G－csf偶聯物的制作方法
                            
            
                            
            文檔序號：3552018閱讀：618來源：國知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：G－csf偶聯物的制作方法
            
技術領域：
            本發明涉及能顯示粒細胞集落刺激因子(G-CSF)活性的新的多肽，顯示G-CSF活性的多肽與非多肽組分的偶聯物，制備這種多肽或偶聯物的方法以及所述多肽或偶聯物在治療，尤其對中性粒細胞減少癥或白細胞減少癥的治療方面的應用。
            
背景技術：
             白細胞在骨髓中的生長，分裂和分化的過程稱為造血(Dexter andSpooncer，Ann.Rev.Cell.Biol.，3423，1987)。每種類型的血細胞都來自多能干細胞。體內通常能產生三種類型的血細胞紅血細胞(紅細胞)，血小板和白血細胞(白細胞)，后者的大多數參與宿主的免疫防御。造血前體細胞的增殖和分化由一個細胞因子家族調節，這一家族的細胞因子包括集落刺激因子(CSF′s)例如G-CSF和白細胞介素(Arai等，Ann.Rev.Biochem.，59783-836，1990)。G-CSF在體內的主要生物學作用是刺激某些稱為嗜中性粒細胞的白細胞的生長和發育(Welte等，PNAS-USA 821526-1530，1985，Souza等，science，23261-65，1986)。當嗜中性粒細胞被釋放到血流時，這些細胞便行使抗御細菌感染及其它感染的功能。
            
Nagata等，nature 319415-418，1986曾報道過人G-CSF(hG-CSF)的氨基酸序列。hG-CSF是一種單體蛋白，它通過形成2個G-CSF分子和2個受體的2∶2復合物使G-CSF受體二聚化(Horan等，(1996)，Biochemistry 35(15)4886-96)。Aritomi等，nature 401713-717，1999描述了G-CSF受體的BN-BC結構域和hG-CSF之間形成的復合物的X線結構。它們確定以下hG-CSF的殘基為受體結合界面的一部分G4，P5，A6，S7，S8，L9，P10，Q11，S12，L15，K16，E19，Q20，L108，D109，D112，T115，T116，Q119，E122，E123，和L124。rhG-CSF在大腸桿菌，釀酒酵母和哺乳動物細胞中的表達已有報道(Souza等，Science 23261-65，1986，Nagata等，Nature 319415-418，1986，Robinsonand Wittrup，Biotechnol.Prog.11171-177，1985)。
            
白細胞減少癥(白細胞水平下降)和中性粒細胞減少癥(中性粒細胞水平下降)都是導致對各種類型的感染的易感性增加的疾病。中性粒細胞減少癥可以是慢性的(例如，在HIV感染者中)，或者是急性的(例如在接受化療或放療的癌癥患者中)。對于中性粒細胞減少癥的重癥患者(例如因化療所致)而言，即使是非常微弱的感染也可以是嚴重的，甚至可以危及生命。重組人G-CSF(rhG-CSF)通常用于治療各種形式的白細胞減少癥。因此，可得到冠以filgrastim(Gran和Neupogen)，lenograstim(Neutrogin和Granocyte)和nartograstim(Neu-up)名稱的rhG-CSF商業制品。Gran和Neupogen為非糖基化形式，可以在重組大腸桿菌細胞中制備。Neutrogin和Granocyte為糖基化形式，可以在重組CHO細胞中制備，Neu-up為非糖基化形式，它在重組大腸桿菌細胞產生的完整rhG-CSF的N末端區域有5個氨基酸被取代。
            
已有文獻報道了hG-CSF的多種蛋白工程變體(US5,581,476，US5,214,132，US5,362,853，US4,904,584和Riedhaar-Olson等，Biochemistry359034-9041，1996)。為引入比天然多肽至少多一個的糖鏈，已有人建議對hG-CSF及其它多肽進行修飾(US5,218,092)。所述多肽的氨基酸序列可以通過氨基酸取代，氨基酸缺失或氨基酸插入進行修飾以添加另外的糖鏈。除此之外，對天然hG-CSF的聚合物修飾，包括連接PEG基團，已有報道(Satake-Ishikawa Cell Structure and Function 17157-160，1992，US5,824,778，US5,824,784，WO96/11953，WO95/21629，WO94/20069，EP0612846A1，WO01/00011)。
            
Bowen等，Experimental Hematology 27(1999)，425-432公開了PEG偶聯的G-CSF突變蛋白的分子質量及其活性維持時間之間的關系。提示所述蛋白上PEG偶聯部分的分子量與體外活性之間有明顯反比關系，然而體內活性隨分子量的增加而增加。推測偶聯物的較低親和力有增加半壽期的作用，因為受體介導的內吞作用是一種調節造血生長因子水平的重要機制。
            
市售rhG-CSF有短期的藥理學作用，因此在白細胞減少狀態的持續期間必須一天給藥一次。具有較長循環半壽期的分子會減少為緩解白細胞減少癥和預防隨后的感染而必需的給藥次數。現有rG-CSF產品的另一更明顯問題是，即使給病人用了G-CSF，也會在化療后出現中性粒細胞減少癥狀。對這些病人而言，重要的是盡可能縮短中性粒細胞減少癥的持續時間并減輕其程度，從而使嚴重感染的危險降到最低。現有rG-CSF產品還有一個問題是，出現劑量依賴性骨痛。因為骨痛是患者接受rG-CSF治療時體會到的明顯副作用，所以能提供一種不引起骨痛的rG-CSF產品是人們所期望的，這種產品可以本身沒有這種作用，或者是這種產品在足夠小的劑量下有效但該劑量不引起骨痛。因此，很明顯有必要改進重組G-CSF樣分子。
            
關于半壽期，增加蛋白的循環半壽期的一個途徑是保證蛋白的清除，尤其是通過腎臟的清除和受體介導的清除的下降。這可以通過將蛋白與能增加表觀分子量的化學組分偶聯，從而降低腎臟的清除作用，增加上述分子的體內半壽期來實現。進一步地，將蛋白與化學組分連接可以有效地阻斷蛋白裂解性酶與蛋白的物理接觸，由此可以使蛋白免遭非特異性蛋白水解作用的降解。聚乙二醇(Polyethylene glycol)(PEG)便是這樣一種化學組分，它已用于制備治療性蛋白制品。最近，一種在N末端連接了單個20kDa PEG基團的G-CSP分子(NeulastaTM)已獲準在美國銷售。盡管這種PEG化G-CSF分子與非PEG化G-CSF相比半壽期增加，并因此比現有G-CSF產品給藥次數減少，但它與非PEG化G-CSF相比并未顯著縮短中性粒細胞減少癥的持續時間。因此，目前已知的G-CSF分子仍有相當大的改進空間。
            
所以，仍然有必要提供一種新型分子，它既能顯示在白細胞減少癥/中性粒細胞減少癥的治療中有用的G-CSF活性，同時又具有諸如半壽期增加、尤其是中性粒細胞減少癥持續時間縮短等改進特性。本發明涉及這樣的分子。
            
發明簡述本發明涉及特異性偶聯物，其包含一種顯示G-CSP活性的多肽和一種非多肽組分，本發明還涉及上述偶聯物的制備方法和它們在醫學治療和藥物制備方面的應用。相應地，本發明第一個方面涉及各種特異性偶聯物，這些偶聯物包含顯示G-CSF活性的多肽，該多肽具有與SEQ ID NO1所示人G-CSF的已知氨基酸序列不同在于至少一個特異性改變的包含非多肽組分連接基團的氨基酸殘基的氨基酸序列，且至少有一個非多肽組分連接到該多肽的連接基團上。這些偶聯物與未偶聯的hG-CSF相比，除了體內半壽期增加以外，體外生物學活性大大降低，我們很意外地發現這一特點可導致中性粒細胞更快速地恢復。
            
另一方面，本發明涉及顯示G-CSF活性且形成本發明的偶聯物的一部分的多肽。預計本發明的多肽可以用于治療，診斷或其它的目的，但也可具體作為制備本發明偶聯物的中間產物。
            
本發明另一方面涉及一種多肽偶聯物，該偶聯物包含顯示G-CSF活性的多肽，該多肽的氨基酸序列與hG-CSF的氨基酸序列(其氨基酸序列在SEQID NO1中列出)不同在于至少一個氨基酸殘基是經引入或除去的包含非多肽組分連接基團的氨基酸殘基，并且足夠數量或類型的非多肽組分提供了與已知重組G-CSF產品相比半壽期增加和/或中性粒細胞更快速恢復的偶聯物。
            
本發明一個具體方面涉及具有G-CSF活性的多肽偶聯物，它包含這樣一種多肽，該多肽與SEQ ID NO1所示hG-CSF的氨基酸序列相比，具有K16R，K34R，K40R，T105K，和S159K這些取代，還可以在位置H170出現例如R、K或Q這樣的取代，或者在與SEQ ID NO1有至少80％序列同一性的氨基酸序列的相應位置具有上述取代，并且有2-6個(通常為3-6個)分子量約1000-10,000Da的聚乙二醇組分與該多肽的一或多個連接基團相連。其中這些取代都相對于與SEQ ID NO1具有至少約80％序列同一性的序列，所述序列同一性通常至少約90％或95％，如至少約96％，97％，98％或99％。
            
本發明的另一方面還涉及制備本發明偶聯物的方法，包括編碼本發明多肽的核苷酸序列，包含此核苷酸序列的表達載體，和包含上述核苷酸序列或表達載體的宿主細胞。
            
本發明的最后一方面涉及包含本發明偶聯物或多肽的組合物，制備藥物組合物的方法，本發明的偶聯物或組合物作為藥物的應用，和用上述組合物治療哺乳動物的方法。尤其，本發明的多肽，偶聯物或組合物可以用于使正在進行某些類型的放射治療，化療，和骨髓移植的癌癥患者預防感染，用于動員祖細胞在外周血祖細胞移植中聚集，用于治療無論什么原因所致的嚴重慢性或相關的白細胞減少癥，和用于支持對急性髓樣白血病(acute myeloid leukaemia)患者的治療。另外，本發明的多肽，偶聯物或組合物可以用于AIDS或其它免疫缺陷病以及細菌感染的治療。
            
發明詳述定義在本申請和發明的上下文中應用了以下定義術語“偶聯物”是指由一個或多個多肽，通常為單獨一個多肽與一個或多個非多肽組分，尤其是聚合物分子共價連接形成的異源分子。此外，偶聯物可以與一或多個糖組分相連，尤其是借助N-或O-糖基化作用來連接。術語共價連接是指多肽和非多肽組分直接彼此共價連接，或者是通過一個或多個間插組分，例如橋，間隔臂，或連接組分彼此間接共價連接。優選，偶聯物在相應的濃度和條件下是可溶性的，即在生理性的體液(例如血液)中是可溶性的。術語“非偶聯的多肽”可用于指偶聯物的多肽部分。
            
本發明中術語“多肽”可以和術語“蛋白”交換使用。
            
術語“聚合物分子”是由二個或多個單體共價連接形成的分子，其中沒有一種單體是氨基酸殘基，但聚合物是人白蛋白或另一種高豐度血漿蛋白的情況除外。術語“聚合物”可以和術語“聚合物分子”交換使用。該術語將包括糖分子，但通常情況下，該術語不包括通過體內N-或O-的糖基化(以下進一步描述)連接到所述多肽上的這類糖分子，因為這類分子在下文中被稱為“寡糖組分”。除非對聚合物分子的數目有清楚的說明，每次提及本發明多肽中包含的“一個聚合物”，“一個聚合物分子”，“聚合物”或“聚合物分子”或在本發明中應用的上述稱謂都涉及一個或多個聚合物分子。
            
術語“連接基團”是指多肽中能夠偶聯到相關非多肽組分上的氨基酸殘基基團。例如，在聚合物偶聯，尤其與PEG偶聯的情況中，常用的連接基團是賴氨酸的ε氨基或N末端氨基。其它的聚合物連接基團包括游離羧酸基團(例如，C末端氨基酸殘基的游離羧酸基團或天冬氨酸或谷氨酸殘基的游離羧酸基團)，適當活化的羰基基團，氧化的糖組分和巰基基團。有用的連接基團和它們相配對的非肽組分見下表。
            
     
            
     
            
對于體內的N糖基化，術語“連接基團”以非常規的方式應用以表示構成N糖基化位點的氨基酸殘基(帶有N-X’-S/T/C-X″序列，其中X’是除脯氨酸外的任何氨基酸殘基，X″可以是與X’相同或不同的任何氨基酸殘基且優選其不是脯氨酸，N是天冬酰胺，S/T/C可以是絲氨酸，蘇氨酸或半胱氨酸，優選是絲氨酸或蘇氨酸，最優選是蘇氨酸)。盡管N-糖基化位點的天冬酰胺殘基是糖基化過程中寡糖組分所連接的部位，但這種連接不能實現，除非存在N糖基化位點的其它氨基酸殘基。因此，當非肽組分是寡糖組分且經過N-糖基化實現偶聯時，與目標多肽氨基酸序列的改變連用的術語“包含非肽組分連接基團的氨基酸殘基”應理解為構成N糖基化位點的一個或多個氨基酸殘基以下述方式改變，即將功能性N糖基化位點引入到該氨基酸序列或從所述序列中除去。
            
在本申請中，氨基酸的名稱和原子名稱(例如，CA，CB，NZ，N，O，C，等)依照蛋白數據庫(PDB)(www.pdb.org)的定義應用，這些名稱是根據IUPAC命名法命名的(IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids andPeptides(residue names，atom names etc.)，Eur.J.Biochem.138，9-37(1984)和在Eur.J.Biochem.中對它們的更正152，1(1985)。術語“氨基酸殘基”主要是指任何天然或非天然氨基酸殘基，尤其20個天然氨基酸中的氨基酸，即丙氨酸(Ala或A)，半胱氨酸(Cys或C)，天冬氨酸(Asp或D)，谷氨酸(Glu或E)，苯丙氨酸(Phe或F)，甘氨酸(Gly或G)，組氨酸(His或H)，異亮氨酸(Ile或1)，賴氨酸(Lys或K)，亮氨酸(Leu或L)，蛋氨酸(Met或M)，天冬酰胺(Asn或N)，脯氨酸(Pro或P)，谷氨酰胺(Gln或Q)，精氨酸(Arg或R)，絲氨酸(Ser或S)，蘇氨酸(Thr或T)，纈氨酸(Val或V)，色氨酸(Trp或W)和酪氨酸(Tyr或Y)殘基。
            
用于定義氨基酸的位置/取代的術語舉例說明如下F13是指參考氨基酸序列中編號13的位置由苯丙氨酸殘基占據。F13K是指位置13的苯丙氨酸殘基已經被賴氨酸殘基取代。除非另有說明，本文中氨基酸殘基的編號與SEQ ID NO1所示hG-CSF的氨基酸序列相對應。可供選擇的取代用″/″表示，例如，Q67D/E是指其中第67位的谷氨酰胺被天冬氨酸或谷氨酸取代的氨基酸序列。多個取代用″+″表示，例如，S53N+G55S/T是指其中第53位的絲氨酸殘基被天冬酰胺取代且第55位的甘氨酸殘基被絲氨酸或蘇氨酸殘基取代的一個氨基酸序列。
            
術語“核苷酸序列”是指二個或多個核苷酸分子的連續延伸。核苷酸序列可以是基因組型，cDNA型，RNA型，半合成或合成來源的，或它們的任何組合。
            
術語“聚合酶鏈反應”或“PCR”通常是指一種已知的利用熱穩定DNA聚合酶在體外擴增所需核苷酸序列的方法。
            
“細胞”，“宿主細胞”，“細胞系”和“細胞培養物”在本發明中可以交換使用且所有這些術語都應該包括細胞生長或培養后產生的后代。“轉化”和“轉染”可以交換使用，指將DNA導入細胞的過程。
            
“可操作地連接”是指二個或多個核苷酸序列通過酶連接或其它方式共價連接形成相互之間的構型，以使這些序列行使正常功能。例如，如果前序列或分泌前導序列作為參與多肽分泌的前蛋白表達，那么將編碼前序列或分泌前導序列的核苷酸序列可操作地連接到多肽的核苷酸序列上啟動子或增強子如果影響該序列的轉錄則可操作地連接到編碼序列上；如果核糖體結合部位位于可促進翻譯的位置，那么將核糖體結合部位可操作地連接到編碼序列上。通常“可操作地連接”是指被連接的核苷酸序列是鄰近的，且在分泌前導序列的情況下，是鄰近的同時又是處在閱讀狀態的。連接可以方便的在限制性酶切位點完成。如果這樣的部位不存在，那么需要應用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭，并結合標準的重組DNA方法。
            
術語“引入”是指引入含非多肽組分連接基團的氨基酸殘基，尤其通過對現有氨基酸殘基的取代，或通過插入另外的氨基酸殘基。術語“除去”是指將包含非多肽組分連接基團的氨基酸殘基除去，尤其通過將該氨基酸殘基用另外的氨基酸殘基取代的方式除去，或者選擇地通過刪除(沒有取代)預除去的氨基酸殘基。
            
當對親代多肽進行取代時，這些取代優選是“保守性取代”，換句話說取代是在具有相似特點的氨基酸，例如，小氨基酸，酸性氨基酸，極性氨基酸，堿性氨基酸，疏水性氨基酸和芳香性氨基酸之間進行取代。
            
本發明中優選的取代尤其選自下表中列出的保守取代組保守取代組  
            
     
            
與給定的物質聯用的術語“免疫原性”是指該物質能誘導免疫系統的反應。免疫反應可以是細胞或抗體介導的反應(對免疫原性的進一步解釋參見，例如RoittEssential Immunology(8th Edition，Blackwell))。正常情況下，抗體反應性的降低將意味著免疫原性的降低。降低的免疫原性可以通過應用本領域熟知的任何適當的方法，例如體內的方法或體外的方法確定。
            
