養物中生產重組蛋白的方法。
背景技術：
微載體培養在細胞培養領域中廣泛使用。在微載體培養中，細胞或者通過連接固定到固體微載體表面，或者通過連接或物理包埋固定到大孔微載體內部結構上或其內部。當使用微載體培養時，需要在收集培養上清的同時將攜帶細胞的載體保留在培養容器中的方法。一種基于微載體的方法類型是連續灌注法，其中不斷收集培養上清并且不斷添加新培養基。在這個方法類型中，通常通過重力沉淀器或培養容器中內部過濾器來保留微載體。另一種基于微載體的方法類型是半連續方法，其中有規律間隔進行分批式收集培養上清和添加新培養基。在這個方法類型中，通過停止培養容器內的攪拌器，使攜帶細胞的載體沉淀到容器底部，可很容易保留微載體。當含細胞的載體沉淀后，收集部分培養上清并用新培養基替換，其后再次開始攪拌。然而，沉淀過程中不攪拌會使細胞缺乏氧氣或營養。本發明提供了改良方法，它提高了細胞對于沉淀在容器底部時的狀況的承受能力，因此對培養物的總體性能具有積極的作用。
發明概述本發明提供了培養細胞的改良方法，尤其是生產期望多肽的方法，其特征在于它包括在載體沉淀和收集含產物的培養上清之前的冷卻步驟。
在一個方面，本發明提供了在真核細胞中生產多肽的方法，包括步驟(i)在適合所述多肽表達的條件和設定點溫度下培養微載體上的表達所述多肽的細胞；(ii)將培養物冷卻到低于所述設定點的預定溫度；(iii)沉淀微載體；和(iv)收集全部或部分培養基。
在一些實施方案中，該方法進一步包括在所述收集后向培養容器中添加新鮮培養基的步驟。
在一些實施方案中，該方法進一步包括從收集的培養基中回收所述多肽的步驟。
在另一個方面，本發明提供了真核細胞的培養方法，包括步驟(i)在適合維持培養物的條件和設定點溫度下培養微載體上的細胞；(ii)將培養物冷卻到低于所述設定點的預定溫度；(iii)沉淀微載體；和(iv)收集全部或部分培養基。
在一些實施方案中，該方法進一步包括在所述收集后向培養容器中添加新鮮培養基的步驟。
在一些實施方案中，該方法是一種大規模或工業規模方法。
本發明的另一個方面提供了收集由在微載體培養中生長的真核細胞產生的多肽的方法，所述方法包括(i)將培養物冷卻到低于培養設定點的預定溫度，隨后(ii)沉淀微載體。
在一些實施方案中，在允許微載體沉淀前，使培養物從生長溫度冷卻到低于培養設定點溫度約5℃-30℃的溫度，或低于設定點約5℃-20℃的溫度，或低于設定點約5℃-15℃的溫度，或低于培養設定點溫度約5℃、10℃、15℃或20℃的溫度。
在一些實施方案中，在允許培養物沉淀前，使培養物冷卻到約18℃-32℃，或約20℃-30℃，或約22℃-28℃，或約24℃-28℃，或約25℃-27℃。
在一些實施方案中，使用的細胞是昆蟲細胞。在一些實施方案中，使用的細胞是哺乳動物細胞。在其中的一些實施方案中，使用的細胞是BHK細胞；在其它實施方案中，所述細胞是CHO細胞；在其它實施方案中，所述細胞是HEK細胞；在其它實施方案中，所述細胞是COS細胞；在其它實施方案中，所述細胞是HeLa細胞。優選的是BHK和CHO細胞，尤其是CHO細胞。
在一些實施方案中，所述微載體是固體載體；在一些實施方案中，所述微載體是大孔載體；在一些實施方案中，所述微載體是具有表面正電荷的大孔載體。
在一些實施方案中，所述細胞產生期望的多肽，尤其是凝血因子，最優選人因子VII或人因子VII相關多肽，包括但不限于，野生型因子VII，L305V-FVII，L305V/M306D/D309S-FVII，L305I-FVII，L305T-FVII，F374P-FVII，V158T/M298Q-FVII，V158D/E296V/M298Q-FVII，K337A-FVII，M298Q-FVII，V158D/M298Q-FVII，L305V/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII，V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII，K157A-FVII，E296V-FVII，E296V/M298Q-FVII，V158D/E296V-FVII，V158D/M298K-FVII，S336G-FVII；S52A-因子VII，S60A-因子VII；R152E-因子VII，S344A-因子VII，缺乏G1a結構域的因子VIIa；和P11Q/K33E-FVII，T106N-FVII，K143N/N145T-FVII，V253N-FVII，R290N/A292T-FVII，G291N-FVII，R315N/V317T-FVII，K143N/N145T/R315N/V317T-FVII；和在氨基酸序列233Thr至240Asn中具有置換、插入或缺失的FVII，在氨基酸序列304Arg至329Cys中具有置換、插入或缺失的FVII。
在一些實施方案中，表達的蛋白質是人因子VII。在其它實施方案中，表達的蛋白質是與野生型FVII相比生物活性基本相同或提高的因子VII。在其它實施方案中，表達的蛋白質是與野生型FVII相比生物活性得到修飾或降低的因子VII相關多肽。在其它實施方案中，表達的蛋白質是FVIII、FIX、FX、FII、蛋白C、纖溶酶原激活物(t-PA，u-PA)、PDGF、VEGF、生長激素、胰島素、白介素、干擾素或抗體或所述蛋白質的片段。
在一些實施方案中，培養的真核細胞是重組細胞，其中轉化或轉染了由體外基因重組制備的載體。在一些實施方案中，細胞是表達內源性因子VII基因的人細胞。
在一些實施方案中，期望多肽以至少約15mg/L培養物的水平產生。
在一些實施方案中，實施本發明所使用的細胞是通過細胞粘附而附著在固體載體表面或大孔載體內部結構里面的貼壁依賴性細胞。在其它實施方案中，實施本發明所使用的細胞是通過物理包埋而滯留在大孔載體的內部結構里面的懸浮細胞。
在特別優選的實施方案中，宿主細胞是已經改造而表達人因子VII或人因子VII相關多肽和已經適應在缺乏血清或其它動物來源成分下生長的BHK21或CHO細胞。
在一組實施方案中，培養基是缺乏動物來源成分的培養基。在其它實施方案中，培養基缺乏動物來源成分和蛋白(“無蛋白”)。
在一個實施方案中，細胞是CHO細胞，多肽是人因子VII，載體是大孔載體，培養基是無動物來源成分的無蛋白培養基，細胞是CHO細胞，培養溫度設定點是大約36℃，載體沉淀前培養物冷卻到的溫度是大約26℃。