術語“體內功能半壽期”以其正常的含意使用，即在體內/靶器官內多肽或偶聯物仍然存在50％生物學活性的時間，或多肽或偶聯物的活性是最初活性的50％的時間。確定體內功能半壽期的另一種方法可以是確定“血清半壽期”，即50％的多肽或偶聯物分子在被清除之前在血漿或血流中循環的時間。血清半壽期的其它術語包括“血漿半壽期”，“循環半壽期”，“血清清除率”“血漿清除率”，“清除半壽期”。多肽或偶聯物由網狀內皮系統(RES)，腎臟，脾臟或肝臟中的一個或多個，通過受體介導的降解，或通過特異性或非特異性蛋白水解作用，尤其通過受體介導的清除和腎臟的清除而被清除。通常，清除取決于蛋白的大小(相對于腎小球過濾的截留值)，電荷，連接的糖鏈，和該蛋白的細胞受體的存在。被保留的功能性通常選自增殖或受體結合活性。體內功能半壽期和血清半壽期可以通過本領域熟知的任何適當的方法確定，這在以下的材料和方法中進一步討論。
            
關于體內功能半壽期或血清半壽期所用的術語“增加的”是指偶聯物或多肽的相應半壽期經可比條件下的測定，相對于參考分子，例如非偶聯的hG-CSF(例如Neupogen)的半壽期在統計學意義上是增加的。例如，相應半壽期可能增加至少大約25％，例如至少大約50％，例如至少大約100％，200％，500％或1000％。
            
所用術語“腎臟清除”的正常的含意是指腎臟，例如通過腎小球的過濾，腎小管的分泌或腎小管的排泄進行的任何清除。腎臟清除依賴于偶聯物的物理特征，包括大小(直徑)，對稱性，形狀/剛性和電荷。通過任何適當的檢測，例如，一種現有體內檢測法可以確定腎臟清除的降低。通常，腎臟清除可通過給予患者一種標記的(例如，放射性標記或熒光標記的)多肽偶聯物并檢測所收集的患者尿中標記物的活性進行確定。在可比較的條件下，腎臟清除的降低可對比相關的參考多肽例如，相應的非偶聯多肽，非偶聯的相應的野生型多肽或另一偶聯多肽(例如并非依照本發明的偶聯多肽)確定。優選，偶聯物的腎臟清除率與相關的參考多肽相比降低至少50％，優選至少降低75％，最優選至少降低90％。
            
通常，受體的活化是和受體介導的清除(RMC)相關聯的，這使得多肽與其受體在非活化的情況下的結合不能導致RMC，而受體的活化導致RMC。清除是由于受體結合的多肽的內化并隨后被溶酶體降解所致。設計偶聯物使其能夠結合和活化足夠數目的受體，以獲得最佳體內生物學反應并避免活化比獲得該反應所需數量更多的受體，從而可使RMC降低。這可以反映在降低的體外生物學活性和/或增加的脫離率方面。在一個優選實施方案中，本發明的偶聯物與未偶聯的hG-CSF相比，體外生物學活性大大降低。
            
通常，體外生物學活性的降低反映了功效/效率的降低和/或有效性的降低，這可以通過用確定這些特性中任何一種的任何適當方法確定。例如，體外生物學活性可以在基于螢光素酶的試驗中確定(“初步試驗2”；參見材料和方法)。測定體外生物學活性的另一種方法是，利用材料和方法章節所述的基于細胞的試驗(“第二步試驗”)測定本發明偶聯物的結合親和力。
            
目前已經發現，體外生物學活性比hG-CSF(SEQ ID NO1)低，有利于延長血漿半壽期和高度刺激中性粒細胞。還意外發現，給予具有較低體外生物學活性的本發明G-CSF偶聯物與給予hG-CSF相比，中性粒細胞恢復得更快，即中性粒細胞計數更快地恢復到正常水平。這是一個重要發現，原因是，對由于放療或化療等原因而中性粒細胞水平降低的患者，能否盡可能地縮短中性粒細胞減少癥的持續時間是非常關鍵的。因此，在一個優選實施方案中，通過本文所述的螢光素酶試驗測定，或者利用基于細胞的受體結合親和力試驗(“第二步實驗”)測定，本發明偶聯物的體外生物學活性為hG-CSF(這里用作參照多肽的hG-CSF具有SEQ ID NO1，還可以具有N-末端蛋氨酸殘基；所述參照hG-CSF尤其可以是Neupogen，即一種非糖基化的Met-hG-CSF)生物學活性的大約2-30％，優選約3-25％。因此，在可比條件下測定，所述偶聯物的體外生物學活性優選比hG-CSF的體外生物學活性降低至少70％，如至少75％，例如至少80％或85％。換而言之，所述偶聯物具有野生型多肽體外生物學活性的大約2％，通常至少約3％，如至少約4％或5％。例如，在可比條件下測定，所述體外生物學活性為hG-CSF的大約4-20％。當希望降低體外生物學活性以便減少受體介導的清除時，很顯然必須維持足夠的生物學活性以便獲得所需的受體活化，這就是為什么在上文中提到所述生物學活性必須至少是hG-CSF的大約2％，且優選略高的原因。
            
有人發現，在G-CSF的螺旋區，即選自氨基酸位置11-41(螺旋A)，71-95(螺旋B)，102-125(螺旋C)，以及145-170(螺旋D)(相對于SEQ ID NO1)的氨基酸殘基中，出現氨基酸改變(尤其是取代)，如果所得多肽與聚乙二醇偶聯，就可以導致受體介導的清除減少，并因此增加體內半壽期。除了發現半壽期更長以外，還意外發現，給予這種多肽偶聯物與給予市售G-CSF產品Neupogen和NeulastaTM相比，還能以相同或者甚至更好的水平刺激白細胞和中性粒細胞生成。具有降低的體外生物學活性的G-CSF偶聯物因此可以通過在G-CSF的螺旋區中改變(通常是取代)一或多個氨基酸殘基，并將所得多肽與一或多個非多肽組分如聚乙二醇偶聯來制備。
            
優選，多肽偶聯物及其受體的脫離率的增加將達到一定程度，使得可以導致在受體配體復合物的任何實質性內吞作用發生之前，將多肽偶聯物從其受體上釋放出來。受體多肽結合親和力可以依照本文材料和方法部分的描述確定。所述脫離率可以利用材料和方法章節中描述的Biacore技術來測定。體外RMC可以如下確定標記(例如放射性的或熒光的標記)多肽偶聯物，刺激包含針對該多肽的受體的細胞，洗滌這些細胞并檢測標記物的活性。或者，將偶聯物暴露于表達相關受體的細胞。適當時間的溫育后將上清液取出轉移到包含相似細胞的培養孔中。這些細胞對上清液的生物反應可以與非偶聯多肽或另一參考多肽對比確定，這就是RMC降低程度的測量值。
            
通常，偶聯物體外生物學活性的降低可以是其被非多肽組分修飾的結果。然而，為進一步降低體外生物學活性或為其它原因，可能還需要對偶聯物的多肽部分進行修飾。例如，在一個實施方案中，與相應的野生型的多肽相比，位于多肽的受體結合區或其附近的至少一個氨基酸殘基可以用另一氨基酸殘基取代，以降低體外生物學活性。通過取代引入的氨基酸殘基可以是能夠降低偶聯物的體外生物學活性的任何氨基酸殘基。便利地，被引入的氨基酸殘基包含本文定義的非多肽組分連接基團。尤其，當非多肽組分是聚合物分子例如PEG時，被引入的氨基酸殘基可以是賴氨酸殘基。
            
術語“顯示G-CSF活性”是指多肽或偶聯物有天然G-CSF，尤其具有SEQ ID NO1顯示的氨基酸序列的G-CSF的一個或多個功能，包括與G-CSF受體結合的能力(Pukunaga等，J.Bio.Chem，26514008，1990)。G-CSF活性用下面材料和方法中描述的初步檢測方法可以便利地檢測。“顯示”G-CSF活性的多肽當顯示可檢測的功能，例如可檢測的增殖活性或受體結合活性(例如那些通過材料和方法中描述的初步檢測方法確定的活性)時，被認為具備了這樣的活性。本文中顯示G-CSF活性的多肽為簡便起見也可以稱為“G-CSF分子”，即使所述多肽事實上是G-CSF變體也可以。
            
術語“親代G-CSF”或“親代多肽”是指將根據本發明被修飾的分子。親代G-CSF通常是hG-CSF或其變體。“變體”是有一個或多個氨基酸殘基與親代多肽不同的多肽，通常1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個氨基酸殘基不同。rhG-CSF的實例包括filgrastim(Gran和eupogen)，lenograstim(Neutrogin和Granocyte)和nartograstim(Neu-up)。
            
本發明的偶聯物如上所述，本發明第一方面涉及包含顯示G-CSF活性的多肽以及連接至該多肽的連接基團上的至少一個非多肽組分的偶聯物，該多肽包含的氨基酸序列與SEQ ID NO1所示的氨基酸序列不同在于特別引入或去除至少一個包含非多肽組分連接基團的氨基酸殘基。被引入和/或去除的氨基酸殘基在以下進一步描述。應理解偶聯物本身也顯示G-CSF活性。
            
通過引入和/或去除包含非多肽組分連接基團的氨基酸殘基，可以定向改造多肽，以使多肽分子更易于與所選定的非多肽組分偶聯，使偶聯模式最優化(例如保證非多肽組分在G-CSF分子表面最優化分布并保證分子中只存在將進行偶聯的連接基團)，從而獲得既具備G-CSF活性還具有與現有G-CSF分子相比改善了一個或多個特性的新的偶聯分子。
            
多肽可以是任何來源的，尤其可以來源于哺乳動物，優選來源于人，尤其具有氨基酸序列SEQ ID NO1的多肽的變體。
            
在本發明的優選實施方案中，具備G-CSF活性的多肽的一個以上的氨基酸殘基被變更，例如這種變更包括去除和引入含所選非多肽組分連接基團的氨基酸殘基。
            
除本發明公開的旨在去除和/或引入非多肽組分的連接位點的氨基酸殘基變更之外，可以理解本發明多肽的氨基酸序列在需要時可以包含其它的與引入或去除連接位點無關的變更，即其它的取代，插入或缺失。這些變更可以，例如，包括截去N末端和/或C末端一個或多個氨基酸殘基，或在N末端和/或C末端添加一個或多個額外的殘基，例如在N末端添加蛋氨酸殘基。
            
本發明的偶聯物與hG-CSF相比，尤其與rhG-CSF(例如filgrastim，lenograstim或artograstim)或已知的hG-CSF變體相比有一個或多個以下改善的特性縮短中性粒細胞減少癥持續時間的能力增加，功能性體內半壽期增加，血清半壽期增加，腎清除減少，受體介導的清除減少，副作用例如骨痛減弱，和免疫原性降低。
            
可以理解，包含非多肽組分的連接基團的氨基酸殘基，不管它是被引入還是被去除，都將根據所選擇的非多肽組分的性質，且在多數情況下，根據多肽和非多肽組分之間實現偶聯的方法選擇。例如，當將聚乙二醇與賴氨酸殘基偶聯時，合適的活化分子是例如來自Shearwater Corp.的mPEG-SPA，氧基羰基-氧-N-二羧酰亞胺-PEG(US5,122,614)，或可從PolyMASC Pharmaceuticals plc.得到的PEG。對這些分子中的第一個分子將在以下作進一步描述。
            
為避免對親代hG-CSF分子的結構和功能的破壞，依照本發明需要變更的氨基酸殘基總數，例如如本發明下面描述的，(與SEQ ID NO1所示氨基酸序列相比)通常不超過15個。實際引入或去除的氨基酸殘基數目和類型尤其依賴于所期望的偶聯的性質和程度(例如，非肽組分的特征，多少非多肽組分期望或可能與多肽偶聯，期望偶聯發生的部位或應該避免偶聯發生的部位，等)。優選，本發明偶聯物的多肽部分或本發明的多肽有1-15個氨基酸殘基，通常2-10個氨基酸殘基，例如3-8個氨基酸殘基，例如4-6個氨基酸殘基，與SEQ ID NO1顯示的氨基酸序列相比不同。所以，通常本發明的偶聯物的多肽部分或本發明的多肽有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個氨基酸殘基不同于SEQ ID NO1顯示的氨基酸序列。
            
通常偶聯物的多肽部分通常具有與SEQ ID NO1至少約80％同一性的氨基酸序列，優選至少約90％，如至少約95％，例如至少約96％，97％，98％或99％的序列同一性。氨基酸序列的同源性/同一性可以便利地，用例如ClustalW程序，版本1.8，1999年6月，用缺省參數從被比對的序列確定(Thompson等，1994，ClustalWImproving the sensitivity ofprogressive multiple sequence alignment through sequence weighting，position-specific gap penalties and weight matrix choice，Nucleic Acids Res.224673-4680)或從PFAM家族數據庫版本4.0(http//pfam.wustl.edu/)(Nucleic Acids Res.1999 Jan 1；27(1)260-2)通過應用GENEDOC版本2.5(Nicholas，K.B.，Nicholas H.B.Jr.，和Deerfield，D.W.II.1997 GeneDocAnalysis and Visualization of Genetic Variation，EMBNEW.NEWS 414；Nicholas，K.B.and Nicholas H.B.Jr.1997 GeneDocAnalysis andVisualization of Genetic Variation)進行確定。
            
在優選實施方案中，多肽的氨基酸序列和SEQ ID NO1顯示的氨基酸序列之間的差異在于引入至少一個且經常是多個，例如1-15個包含非多肽組分連接基團的氨基酸殘基，優選通過替換的方式引入到氨基酸序列中。所以，多肽部分變更了與所選非多肽組分結合的特定氨基酸殘基的含量，從而獲得更有效的，特異的和/或更大范圍的偶聯。例如，當包含所選非多肽的連接基團的氨基酸殘基總數變更到較佳水平時，由于偶聯獲得的分子的形狀，大小和/或電荷的改變，偶聯物的清除通常明顯降低。進一步地，當包含所選非多肽的連接基團的氨基酸殘基總數增加時，更大比例的多肽分子被所選非多肽組分掩蔽，導致較低免疫反應。
            
本申請中所用術語“一種不同”是指允許另外的不同存在。所以，除了特定的氨基酸的不同之外，其它的氨基酸殘基可以發生突變。
            
在另一優選實施例中，多肽的氨基酸序列和SEQ ID NO1所示氨基酸序列之間的不同是至少一個，優選多個，例如1-15個含非多肽組分連接基團的氨基酸殘基從氨基酸序列中被去除，優選被取代。通過去除一個或多個包含非多肽組分連接基團的氨基酸殘基，可以避免非多肽組分偶聯在多肽上導致不利偶聯的部位，例如在多肽的功能部位處或其附近的氨基酸殘基上(因為在此類部位的偶聯可能由于受體的識別受到影響導致所產生的偶聯物失活或G-CSF活性下降)。本文術語“功能部位”是指一個或多個為hG-CSF功能或效應所必不可少或者相關的氨基酸殘基。這樣的氨基酸殘基構成功能部位的一部分。功能部位可以通過本領域已知的方法確定，優選通過分析多肽和相關受體，例如hG-CSF受體(參見Aritomi等，nature 401713-717，1999)的復合物的結構確定。
            
本發明的偶聯物通常包含足夠數量和類型的非多肽組分，以使該偶聯物與hG-CSF，例如filgrastim，lenograstim或nartograstim比較，優選與包含N末端連接的單個20kDa PEG組分的rhG-CSF比較，縮短中性粒細胞減少癥持續時間的能力增加。縮短中性粒細胞減少癥持續時間的能力的增加可以通過本文材料和方法章節(“在具有化療誘導的中性粒細胞減少癥的大鼠中測量偶聯型和非偶聯型hG-CSF及其變體的體內生物學活性”)中的描述來確定。
            
本發明的偶聯物可以包含非多肽組分的至少一個尚未偶聯、可進行偶聯的連接基團。在本發明的上下文中所用的術語“可偶聯的連接基團”是指位于多肽中可進行偶聯的部位的連接基團，且當進行偶聯時，若不存在特殊的預防措施，上述連接基團便可與相關的非多肽組分偶聯。例如，這類連接基團可以是多肽表現其活性必需或相關的氨基酸殘基的一部分。避免其它可偶聯連接基團發生偶聯的一個便利方法是利用輔助分子對連接基團進行掩蔽，例如采用題為“對功能部位的阻斷”部分所述的方式。應理解尚未被偶聯但可偶聯連接基團的數目由特定的G-SCF多肽和可偶聯的連接基團的位置決定。例如，多肽偶聯物包含一個或二個未被偶聯但可偶聯的連接基團，和至少一個，優選二個或多個已被偶聯的連接基團。
            
G-CSF的4個螺旋包括氨基酸殘基11-41(螺旋A)，71-95(螺旋B)，102-125(螺旋C)，以及145-170(螺旋D)(Zink等，(1994)Biochemistry338453-8463)。意外發現，雖然一般認為對蛋白質螺旋(例如G-CSF等4螺旋束蛋白的螺旋結構)進行修飾的同時有干擾蛋白功能的危險，但當非多肽組分與位于G-CSF的一或多個螺旋區的氨基酸殘基相連時可以得到有利的結果。在一個實施方案中，本發明的多肽偶聯物因此包含至少一個非多肽組分，且該組分與位于其中一個螺旋(尤其B、C或D螺旋中的一或多個)中的氨基酸殘基相連。
            
本發明的偶聯物，其中非多肽組分與賴氨酸連接總體上，多肽偶聯物可以包含i)顯示G-CSF活性的多肽，該多肽包含的氨基酸序列與SEQ ID NO1顯示的氨基酸序列不同在于它至少存在選自以下取代中的一個取代T1K，P2K，L3K，G4K，P5K，A6K，S7K，S8K，L9K，PICK，Q11K，S12K，F13K，L14K，L15K，E19K，Q20K，V21K，Q25K，G26K，D27K，A29K，A30K，E33K，A37K，T38K，Y39K，L41K，H43K，P44K，E45K，E46K，V48K，L49K，L50K，H52K，S53K，L54K，156K，P57K，P60K，L61K，S62K，S63K，P65K，S66K，Q67K，A68K，L69K，Q70K，L71K，A72K，G73K，S76K，Q77K，L78K，S80K，F83K，Q86K，G87K，Q90K，E93K，G94K，S96K，P97K，E98K，L99K，G100K，P101K，T102K，D104K，T105K，Q107K，L108K，D109K，A111K，D112K，F113K，T115K，T116K，W118K，Q119K，Q120K，M121K，E122K，E123K，L124K，M126K，A127K，P128K，A129K，L130K，Q131K，P132K，T133K，Q134K，G135K，A136K，M137K，P138K，A139K，A141K，S142K，A143K，F144K，Q145K，S155K，H156K，Q158K，S159K，L161K，E162K，V163K，S164K，Y165K，V167K，L168K，H170K，L171K，A172K，Q173K和P174K，和ii)至少一個與該多肽的賴氨酸殘基相連的非多肽組分，還可以有N-末端氨基酸殘基。
            
hG-CSF包含四個賴氨酸殘基，其中K16位于受體結合結構域，其它的分別位于距離受體結合結構域相對較近的23，34和40位。為了避免這些賴氨酸殘基的一個或多個氨基酸殘基的偶聯反應(因為這種偶聯可以使所產生的偶聯物的活性喪失或嚴重下降)需要去除至少一個賴氨酸殘基，例如二個，三個或所有這些殘基。所以，在另一更優選的方面本發明涉及以上定義的多肽偶聯物，其中選自K16，K23，K34和K40的至少一個氨基酸殘基被刪除或被另一氨基酸殘基取代。優選至少K16被另一氨基酸殘基取代。
            
優選的氨基酸取代實例包括Q70K，Q90K，T105K，Q120K，T133K，S159K和H170K/Q/R中的一個或多個，例如這些取代中的二個，三個或四個或五個，例如Q70K+Q90K，Q70K+T105K，Q70K+Q120K，Q70K+T133K，Q70K+S159K，Q70K+H170K，Q90K+T105K，Q90K+Q120K，Q90K+T133K，Q90K+S159K，Q90K+H170K，T105K+Q120K，T105K+T133K，T105K+S159K，T105K+H170K，Q120K+T133K，Q120K+S159K，Q120K+H170K，T133K+S159K，T133K+H170K，S159K+H170K，Q70K+Q90K+T105K，Q70K+Q90K+Q120K，Q70K+Q90K+T133K，Q70K+Q90K+S159K，Q70K+Q90KH170K，Q70K+T105K+T120K，Q70K+T105K+T133K，Q70K+T105K+S159K，Q70K+T105K+H170K，Q70K+Q120K+T133K，Q70K+Q120K+S159K，Q70K+Q120K+H170K，Q70K+T133K+S159K，Q70K+T133K+H170K，Q70K+S159K+H170K，Q90K+T105K+Q120K，Q90K+T105K+T133K，Q90K+T105K+S159K，Q90K+T105K+H170K，Q90K+Q120K+T133K，Q90K+Q120K+S159K，Q90K+Q120K+H170K，Q90K+T133K+S159K，Q90K+T133K+H170K，Q90K+S159K+H170K，T105K+Q120K+T133K，T105K+Q120K+S159K，T105K+Q120K+H170K，T105K+T133K+S159K，T105K+T133K+H170K，T105K+S159K+H170K，Q120K+T133K+S159K，Q120K+T133K+H170K，Q120K+S159K+H170K，T133K+S159K+H170K，，Q70K+Q90K+T105K+Q120K，Q70K+Q90K+T105K+T133K，Q70K+Q90K+T105K+S159K，Q70K+Q90K+T105K+H170K，Q70K+Q90K+Q120K+T133K，Q70K+Q90K+Q120K+S159K，Q70K+Q90K+Q120K+H170K，Q70K+Q90K+T133K+S159K，Q70K+Q90K+T133K+H170K，Q70K+Q90K+S159K+H170K，Q70K+T105K+Q120K+T133K，Q70K+T105K+Q120K+S159K，Q70K+T105K+Q120K+H170K，Q70K+T105K+T133K+S159K，Q70K+T105K+T133K+H170K，Q70K+T105K+S159K+H170K，Q70K+Q120K+T133K+S159K，Q70K+Q120K+T133K+H170K，Q70K+T133K+S159K+H170K，Q90K+T105K+Q120K+T133K，Q90K+T105K+Q120K+S159K，Q90K+T105K+Q120K+H170K，Q90K+T105K+T133K+S159K，Q90K+T105K+T133K+H170K，Q90K+T105K+S159K+H170K，Q90K+Q120K+T133K+S159K，Q90K+Q120K+T133K+H170K，Q90K+Q120K+S159K+H170K，Q90K+T133K+S159K+H170K，T105K+Q120K+T133K+S159K，T105K+Q120K+T133K+H170K，T105K+Q120K+S159K+H170K，T105K+T133K+S159K+H170K，或Q120K+T133K+S159K+H170K，其中的取代H170K可以用H170Q或H170R代替。
            
具有至少一個被引入和一個被去除的賴氨酸的多肽優選包含至少一個，例如一個，二個，三個或四個選自K16R，K16Q，K23R，K23Q，K34R，K34Q，K40R和K40Q的取代，更優選至少一個K16R取代，以便避免該殘基的偶聯。優選，上述多肽包含至少一個選自K16R+K23R，K16R+K34R，K16R+K40R，K23R+K34R，K23R+K40R，K34R+K40R，K16R+K23R+K34R，K16R+K23R+K40R，K23R+K34R+K40R，K16R+K34R+K40R和K16R+K23R+K34R+K40R的取代。在一個優選實施方案中，該多肽包括取代K16R+K34R+K40R，但第23位的賴氨酸未發生改變。如上所述，本段所列的用于去除賴氨酸殘基的每一種取代或取代組合，可以適當地與本文公開的用于引入賴氨酸殘基的任何其它取代一起使用，尤其可以與上一段列舉的取代一起使用。
            
在一個具體實施方案中，所述多肽包括取代K16R，K34R，K40R，T105K和S159K，并且與2-6(通常3-6)個分子量約1000-10,000Da的聚乙二醇組分偶聯。
            
在一個實施方案中，本發明偶聯物在T133位糖基化，即該位置相對于野生型hG-CSF未發生改變。這是一個天然糖基化位點。或者，偶聯物也可以不發生糖基化，但優選糖基化的偶聯物。
            
尤其，偶聯物可以與2-6(通常3-6)個分子量約5000-6000Da的聚乙二醇組分相連，例如與分子量約5kDa的mPEG相連。優選偶聯物連接有4-5個分子量約5000-6000Da的聚乙二醇組分，例如5kDa mPEG。
            
在另一實施方案中，所制備的偶聯物可以僅與單一數量的PEG組分相連，例如每一多肽與2，3，4，5或6個PEG組分相連，或者是與不同數量的PEG組分相連的多肽偶聯物混合物，例如具有2-5，2-4，3-5，3-4，4-6，4-5，或5-6個連接的PEG組分的混合物。如上所述，優選的偶聯混合物的一個實例也具有4-5個約5kDa的PEG組分。
            
可以理解，具有特定數量的相連的PEG組分的偶聯物，或者具有一定數量范圍的相連的PEG組分的偶聯物的混合物，可以通過選擇合適的PEG化條件來獲得，并且還可以通過利用隨后的純化來分離具有所需數量的PEG組分的偶聯物。分離具有不同數量的PEG組分的G-CSF分子的方法實例如下。所連接的PEG組分的數量可通過例如SDS-PAGE來確定。為了本發明的目的，如果一種多肽偶聯物經SDS-PAGE凝膠分離后，除了與給定數量的PEG組分相對應的數條帶以外，未顯示出其它帶或者僅顯示微弱的其它帶，則可以認為該多肽偶聯物連接了所述給定數量的PEG組分。例如，一份多肽偶聯物樣品經SDS-PAGE凝膠分離后，顯示出分別對應于4和5個PEG基團的帶，而對應于3或6個PEG基團的帶很微弱或者根本未出現，則可以認為該多肽偶聯物連接了4-5個PEG基團。
            
如上所述，優選非多肽組分是聚合物分子，優選選自線性或分支的聚乙二醇或另一種聚環氧烷。優選的聚合物分子有來自Shearwater Corp.的mPEG-SPA(尤其SPA-mPEG 5000)，或氧基羰基-氧-N-二羧酰亞胺PEG(US5,122,614)。
            
可以理解，在這一章節中具體提到的任何氨基酸變更(尤其取代)，可以與公開了具體氨基酸修飾(尤其糖基化位點的引入和/或去除)的本發明其它章節中具體提到的任何氨基酸變更(優選取代)組合。
            
本發明的糖基化偶聯物除了如上所述具有引入的和去除的賴氨酸殘基以外，本發明偶聯物還可以通過在糖基化宿主細胞中表達所述多肽，而在hG-CSF的天然糖基化位點(T133)和/或引入的(一或多個)糖基化位點發生糖基化，使最終得到的偶聯物包含一或多個糖組分。所述偶聯物因此可以是具有G-CSF活性的糖基化多肽，其包含不同于SEQ ID NO1的氨基酸序列，所述不同在于通過選自下組的至少一種取代將至少一個非天然糖基化位點引入氨基酸序列中L3N+P5S/T，P5N，A6N，S8N+P1OS/T，P10N，Q11N+F13S/T，S12N+L14S/T，F13N+L15S/T，L14N+K16S/T，K16N+L18S/T，E19N+V21S/T，Q20N+R22S/T，V21N+K23S/T，R22N+I24S/T，K23N+Q25S/T，Q25N+D27S/T，G26N+G28S/T，D27N+A29S/T，A29N+L31S/T，A30N+Q32S/T，E33N+L35S/T，A37N+Y39S/T，T38N+K40S/T，Y39N+L41S/T，P44N+E46S/T，E45N+L47S/T，E46N+V48S/T，V48N+L50S/T，L49N+G51S/T，L50N+H52S/T，H52N+L54S/T，S53N+G55S/T，P60N，L61N，S63N+P65S/T，P65N+Q67S/T，S66N+A68S/T，Q67N+L69S/T，A68N+Q70S/T，L69N+L71S/T，Q70N+A72S/T，L71N+G73S/T，G73N+L75S/T，S76N+L78S/T，Q77N+H79S/T，L78N，S80N+L82S/T，F83N+Y85S/T，Q86N+L88S/T，G87N+L89S/T，Q90N+L92S/T，E93N+I95S/T，P97N+L99S/T，L99N+P101S/T，P101N+L103S/T，T102N+D104S/T，D104N+L106S/T，T105N+Q107S/T，Q107N+D109S/T，L108N+V110S/T，D109N+A111S/T，A111N+F113S/T，D112N+A114S/T，F113N，T115N+1117S/T，T116N+W118S/T，W118N+Q120S/T，Q119N+M121S/T，Q120N+E122S/T，M121N+E123S/T，E122N+L124S/T，E123N+G125S/T，L124N+M126S/T，M126N+P128S/T，P128N+L130S/T，L130N+P132S/T，P132N+Q134S/T，T133N+G135S/T，Q134N+A136S/T，A136N+P138S/T，P138N+F140S/T，A139N+A141S/T，A141N+A143S/T，S142N+F144S/T，A143N+Q145S/T，F144N+R146S/T，Q145N+R147S/T，R146N+A148S/T，R147N+G149S/T，S155N+L157S/T，H156N+Q158S/T，S159N+L161S/T，L161N+V163S/T，E162N，V163N+Y165S/T，S164N+R166S/T，Y165N+V167S/T，R166N+L168S/T，V167N+R169S/T，L168N+H170S/T，R169N+L171S/T和H170N+A172S/T，其中S/T代表一個S或T殘基，優選T殘基。
            
可以理解，為了制備依照這一方面的偶聯物，所述多肽必須在能夠將寡糖組分連接到糖基化位點的糖基化宿主細胞中表達，或者使多肽在體外得到糖基化。糖基化宿主細胞的實例在下文的題為“與寡糖組分的偶聯”的章節中給出。
            
或者，依照這一方面的偶聯物包含具有G-CSF活性的多肽，該多肽包含不同于SEQ ID NO1的氨基酸序列，所述不同在于至少一個選自P5N，A6N，P10N，P60N，L61N，L78N，F113N和E162N，更優選選自PSN，A6N，PION，P60N，L61N，F113N和E162N，例如選自P60N，L61N，F113N，E162N中的取代。
            
或者，本發明該方面的偶聯物包含顯示G-CSF活性的多肽，該多肽含有不同于SEQ ID NO1的氨基酸序列，所述不同在于至少一個選自下組的取代D27N+A29S，D27N+A29T，D104N+L106S，D 104N+L106T，D109N+A111S，D109N+A111T，D112N+A114S和D112N+A114T，更優選選自D27N+A29S，D27N+A29T，D104N+L106S，D104N+L106T，D112N+A114S，和D112N+A114T，如選自D27N+A29S，D27N+A29T，D104N+L106S，和D104N+L106T。
            
制備本發明偶聯物的方法在以下“與聚合物分子的偶聯”和“與寡糖組分的偶聯”的章節中，描述了與特定類型非多肽組分的偶聯。一般來說，本發明多肽偶聯物可以如下制備在有益于所述多肽表達的條件下培養適當的宿主細胞，并收獲所述多肽，之后使所述多肽與非多肽組分體外偶聯。在含有至少一個N-或O-糖基化位點的糖基化多肽的情況中，優選利用能進行體內糖基化的真核宿主細胞來實現糖基化。
            
與聚合物分子的偶聯將與多肽偶聯的聚合物分子可以是任何一種適當的聚合物分子，例如天然的或合成的均聚物或雜聚物，通常多肽與分子量在大約300-100,000Da的范圍的分子偶聯，例如在大約500-20,000Da，更優選在大約1000-15,000Da，甚至更優選在大約2000-12,000Da，例如在大約3000-10,000的范圍之間的分子。本發明關于聚合物分子所使用的一詞“大約”是指一個大概范圍的分子量且反映這樣一個事實，即通常在給定的聚合物制品中會有一個確定的分子量分布。
            
均聚物的實例包括多羥基化合物(即聚-OH)，聚胺(即聚-NH2)和聚羧酸(即聚-COOH)。雜聚物是包含不同偶聯基團，例如羥基和胺基的聚合物。
            
適當的聚合物分子的實例包括選自聚環氧烷(PAO)，包括聚亞烷基二醇(PAG)，例如線性的或分支的聚乙二醇(PEG)和聚丙烯乙二醇(PPG)，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸酯(poly-carboxylate)，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯-共-馬來酸酐(polyethylene-co-maleic acid anhydride)，聚苯乙烯-共-馬來酸酸酐(polystyrene-co-maleic acid anhydride)，右旋糖酐，包括羧甲基右旋糖酐或任何其它的適合降低免疫原性和/或增加體內功能半壽期和/或血清半壽期的生物聚合物的聚合物分子。聚合物分子的另一實例是人白蛋白或另一高豐度血漿蛋白。通常，聚環氧烷來源的聚合物是適合生物的，無毒性的，無抗原性的，無免疫原性的，有各種水溶解特性，且易從活的生物體排泄。
            
PEG是優選的聚合物分子，因為與多肽例如右旋糖酐相比它僅有幾個能夠進行交叉連接的反應基團。尤其，單一功能的PEG，例如甲氧基聚乙二醇(mPEG)，因為它的偶聯化學反應相對簡單(僅僅一個反應基團可用于與多肽上的連接基團的偶聯)所以受到關注。因而，交叉連接的危險被排除，所產生的多肽偶聯物是較均一的且聚合物分子與多肽的反應比較容易受到控制。
            
為了實現聚合物分子和多肽的共價連接，提供的聚合物分子的羥基結尾的基團是活化的形式，即是功能性的反應基團。適當的活化的聚合物分子可以購買到，例如從Shearwater Polymers，Inc.，Huntsville，AL，USA，或從PolyMASC Pharmaceuticals plc，UK.購買到。或者，聚合物分子可以通過本領域已知的便利的方法，例如WO90/13540中公開的方法活化。本發明中應用的活化的線性或分支狀的聚合物分子的具體的實例在ShearwaterPolymers，Inc.1997 and 2000 Catalogs(Functionalized Biocompatible Polymersfor Research and pharmaceuticals，Polyethylene Glycol and Derivatives，納入本發明作參考)中描述。活化的PEG聚合物的具體實例包括以下線性PEGNHS-PEG(例如SPA-PEA，SSPA-PEG，SBA-PEG，SS-PEG，SSA-PEG，SC-PEG，SG-PEG，和SCM-PEG)，和NOR-PEG)，BTC-PEG，EPOX-PEG，NCO-PEG，NPC-PEG，CDI-PEG，ALD-PEG，TRES-PEG，VS-PEG，IODO-PEG，和MAL-PEG，和分支PEG例如PEG2-NHS以及那些在US5,932,462和US5,643,575中公開的聚合物，它們都被納入本發明作參考。進一步地，在以下被納入本發明作參考的出版物中，公開了有用的聚合物分子和/或PEG化化合物US5,824,778，US5,476,653，WO97/32607，EP229,108，EP402,378，US4,902,502，US5,281,698，US5,122,614，US5,219,564，WO92/16555，WO94/04193，WO94/14758，WO94/17039，WO94/18247，WO94/28024，WO95/00162，WO95/11924，W095/13090，WO95/33490，WO96/00080，WO97/18832，WO98/41562，WO98/48837，WO99/32134，WO99/32139，WO99/32140，WO96/40791，WO98/32466，WO95/06058，EP439508，WO97/03106，WO96/21469，WO95/13312，EP921131，US5,736,625，WO98/05363，EP809996，US5,629,384，WO96/41813，WO96/07670，US5,473,034，US5,516,673，EP605963，US5,382,657，EP510356，EP400472，EP183503和EP154316。
            