圖1圖示了FFF 1235，FFF 1239和FFF 1242培養物中的FVII滴度(概述在500L培養容器內，在Cytopore載體上培養CHO細胞)。
圖2至圖4顯示了FFF 1235，FFF 1239和FFF 1242培養物中的細胞計數和FVII滴度FFF 1235，細胞計數和FVII滴度(圖2)；FFF1239，細胞計數和FVII滴度(圖3)；和FFF 1242，細胞計數和FVII滴度(圖4)。
發明詳述本發明提供了基于微載體培養真核細胞的方法，尤其是用于以大規模或工業量生產這種細胞表達的期望多肽。培養方法類型是基于微載體的方法類型，載體沉淀后分批式收集培養上清。
已經發現在含細胞的載體沉淀前進行冷卻步驟對培養的總體性能具有積極的作用。
不希望受科學理論的限制，據信冷卻步驟可增加細胞承受它們沉淀在培養容器底部時的狀況的能力。這繼而又對培養物的總體性能具有積極作用。在沉淀期間，500L培養容器中沉淀持續約一小時，不能進行氧氣控制，溶解氧的濃度迅速降低。
當使用這里所述的微載體方法時，載體沉淀前，培養容器的溫度控制環臨時失活；然而，對培養容器不進行主動冷卻。溫度控制環失活的唯一目的是防止細胞沉淀在培養容器底部時局部過分加熱。失活不會使培養容器實際冷卻，通常溫度降低少于1℃。已經發現利用根據本發明的冷卻步驟，冷卻到低于培養溫度設定點以下如10℃，例如冷卻到26℃，細胞的氧需求(由耗氧量測定)可降低大約50％。冷卻到20℃，細胞的氧需求降低大約75％。將培養物冷卻到低于培養溫度設定點的預定溫度(如，低于設定點約5℃-30℃，或約5℃-20℃，或約5℃-15℃，或約5℃、10℃、15℃或20℃)。
載體沉淀之前立即應用根據本發明的冷卻步驟。這里使用的“之前立即”是指當培養容器的內容物一冷卻至預定溫度時，就立即停止冷卻并停止攪拌容器，以允許含細胞的載體沉淀到容器底部。
通常的冷卻步驟持續時間需要10至240分鐘，如20至180分鐘，或30至120分鐘，這取決于培養容器的大小、期望降低的溫度和使用的冷卻方法；然而，任何冷卻步驟持續時間都包括在本發明中。因此，通常在使含細胞的微載體沉淀前約10-240分鐘開始冷卻步驟。例如，通過向培養容器夾套提供冷卻水，使500L培養容器的溫度從36℃的培養溫度降低至26℃，通常需要花費大約30分鐘；通過向培養容器夾套提供冷卻水，使5000L培養容器的溫度從36℃的培養溫度降低至26℃，通常也需要花費大約30分鐘。
通常步驟實施如下使培養容器的溫度控制環失活，并冷卻培養容器，例如使冷卻水通向培養容器夾套的閥門保持持續開啟。不斷監測溫度，當培養容器的內容物達到低于設定點溫度的預定溫度，如，低于培養設定點10℃，則停止冷卻。其后，停止攪拌培養容器，由此使含細胞的載體沉淀。沉淀后，收集部分培養上清或培養基，并且向培養容器中加入新鮮培養基來替換收集的培養基。在收集了培養上清和加入了新鮮培養基后，開始攪拌，通過激活溫度控制環，使溫度再次調整到培養設定點。加入的新鮮培養基通常預熱至接近培養設定點的溫度，如，至大約30℃，或高于之，依實際的設定點而定。
實施本發明時，可以使用任何冷卻培養物的有效方法。冷卻培養容器可以例如通過向培養容器夾套提供足夠時間的冷卻水直到達到期望溫度，或者可以給培養容器配備冷卻線圈，冷卻線圈可以單獨或與上述冷卻夾套聯合使用。
細胞培養程序在攪拌培養容器系統中實施本發明的細胞培養，并使用基于微載體的方法類型。在基于微載體的方法中，細胞已經遷移到載體(大孔載體)的內部結構內或它們已貼在載體(固體載體)表面，或二者皆有。在基于微載體的方法中，開始時將真核細胞、微載體和培養基提供到培養容器內。接下來幾天，如果培養體積未能從開始達到容器的最終工作體積，則可以補入另外的培養基。在接下來的時期，周期性收集含產物的培養上清并用新的培養基替換，直到培養最終終止。當收集含產物的上清時，停止攪動(如攪拌)培養基，使含細胞的載體沉淀，隨后取出部分含產物的培養基。
增殖步驟達到生產期之前，即有規律收集含產物的培養上清進行進一步下游加工之前，根據可能適合于所述具體細胞的任何方案或規則使細胞增殖。增殖期可以是單步驟或多步驟程序。在單步驟增殖程序中，從貯器中取出細胞并直接接種到將進行生產的含微載體的培養容器中。在多步驟增殖程序中，從存器中取出細胞并通過一系列尺寸不斷增加的培養容器增殖，直到到達將進行生產的含微載體的最終培養容器。增殖步驟期間，細胞在優化利于生長的條件下生長。培養條件，如溫度、pH、溶解氧等等是已知對該特定細胞最佳的，并且對本領域技術人員或熟練人員來說很明顯(如見Animal CellCultureA Practical Approach 2″d Ed.，Rickwood，D.andHames，B.D.，eds.，Oxford University Press，New York(1992))。
在本發明的一個實施方案中，細胞培養工藝在一個培養容器中操作將細胞直接接種到將進行生產的含微載體的培養容器中；使細胞增殖直到達到合適的細胞密度，啟動生產期。
本發明的另一個實施方案中，細胞培養工藝在至少兩個不同的培養容器中進行一個或多個種子培養容器(第一增殖步驟)，隨后是生產培養容器(最后增殖步驟后是生產期)。在第一增殖步驟中，將表達期望多肽的細胞接種到含培養基的種子培養容器并使之增殖，直到細胞達到最低交叉接種(cross-seeding)密度。隨后，將經過增殖的種子培養物轉移到含(a)培養基和(b)微載體的生產培養容器內。在這個培養容器中，在某條件下培養細胞，從而細胞遷移到固體載體表面上或大孔載體的外和內表面，并且它們繼續在大孔載體的外和內表面生長。在這個最后增殖步驟中，它們繼續生長，直到細胞完全定居到載體中。在這個最后增殖步驟期間，使微載體沉淀到培養容器底部，從而進行培養基更換，接著去除預定百分比釜體積的培養基，向容器中加入相應百分比釜體積的新鮮培養基。然后將微載體重新懸浮于培養基中，以預定間隔重復這個培養基去除和更換過程，例如每隔24小時。更換的培養基量依賴于細胞密度而定，通常可以是釜體積的10-95％，優選25％至80％，如下表1所示。
人們會理解在增殖期是多步驟程序的方法中，增殖可以在尺寸不斷增加的培養容器中進行，直到獲得足夠用于最后培養容器的細胞。例如，可以循序使用一個或多個5L、50L、或500L的種子培養容器。種子培養容器通常具有5L-1000L的容量。通常，細胞以大約0.2-0.4×106個細胞/mL的初始密度接種到種子培養容器內，使之增殖，直到培養物達到大約1. 0×106個細胞/mL的細胞密度。通常，最小交叉接種密度是0.8-1.5×106個細胞/mL。
適合生產期望多肽如因子VII的一些設定點并不必然適合細胞的最初生長，無論在種子培養中還是在微載體上都可能如此。例如，兩個時期的溫度、DOT(dissolved oxygen tension)和/或pH可能不同。在增殖期間進行培養基更換的目的是保持細胞存活和生長，而并非收集培養上清進行下游加工。
下表1概括了最終培養容器(含微載體)中用于最后增殖步驟的可能培養條件。

表1生產期當細胞密度達到適合開始生產期的值時，即，適合含產物培養上清進行下游加工時，每24小時收集60-95％培養上清，優選收集80％培養上清。通常此細胞密度值是1-12×106個細胞/mL。在此點可以改變設定點，并設置為適合生產期望多肽的值。
通過使微載體沉淀到釜底部來進行培養基更換，其后取出選定百分比釜體積的培養基，并向容器中加入相應百分比釜體積的新鮮培養基。通常更換25-90％釜體積；優選用新鮮培養基替換80％釜體積。接著使微載體重新懸浮于培養基中，通常每10至48小時重復此培養基取出和更換過程；優選每24小時進行。
表2顯示了此工藝的概要。

表2任選地，可以在進入生產期時和生產期期間使培養的溫度設定點下調。
當進入生產期時，通常將溫度、工作pH和培養基更換頻率改變為最優于生產的值。生長和生產期中溫度范圍和值的實例可分別見表1和2。對于CHO細胞系，生產期間優選大約36℃的溫度。
微載體這里使用的微載體是足夠小而能夠用于懸浮培養(伴有不對細胞引起明顯剪切損害的攪拌速度)的顆粒。它們是固體、多孔的，或表面覆蓋有多孔涂層的固體核心。微載體可以是例如但不限于基于纖維素或葡聚糖，并且它們的表面(在多孔載體情況下是外部和內部表面)可以帶正電荷。
在一組實施方案中，該微載體的總體顆粒直徑在大約150和350μm之間；并且正電荷密度為大約0.8-2.0meq/g。在一組實施方案中，微載體是固體載體。有用的固體微載體包括但不限于Cytodex 1TM和Cytodex 2TM(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway NJ)。固體載體尤其適合于貼壁細胞(貼壁依賴性細胞)。
在另一組實施方案中，微載體是大孔載體。這里使用的大孔載體是如基于纖維素的顆粒，它們具有下列性質(a)足夠小而能夠用于懸浮培養(伴有不對細胞引起明顯剪切損害的攪拌速度)；和(b)它們具有足夠大小的孔和內部空間而能夠使細胞遷移進入該顆粒的內部空間。在一個實施方案中，它們的表面(外表面和內表面)可以帶有正電荷。在一組實施方案中，該微載體(a)總體顆粒直徑在大約150和350μm之間；(b)具有平均開口直徑約15-40μm的孔；和(c)具有約0.8-2.0meq/g之間的正電荷密度。在一些實施方案中，正電荷由DEAE(N，N-二乙基氨基乙基)基團提供。有用的大孔載體包括但不限于Cytopore1TM和Cytopore2TM(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway NJ)。特別優選的是Cytopore1TM載體，其具有230μm的平均顆粒直徑，30μm的平均孔大小和1.1meq/g的正電荷密度。
大規模培養條件這里使用的大規模培養容器具有至少大約100L的容量，優選至少大約500L，更優選至少大約1000L，最優選至少大約5000L。在細胞培養工藝是在至少兩個不同培養容器中操作的情況下，如在一個或多個種子培養容器(第一增殖步驟)后有生產培養容器(最后增殖步驟后是生產期)，那么該方法通常包括將大約50L增殖種子培養物(大約1.0×106個細胞/ml)轉移到含150L培養基的500L培養容器中。在適當條件下維持大規模培養，適當的溫度、pH、溶解氧張力(DOT)和攪拌速度，通過向培養容器中加入培養基逐步來增加體積。在微載體工藝的情況下，培養容器也包括對應于1至10g/L微載體終濃度的量的微載體。轉移后，在最初24小時內，細胞通常遷移到載體表面或進入載體內部。術語“大規模工藝”可以與“工業規模工藝”互換使用。此外，術語“培養容器”可以與“釜”、“反應器”、“發酵罐”、“生物反應器”互換使用。
細胞在實施本發明時，優選培養的細胞是真核細胞，更優選已建立的真核細胞系，包括但不限于CHO(如ATCC CCL61)、COS-1(如ATCC CRL1650)、幼倉鼠腎細胞系(BHK)和HEK293(如ATCC CRL1573；Graham et al.，J.Gen.Virol.3659-72，1977)細胞系。優選的BHK細胞系是tk-ts13 BHK細胞系(Waechter和Baserga，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 791106-1110，1982)，以下稱作BHK 570細胞。BHK 570細胞系可從美國通常培養物保藏中心，12301 ParklawnDr.，Rockville，MD 20852得到，ATCC登記號CRL10314。tk-ts13BHK細胞系也可以從ATCC得到，登記號CRL 1632。
優選的CHO細胞系可從ATCC得到的CHO K1細胞系，登記號CC161。
其它適合的細胞系包括但不限于大鼠Hep I(大鼠肝細胞瘤；ATCCCRL 1600)，大鼠Hep II(大鼠肝細胞瘤；ATCC CRL 1548)，TCMK(ATCCCCL 139)，人肺(ATCC HB 8065)，NCTC 1469(ATCC CCL 9.1)；DUKX細胞(CHO細胞系)(Urlaub和Chasin，Proc Natl.Acad.Sci.USA 774216-4220，1980)(DUKX細胞也稱作DXB11細胞)，和DG44(CHO細胞系)(Cell，33405，1983，和Somatic Cell and Molecular Genetics12555，1986)。也有用的是3T3細胞，Namalwa細胞和骨髓瘤細胞以及骨髓瘤細胞與其它細胞的融合細胞。在一些實施方案中，該細胞可以是突變或重組細胞，如表達可催化蛋白質翻譯后修飾的酶(如，糖基化酶如糖基轉移酶和/或糖苷酶，或加工酶如前肽)在量或質上與它們所來源的細胞類型不同的細胞。合適的昆蟲細胞系也包括但不限于鱗翅目細胞系，如Spodoptera frugiperda細胞或Trichoplusiani細胞(如見US 5,077,214)。