多肽和活化的聚合物分子的偶聯可通過應用任何便利的方法，例如按照以下參考文獻中描述的方法(這些文獻也描述了聚合物分子的適當的活化方法)進行R.F.Taylor，(1991)，″Protein immobilisation.Fundamental andapplications″，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，″Chemistry of ProteinConjugation and Crosslinking″，CRC Press，Boca Raton；G.T.Hermanson等，(1993)，″Immobilized Affinity Ligand Techniques″，Academic Press，N.Y.)。根據多肽的連接基團(實例在上面已給出)和聚合物的功能基團(例如胺，羥基，羧基，醛，sulfydryl，琥珀酰亞胺(succinimidyl)，馬來酰亞胺，乙烯基砜(vinysulfone)或鹵代醋酸鹽(haloacetate)技術人員知道所要應用的活化方法和/或偶聯化學。PEG化可以是直接指向多肽上所有可利用的連接基團(即被暴露在多肽表面的那些連接基團)的偶聯或者可以是直接指向一個或多個特定的連接基團，例如N末端氨基(US5,985,265)的偶聯。進一步地，偶聯可以以一步或逐步的方式完成(例如象WO99/55377描述的那樣)。
            
可以理解，通過設計PEG化作用可以制備出最佳的分子，使得所連接的PEG分子的數量、大小和形式(例如，線性還是分支)、以及它們在多肽中的連接位置都最佳。所用聚合物的分子量可根據預期效果進行選擇。例如，當偶聯的主要目的是獲得高分子量和較大體積的偶聯物(例如為了降低腎清除)時，可與一或幾個高分子量聚合物分子偶聯，或與很多個分子量較小的聚合物分子偶聯，以獲得所需效果。但優選，使用數個分子量相對較低的聚合物分子。當需要較大程度地掩蔽表位時也是如此。這時，可以應用例如分子量約5,000Da的2-8個聚合物，例如3-6個這樣的聚合物。如以下列舉的實例，與應用較少的具有較高分子量的聚合物分子(例如1-3個分子量為12,000-20,000的分子)相比，應用較多的具有較低分子量的聚合物分子(例如4-6個分子量為5000的分子)，在改善多肽偶聯物的體內功能半壽期方面更有優點，即使當這兩種情況中所連接的聚合物分子的總分子量相同時，也是如此或類似。可以相信，較小分子量的較多的聚合物分子的存在比例如單獨一個較大的聚合物分子可以為多肽提供較大的半徑或外觀形狀，至少當聚合物分子是相對均一地分布在多肽表面時情況是這樣的。
            
另外還發現，當本發明偶聯物的至少一個主要部分的表觀大小(也稱“表觀分子量”或“表觀質量”)為至少約50kDa，優選至少約55kDa，更優選至少約60kDa，例如至少約66kDa時，能獲得較有利的結果。我們相信這可歸因于以下事實對于具有相當大的表觀大小的偶聯物而言，腎清除基本上消失了。在本文上下文中，G-CSF偶聯物或多肽的“表觀大小”通過以下實施例章節中描述的SDS-PAGE方法來確定。
            
術語“主要部分”的使用與本發明多肽偶聯物通常含有多個單獨的偶聯物且它們與不同數量的非多肽組分相連的事實有關。例如，給定的多肽在給定的一套PEG化條件中進行PEG化，可以得到一種組合物，其中大多數的多肽偶聯物個體與例如3-5個PEG基團連接，絕大多數的偶聯物連接4個PEG基團。很顯然，這些偶聯物分子彼此的表觀分子量是不同的。在這個實例中，如果我們假定G-CSF多肽與分子量為5kDa的PEG基團偶聯，則僅與3個PEG基團偶聯的那些偶聯物在SDS-PAGE凝膠上表現為表觀分子量小于約50kDa的帶，而與4或5個PEG基團偶聯的那些偶聯物則產生明顯較大的表觀分子量的帶，很可能它們全部都大于約50kDa。因此，在這個實例中，在SDS-PAGE凝膠上將出現3種主要的帶，它們分別對應于與3，4，或5個PEG基團偶聯的偶聯物。因此，術語“主要部分”在本說明書和權利要求書的上下文中是指，SDS-PAGE凝膠上的上述主要帶至少有一種對應于所指明的最低表觀分子量。
            
優選，單獨的偶聯物分子有至少50％具有上述的最低表觀大小。更優選，偶聯物分子有至少60％具有所述最低表觀大小，還更優選至少70％，75％，80％或85％。最優選，偶聯物分子有至少90％具有上述的最低表觀大小，即至少50kDa且優選更大，例如至少55kDa或60kDa。
            
可以理解，偶聯物或多肽的表示為kDa的表觀大小不必與該偶聯物或多肽的實際分子量一致。這種表觀大小更有可能反映的是真實的分子量以及總體質量這二者。由于在大多數情況中，一或多個PEG基團或其它非多肽組分的連接可以使與之連接的多肽的質量大大增加，故本發明多肽偶聯物的表觀大小通常超過該偶聯物的真實分子量。因此，考慮到腎清除，本發明偶聯物可以很容易地表現出分子量大于例如66kDa(對應于表觀大小)的多肽的特征、但其實際分子量卻小于66kDa。我們相信，表觀大小上的這種效應是導致以下現象的原因連接例如4個5kDa的PEG基團的結果要超出僅連接一個20kDa的PEG基團的多肽。
            
盡管僅將單個聚合物分子連接在蛋白上的單個連接基團上不是優選的情況，但在僅連接一個聚合物分子的事件中，如果該聚合物分子(線性或分支的都可以)具有相對較高的分子量，例如約20kDa，通常較有利。
            
在另一個優選實施方案中，本發明的偶聯物具有1)至少一個表觀分子量至少約50kDa的主要部分和2)與上述hG-CSF相比降低的體外生物學活性(降低的受體結合親和力)。我們發現，這樣的偶聯物由于表觀大小較大而導致腎清除水平較低，并且由于體外生物學活性較低(受體結合親和力較低)而導致受體介導的清除水平較低。總體結果在以下方面是非常優秀的有效刺激中性粒細胞、顯著增加體內半壽期、因此而長時間發揮作用從而帶來重要的臨床效益。
            
通常，聚合物的偶聯是在使盡可能多的可利用的聚合物連接基團與聚合物分子反應的條件下進行的。這可以通過使聚合物相對于多肽(連接位點的數量)適當摩爾過量的方式達到。活化的聚合物分子與多肽連接位點的典型摩爾比最多約1000-1，例如最多約200-1或最多約100-1。但在一些情況中，例如，在需要較低程度的聚合物連接時，上述比例可以有所降低，例如最多約50-1，10-1或5-1。
            
本發明對聚合物分子通過一個接頭與多肽偶聯也進行了研究。適當的接頭對技術人員來說是熟知的。優選的實例是氰尿酰氯(Abuchowski等，(1977)，J.Biol.Chem.252，3578-3581；US 4,179,337；Shafer等，(1986)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.，24，375-378)。
            
偶聯后，按本領域已知的方法如通過將伯胺加入到反應混合物中而封閉殘留的活化聚合物分子，并通過合適的方法除去所產生的失活的聚合物分子(參見材料與方法)。
            
在一個優選實施例中，本發明的多肽偶聯物包含PEG分子，其與所述多肽中可用于PEG化的一些、大多數或優選基本上全部賴氨酸殘基連接，所述PEG分子尤其是線性或分支的PEG分子，例如分子量約1-15kDa，通常約2-12kDa，例如約3-10kDa，例如約5或6kDa的PEG分子。
            
可以理解，根據多種情況，例如多肽的氨基酸序列，所用活化PEG化合物的性質和特定的PEG化條件，包括PEG與多肽的摩爾比，可獲得不同程度的PEG化，較高程度的PEG化通常可以通過PEG與多肽的較高比率獲得。然而，由任何給定的PEG化過程所產生的PEG化多肽，通常將包含PEG化程度略有差異的多肽偶聯物的隨機分布。必要時，這種與不同數量的PEG組分相連的多肽的混合物，可以利用以下實施例中描述的方法進行純化，從而獲得具有更單一的PEG化程度的產物。
            
在另一實施例中，本發明的多肽偶聯物包括連接至可用于PEG化多肽賴氨酸殘基上的PEG分子，和另外連接至多肽的N末端氨基酸殘基上的PEG分子。
            
與寡糖組分的偶聯與寡糖組分的偶聯可以在體內或體外進行，優選體內。為了完成包含一個或多個糖基化位點的G-CSF分子的體內糖基化，必須將編碼多肽的核苷酸序列插入到可糖基化的真核表達宿主中。表達宿主細胞可選自真菌(絲狀真菌或酵母)、昆蟲、動物細胞，或選自轉基因植物細胞。在一個實施方案中，宿主細胞是哺乳動物細胞，如CHO細胞、BHK細胞或HEK細胞，如HEK293，或昆蟲細胞，如SF9細胞，或者酵母細胞如釀酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)、畢赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)或下文描述的任何宿主細胞。也可利用糖(右旋糖酐)與多肽氨基酸殘基的體外共價偶聯，例如，按照WO87/05330和Aplin等，CRC Crit Rev.Biochem.，pp.259-306，1981中所描述的方法進行。
            
寡糖組分或PEG與蛋白-和肽-結合的Gln殘基的在體外的偶聯可通過谷氨酰胺轉移酶(TG酶)來實現。在所謂交聯反應中谷氨酰胺轉移酶催化供體的胺基轉移到蛋白結合型和肽結合型的Gln殘基上。供體的胺基可以是蛋白結合型或肽結合型的，例如象賴氨酸殘基中的ε胺基，或者可以是小的或大的有機分子的一部分。在谷氨酰胺轉移酶催化的交聯中一個可起胺基供體作用的小的有機分子的實例是腐胺(1，4丁二胺)。在谷氨酰胺轉移酶催化的交聯中起胺基供體作用的較大的有機分子的一個實例是包含胺基的PEG(Sato等，Biochemistry 35，13072-13080)。
            
通常，谷氨酰胺轉移酶是高度特異性的酶，不是每個暴露在蛋白質表面的Gln殘基都可以在谷氨酰胺轉移酶的催化下交聯到包含胺基的底物上。相反，僅僅幾個Gln殘基可自然起到谷氨酰胺轉移酶底物的功能，但決定哪一個Gln-殘基是好的谷氨酰胺轉移酶底物的準確標準尚未可知。所以，為了使蛋白易于進行谷氨酰胺轉移酶催化的交聯反應，通常在方便的位置添加已知可以很好地行使谷氨酰胺轉移酶底物功能的氨基酸序列是首要條件。已知幾種氨基酸序列本身是或者包含極好的天然谷氨酰胺轉移酶底物例如P物質，快反應型彈性蛋白酶抑制肽，血纖蛋白原，纖連蛋白，α2纖溶酶抑制物，α酪蛋白和β酪蛋白。
            
功能性位點的封閉已經報道聚合物的過度偶聯可導致與聚合物偶聯的多肽活性喪失。消除該問題的方法可以是，例如去除位于功能性位點的連接基團，或在偶聯前封閉功能性位點、從而在偶聯時功能性位點處在被封閉狀態。后一種策略構成本發明進一步的技術方案(第一種策略在上文中進行了舉例說明，如通過去除鄰近功能性位點的賴氨酸殘基)。更具體來說，按照第二種策略，多肽和非多肽組分之間的偶聯是在多肽功能性位點在能夠結合多肽功能性位點的輔助分子封閉的條件下進行的。
            
優選地，輔助分子能特異性識別多肽的功能性位點，如受體，特別是G-CSF受體或G-CSF受體的一部分。另外，輔助分子可以是抗體，特別是識別顯示G-CSF活性的多肽的單克隆抗體。特別是，輔助分子可以是中和性單克隆抗體。
            
所述多肽可以在偶聯之前與輔助分子相互作用。這確保多肽的功能性位點被掩蓋或保護并因此不能被非多肽組分如聚合物衍生。從輔助分子洗脫后，非多肽組分和多肽之間的偶聯可用至少部分保留的功能性位點來恢復。
            
具有被封閉的功能性位點的多肽與聚合物、寡糖組分或任何其它化合物的隨后偶聯，以常規方式進行，如上文所述。
            
不考慮用于掩蓋偶聯物中多肽功能性位點的輔助分子的性質，理想的是輔助分子不含或僅僅含有少量的與分子中指定非多肽組分結合的基團，其中與這些基團的偶聯將阻止偶聯的多肽從輔助分子上解除吸附。因此，可與多肽非掩蓋部分中存在的連接基團選擇性偶聯并且輔助分子可反復用于重復偶聯。例如，如果非多肽組分是聚合物分子如PEG這種具有賴氨酸ε氨基或N-末端氨基酸殘基作為連接基團的分子時，理想的是輔助分子基本上不含可偶聯的ε氨基，優選不含任何ε氨基。因此，在優選的實施方案中，輔助分子是能夠與多肽功能性位點結合的蛋白質或肽，該蛋白質或肽不含任何與指定非多肽組分可偶聯的連接基團。
            
本發明的實施例中多肽偶聯物是從多種多樣的編碼目的多肽的核苷酸序列中制備的，功能基團的阻斷是在偶聯之前在微滴定板中實現的，例如，將表達出來的多肽變體加入到包含被固定的阻斷基團，例如受體，抗體或類似物的微滴定板中。
            
在另一實施例中，輔助分子首先與固相，例如柱充填材料，例如交聯葡聚糖或瓊脂糖珠，或一種表面，例如反應器皿共價連接。隨后，將多肽裝載到攜帶輔助分子的柱體材料上，然后依照本領域熟知的方法，例如按照上文所述進行偶聯。該方法允許多肽偶聯物通過洗脫與輔助分子分離。多肽偶聯物通過常規技術在不導致多肽偶聯物實質性降解的物理化學條件下洗脫。包含多肽偶聯物的液相從固相中被分離，但輔助分子仍然與多肽偶聯物共價連接。所述分離可以用其它的方法實現例如，輔助分子可以用一個第二分子(例如生物素)衍生，所述第二分子可以被一個特異性結合物(例如鏈霉抗生物素)識別。可以將特定的結合物與固相連接，這樣使多肽偶聯物與輔助分子-第二分子復合物在經過第二個輔助物-固相柱時得到分離，在隨后洗脫時，輔助分子-第二分子復合物保留在固相柱上，而多肽偶聯物從柱上被洗脫下來。多肽偶聯物可以任何適當的方式從輔助分子中釋放出來。通過提供輔助分子從與其結合的G-CSF的功能位點分離的條件可解除保護作用。例如，聚合物偶聯的抗體和抗獨特型抗體之間形成的復合物可以通過將pH值調整到酸性或堿性pH水平得到解離。
            
帶標記的多肽的偶聯在另一實施方案中，多肽與標記物(即通常由1-30，例如1-20個氨基酸殘基組成的一段氨基酸序列或肽片段)以融合蛋白的形式表達。除了能使純化快速和容易外，該標記物還是被標記的多肽和非多肽組分之間實現偶聯的便利工具。尤其，標記物可以用來完成微滴定板中的偶聯或通過標記物將標記后的多肽固定到其它載體，例如順磁性珠上。在微滴定板上與標記的多肽偶聯具有以下優點，標記的多肽可從培養肉湯直接固定在微滴定板上(原則上不經任何純化)并進行偶聯。因此，可減少操作步驟的總數(從表達到偶聯)。而且，標記物可起間隔臂分子的作用以確保更易于使固定的多肽偶聯。使用標記多肽進行的偶聯可以是與本文中公開的任何非多肽組分的偶聯，如與聚合物分子如PEG的偶聯。
            
所要應用的特定標記物的特征并不重要，只要該標記物能夠和多肽一起被表達且能夠被固定到適當的表面或載體物質上。可以市場上購買到許多適當的標記物，例如購自Unizyme boratories，Denmark。例如，所述標記物可以是任一下列序列Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-Gln(SEQ ID NO5)His-His-His-His-His-His(SEQ ID NO9)Met-Lys-His-His-His-His-His-His(SEQ ID NO10)Met-Lys-His-His-Ala-His-His-Gln-His-His(SEQ ID NO11)Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln(SEQ ID NO12)或以下的任何序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO13)(在Mol.Cell.Biol.C 53610-16，1985中描述的C末端標記物)DYKDDDDK(SEQ ID NO14)(C末端或N末端標記物)YPYDVPDYA(SEQ ID NO15)也可以從市場上獲得抗上述標記物的抗體，例如可購自ADI，Aves Laband Research Diagnostics。
            
應用標記后的多肽進行PEG化便利方法在以下材料與方法部分描述。隨后可以用從市場上可購到的酶將標記物從多肽中切割下來。
            
制備本發明的多肽或本發明偶聯物的多肽組分的方法本發明的多肽或偶聯物的多肽部分，可選擇地，以糖基化形式，通過本領域熟知的任何適當的方法制備。所述方法包括構建編碼多肽的核苷酸序列并且在適當的轉化或轉染宿主中表達。然而，本發明的多肽也可以通過化學合成的方法制備(盡管這種方法的效率較低)，或者聯合應用化學合成和重組DNA技術。
            
編碼本發明的多肽或偶聯物的多肽部分的核苷酸序列可以通過分離或合成編碼親代G-CSF，例如具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的hG-CSF的核苷酸序列構建，然后改變核苷酸序列以引入(即插入或取代)或刪除(即去除或取代)相關的氨基酸殘基。
            