在一些實施方案中，用于實施本發明的細胞能夠在懸浮培養物中生長。這里使用的能懸浮培養的細胞是可懸浮生長、而不會形成大的堅硬聚集體的那些細胞，即單分散的或以每個聚集體僅少量細胞的松散聚集體生長的細胞。能懸浮培養的細胞包括但不限于未經適應或操作即生長在懸浮液中的細胞(如造血細胞或淋巴細胞)和已經對貼壁依賴性細胞(如上皮或成纖維細胞)進行了逐步適應化而能進行懸浮生長的細胞。
用于實施本發明的細胞可以是貼壁細胞(也已知是固定依賴性或貼壁依賴性細胞)。這里使用的貼壁細胞是需要將自身粘貼或固定到合適表面來增殖和生長的那些細胞。在本發明的一個實施方案中，使用的細胞是貼壁細胞。在這些實施方案中，增殖期和生產期都包括微載體的使用。使用的貼壁細胞在增殖期間應該能夠遷移到載體上(和進入載體內部結構，如果使用大孔載體的話)，當轉移到生產生物反應器時能夠遷移到新的載體處。如果貼壁細胞自己不足以遷移到新的載體，則通過將含細胞的微載體接觸蛋白水解酶或EDTA可使它們從載體上釋放下來。使用的培養基(尤其是不含動物來源成分的培養基)應該還含有適合支持貼壁細胞的成分；適合培養貼壁細胞的培養基可從商業供應商獲得，如Sigma。
細胞也可以是適應懸浮或能夠懸浮的細胞。如果使用這種細胞，細胞的增殖可以在懸浮液中進行，因此僅在生產培養容器本身在最后增殖期和生產期使用微載體。在適應懸浮的細胞的情況下，使用的微載體通常是大孔載體，其中細胞通過物理包埋到載體內部結構里而貼壁。
培養基術語“細胞培養基”和“培養基”是指用于真核生物生長的營養溶液，其中通常提供一種或多種下列種類中的至少一種成分(1)有助于培養基重量摩爾滲透壓濃度的鹽如鈉、鉀、鎂和鈣鹽；(2)能量來源，通常是碳水化合物的形式如葡萄糖；(3)所有必需氨基酸，通常是二十個氨基酸的基本組；(4)以低濃度需要的維生素和/或其它有機化合物；和(5)微量元素，其中微量元素定義為通常需求濃度很低的無機化合物(通常在微摩爾濃度范圍)。該營養溶液可以任選補充下列任何種類中的一種或多種成分(a)動物血清；(b)激素和其它生長因子，如胰島素、轉鐵蛋白質和表皮生長因子；和(c)蛋白質和組織的水解產物。
本發明包括在含有動物來源成分(如血清或血清成分)的培養基以及缺乏動物來源成分的培養基中培養真核細胞。包括動物來源成分(如，胎牛血清(FBS))的細胞培養基可以含有5％以上血清或0-5％血清，如，0-1％血清或0-0.1％血清。優選缺乏動物來源成分的培養基。這里使用的“動物來源”成分是完整動物中產生的任何成分(如，從血清中分離和純化的蛋白質)，或使用完整動物中產生的成分而制備的任何成分(如使用從動物分離和純化的酶水解植物來源材料而制備的氨基酸)。相比之下，具有動物蛋白的序列(即具有動物基因組起源)，但在細胞培養物中體外生成的蛋白質不是“動物來源”成分，該體外生成是在缺乏完整動物中產生的、從完整動物分離和純化的成分的培養基中進行的(如，在重組酵母或細菌細胞或在已建立的連續真核細胞系中生成的，可以是重組體或非重組體)(如，酵母或細菌細胞中產生的胰島素，或已建立的哺乳動物細胞系，如CHO、BHK或HEK細胞中產生的胰島素，或Namalwa細胞中產生的干擾素)。例如，具有動物蛋白的序列(即具有動物基因組起源)、但在缺乏動物來源成分的培養基中在重組細胞內生成的蛋白質(如酵母或細菌細胞產生的胰島素)不是“動物來源成分”。因此，缺乏動物來源成分的細胞培養基可以含有重組產生的動物蛋白，然而，這種培養基不含有如動物血清或從動物血清中純化的蛋白質或其它產物。這種培養基可以含有例如一種或多種來源于植物的成分。可以使用本發明條件下支持細胞生長和維持的任何細胞培養基，尤其是缺乏動物來源成分的培養基。通常，該培養基含有水、重量摩爾滲透壓濃度調節劑、緩沖液、能源、氨基酸、無機或重組鐵源、一種或多種合成或重組生長因子、維生素和輔因子。在一個實施方案中，該培養基缺乏動物來源成分，并缺乏蛋白質(“無蛋白質”)。缺乏動物來源成分和/或蛋白質的培養基可從商業供應商得到，如，Sigma，JRH Biosciences，Gibco和Gemini。
除了常規成分，適合產生因子VII或因子VII相關多肽的培養基含有微生素K，它是因子VII中谷氨酸殘基γ羧化所需，濃度為大約0.1-50mg/升，優選大約0.5-25mg/升，更優選大約1-10mg/升，最優選大約5mg/升。
適合用于本發明的培養基可從商業供應商得到，例如Gibco和JRHBiosciences。
在一個實施方案中，培養基包括表3所示，并非必要地補充了一種或多種表4所示的成分。
下表(表3)是適合用于本發明培養基的組成。可以非必要地向培養基中加入表4所列的一種或多種成分。表4列出了優選范圍。在一個實施方案中，使用的培養基是318-X培養基；在另一個實施方案中，它是CHO-K培養基。


任選成分


表4在另一個實施方案中，使用的培養基具有下列組成(318-U培養基)



表5優選培養基是缺乏動物來源成分的培養基，或缺乏動物來源成分并缺乏蛋白的培養基(“無蛋白”)。
在一個實施方案中，培養基是商業可得到的缺乏動物來源成分的無蛋白CHO培養基(JRH Biosciences)，細胞系是CHO細胞。在一個實施方案中，培養基是318-X培養基，細胞系是BHK細胞系；在另一個實施方案中，培養基是318-U培養基，細胞系是BHK細胞系。在另一個實施方案中，培養基是CHO-K培養基，細胞系是CHO細胞系。
在一些實施方案中，用于實施本發明的細胞適應在缺乏動物來源成分的培養基如缺乏血清的培養基中懸浮生長。Schar-fenberg，et al.，Animal Cell Technology Developments towardsthe21stCentury，E.C.Beuvery et al.(Eds.)，Kluwer AcademicPublishers，pp.619-623，1995(BHK和CHO細胞)；Cruz，Biotechno/.Tech.11117-120，1997(昆蟲細胞)；Keen，Cytotechnol.17203211，1995(骨髓瘤細胞)；Berget al.，Biotechniques 14972-978，1993(人腎293細胞)描述了這種適應化步驟。在特別優選的實施方案中，宿主細胞是已經改造而表達人因子VI I并且已適應在缺乏血清或動物來源成分下生長的BHK21或CHO細胞。
培養容器培養容器可以是通過傳統葉輪型形式來完成攪拌的傳統攪拌釜反應器(CSTR)，或通過從容器底部引入空氣來完成攪拌的空氣提升式反應器。需要控制在指定范圍的參數是pH、溶解氧張力(DOT)和溫度。pH可以由如改變頂部空間氣體中二氧化碳(CO2)濃度和需要時向培養液體中添加堿來控制。溶解氧張力可以通過如噴入空氣或純氧或其混合物來維持。溫度控制介質是水，需要時加熱或冷卻。水可以通過環繞容器的夾套或通過浸入培養物中的管道圈。
加工步驟一旦從培養容器中取出培養基，即可對其進行一個或多個加工步驟以獲得期望蛋白，包括但不限于離心或過濾以去除沒有固定在載體上的細胞；親和層析、疏水相互作用層析；離子交換層析；大小排阻層析；電泳步驟(如制備型等電聚焦(IEF)、差異溶解度(如，硫酸銨沉淀))或提取等等。通常見Scopes，Prtein Purification，Springer-Verlag，New York，1982；和Protein Purification，J.-C.Janson and Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989。
因子VII或因子VII相關多肽的純化可以包括如在抗因子VII抗體柱中進行的親和層析(如見Wakabayashi et al.，J.Biol.Chem.26111097，1986；Thim et al.，Biochem.277785，1988)和使用因子XIIa或具有胰蛋白酶樣特異性的其它蛋白酶，如因子IXa、激肽釋放酶、因子Xa和凝血酶蛋白水解切割進行的活化。如見Osterud et al.，Biochem.112853(1972)；Thomas，U.S.Patent No.4,456,591；Hedner et al.，J.Clin.Invest.711836(1983)。可供選擇地，因子VII可以通過離子交換層析柱活化，如Mono Q(Pharmacia)等。
大規模生產多肽在一些實施方案中，用于實施本發明的細胞是表達內源性因子VII基因的人細胞。在這些細胞中，內源性基因可以是完整的或經過原位修飾的，或因子VII基因外部的序列經過原位修飾而改變了內源性因子VII基因的表達。
在其它實施方案中，改造任何真核生物來源的細胞以表達來自重組基因的人因子VII。這里使用的“因子VII”或“因子VII多肽”包括野生型因子VII(即具有美國專利4,784,950公開的氨基酸序列的多肽)，以及與野生型因子VII相比其生物活性基本相同或有所提高的因子VII變體。術語“因子VII”意指包括未切割(酶原)形式的因子VII多肽，以及經過蛋白水解加工而得到其相應生物活性形式的多肽，它們可被稱作因子VIIa。通常，在殘基152和183之間切割因子VII而得到因子VIIa。
這里使用的“因子VII相關多肽”包括多肽，包括變體，其中因子VIIa生物活性與野生型因子VIIa活性相比實質性改變或降低。這些多肽包括但不限于導入了可修飾或破壞多肽生物活性的特定氨基酸序列改變的因子VII或因子VIIa。
因子VIIa在血液凝固中的生物活性源自其(i)結合組織因子(TF)和(ii)催化因子IX或因子X的蛋白水解切割以產生活化因子IX或X(分別是因子IXa或Xa)的能力。為了本發明，使用因子VII缺陷的血漿和組織促凝血酶原激酶測定制劑促進血液凝固的能力，由此可以量化因子VIIa的生物活性，如美國專利5,997,864所述。在這個方法中，生物活性表示為相對于對照樣品而言凝血時間的縮短，通過與含1單位/ml因子VII活性的人血清庫標準相比而轉換為“因子VII單位”。可供選擇地，因子VIIa生物活性可以由下列定量(i)測定在包括包埋在脂膜內的TF和因子X的系統中，因子VIIa產生Xa的能力(Persson et al.，J.Biol.Chem.27219919-19924，1997)；(ii)測定在含水系統中因子X的水解；(iii)使用基于表面胞質共振的設備測定其與TF的物理結合(Persson，FEBS Letts.413359-363，1997)和(iv)測定合成底物的水解。
與野生型因子VIIa相比生物活性基本相同或有所提高的因子VII變體包括當在上述凝血實驗、蛋白水解實驗或TF結合實驗中的一個或多個實驗中測試時，顯示出在相同細胞類型中產生的因子VIIa的比活性的至少約25％，優選至少約50％，更優選至少約75％和最優選至少約90％的那些變體。與野生型因子VIIa相比生物活性實質性降低的因子VII變體是當在上述凝血實驗、蛋白水解實驗或TF結合實驗中的一個或多個實驗中測試時，顯示出比活性低于在相同細胞類型中產生的野生型因子VIIa的比活性的約25％，優選低于約10％，更優選低于約5％和最優選低于約1％的那些變體。相對于野生型因子VII其生物活性實質性改變的因子VII變體包括但不限于顯示TF非依賴型因子X水解活性的因子VII變體和結合TF但不切割因子X的變體。
無論顯示與野生型因子VII基本相同或更好的生物活性，或者顯示相對于野生型因子VII而言實質性改變或降低了的生物活性，因子VII的變體包括但不限于具有通過插入、缺失或置換一個或多個氨基酸而與野生型因子VII序列不同的氨基酸序列的多肽。
具有與野生型因子VII基本相同生物活性的因子VII變體的非限制性實例包括S52A-FVIIa，S60A-FVIIa(Lino et al.，Arch.Biochem.Biophys.352182-192，1998)；美國專利5,580,560中公開的顯示蛋白水解穩定性增加的FVIIa變體；在殘基290和291之間或殘基315和316之間發生蛋白水解切割的因子VIIa(Mollerup et al.，Biotechnol.Bioeng.48501-505，1995)；氧化形式的因子VIIa(Kornfelt et al.，Arch.Biochem.Biophys.36343-54，1999)；PCT/DK02/00189中公開的FVII變體；和WO 02/38162(Scripps研究院)公開的顯示蛋白水解穩定性增加的FVII變體；WO 99/20767(明尼蘇達大學)公開的具有經修飾型Gla結構域并顯示膜結合增強的FVII變體；和WO 01/58935(Maxygen ApS)公開的FVII變體。