依照常規方法通過定點突變可便利地修飾核苷酸序列。或者，可通過化學合成核苷酸序列，例如通過應用一種寡聚核苷酸合成儀制備，其中寡聚核苷酸是在目的多肽的氨基酸序列的基礎上設計的，且優選那些有利于在制備重組多肽的宿主細胞中表達的那些密碼子。例如可以合成編碼目的多肽部分的幾個小寡核苷酸，然后通過PCR，連接反應或連接酶鏈反應(LCR)將所述寡核苷酸裝配起來(Barany，PNAS 88189-193，1991)。通常，每個寡核苷酸包含用于補足性裝配的5′或3′的懸垂部分。
            
可以應用另外的核苷酸序列修飾方法制備高產量篩選的多肽變體，例如，US5,093,257中公開的涉及同源交叉的方法，和涉及基因改組(shuffling)的方法，即二個或多個同源核苷酸序列的重組導致新的核苷酸序列與起初的核苷酸序列比較具有多個核苷酸改變。基因改組(也稱為DNA改組)涉及一個或多個隨機片段的循環和核苷酸序列的組裝，然后進行篩選以選擇編碼具有所需特性的多肽的核苷酸序列。為了進行同源基礎的核酸改組，核苷酸序列相關的部分優選至少50％相同，例如至少60％相同，更優選至少70％相同，例如至少80％相同。重組可以在體外或者體內進行。
            
適當的體外基因改組方法的實例由Stemmer等，(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA；vol.91，pp.10747-10751；Stemmer(1994)，nature vol.370，pp.389-391；Smith(1994)，Nature vol.370，pp.324-325；Zhao等，natureBiotechnology，1998，Mar；16(3)258-61；Zhao H.and Arnold，FB，1997，Vol.25.No.6 pp.1307-1308；Shao等，Nucleic Acids Research 1998，Jan 15；26(2)pp.681-83；WO95/17413公開。適當的體內改組方法的實例在WO97/07205中公開。其它的通過體外或體內重組的核酸序列的突變技術已由例如WO97/20078和US5,837,458公開。特定的改組技術的實例包括“家族改組”，“合成改組”和“計算機摹擬(in silico)改組”。家族改組涉及將來自不同種屬的同源基因的家族進行一個或多個改組循環，然后進行篩選或選擇。家族改組技術已由例如Crameri等，(1998)，nature vol.391，pp.288-291；Christians等，(1999)，nature Biotechnology vol.17，pp.259-264；Chang等，(1999)，nature Biotechnology vol.17，pp.793-797；and Ness等，(1999)，natureBiotechnology Vol.17，893-896公開。合成改組涉及提供重疊的合成寡核苷酸文庫，所述寡核苷酸是以例如目標同源基因序列比對為基礎的。將合成的寡核苷酸重組，然后將所形成的重組核酸序列進行篩選，如果需要，可將所形成的重組序列用于進一步的改組循環。合成改組技術在WO00/42561中公開。計算機摹擬改組中涉及DNA的改組程序，該改組程序是應用計算機系統進行或模擬的，所以部分或完全避免了核酸的人工操作。WO00/42560公開了計算機摹擬改組的技術。
            
一旦完成組裝(通過合成，定點突變或其它的方法)，即將編碼多肽的核苷酸序列插入到一種重組載體中，且可操作地連接到期望轉化的宿主細胞中G-CSF表達所需的調控序列上。
            
可以理解，不是所有的載體和表達調控序列都能同樣完好的表達編碼本文所述多肽的核苷酸序列。即使應用同樣的表達系統所有的宿主也不是都能同樣完好地行使其功能。然而，本領域中有一種技術可以在無不適當試驗的情況下對這些載體，表達調控序列和宿主進行選擇。例如，在選擇載體時，必須考慮到宿主，因為載體必須在宿主中復制或能夠整合到染色體中。也應該考慮載體的拷貝數量，其調控拷貝數量的能力，和任何其它的由載體編碼的蛋白的表達，例如抗生素標志物。在選擇表達調控序列時，也應該考慮許多因素。這些因素包括，例如，序列的相對長度，序列的可控制性，和該調控序列與編碼多肽的核苷酸序列的相容性，尤其要注意序列的可能的二級結構。選擇宿主時應該考慮宿主與所選載體的相容性，由核苷酸序列編碼的產物的毒性，宿主的分泌特性，宿主正確折疊多肽的能力，宿主的發酵或培養條件，和由核苷酸序列編碼的產物的純化的難易。
            
重組載體可以是自主復制的載體，即這種載體可以作為染色體外的實體存在，其復制獨立于染色體的復制，例如質粒。或者，載體也可以是這樣一種載體，當導入到宿主細胞時，其被整合到宿主細胞基因組中且同被整合的染色體一起復制。
            
載體優選是一種表達載體，在該表達載體中編碼本發明的多肽的核苷酸序列被可操作性地連接到核苷酸序列轉錄所需的另外的區段上。通常，載體來源于質粒或病毒DNA。本發明中提到的在宿主細胞中表達的許多適宜的表達載體可從商業渠道購買或者在文獻中有描述。用于真核宿主的表達載體包括，例如來自SV40，牛乳突淋瘤病毒，腺病毒和細胞巨化病毒的包含表達調控序列的載體。特定的載體是，例如pCDNA3.1(+)\Hyg(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)和pCI-neo(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。用于酵母細胞的表達載體包括2μ質粒和它們的衍生物，POT1(US4,931,373)，在Okkels，Ann.New York Acad.Sci.782，202-207，1996，和pPICZ A，B或C(Invitrogen)中描述了pJS037載體。用于昆蟲細胞的載體包括pVL941，pBG311(Cate等，″Isolation of the Bovine and Human Genes for MullerianInhibiting Substance And Expression of the Human Gene In Animal Cells″，細胞45，pp.685-98(1986)，pBluebac 4.5和pMelbac(兩者都可以從Invitrogen獲得)。用于細菌宿主的表達載體包括已知的細菌質粒，例如來自大腸桿菌的質粒，包括pBR322，pET3a和pET12a(兩個都來自Novagen Inc.，WI，USA)，較寬宿主范圍的質粒，例如RP4，噬菌體DNA，例如λ噬菌體的許多衍生物，例如NM989，及其它的DNA噬菌體，例如M13和絲狀單鏈DNA噬菌體。
            
本發明中應用的其它載體包括允許編碼多肽的核苷酸序列以一定的拷貝數擴增的那些載體。上述可擴增的載體在本領域中已熟知。它們包括，例如能夠通過DHFR擴增(參見，例如，Kaufman，U.S.Pat.No.4,470,461，Kaufman和Sharp，″Construction Of A Modular Dihydrafolate Reductase cDNAGeneAnalysis Of Signals Utilized For Efficient Expression″，Mol.Cell.Biol.，2，pp.1304-19(1982))和谷氨酰胺合成酶擴增(″GS″)的載體(參見，例如，US5,122,464和EP338,841)。
            
重組載體可進一步包含能夠使所述載體在所述宿主細胞中復制的DNA序列。此序列的一個例子(宿主細胞是哺乳動物細胞時)是SV40的復制起始點。當宿主細胞是酵母細胞時，能夠使載體復制的合適序列是酵母質粒2μ復制基因REP1-3和復制起始點。
            
載體也可含有能選擇的標記，如基因，其產物補充宿主細胞的缺陷，如編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)或粟酒裂殖酵母TPI的基因(P.R.Russell，Gene 40，1985，pp.125-130)，或者賦予對藥物如氨芐青霉素、卡那霉素、四環素、氯霉素、新霉素、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性的基因。對于絲狀真菌來說，能選擇的標記包括amdS、pyrG、arcB、niaD、sC。
            
術語“控制序列”在本文中包括對本發明多肽表達必需的或有利的所有成分。每個控制序列對編碼多肽的核苷酸序列來說可以是天然的或外來的。這些控制序列包括但不限于前導區、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、增強子或上游活化序列、信號肽序列和轉錄終止子。控制序列至少包括啟動子。
            
本發明可以使用各種各樣的表達控制序列。這些可使用的表達控制序列包括與前述表達載體的結構基因相連的表達控制序列以及已知控制原核或真核細胞或其病毒的基因表達的任何序列及其各種組合。
            
哺乳動物細胞中指導轉錄的合適控制序列的實例包括SV40和腺病毒的早期或晚期啟動子，如腺病毒2的主要晚期啟動子、MT-1(金屬硫蛋白基因)啟動子、人巨細胞病毒立即早期基因啟動子(CMV)、人延伸因子1α(EF-1α)啟動子、果蠅最小熱休克蛋白70啟動子、勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動子、人遍在蛋白C(UbC)啟動子、人生長激素終止子、SV40或腺病毒E1b區聚腺苷酸化信號和Kozak共有序列(Kozak，M.J Mol Biol 1987 Aug 20；196(4)947-50)。
            
為了改善在哺乳動物細胞中的表達，可以將合成的內含子插入編碼所述多肽的核苷酸序列的5’未翻譯區。合成內含子的實例是來自質粒pCI-Neo的合成內含子(購自Promega Corporation，WI，USA)。
            
昆蟲細胞中指導轉錄的合適控制序列的實例包括多角體蛋白啟動子、P10啟動子、苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)多角體病毒堿性蛋白啟動子、桿狀病毒立即早期基因1啟動子和桿狀病毒39K延遲早期基因啟動子和SV40聚腺苷酸化序列。在酵母宿主細胞中使用的合適控制序列的實例包括酵母α交配系統的啟動子、酵母丙糖磷酸異構酶(TPI)啟動子、來自酵母糖酵解基因或乙醇脫氫酶基因的啟動子、ADH2-4c啟動子和誘導型GAL啟動子。在絲狀真菌宿主細胞中使用的合適控制序列的實例包括ADH3啟動子和終止子，由編碼如下酶的基因衍生的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶丙糖磷酸異構酶或堿性蛋白酶、黑曲霉α淀粉酶、黑曲霉或構巢曲霉(A.Nidulans)葡糖淀粉酶、構巢曲霉乙酰胺酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶或脂肪酶，TPI1終止子和ADH3終止子。在細菌宿主細胞中使用的合適控制序列的實例包括lac系統、trp系統、TAC或TRC系統的啟動子和噬菌體λ的主要啟動子區域。
            
信號肽的存在與否取決于，例如用于生產需要表達的多肽(細胞內或細胞外多肽)的表達宿主細胞、以及是否需要分泌。為了在絲狀真菌中使用，信號肽可以由編碼曲霉屬菌株的淀粉酶或葡糖淀粉酶的基因、編碼米赫根毛霉脂肪酶或蛋白酶或Humicola lanuginosa脂肪酶的基因方便衍生。信號肽優選由編碼米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩定淀粉酶或黑曲霉葡糖淀粉酶的基因衍生。為了在昆蟲細胞中使用，信號肽可以由昆蟲基因方便地衍生(參見WO90/05783)，如鱗翅目Manduca sexta脂動激素前體(US5023328)、蜜蜂蜂毒素(Invitrogen)、蛻皮甾類UDP葡糖基轉移酶(egt)(Murphy等，Protein Expression and Purification 4，349-357(1993))或人胰脂酶(hpl)(Methods in Enzymology 284，pp.262-272，1997)。哺乳動物細胞中使用的優選信號肽是hG-CSF的信號肽或鼠Igк輕鏈信號肽(Coloma，M(1992)J.Imm.Methods 15289-104)。為了在酵母細胞中使用，發現合適的信號肽是釀酒酵母α-因子信號肽(參見US4870008)、改良的羧肽酶信號肽(參見L.A.Valls等，Cell 48，1987，pp.887-897)、酵母BAR1信號肽(參見WO87/02670)和酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信號肽(參見M.Egel-Mitani等人，Yeast 6，1990，pp.127-137)和合成的前導序列TA57(WO98/32867)。已發現適宜于大腸桿菌的信號肽是ompA。
            
編碼顯示G-CSF活性的多肽的本發明核苷酸序列，無論是通過定點誘變、合成還是其它方法制備的，都可以包括也可以不包括編碼信號肽的核苷酸序列。多肽從表達該多肽的細胞中分泌時，存在信號肽。如果存在，此信號肽應當由選來用于表達多肽的細胞識別。信號肽可以與多肽同源(如，通常與G-CSF相連)或異源(即，來自于除hG-CSF之外的另一來源)或者可以與宿主細胞同源或異源，即是由宿主細胞正常表達的信號肽或是由宿主細胞非正常表達的。因此，信號肽可以是原核的如由細菌如大腸桿菌衍生的，或真核的，如由哺乳動物或昆蟲或酵母細胞衍生的。
            
可以使用任何合適的宿主產生本發明偶聯物的多肽或多肽部分，包括細菌、真菌(包括酵母)、植物、昆蟲、哺乳動物或其它合適的動物細胞或細胞系、以及轉基因動物或植物。細菌宿主細胞的實例包括革蘭氏陽性細菌如芽孢桿菌，如短芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌、或鏈霉菌，或革蘭氏陰性細菌，如大腸桿菌或假單孢菌菌株。可將載體引入細菌宿主細胞，例如可通過原生質體轉化(參見如Chang and Cohen，1979，Molecular General Genetics168111-115)，使用感受態細胞(參見如Young and Spizizin，1961，Journal ofBacteriology 81823-829，或Dubnau and Davidoff-Abelson，1971，Journal ofMolecular Biology 56209-221)、電穿孔(參見如Shigekawa and Dower，1988，Biotechniques 6742-751)或偶聯(參見如Koehler and Thorne，1987，Journal ofBacteriology 1695771-5278)來進行。合適的絲狀真菌宿主細胞的實例包括曲霉屬菌株，如米曲霉、黑曲霉或構巢曲霉，鐮刀菌屬或木霉菌屬。真菌細胞可以轉化，轉化過程涉及原生質體形成、原生質體轉化和細胞壁通過本身已知的方式再生。在EP238023和US5679543中描述了轉化曲霉屬宿主細胞的合適方法。在Malardier等1989，Gene 78147-156和WO96/00787中描述了轉化鐮刀菌屬的合適方法。合適的酵母宿主細胞的實例包括糖酵母屬的菌株，如釀酒酵母屬、裂殖酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬，如巴斯德畢赤酵母或P.Methanolica、漢遜酵母屬，如多形漢遜酵母或Yarrowia。酵母可使用Becker和Guarente，In Abelson，J.N.And Simon，M.I.，editors，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods in EnzymologyVolume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito等人，1983，Joumal of Bacteriology 153163；和Hinnen等人1978，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 751920中所述的方法和ClontechLaboratories，Inc，Palo Alto，CA，USA(在YeastmakerTMYeast TranformationSystem Kit的產品使用說明書)公開的來轉化。合適昆蟲宿主細胞的實例包括鱗翅目細胞系，如草地夜蛾(Sf9或Sf21)或粉紋夜蛾細胞(HighFive)(US5077214)。可以按Invitrogen所述方法轉化昆蟲細胞并在其中產生異源多肽。合適哺乳動物宿主細胞的實例包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系(如，CHO-K1；ATCC CCL-61)、綠猴細胞系(COS)(如，COS1(ATCCCRL-1650)、COS7(ATCC CRL-1651))；小鼠細胞(如，NS/O)、倉鼠幼鼠腎臟(BHK)細胞系(如，ATCC CRL-1632或ATCC CCL-10)和人細胞(如，HEK293(ATCC CRL-1573))，以及組織培養中的植物細胞。另外合適的細胞系在本領域中是已知的并可購自公開的保藏中心如美國典型培養物保藏中心，Rockville，Maryland。將外源性DNA引入哺乳動物宿主細胞的方法包括磷酸鈣介導的轉染、電穿孔、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂質體介導的轉染、病毒載體和由Life Technologies Ltd，Paisley，UK所述的使用Lipofectamin2000的轉染方法。這些方法在本領域中是已知的，例如Ausbel等(eds.)，1996，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，USA所述。按建立的方法進行哺乳動物細胞的培養，例如在Animal CellBiotechnology，Methods and Protocols，Nigel Jenkins編，1999，Human Press Inc，Totowa，New Jersey，USA and Harrison MA and Rae IF，General Techniques ofCell Culture，Cambridge University Press 1997中的公開的。
            
在本發明生產方法中，細胞用本領域已知的方法在適于生產多肽的營養培養基中培養。例如，細胞可以在實驗室中通過振搖燒瓶培養、小規模或大規模發酵(包括連續、成批、補料分批或固體狀態發酵)或在合適培養基和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行工業發酵來發酵。培養在含有碳和氮源和無機鹽的合適營養培養基中使用本領域已知的方法來進行。合適的培養基可商購或可以按公開的組成來制備(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中所述的)。如果多肽分泌在營養培養基中，多肽可從培養基中直接回收。如果多肽不被分泌，可從細胞裂解物中回收。
            
可通過本領域已知的方法來回收所得多肽。例如，可通過常規方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發或沉淀從營養培養基中回收多肽。
            
可通過本領域已知的各種方法來純化多肽，所述方法包括但不限于層析(如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(如，制備性等電聚焦)、溶解度差異(如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(參見，如Protein Purification，J.-C.Janson and Lars Ryden，編，VCH Publishers，NewYork，1989)。純化具有G-CSF活性的多肽的具體方法參見D.Metcalf和N.A.Nicola的The hemopoietic colony-stimulating factors，p.50-51，CambridgeUniversity Press(1995)，以及參見C.S.Bae等的Appl.Microbiol.Biotechnol，52338-344(1999)和US4,810,643。
            