與野生型FVIIa相比生物活性增加的FVII變體的非限制性實例包括WO 01/83725、WO 02/22776；WO 02/38162(Scripps研究院)中公開的FVII變體；NN ansφgninger；和JP 2001061479(Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)公開的活性增加的FVIIa變體。
相對于野生型因子VII而言活性實質性降低或改變的因子VII變體的非限制性實例包括R152E-FVIIa(Wildgoose et al.，Biochem 293413-3420，1990)，S344A-FVIIa(Kazama et al.，J.Biol.Chem.27066-72，1995)，FFR-FVIIa(Holst et al.，Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg.15515-520，1998)，和缺乏Gla結構域的因子VIIa(Nicolaisen et al.，FEBS Letts.317245-249，1993)。
因子VII或因子VII相關多肽的實例包括但不限于野生型因子VII，L305V-FVII，L305V/M306D/D309S-FVII，L305I-FVII，L305T-FVII，F374P-FVII，V158T/M298Q-FVII，V158D/E296V/M298Q-FVII，K337A-FVII，M298Q-FVII，V158D/M298Q-FVII，L305V/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII，V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII，K157A-FVII，E296V-FVII，E296V/M298Q-FVII，V158D/E296V-FVII，V158D/M298K-FVII，S336G-FVII；S52A-因子VII，S60A-因子VII；R152E-因子VII，S344A-因子VII，缺乏Gla結構域的因子VIIa；和P11Q/K33E-FVII，T106N-FVII，K143N/N145T-FVII，V253N-FVII，R290N/A292T-FVII，G291N-FVII，R315N/V317T-FVII，K143N/N145T/R315N/V317T-FVII；和在氨基酸序列233Thr至240Asn中具有置換、添加或缺失的FVII，在氨基酸序列304Arg至329Cys中具有置換、添加或缺失的FVII。
本發明也包括培養、尤其是大規模培養表達一個或多個感興趣蛋白的真核細胞，所述感興趣蛋白的表達或者是來自于內源性基因，或者是在將編碼該蛋白的重組基因導入這種細胞后進行的。這種蛋白包括但不限于因子VIII；因子IX；因子X；蛋白C；組織因子；凝乳酶；生長激素，包括人生長激素；牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α-1抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；黃體生成素；胰高血糖素；心房肽；肺表面活性劑；纖溶酶原激活劑，如尿激酶或者人尿或組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子α和β；腦啡肽酶；人巨噬細胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；米勒抑制物質；松弛素A鏈；松弛素B鏈；松弛素原；小鼠促性腺激素相關肽；微生物蛋白；如β內酰胺酶；DNA酶；抑制素；活化素；血管內皮細胞生長因子(VEGF)；激素或生長因子的受體；整聯蛋白；蛋白A或D；類風濕因子；神經營養因子如骨衍生神經營養因子(BDNF)，神經營養素-3，-4，-5或-6(NT-3，NT-4，NT-5，或NT-6)或神經生長因子如NGF-β；血小板衍生生長因子(PDGF)；成纖維細胞生長因子如α-FGF和β-FGF；表皮生長因子(EGF)；轉化生長因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，胰島素樣生長因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；CD蛋白如CD-3，CD-4，CD-8，和CD-19；紅細胞生成素；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成蛋白(BMP)；干擾素如干擾素-α，-β和-γ；集落刺激因子(CSFs)，如M-CSF，GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)，如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原如AIDS包膜的一部分；轉運蛋白；歸巢受體；地址素；調節蛋白；抗體和上述任何多肽的片段。
下列實施例旨在非限制性闡述本發明。
實施例實施例1CHO細胞的制備Persson和Nielsen.1996.FEBS Lett.385241-243已經描述了表達人FVII的質粒載體pLN174。簡單說，它攜帶編碼人FVII(包括前肽)的cDNA核苷酸序列，處于用于轉錄所插入cDNA的小鼠金屬硫蛋白啟動子的控制下，并且含有處于SV40早期啟動子控制下的小鼠二氫葉酸還原酶cDNA作為選擇性標記。
為了構建編碼γ羧化識別序列的質粒載體，使用含編碼FVII(包括其前肽)的cDNA的克隆載體pBluescript II KS+(Stratagene)(pLN171)。(Persson et al.，1997.J.Biol.Chem.27219919-19924)。通過對該克隆載體進行反向PCR介導的誘變，將編碼終止密碼子的核苷酸序列插入到編碼FVII的cDNA內，FVII前肽之后。經NaOH處理使模板質粒變性，隨后用Pwo(Boehringer Mannheim)和Taq(Perkin-Elmer)聚合酶和下列引物進行PCR5′-AGC GTT TTA GCG CCG GCG CCG GTG CAG GAC-3′5′-CGC CGG CGC TAA AAC GCT TTC CTG GAG GAG CTG CGG CC-3′用DpnI消化所得混合物，以消化殘留模板DNA，用PCR產物轉化大腸桿菌。通過測序篩選克隆中突變的存在。將正確克隆的cDNA以BamHI-EcoRI片段轉移到表達質粒pcDNA3(Invitrogen)中。所得質粒被稱作pLN329。采用Fugerne6方法(Boehriner-Mannheim)，用等量pLN174和pLN329轉染CHO K1細胞(ATCC CC161)。添加氨甲喋呤至1μM和G-418至0.45mg/ml來選擇轉染體。經有限稀釋法克隆轉染體庫并測定來自該克隆的FVII表達。