本發明的藥物組合物及其應用本發明進一步包含本文所述多肽或偶聯物的組合物和至少一種可藥用載體或賦形劑。
            
用本發明的多肽，偶聯物或藥物組合物可以制備治療某些疾病的藥物，尤其用于預防正接受某些類型的化療，放療和骨髓移植治療的癌癥患者的感染，在外周血前體細胞移植時用于動員前體細胞匯聚，用于嚴重的慢性或相關的白細胞減少癥患者的治療，用于急性髓樣白血病患者的治療，用于AIDS病或其它免疫缺陷病的治療，和抗真菌治療，尤其用于對全身性或侵襲性念珠菌病的治療。
            
另一方面，本發明的多肽、偶聯物或藥物組合物可用于對一般(general)造血疾病(包括放療或化療引發的那些，尤其是中性粒細胞減少癥或白細胞減少癥)，AIDS或其它免疫缺陷病的患者進行治療的方法中，該方法包括對需要治療的哺乳動物施用上述多肽、偶聯物或藥物組合物。尤其是，所述方法旨在增加中性粒細胞水平不足(例如，由于化療，放療，或者HIV或另一種病毒感染所致)的患者體內中性粒細胞的水平。
            
將本發明的多肽和偶聯物以“治療有效的”劑量，即足以對給藥治療的疾病產生所期望的效果的劑量，給予患者。準確的劑量將根據所要治療的疾病決定，且可以由本領域技術人員用已知的技術確定。本發明的多肽或偶聯物可以例如用類似于rhG-CSF，例如Neupogen的治療劑量給藥。本發明偶聯物的適當劑量預計是在大約5-300μg/kg體重的范圍內(根據偶聯物的蛋白部分的重量)，10-200μg/kg，例如25-100μg/kg。本發明的多肽，偶聯物或組合物的有效量尤其依賴于，疾病，劑量和給藥的時間表，多肽或偶聯物或組合物是否單獨給藥或與其它的治療制劑結合給藥，組合物的血清半壽期，患者的一般健康狀況，和給藥的頻率，這些對本領域的技術人員來說是顯而易見的。優選，本發明的多肽，偶聯物，制品或組合物以有效量給予，尤其所給劑量足以使所涉及的患者體內白細胞，尤其是嗜中性粒細胞的數量達到正常。依照慣例以一定時間間隔簡單地計數白細胞可以確定白細胞數量是否已達到正常。
            
本發明的多肽或偶聯物優選以包含一個或多個可藥用載體或賦形劑的組合物形式給藥。可把多肽或偶聯物以本領域人人盡知的方式配制成藥物組合物以產生儲存十分穩定且適合對人或動物給藥的多肽藥物。可以將藥物組合物以多種形式配制，包括液態或凝膠體，或凍干的或任何其它的形式。優選形式取決于所要治療的具體指征，這一點對本領域的技術人員來說是顯而易見的。
            
因此，本發明提供治療各種形式的白細胞減少癥或中性粒細胞減少癥的組合物和方法。尤其本發明的多肽，偶聯物或組合物可用來預防正接受某些類型的放療，化療和骨髓移植的癌癥患者的感染，在外周血前體細胞移植時用于動員前體細胞匯聚，用于治療嚴重的慢性或相關的白細胞減少癥和用于患急性髓細胞性白血病患者的支持治療。另外，本發明的多肽，偶聯物或組合物可用于治療AIDS或其它的免疫缺陷病，用于抗真菌治療，尤其用于治療全身性或侵襲性念珠菌病，和用于治療細菌感染。
            
鑒于本發明的多肽偶聯物具有較長的體內半壽期，并已發現它們通過給藥單一劑量就能縮短中性粒細胞減少癥和白細胞減少癥的持續時間，而不象hG-CSF那樣必需每天給藥，故本發明的偶聯物非常適合于例如每周一次給藥以達到預防和/或治療中性粒細胞減少癥的目的。在一個實施方案中，本發明的多肽偶聯物或藥物組合物用于預防和/或治療由于化療引起的中性粒細胞減少癥。在通過靜脈注射或另一種形式的注射(如皮下注射或肌肉注射)而每周一次給藥進行化療的情況中，通常每次化療之前、之后或同時給藥單一劑量的本發明偶聯物就足夠達到效果了。在通過其它途徑給藥(例如每天一次口服或一段較長時間內通過輸液泵輸液)進行化療的情況中，本發明的偶聯物可以以類似的方式給藥，例如一周一次，或當化療次數少于一周一次時為每次化療給藥一次。
            
藥物形式本發明的多肽或偶聯物可以“原型”和/或以它們的鹽形式應用。適當的鹽包括，但不限于，堿金屬鹽或堿土金屬鹽，例如鈉，鉀和鎂鹽，和例如鋅鹽。這些鹽和復合物可以作為一種晶型和/或無定形的結構存在。
            
賦形劑“可藥用的”是指一種所使用的劑量和濃度在接受藥物的患者體內不產生任何不良作用的載體或賦形劑。上述可藥用的載體和賦形劑在本領域是人所共知的(參見Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th edition，A.R.Gennaro，Ed.，Mack Publishing Company  ；Pharmaceutical FormulationDevelopment of Peptides and Proteins，S.Frokjaer和L.Hovgaard，Eds.，Taylor& Francis  ；和Handbook of Pharmaceutical Excipients，3rd edition，A.Kibbe，Ed.，Pharmaceutical Press  )。
            
藥物的混合本發明的藥物組合物可以單獨給藥或與其它的治療劑結合給藥。可以將這些制劑作為同一藥物組合物的一部分給藥，或與本發明的多肽或偶聯物分開，同時給藥或按照另一治療時間表給藥。另外，本發明的多肽或偶聯物或藥物組合物可以用作對其它治療的一種輔助治療。
            
患者本發明中的“患者”既包括人和其它哺乳動物。因此所述方法可用于人類治療和獸用。
            
給藥途徑本發明配制劑可以通過多種方式給藥，包括但不限于，經口服、皮下、靜脈內、腦內、鼻內、真皮內、腹膜內、肌肉內、肺內、陰道內、直腸內、眼球內或以任何其它可接受的方式給藥。配制劑可以連續地灌輸給藥，也可以利用本領域熟知技術進行大藥丸注射(bolus injection)。一般情況下，將所述配制劑設計成適合于非胃腸道給藥，例如通過皮下途徑給藥。
            
非胃腸道給藥劑(Parentals)藥物組合物的實例是設計成非腸道給藥的溶液劑。盡管在很多情況下，藥物溶液劑可以以適用于立即使用的液體制劑形式提供，但所述非腸道制劑也可以以冷凍或凍干形式提供。在前者情況下，所述組合物在使用前必須解凍。后一劑型通常用于增強組合物中所包含的活性組分在各種貯存條件下的穩定性，正如本領域技術人員已知的那樣，凍干制劑通常比其液體相應物更穩定。所述凍干制劑在使用前通過加入一種或多種適宜的可藥用稀釋劑如滅菌注射用水或滅菌生理鹽水溶液重新配制。
            
在非胃腸道給藥的情況下，制成凍干制劑或水溶液備用，如通過將具有所需純度的多肽與一種或多種本領域常用的可藥用載體、賦形劑或穩定劑(統稱為“賦形劑”)適當混合來制備，賦形劑如緩沖劑、穩定劑、防腐劑、等滲劑、非離子去污劑、抗氧化劑和/或其它各種添加劑。
            
緩沖劑有助于將pH保持在接近生理條件的范圍中。它們通常以大約2mM-50mM的濃度范圍存在。本發明使用的合適緩沖劑包括有機和無機酸及其鹽如檸檬酸鹽緩沖劑(如，檸檬酸一鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸一鈉混合物等)、琥珀酸鹽緩沖劑(如，琥珀酸-琥珀酸一鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩沖劑(如，酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、富馬酸鹽緩沖劑(如，富馬酸-富馬酸一鈉混合物、富馬酸-富馬酸二鈉混合物、富馬酸一鈉-富馬酸二鈉混合物等)、葡萄糖酸(gluconate)鹽緩沖劑(如，葡萄糖酸-葡萄糖酸鈉混合物、葡萄糖酸-氫氧化鈉混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩沖劑(如，草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩沖劑(如，乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)和乙酸鹽緩沖劑(如，乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物等)。其它可能的緩沖劑是磷酸鹽緩沖劑、組氨酸緩沖劑和三甲胺鹽如Tris。
            
加入防腐劑來阻滯微生物生長，加入的量通常約為0.2％-1％(w/v)。本發明使用的合適防腐劑包括酚、苯甲醇、間甲酚、羥苯甲酸(paraben)甲酯、羥苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苯甲基銨氯化物、苯亞甲基鎓鹵化物(如苯亞甲基鎓氯化物、溴化物或碘化物)、氯化己烷雙胺、羥苯甲酸烷基酯如羥苯甲酸甲酯或羥苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇和3-戊醇。
            
可以加入等滲劑來確保液體組合物的等滲性，等滲劑包括多羥糖醇，優選三羥或更高級糖醇，如甘油、赤蘚醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。多羥基醇的量可為0.1％-25％重量比，通常為1％-5％，以其它組分的相對量計算。
            
穩定劑涉及一大類賦形劑，其功能范圍從膨脹劑到溶解治療劑的或有助于防止變性或與容器壁粘合的添加劑。通常的穩定劑可以是多羥糖醇(上文列舉的)；氨基酸如精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、丙氨酸、omithine、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、蘇氨酸等，有機糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水蘇糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括環醇如環己六醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫還原劑，如脲，谷胱甘肽、硫辛酸、巰基乙酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量多肽(即＜10個殘基)；蛋白質如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；單糖如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖；二糖如乳糖、麥芽糖和蔗糖；三糖如棉子糖，和多糖如葡聚糖。基于活性蛋白質重量計算，穩定劑通常的存在范圍為0.1-10000重量份。
            
可以存在非離子表面活性劑或清潔劑(也稱作“濕潤劑”)以有助于溶解治療劑以及保護治療性多肽來避免攪拌誘導的聚集，其也允許配方劑暴露于剪切表面壓力而沒有引起多肽變性。合適的非離子表面活性劑包括聚山梨酸酯(polysorbate)(20，80等)、polyoxamer(184，188等)、Pluronic多元醇、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單醚(Tween20、Tween80等)。
            
其它各種賦形劑包括膨脹劑或填充劑(如淀粉)、螯合劑(如EDTA)、抗氧化劑(如抗壞血酸、蛋氨酸、維生素E)和共溶劑。
            
活性組分也可以被包裹在制備的微囊中，例如通過coascervation技術或通過界面聚合制備的，例如羥甲基纖維素、明膠或聚(甲基甲丙烯酸酯)微囊，包裹在膠體狀藥物釋放體系(例如脂質體、白蛋白微球、微乳、納米顆粒和納米膠囊)中或包裹在大乳劑中。在Remington’s PharmaceuticalSciences(同上)中公開了這些技術。
            
體內給藥所使用的非胃腸道制劑必須是滅菌的。該過程容易完成，例如，通過無菌濾膜來過濾。
            
持續釋放制劑持續釋放制劑的合適例子包括含有多肽或偶聯物的固體疏水聚合物半滲透材料、具有合適形式如膜或微囊的材料。持續釋放材料的例子包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥基乙基甲丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如ProLease技術或Lupron Depot(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。聚合物如乙烯乙酸乙酯和乳酸-乙醇酸能夠長時間釋放分子如長達或超過100天，某些水凝膠在較短時間內釋放蛋白質。包囊中的多肽長時間保留在體內時，它們因在37℃潮濕的環境中暴露而變性或聚集，導致喪失生物學活性并且可能改變免疫原性。合理的穩定策略可根據所涉及的機理設計。例如，如果發現聚集機理是通過硫代二硫化物相互交換形成分子內S-S鍵，那么可通過修飾巰基、凍干酸性溶液、控制含濕量、使用適宜的添加劑和開發特異性聚合物基質組合物來達到穩定。
            
本文引用的所有參考文獻都以其全文引入作為參考。
            
本發明將通過以下的非限制性實施例做進一步描述。
            

            

            
圖1rhG-CSF(Neupogen)和SPA-PEG 5000-偶聯的hG-CSF K16RK34R K40R Q70K Q90K Q120K的體內半壽期。
            
圖2rhG-CSF(Neupogen)和SPA-PEG 5000-偶聯的hG-CSF K16RK34R K40R Q90K T105K Q159K的體內半壽期。
            
圖3在健康大鼠中，rhG-CSF(Neupogen)，SPA-PEG 5000-偶聯的hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q120K和SPA-PEG 5000-偶聯的hG-CSFK16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K的體內生物學活性。
            
圖4在健康大鼠中，rhG-CSF(Neupogen)，SPA-PEG 5000-偶聯的hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q120K T133K和SPA-PEG 5000-偶聯的hG-CSF K16R K34R K40R Q90K Q120K T133K的體內生物學活性。
            
圖5在健康大鼠中，rhG-CSF(Neupogen)，SPA-PEG 12000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R和不同劑量的SPA-PEG 5000-偶聯的hG-CSFK16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K的體內生物學活性。
            
圖6在健康大鼠中，rhG-CSF(Neupogen)，SPA-PEG 5000-偶聯的hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K，SPA-PEG 5000-偶聯的hG-CSF K16R K34R K40R Q90K T105K S159K和SPA-PEG 20000-偶聯的hG-CSF K16R K34R K40R T105K S159K的體內生物學活性。
            
圖7在患有化療引起的中性粒細胞減少癥的大鼠中，rhG-CSF(Neupogen)，SPA-PEG 5000-偶聯的hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90KT105K，和SPA-PEG 20000-偶聯的hG-CSF K16R K34R K40R Q90K的體內生物學活性。
            
圖8在患有化療引起的中性粒細胞減少癥的大鼠中，rhG-CSF(Neupogen)，SPA-PEG 5000-偶聯的hG-CSF K16R K34R K40R T105KS159K和SPA-PEG 5000-偶聯的hG-CSF K16R K34R K40R Q90K T105KS159K的體內生物學活性(白細胞計數)。
            
圖9在患有化療引起的中性粒細胞減少癥的大鼠中，rhG-CSF(Neupogen)和SPA-PEG 5000-偶聯的hG-CSF K16R K34R K40R T105KS159K的體內生物學活性(絕對中性粒細胞計數)。
            
圖10在患有化療引起的中性粒細胞減少癥的大鼠中，rhG-CSF(Neupogen)，帶有20kDa N-末端PEG基團的rhG-CSF(NeulastaTM)，以及產生于酵母和CHO細胞中的與SPA-PEG 5000-偶聯的hG-CSF K16R K34RK40R T105K S159K的體內生物學活性(白細胞計數)。
            
圖11在患有化療引起的中性粒細胞減少癥的大鼠中，rhG-CSF(Neupogen)，帶有20kDa N-末端PEG基團的rhG-CSF(NeulastaTM)，以及產生于酵母和CHO細胞中的與SPA-PEG 5000-偶聯的hG-CSF K16R K34RK40R T105K S159K的體內生物學活性(絕對中性粒細胞計數)。
            
序列表所附序列表包含以下序列SEQ ID NO1人G-CSF的氨基酸序列。
            
SEQ ID NO2編碼人G-CSF的合成的DNA序列，具有利于在大腸桿菌中最佳表達的密碼子使用特性。
            
SEQ ID NO3OmpA信號序列的氨基酸序列。
            
SEQ ID NO4編碼OmpA信號序列的合成的DNA序列。
            
SEQ ID NO5合成的組氨酸標記物。
            
SEQ ID NO6編碼SEQ ID NO5所示組氨酸標記物的合成的DNA序列。
            
SEQ ID NO7人G-CSF信號肽的氨基酸序列。
            
SEQ ID NO8編碼人G-CSF，包括SEQ ID NO7所示信號肽的，合成的DNA序列，其具有適于在CHO細胞中最佳表達的密碼子使用特性。
            
SEQ IDNO9-15各種人工合成的標記物材料與方法用于確定需要修飾的氨基酸的方法可接近的表面區域(ASA)通過NMR波譜儀確定的10種結構的3D全貌(Zink等，(1994)Biochemistry338453-8463)可從蛋白數據庫(Protein Data Bank)(PDB)(www.rcsb.org/pdb/)中獲得。可將該信息輸入計算機程序Access(B.Lee和F.M.Richards，J.Mol.Biol.55379-400(1971))版本2(Copyright1983 YaleUniversity)并用于計算結構中各個原子的可接近的表面區域(ASA)。該方法通常使用1.4大小的探針并將可接近的表面區域(ASA)定義為探針中心形成的面積。于該計算前，從坐標中去除所有水分子和所有氫原子，以及其它不與該蛋白質直接相連的原子。
            
側鏈的分部(fractional)ASA側鏈原子的分部ASA通過側鏈中原子的ASA總和除以延長的ALA-x-ALA三肽中該殘基類型側鏈原子的ASA代表值來計算。參見Hubbard，Campbell & Thornton(1991)J.Mol.Biol.220，507-530。在該例中，CA原子被看作甘氨酸殘基側鏈的一部分但不被看作其它殘基的一部分。下表表示側鏈的100％ASA標準Ala69.232Leu140.76   2Arg200.35   2Lys162.50   2Asn106.25   2Met156.08   2Asp102.06   2Phe163.90   2Cys96.692Pro119.65   2Gln140.58   2Ser78.162Glu134.61   2Thr101.67   2Gly32.282Trp210.89   2His147.00   2Tyr176.61   2Ile137.91   2Val114.14   2  
            
該結構中未探測到的殘基被定義為100％暴露，因為可以認為這些殘基位于彈性區域。
            
確定原子之間的距離用分子制圖軟件，例如InsightIIv.98.0，MSI INC可以非常容易地確定原子之間的距離。
            
關于要修飾的殘基的總體考慮事項如上所述，依照本發明需要修飾的氨基酸殘基優選是下述氨基酸殘基其側鏈表面是暴露的，尤其其側鏈的25％以上暴露在分子表面，更優選50％以上的側鏈暴露在分子表面。另一種考慮是優選將位于受體接觸面上的殘基排除以免其對受體的結合或活化可能產生干擾或至少使干擾降低到最小。進一步考慮的是應該將距離最近的lys(Glu，Asp)CB-CB(對Gly而言為CA)不足10的殘基排除。最后，優選的修飾部位具體是具有親水和/或帶電殘基，即Asp，Asn，Glu，Gln，Arg，His，Tyr，Ser和Thr的那些，具有精氨酸殘基的部位尤其優選。
            