進一步亞克隆高產量克隆，選擇出在含10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle′s培養基中FVII表達水平為2.4pg/細胞/天的克隆E11。使該克隆適應在商業可獲得的無動物來源成分的CHO培養基(JRHBioscience)中進行的無血清懸浮培養。
實施例2因子VII的制備實驗條件總結本實施例中，在所有三個培養中，均向用于CHO細胞的市售無動物來源成分的無蛋白培養基(JRH Biosciences)中補充胰島素(5mg/L)和維生素K1(5mg/L)。
培養容器的大小是500L。方法類型是標準Cytopore 1微載體培養，其中載體沉淀后，每日分批式更換80％培養基(400L)。
在FFF1239和FFF1242培養中，每天載體沉淀前更換培養基時立即實施冷卻步驟(對于FFF1239，冷卻到26℃；對于FFF1242，冷卻到26℃，直到第19天；隨后冷卻到20℃，直到第53天)。在所有三個培養的整個過程中，對于培養參數溫度、pH和溶解氧使用標準設定點。溫度設定點是36.0℃。pH設定點是7.10時調低pH(向頂部空間添加CO2氣體)和6.80時調高pH(向培養液中添加碳酸鈉溶液)。溶解氧的設定點是用空氣50％飽和。
結果概述和結論三個培養的第一個中，將高產CHO克隆FFF1235(如實施例1所述)以標準微載體方法培養，并且不進行冷卻步驟。如從圖1看到的，FVII滴度對時間的圖形是“鐘形”，即在這個培養中，從第18-20天起看到FVII滴度下降。顯而易見此下降是由培養容器中總細胞密度下降引起的，即由培養容器中細胞的損失引起。
FFF1239和FFF1242中，載體沉淀前實施的冷卻步驟期間，冷卻水通向夾套的閥門持續保持開放。冷卻水溫度是10-15℃，它是決定冷卻步驟持續時間的唯一參數。從36.0℃分別冷卻降至26.0℃和20.0℃，各消耗大約30分鐘和55分鐘。將在舊培養基收集后添加到培養容器中的新培養基預熱到30℃。加入新培養基后，以設定點36.0℃激活培養容器的溫度控制環，隨后經約120分鐘加熱至設定點，不論載體沉淀前的目標溫度是多少(26.0℃或20.0℃)均如此。
每日實施冷卻步驟的FFF1239和FFF1242兩個培養的總體模式與FFF1235培養相似。在FFF1239和FFF1242中，載體沉淀前立即實施的每日冷卻步驟確實對細胞密度和FVII滴度有積極作用。盡管圖形仍然是“鐘形”，但是冷卻步驟確實增加了細胞密度和FVII滴度的峰值(FFF1239的FVII峰滴度是36mg/L，而FFF1235的是22mg/L)，并延長了具有高細胞密度和高FVII滴度的期間(FVII滴度高于15mg/L的時間，對于FFF1235而言是8-9天，而在FFF1239中延長到13-14天)。可以看到，冷卻至26℃使細胞密度和FVII滴度達到最高。
結果

圖1圖示了FFF1235、FFF1239和FFF1242的FVII滴度。
圖2至圖4顯示了FFF1235、FFF1239和FFF1242培養的細胞計數和FVII滴度。
從FFF1239和FFF1242培養得出的總體結論是載體每日沉淀前的冷卻步驟確實對培養物的總體性能具有積極作用，并且26℃優于20℃。
這里提及的所有專利、專利申請和參考文獻以其完整形式引入本文作為參考。
按照上面的詳細描述，本領域技術人員將能得到本發明很多變型的啟示。這種顯而易見的變型包括在所附權利要求的全部意欲保護的范圍中。
序列表<110> Novo Nordisk A/S<120> 在真核細胞中生產重組蛋白的方法<130> 6480.504-WO<160> 2<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 30<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物<400> 1agcgttttag cgccggcgcc ggtgcaggac 30<210> 2<211> 38<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物<400> 2cgccggcgct aaaacgcttt cctggaggag ctgcggcc 38
權利要求
1.一種在真核細胞中生產多肽的方法，包括步驟(i)在適合所述多肽表達的條件和設定點溫度下，培養微載體上的表達所述多肽的細胞；(ii)將培養物冷卻到低于所述設定點的預定溫度；(iii)沉淀該微載體；和(iv)收集全部或部分培養基。
2.根據權利要求1的方法，其中進一步包括，在所述收集后，向培養容器中添加新鮮培養基的步驟。
3.根據權利要求1或2的方法，其中進一步包括從收集的培養基中回收所述多肽的步驟。
4.根據權利要求1至3中任一項的方法，其中預定溫度低于設定點約5℃-30℃。
5.根據權利要求4的方法，其中預定溫度低于設定點約5℃-20℃。
6.根據權利要求5的方法，其中預定溫度低于設定點約5℃-15℃。
7.根據權利要求6的方法，其中預定溫度低于設定點約10℃。
8.根據權利要求1至3中任一項的方法，其中，在沉淀前，將培養物冷卻到約18℃-32℃的溫度。
9.根據權利要求7的方法，其中將培養物冷卻到約20℃-30℃的溫度。
10.根據權利要求9的方法，其中將培養物冷卻到約22℃-28℃的溫度。
11.根據權利要求10的方法，其中將培養物冷卻到約24℃-28℃的溫度。
12.根據權利要求11的方法，其中將培養物冷卻到約25℃-27℃的溫度。
13.根據權利要求1至12中任一項的方法，其中所述真核細胞是昆蟲細胞。
14.根據權利要求1至12中任一項的方法，其中所述真核細胞是哺乳動物細胞。