鑒定需要修飾的G-CSF氨基酸殘基以下例舉了確定本發明所要修飾的氨基酸殘基時一般應該考慮的因素。
            
對應用X線晶體學(Hill等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905167-5171)和NMR波譜學方法(Zink等，(1994)Biochemistry338453-8463)得到的人G-CSF三維結構已有報道。如上所述，Aritomi等(nature 401713-717，1999)已確定以下hG-CSF殘基為受體結合界面的一部分G4，P5，A6，S7，S8，L9，P10，Q11，S12，L15，K16，E19，Q20，L108，D109，D112，T115，T116，Q119，E122，E123，和L124。因此，盡管可以對這些殘基進行修飾，但優選不修飾這些殘基。
            
通過將Zink等(1994)確定的G-CSF的10種NMR結構用作輸入結構，然后計算側鏈的平均ASA，而將以下殘基確定為具有25％以上的ASAM0，T1，P2，L3，G4，P5，A6，S7，S8，L9，P10，Q11，S12，F13，L14，L15，K16，C17，E19，Q20，V21，R22，K23，Q25，G26，D27，A29，A30，E33，K34，C36，A37，T38，Y39，K40，L41，H43，P44，E45，E46，V48，L49，L50，H52，S53，L54，I56，P57，P60，L61，S62，S63，P65，S66，Q67，A68，L69，Q70，L71，A72，G73，C74，S76，Q77，L78，S80，F83，Q86，G87，Q90，E93，G94，S96，P97，E98，L99，G100，P101，T102，D104，T105，Q107，L108，D109，A111，D112，F113，T115，T116，W118，Q119，Q120，M121，E122，E123，L124，M126，A127，P128，A129，L130，Q131，P132，T133，Q134，G135，A136，M137，P138，A139，A141，S142，A143，F144，Q145，R146，R147，S155，H156，Q158，S159，L161，E162，V163，S164，Y165，R166，V167，L168，R169，H170，L171，A172，Q173，P174。
            
同樣，以下殘基具有50％以上ASAM0，T1，P2，L3，G4，P5，A6，S7，S8，L9，P10，Q11，S12，F13，L14，L15，K16，C17，E19，Q20，R22，K23，G26，D27，A30，E33，K34，T38，K40，L41，H43，P44，E45，E46，L49，L50，S53，P57，P60，L61，S62，S63，P65，S66，Q67，A68，L69，Q70，L71，A72，G73，S80，F83，Q90，G94，P97，E98，P101，D104，T105，L108，D112，F113，T115，T116，Q119，Q120，E122，E123，L124，M126，P128，A129，L130，Q131，P132，T133，Q134，G135，A136，A139，A141，S142，A143，F144，R147，S155，S159，E162，R166，V167，R169，H170，L171，A172，Q173，P174。
            
用分子制圖程序InsightIIv.98.0確定以下殘基，它們具有距離最近的氨基15以上的CB原子(在甘氨酸的情況下是CA)，這樣的原子被確定為賴氨酸的NZ原子和N末端殘基T1的N原子。以下所列包括在10種NMR結構的至少一種中滿足這一標準的殘基G4，P5，A6，S7，S8，L9，P10，Q11，L14，L15，L18，V21，R22，Q25，G26，D27，G28，A29，Q32，L35，C36，T38，Y39，C42，H43，P44，E45，E46，L47，V48，L49，L50，G51，H52，S53，L54，G55，156，P57，W58，A59，P60，L61，S62，S63，C64，P65，S66，Q67，A68，L69，Q70，L71，A72，G73，C74，L75，S76，Q77，L78，H79，S80，G81，L82，F83，L84，Y85，Q86，G87，L88，L89，Q90，A91，L92，E93，G94，195，S96，P97，E98，L99，G100，P101，T102，L103，D104，T105，L106，Q107，L108，D109，V110，A111，D112，F113，A114，T115，T116，I117，W118，Q119，Q120，M121，E122，E123，L124，G125，M126，A127，P128，A129，L130，Q131，P132，T133，Q134，G135，A136，M137，P138，A139，F140，A141，S142，A143，P144，Q145，R146，R147，A148，G149，G150，V151，L152，V153，A154，S155，H156，L157，Q158，S159，F160，L161，E162，V163，S164，Y165，R166，V167，L168，R169，H170，L171，A172，Q173，P174。
            
分子制圖程序InsightIIv.98.0也用于確定以下殘基，它們具有離最近的酸性基團10以上的CB原子(在甘氨酸的情況下是CA)，這樣的原子被確定為天冬氨酸的CG原子，谷氨酸的CD原子和C末端殘基P174的C原子。以下所列包括在10種NMR結構的至少一種中滿足這一標準的殘基M0，T1，P2，L3，G4，P5，A6，S7，S8，L9，P10，Q11，S12，P13，L14，T38，Y39，K40，L41，C42，L50，G51，H52，S53，L54，G55，I56，P57，W58，A59，P60，L61，S62，S63，C64，P65，S66，Q67，A68，L69，Q70，L71，A72，G73，C74，L75，S76，Q77，L78，H79，S80，G81，L82，F83，L84，Y85，Q86，G87，L88，I117，M126，A127，P128，A129，L130，Q131，P132，T133，Q134，G135，A136，M137，P138，A139，F140，A141，S142，A143，F144，Q145，R146，R147，A148，G149，G150，V151，L152，V153，A154，S155，H156，L157，V167，L168，R169，H170，L171。
            
綜合以上所列并經比較發現，有可能選擇單個氨基酸殘基進行修飾，從而產生一組有限數目的氨基酸殘基，它們在特定G-CSF多肽中的修飾很可能產生所期望的特性。
            
hG-CSF及其變體的PEG化方法hG-CSF及其變體在溶液中的PEG化人hG-CSF及其變體在50mM磷酸鈉，100mM NaCl，pH8.5的溶液中以250μg/ml的濃度進行PEG化。PEG的摩爾數超過所述蛋白上PEG化位點的50-100倍。將反應混合物放入37℃熱混合器中，1200rpm，30分鐘。30分鐘后，加入摩爾數過量的甘氨酸終止反應。
            
用陽離子交換層析去除反應混合物中過量的PEG，甘氨酸及其它副產品。用20mM檸檬酸鈉pH2.5稀釋PEG化反應混合物至離子強度7mS/cm以下。用5N HCl調整pH值至2.5。將上述混合物加到用20mM檸檬酸鈉pH2.5平衡過的SP-sepharose FF柱上。用4個柱體積的平衡緩沖液將未結合的物質從柱上洗下來。用20mM的檸檬酸鈉，750mM氯化鈉以三個柱體積洗脫PEG化蛋白。濃縮純PEG化G-CSF并用分子量截留值(mwco)為10kDa的VivaSpin濃縮儀對其進行緩沖液的交換。
            
有G-CSF活性的標記多肽在微量滴定板中的PEG化表達攜帶適當的標記物，例如上述一般描述中列舉的任何一種標記物，并顯示G-CSF活性的多肽，然后，將培養液轉移至能固定標記多肽的微量滴定板的一個或多個孔中。當標記物是Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-Gln時，使用可購自QIAGEN的鎳-氨三乙酸(Ni-NTA)HisSorb微量滴定板。
            
將標記多肽固定到微量滴定板，然后用適于結合和隨后PEG化的緩沖液洗滌各孔，然后與選擇的活化PEG一起溫育。例如，可使用ShearwaterCorp.的M-SPA-5000。應使活化的PEG與多肽的摩爾比優化，但通常大于10∶1，例如大約100∶1或更高。室溫反應合適的時間，通常約1小時后，除去活化的PEG溶液以便中止反應。偶聯蛋白通過與適當的緩沖液溫育而從微量滴定板中被洗脫下來。適當的洗脫緩沖液可能包含咪唑，過量NTA或另一種螯合化合物。分析所述偶聯蛋白的相應生物學活性和免疫原性。可任選使用本領域公知的方法，如使用二氨基肽酶將該標記物切割下來并用GCT(谷氨酰環轉移酶)將1-位的Gln轉化為焦谷氨酰基，最后用PGAP(焦-谷氨酰基-氨肽酶)將其切割下來，產生無標記的蛋白質。該方法包括幾步驟金屬螯合親和層析。或者，可以將經過標記的多肽進行偶聯。
            
具有封閉的受體結合位點的hG-CSF活性多肽的PEG化為了使hG-CSF以一定方式最佳PEG化，并保證參與受體識別的賴氨酸不被PEG化，已經開發了下列方法純化的hG-CSF按照實施例4所述方法獲得。hG-CSF多肽和G-CSF受體可溶性結構域以2∶2化學計量組成的同型二聚體復合物在磷酸鹽緩沖液(PBS)pH7中形成。hG-CSF多肽的濃度是大約20ug/ml或1uM且受體以相同的摩爾濃度存在。
            
將來自Shearwater Corp.的M-SPA-5000以三種不同濃度加入，所述濃度分別比hG-CSF多肽中連接位點的數量過量10，25和50摩爾。反應時間為室溫30分鐘。反應了30分鐘后，將反應混合物調為pH2.0，且將反應混合物上樣至Vydac C18柱上，然后基本上按已描述的方法(Utsumi等，J.Biochem.，Vol.101，1199-1208，(1987)用乙腈梯度液洗脫。或者，可使用異丙醇梯度洗脫。
            
用本文描述的初步篩選試驗對各組分進行分析，然后將上述方法獲得的活性PEG化hG-CSF多肽于-80℃儲存在包含1mg/ml人血清白蛋白(HSA)的PBS pH7中。
            
用于鑒定偶聯和非偶聯型hG-CSF及其變體的方法確定hG-CSF及其變體的分子大小偶聯型或非偶聯型hG-CSF或其變體的分子量可以通過SDS-PAGE，凝膠過濾，基質輔助的激光解吸附質譜測定法(matrix assisted laser desorptionmass spectrometry)或者平衡離心法確定。正如所解釋的那樣，SDS-PAGE提供關于“表觀分子量”的信息。真實的分子量可利用質譜術便利地測定。SDS-PAGE用來自InvitrogenTM的NuPAGE試劑盒(Novex高顯現度預鋪(high-performance pre-cast)凝膠)來進行。將15μl樣品加載到NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝膠(Cat.Nr.NPO321)上，在NuPAGE MES SDS電泳緩沖液(Cat.Nr.NPO002-02)中以200v和120mA洗脫35分鐘。
            
確定多肽濃度用280nm光密度檢測法，酶聯免疫吸附實驗(ELISA)，放射免疫分析(RIA)，或本領域熟知的其它此類免疫檢測技術檢測多肽的濃度。而且，樣品中的多肽濃度也可用Biacore儀器用包被了該多肽特異性抗體的Biacore芯片進行檢測。
            
將上述抗體通過多種化學方法共價偶聯到Biacore芯片上。或者，使抗體非共價結合，例如通過特異性針對抗多肽抗體Fc部分的抗體來結合。將Fc特異性抗體首先共價偶聯到芯片上。然后使抗多肽抗體流過該芯片并被第一抗體直接結合。進一步地，可用鏈霉親和素包被的表面(例如BiacoreSensor Chip SA)固定生物素化抗體(Real-Time Analysis of BiomolecularInteractions，Nagata and Handa(Eds.)，2000，Springer Verlag，Tokyo；Biacore2000 Instrument Handbook，1999，Biacore AB)。
            
當樣品流過該芯片時，可以使多肽結合到包被抗體上并可以檢測質量的增加。可用已知濃度的多肽制品繪出標準曲線，隨后確定樣品中多肽的濃度。每次注射樣品后，通過能去除結合型分析物的適當洗脫液(例如低pH值的緩沖液)使傳感器芯片再生。
            
通常，所應用的抗體是抗野生型多肽的單克隆抗體。在野生型多肽中引入突變或其它操作(額外糖基化或聚合物偶聯)可以改變上述抗體的識別。進一步地，能使多肽的分子量增加的操作將使胞質基因共振信號(plasmonresonance signal)增強。因此，有必要對每一種待測分子建立一個標準曲線。
            
檢測偶聯和非偶聯型hG-CSF及其變體的體外和體內活性的方法初步試驗1-體外G-CSF活性試驗鼠細胞系NFS-60(從Dr.J.Ihle，St.Jude Children′s，Research Hospital，Tennessee，USA獲得)的增殖依賴于生長培養基中活性G-SCF的存在。因此，hG-CSF及其變體的體外生物學活性可以如下檢測，把G-CSF樣品加到生長培養基中，溫育一段時間后檢測正在分裂的NFS-60細胞的數量。
            
將NFS-60細胞培養在包含10％w/w FBS(胎牛血清)，1％w/wPen/Strep，每升10μg的hG-CSF和2mM Glutamax的Iscoves DME培養基中。在加入樣品前，用無hG-CSF的生長培養基洗滌細胞兩次，然后稀釋細胞至2.2×105細胞/ml的濃度。加100μl細胞懸液至96孔微滴定板(Corning)的每孔中。
            
包含偶聯型或非偶聯型G-CSF或其變體的樣品用生長培養基稀釋至濃度達到1.1×10-6M至1.1×10-13M。每種樣品取10μl加至包含NFS-60細胞的3個孔中。由10μl哺乳動物生長培養基組成的對照加在每個微滴定板的8個孔中。細胞培養48小時(37℃，5％CO2)后用WST-1細胞增殖劑(RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，Germany)對每個孔中正在分裂的細胞進行定量。各孔加0.01ml WST-1，然后在5％CO2的空氣環境下37℃溫育150min。活細胞中線粒體脫氫酶分解四唑鹽WST-1形成甲臜(formazan)，該產物可通過450nm下的吸光率定量。從而對每個孔中的活細胞進行定量。
            
在上述檢測基礎上，計算每種偶聯和非偶聯G-CSF分子或其變體的劑量反應曲線，然后確定每種分子的EC50值。該值等于獲得非偶聯人G-CSF最大增殖活性的50％所必需的活性G-CSF蛋白的量。所以，EC50值直接計量給定蛋白的體外活性，EC50值較低表示活性較高。
            
初步試驗2-體外G-CSF活性試驗用質粒轉染鼠造血細胞系BaF3，該質粒攜帶人G-CSF受體基因，轉錄調節子，fos的啟動子及其后的螢光素酶報告基因。用G-CSF樣品刺激上述細胞系，多種細胞內反應引發對fos表達的刺激，隨后導致螢光素酶的表達。這種刺激可以通過Steady-GloTM螢光素酶檢測系統(Promega，Cat.No.E2510)監測，籍此可以對G-CSF樣品的體外活性進行檢測。
            
在37℃潮濕的5％CO2空氣環境下，在完全培養基(RPMI-1640/HEPES(Gibco/BRL，Cat.No.22400)，10％FBS(HyClone，特定的)，1×青霉素/鏈霉素(Gibco/BRL，Cat.No.15140-122)，1×L-谷氨酰胺，(Gibco/BRL，Cat.No.25030-081)，10％WEHI-3培養液(可產生muIL-3)中培養BaF3/hGCSF-R/pfos-lux細胞，使其生長到5×105細胞/mL的密度(匯合的)。每2-3天以大約2×104細胞/mL進行再接種。
            
在檢測的前一天，將對數期細胞以2×105細胞/mL懸浮在饑餓培養基中(DMEM/F-12(Gibco/BRL，Cat.No.11039)，1％BSA(Sigma，Cat.No.A3675)，I×青霉素/鏈霉素(Gibco/BRL，Cat.No.15140-122)，1×L-谷氨酰胺(Gibco/BRL，Cat.No.25030-081)，0.1％WEHI-3培養液)，維持饑餓狀態20小時。然后用PBS洗滌細胞兩次并用臺盼蘭活性染色法檢測所述細胞的活性。將細胞以4×106細胞/mL的濃度重新懸浮在試驗培養基中(RPMI-1640(無酚紅，Gibco/BRL，Cat.No.11835)，25mM HEPES，1％BSA(Sigma，Cat.No.A3675)，1×青霉素/鏈霉素(Gibco/BRL，Cat.No.15140-122)，1×L-谷氨酰胺(Gibco/BRL，Cat.No.25030-081)，然后96孔微滴定板(Corning)中每孔加50μl所述細胞。用試驗培養基將包含偶聯型或非偶聯型G-CSF或其變體的樣品稀釋到濃度為1.1×10-7M至1.1×10-12M。每種樣品50μl加入包含BaF3/hGCSF-R/pfos-lux細胞的三個孔中。將陰性對照50μl培養基加入到每塊微滴定板的8個孔中。將平板輕輕混合并于37℃保溫2小時。依照PromegaSteady-GloTM的操作步驟(Promega Steady-GIo螢光素酶檢測系統，Cat.No.E2510)檢測螢光素酶的活性。每孔加100μl底物，然后輕輕混勻。在TopCount發光儀(Packard)上以SPC(單光子計數)的模式檢測發光。
            
根據上述檢測，可以繪出每種偶聯和非偶聯G-CSF分子或其變體的劑量反應曲線，之后，可確定每種分子的EC50值。
            
第二步試驗-G-CSF或其變體與hG-CSF受體的結合親和力應用標準的結合實驗對rhG-CSF或其變體與hG-CSF受體的結合進行研究。所述受體可以是純化的細胞外受體功能區，結合到純化的細胞漿膜上的受體，或整個細胞，這些細胞可以是天然表達G-CSF受體的細胞系(例如NFS-60)或用編碼所述受體的cDNAs轉染的細胞。rhG-CSF或其變體與天然hG-CSF競爭結合位點的能力可通過其與標記后的G-CSF-類似物，例如生物素化的hG-CSF或放射性碘標記的hG-CSF共同溫育進行分析。這種檢測的實例由Yamasaki等(Drugs.Exptl.Clin.Res.24191-196(1998))描述。
            