15.根據權利要求14的方法，其中所述哺乳動物細胞選自HEK，BHK和CHO細胞。
16.根據權利要求15的方法，其中所述哺乳動物細胞是CHO細胞。
17.根據權利要求1至16中任一項的方法，其中所述多肽是因子VII或因子VII相關多肽。
18.根據權利要求17的方法，其中所述多肽是野生型人因子VII。
19.根據權利要求17的方法，其中所述多肽是因子VII相關多肽，該多肽選自由下列組成的組L305V-FVII，L305V/M306D/D309S-FVII，L305I-FVII，L305T-FVII，F374P-FVII，V158T/M298Q-FVII，V158D/E296V/M298Q-FVII，K337A-FVII，M298Q-FVII，V158D/M298Q-FVII，L305V/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII，V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII，K157A-FVII，E296V-FVII，E296V/M298Q-FVII，V158D/E296V-FVII，V158D/M298K-FVII，S336G-FVII；S52A-因子VII，S60A-因子VII；R152E-因子VII，S344A-因子VII，缺乏Gla結構域的因子VIIa；和P11Q/K33E-VII，T106N-FVII，K143N/N145T-FVII，V253N-FVII，R290N/A292T-FVII，G291N-FVII，R315N/V317T-FVII，K143N/N145T/R315N/V317T-FVII；和在氨基酸序列233Thr至240Asn中具有置換、插入或缺失的FVII，在氨基酸序列304Arg至329Cys中具有置換、插入或缺失的FVII。
20.根據權利要求1至19中任一項的方法，其中所述多肽產生水平至少是大約15mg/L培養物。
21.根據權利要求1至3中任一項的方法，其中所述多肽是人因子VII，所述細胞是CHO細胞，所述載體是大孔載體，所述培養設定點是36℃，并在使載體沉淀前將培養物冷卻到大約26℃。
22.一種真核細胞的培養方法，包括步驟(i)在適合維持培養物的條件和設定點溫度下，培養微載體上的細胞；(ii)將培養物冷卻到低于所述設定點的預定溫度；(iii)沉淀該微載體；和(iv)收集全部或部分培養基。
23.根據權利要求22的方法，其中進一步包括在所述收集后向培養容器中添加新鮮培養基的步驟。
24.根據權利要求22至23中任一項的方法，其中所述預定溫度低于設定點約5℃-30℃。
25.根據權利要求24的方法，其中所述預定溫度低于設定點約5℃-20℃。
26.根據權利要求25的方法，其中所述預定溫度低于設定點約5℃-15℃。
27.根據權利要求26的方法，其中所述預定溫度低于設定點約10℃。
28.根據權利要求22至23的方法，其中將所述培養物冷卻到約18℃-32℃。
29.根據權利要求28的方法，其中將所述培養物冷卻到約20℃-30℃的溫度。
30.根據權利要求29的方法，其中將所述培養物冷卻到約22℃-28℃的溫度。
31.根據權利要求30的方法，其中將所述培養物冷卻到約24℃-28℃的溫度。
32.根據權利要求31的方法，其中將所述培養物冷卻到約25℃-27℃的溫度。
33.根據權利要求22至32中任一項的方法，其中所述真核細胞是昆蟲細胞。
34.根據權利要求22至32中任一項的方法，其中所述真核細胞是哺乳動物細胞。
35.根據權利要求34的方法，其中所述哺乳動物選自HEK、BHK和CHO細胞組成的組。
36.根據權利要求35的方法，其中所述哺乳動物細胞是CHO細胞。
37.根據權利要求22至36中任一項的方法，其中所述細胞產生期望的因子VII或因子VII相關多肽。
38.根據權利要求37的方法，其中所述期望多肽是野生型人因子VII。
39.根據權利要求38的方法，其中所述期望多肽是因子VII相關多肽，其選自由下列組成的組L305V-FVII，L305V/M306D/D309S-FVII，L305I-FVII，L305T-FVII，F374P-FVII，V158T/M298Q-FVII，V158D/E296V/M298Q-FVII，K337A-FVII，M298Q-FVII，V158D/M298Q-FVII，L305V/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII，V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII，K157A-FVII，E296V-FVII，E296V/M298Q-FVII，V158D/E296V-FVII，V158D/M298K-FVII，S336G-FVII；S52A-因子VII，S60A-因子VII；R152E-因子VII，S344A-因子VII，缺乏Gla結構域的因子VIIa；和P11Q/K33E-FVII，T106N-FVII，K143N/N145T-FVII，V253N-FVII，R290N/A292T-FVII，G291N-FVII，R315N/V317T-FVII，K143N/N145T/R315N/V317T-FVII；和在氨基酸序列233Thr至240Asn中具有置換、插入或缺失的FVII，在氨基酸序列304Arg至329Cys中具有置換、插入或缺失的FVII。
40.根據權利要求22至39中任一項的方法，其中所述期望多肽的產生水平為至少大約15mg/L培養物。
41.一種用于收集由微載體培養中生長的真核細胞所產生的多肽的方法，所述方法包括(i)將培養物冷卻到低于培養設定點的預定溫度，隨后(ii)沉淀該微載體。
全文摘要
本發明提供了在微載體真核細胞培養中生產多肽的方法，該方法包括步驟(i)在適合所述多肽表達的條件和設定點溫度下，培養微載體上的表達所述多肽的細胞；(ii)將培養物冷卻到低于所述設定點的預定溫度；(iii)沉淀該微載體；和(iv)收集全部或部分培養基。
文檔編號C07K14/435GK1564863SQ02819597
公開日2005年1月12日 申請日期2002年9月20日 優先權日2001年10月2日
發明者I·M·克努森 申請人:諾和諾德醫療保健公司