可選擇地將hG-CSF受體的細胞外結構域偶聯到Fc上且將其固定到96孔板上。隨后加入RhG-CSF或其變體，它們的結合可以用特異性的抗hG-CSF抗體或生物素化的或放射性碘標記的hG-CSF進行檢測。
            
測定偶聯型和非偶聯型rhG-CSF及其變體的體內半壽期本發明一個重要方面是延長生物學半壽期，這可以通過構建以下hG-CSF實現，其中的多肽與聚合物組分偶聯或不偶聯。hG-CSF血清濃度的快速消減使評估對使用偶聯型和非偶聯型hG-CSF及其變體進行的治療的生物學反應變得重要。優選，在靜脈內(i.v.)給藥后，本發明的偶聯型和非偶聯型hG-CSF及其變體也具有延長的血清半壽期，使例如ELISA方法或初步篩選檢測成為可能。體內生物半壽期的檢測按照以下描述進行。
            
應用雄性Sprague Dawley大鼠(7周齡)。在給藥的當天，稱量動物體重(每個動物280-310g)。將非偶聯型和偶聯型hG-CSF樣品按每kg體重100μg經尾靜脈注射給三只大鼠。注射后1分鐘，30分鐘，1，2，4，6，和24小時，在CO2麻醉下每只大鼠眼球取血500μl。室溫儲存血樣品11/2小時后，離心分離血清(4℃，18000xg離心5分鐘)。-80℃儲存血樣品至分析日。將樣品在冰上解凍后通過G-CSF體外活性試驗(參見初步試驗2)對血清樣品中的活性G-CSF進行定量。
            
US5,824,778中描述了測定G-CSF或其變體的體內半壽期的另一試驗，該文獻引入本發明作參考。
            
在健康大鼠中測定偶聯型和非偶聯型hG-CSF及其變體的體內生物學活性SPF Sprague Dawley大鼠購自丹麥的M & B A/S，檢測hG-CSF的體內生物學活性，用于評估偶聯型和非偶聯型G-CSF及其變體的生物學效力。
            
于大鼠抵達當天按照6只一組隨機分配。使所有動物適應7天，淘汰那些身體狀況不良的個體或者超重的個體。適應階段開始時的體重范圍是250-270g。
            
給藥當天大鼠禁食16小時，隨后按每kg體重100μg皮下注射hG-CSF或其變體。每種hG-CSF樣品給按照6只一組隨機分配的大鼠注射。在給藥前和給藥的6，12，24，36，48，72，96，120和144小時后，從大鼠尾靜脈取血300μl，加EDTA使其穩定。分析血樣的以下血液學參數血紅蛋白，紅細胞計數，血細胞比容，平均細胞體積，平均細胞血紅蛋白濃度，平均細胞血紅蛋白，白細胞計數，分化型白細胞計數(中性粒細胞，淋巴細胞，嗜酸性粒細胞，嗜堿性粒細胞，單核細胞)。根據這些檢測可以評估偶聯型和非偶聯型hG-CSF及其變體的生物學效力。測定hG-CSF或其變體的體內生物學活性的其它試驗可參見US5,681,720，US5,795,968，US5,824,778，US5,985,265和Bowen等，Experimental Hematology 27425-432(1999)。
            
在具有化療誘導的中性粒細胞減少癥的大鼠中測定偶聯型和非偶聯型hG-CSF及其變體的體內生物學活性SPF Sprague Dawley大鼠購自丹麥的M&B A/S。于大鼠抵達當天將它們按照6只一組隨機分配。使所有動物適應7天，淘汰那些身體狀況不良的個體或者超重的個體。適應階段開始時的大鼠體重范圍為250-270g。
            
給藥hG-CSF樣品的24小時之前，對大鼠腹腔注射50或90mg/kg體重的環磷酰胺(CPA)。PEG化hG-CSF變體以單一劑量的形式在第0天進行皮下注射，而非偶聯型hG-CSF以單一劑量的形式在第0天或者按每天一次的方案進行皮下注射。在第0天給藥hG-CSF或變體時的劑量是100μg/kg體重。每天一次給藥非偶聯型hG-CSF(Neupogen)時，劑量有變，參見以下實施例。每一hG-CSF樣品注射6只隨機分配的大鼠。在給藥前，以及給藥的6，12，24，36，48，72，96，120，144和168小時以后，從大鼠尾靜脈采血300μl，加EDTA使其穩定。分析這些血樣的以下血液學參數血紅蛋白，紅細胞計數，血細胞比容，平均細胞體積，平均細胞血紅蛋白濃度，平均細胞血紅蛋白，白細胞計數，分化型白細胞計數(中性粒細胞，淋巴細胞，嗜酸性粒細胞，嗜堿性粒細胞，單核細胞)。根據這些測量值評價偶聯型和非偶聯型hG-CSF及其變體的生物學效力。
            
確定多肽的受體-結合親和力(結合速率和解離速率)用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)，放射免疫分析(RIA)，或本領域熟知的其它此類免疫檢測技術可以檢測受體和配體之間的結合強度。使用胞質基因共振檢測的Biacore儀(Zhou等，Biochemistry，1993，32，8193-98；Faegerstram和O′Sh annessy，1993，In Handbook of Affinity Chromatography，229-52，Marcel Dekker，Inc.，NY)也可以檢測配體-受體結合相互作用。
            
Biacore技術允許受體結合到金表面并使配體流過所述受體。胞質基因共振檢測實時對結合到該表面的物質進行直接計量。使用該技術可獲得結合速度常數和解離速度常數并因此直接確定配體-受體解離常數和親和力常數。
            
hG-CSF偶聯物的體外免疫原性檢驗用檢測偶聯物相對于參考分子或制品的免疫原性的ELISA方法確定本發明偶聯物的免疫原性下降。通常，參考分子或制品是重組人G-CSF制品例如Neupogen或另一種重組人G-CSF制品，例如US5,824,784中描述的N末端PEG化rhG-CSF分子。ELISA方法是以抗體為基礎建立的，所述抗體來自用上述重組G-CSF制品中的一種進行治療的患者。當試驗中本發明偶聯物的反應與參考分子或制品相比在統計學意義上明顯下降時應認為免疫原性是下降的。
            
G-CSF生物分析中對活性的中和作用用上述G-CSF生物分析方法分析抗G-CSF血清對hG-CSF偶聯物的中和作用。
            
使用來自G-CSF參考分子治療的患者或來自己被免疫的動物的血清。加入固定濃度(1∶20-1∶500稀釋(患者血清)或20-1000ng/ml(動物血清))或從1∶20(患者血清)或1000ng/ml(動物血清)開始進行5倍連續稀釋的上述血清。在總量為80μl DMEM培養基+10％FCS中以從10nM開始進行7倍稀釋的濃度或以固定濃度(1-100pM)加入HG-CSF偶聯物。將血清與hG-CSF偶聯物在37℃溫育1小時。
            
然后將樣品(0.01ml)轉移到96孔組織培養板中包含NFS-60細胞的0.1ml DMEM培養液中。培養物在5％CO2的空氣環境下37℃溫育48小時。然后加0.01ml WST-1(WST-1細胞增殖劑Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)至培養物中，在5％CO2的空氣環境下37℃溫育150分鐘。活細胞中線粒體脫氫酶對四唑鹽WST-1的分解導致形成甲臜，該產物通過檢測450nm的吸光度進行定量。
            
在有固定量血清的條件下對hG-CSF偶聯物樣品進行滴定時，中和效應被定義為倍數抑制(FI)，計量為EC50(有血清)/EC50(無血清)。G-CSF變體蛋白的抗體中和作用的下降被定義為 實施例1編碼hG-CSF的合成基因的構建和克隆以下DNA片段是按照Stemmer等，(1995)，Gene 164，pp.49-53描述的通用步驟合成的片段1，由以下序列組成Bam HI消化位點，編碼YAP3信號肽的序列(WO98/32867)，編碼TA57前導序列的序列(WO98/32867)，編碼KEX2蛋白酶識別位點的序列(AAAAGA)，編碼hG-CSF的序列(SEQ ID NO2，其密碼子使用特點有利于在大腸桿菌中表達)和Xba I消化位點。
            
片段2，由以下序列組成Bam HI消化位點，編碼YAP3信號肽的序列(WO98/32867)，一個編碼TA 57前導序列的序列(WO98/32867)，編碼組氨酸標記物的序列(SEQ ID NO5)，編碼KEX2蛋白酶識別位點的序列(AAAAGA)，編碼hG-CSF的序列(SEQ ID NO2，其密碼子使用特點有利于在大腸桿菌中表達)和Xba I消化位點。
            
片段3，由以下序列組成Nde I消化位點，編碼OmpA信號肽的序列(SEQ ID NO3)，編碼hG-CSF的序列(SEQ ID NO2，其密碼子使用特點有利于在大腸桿菌中表達)和Bam HI消化位點。
            
片段4，由以下序列組成Bam HI消化位點，Kozak共有序列(Kozak，M.JMol Biol 1987 Aug 20；196(4)947-50)，編碼hG-CSF信號肽的序列(SEQ IDNO7)和編碼hG-CSF的序列(SEQ ID NO8，其密碼子使用特點有利于在CHO中表達)和Xba I消化位點。
            
用標準DNA技術將DNA片段1和2插入到質粒pJSO37(Okkels，Ann.New York Acad.Sci.782202-207，1996)中的Bam HI和Xba I消化位點。這樣產生質粒pG-CSFcerevisiae和pHISG-CSFcerevisiae。
            
用標準DNA技術將DNA片段3插入到質粒pET12a(Invitrogen)中的Nde I和Bam HI消化位點。這樣產生質粒pG-CSFcoli。
            
用標準DNA技術將DNA片段4插入到質粒pcDNA3.1(+)(Invitrogen)中的Bam HI和Xba I消化位點。這樣產生質粒pG-CSFCHO。
            
實施例2hG-CSF在釀酒酵母和大腸桿菌(E.coli)中的表達用質粒pG-CSFcerevisiae或pHISG-CSFcerevisiae轉化釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YNG318(可從美國典型培養物保藏中心，VA，USA以保藏號ATCC 208973獲得)，分離出包含這兩種質粒中任一種的轉化子，然后在細胞外分別表達攜帶和不攜帶HIS標記物的hG-CSF，以上各個步驟按照文獻中描述的標準技術進行。用pG-CSFcoli轉化大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen，Cat.No.69387-3)，分離出包含該質粒的轉化子，隨后在上清液和細胞的外周胞質中表達hG-CSF，以上步驟按照Novagen的pETSystem Manual(第8版)中描述的進行。
            
釀酒酵母和大腸桿菌對hG-CSF的表達可以用ImmunoPureUltra-Sensitive ABC兔IgG染色試劑盒(Pierce)和多克隆抗hG-CSF抗體(Pepro Tech EC Ltd.)通過Western印跡分析來檢驗。結果發現所述蛋白具有正確的大小。
            
在釀酒酵母和大腸桿菌中的攜帶和不攜帶N末端組氨酸標記物的hG-CSF的表達水平可用市售G-CSF特異性ELISA試劑盒(QuantikineHuman G-CSF Immunoassay，R & D Systems Cat.No.DCS50)進行定量。檢測到的數值在以下列出。
            
     
            
實施例3產生穩定的CHO-KI G-CSF生產者于轉染的前一天，將CHO K1細胞系(ATCC#CC1-61)接種在T-25燒瓶中的5ml DMEM/F-12培養基(Gibco# 31330-038)中，該培養基添加了10％FBS以及青霉素/鏈霉素。一天后(當幾乎100％鋪滿時)，開始準備轉染將90μl不含添加物的DMEM培養基等分至14ml聚苯乙烯試管(Corning)中。直接將10μl Fugene 6(Roche)加入該培養基，室溫溫育5min。與此同時，將5μg質粒pG-CSFCHO等分至另一個14ml的聚苯乙烯試管中。保溫后，將該Fugene 6混合物直接加入DNA溶液中，室溫保溫15min。然后將所有液體滴加到細胞培養基中。
            
一天后，將該培養基更換為含有360μg/ml潮霉素(Gibco)的新鮮培養基。此后每天更新選擇培養基，直至主要轉染池達到100％鋪滿。將該主要轉染池通過有限稀釋的方法進行再克隆(將300個細胞接種到5個96-孔平板中)。
            
實施例4從釀酒酵母培養上清中純化hG-CSF及其變體hG-CSF的純化如下進行通過離心去除細胞。然后將去除了細胞的上清液通過0.22μm的過濾器過濾除菌。經過濾除菌后的上清液在10mM，pH4.5的醋酸鈉中稀釋5倍。每5升稀釋后的上清液加入10ml濃縮的醋酸調整pH。在將該溶液應用于陽離子交換柱之前其離子強度應該在8mS/cm以下。
            
將稀釋后的上清液以90cm/h的線性流速裝載到已用50mM，pH4.5的醋酸鈉平衡的SP-sepharose FF(Pharmacia)柱上，直到該柱的洗出液達到穩定的UV和基線導電性水平。用所述平衡緩沖液洗柱直到柱流出液的UV吸光度和導電性達到穩定水平，從而去除未結合的物質。用線性梯度；30個柱體積；0-80％的緩沖液B(50mM NaAc，pH4.5，750mM NaCl)以45cm/h的流速將結合的G-CSF蛋白從柱子上洗脫下來。根據SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的結果將包含G-CSF的組分匯集。加入氯化鈉直到該溶液的離子強度在80mS/cm以上。
            
將上述蛋白溶液裝載到已用50mM NaAc，pH4.5，750mM NaCl平衡的Phenyl Toyo Pearl 650S柱上。用該平衡緩沖液洗下未結合的物質。通過應用MilliQ水的逐步梯度進行G-CSF的洗脫。將包含G-CSF的組分匯總。通過應用上述2步沖洗(down stream)的策略，能獲得90％以上純度的G-CSF。然后純化的蛋白通過在280nm的分光光度檢測和/或通過氨基酸分析進行定量。
            
將包含G-CSF的組分匯總。用VivaSpin濃縮器(mwco5kDa)進行緩沖液交換和濃縮。
            
實施例5鑒定和定量非偶聯型和偶聯型hG-CSF及其變體SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳對純化并濃縮的G-CSF進行SDS-PAGE分析。明顯可見一種表觀分子量大約17kDa的單一條帶。
            
吸光度通過分光光度測量法評估G-CSF濃度。通過檢測在280nm的吸光度和應用0.83的理論消光系數可以計算出蛋白的濃度。
            
氨基酸分析通過氨基酸分析更準確測定蛋白。對純化的G-CSF所進行的氨基酸分析揭示，經實驗確定的氨基酸組分與根據DNA序列推測的氨基酸組成是一致的。
            
實施例6PEG化wt G-CSF和G-CSF變體的MALDI-TOF質譜測定用MALDI-TOF質譜測定法評估連接到PEG化wt G-CSF和所選擇的PEG化G-CSF變體上的PEG基團數。
            
Wt G-CSF包含5個預計為SPA-PEG連接位點的伯氨基(N末端氨基和K16，K23，K34和K40上的ε氨基)。wt G-CSF用SPA-PEG 5000PEG化后，MALDI-TOF質譜檢測顯示主要存在連接有4，5和6個PEG基團的wtG-CSF變體，此外，連接7個PEG基團的wt G-CSF變體也清晰可見，但量較少。
            
具有K16R，K34R，K40R，Q70K，Q90K，和Q120K取代的G-CSF變體也包含5個伯氨基(N末端氨基和K23，K70，K90和K120上的ε氨基)。這種G-CSF變體被SPA-PEG5000PEG化后，MALDI-TOF質譜檢測顯示主要存在連接有4，5和6個PEG基團的G-CSF變體，此外，連接7個PEG基團的G-CSF變體也清晰可見，但量較少。
            
具有K16R，K34R，和K40R取代的G-CSF包含2個伯氨基(N末端氨基和K23上的ε氨基)。該G-CSF變體用SPA-PEG 12000PEG化后，MALDI-TOF質譜檢測顯示主要存在連接有2和3個PEG基團的G-CSF變體，此外，連接4個PEG基團的G-CSF變體也清晰可見，但量較少。
            
上述觀察清楚地顯示除包含氨基的氨基酸殘基外，其它的氨基酸殘基在所應用的PEG化條件下有時也可以進行PEG化。上述觀察還顯示在引入氨基的部位進行PEG化具有一定重要性。這在wt G-CSF和G-CSF變體的SDS-PAGE分析中也已觀察到。
            
如實施例11所述，當應用SPA-PEG化學法時組氨酸170完全被PEG化。此外，K23和S159被部分PEG化。這解釋了除hG-CSF及其變體中已經形成的伯氨基外，還有1-2個另外的PEG化位點。
            
實施例7PEG化和非PEG化G-CSF變體的肽作圖為了繪制G-CSF和G-CSF變體上另外的SPA-PEG連接位點，應用以下策略。
            
為了將預期的PEG化位點數降至最少，選擇具有少量氨基的G-CSF變體。所選擇的G-CSF變體具有K16R，K34R，K40R和H170Q取代。除了K23上的在先資料顯示無任何程度PEG化的ε胺基外，該變體僅僅包含一個N末端伯胺。所以，在該G-CSF變體中胺基基團上的PEG化背景明顯降低。應用SPA-PEG 5000對G-CSF變體進行PEG化。PEG化后，使G-CSF變體變性，使其二硫鍵還原，使所得巰基烷基化，然后用谷氨酸特異性蛋白酶降解己烷基化并PEG化的蛋白。最后，所形成的肽通過反相HPLC分離。
            
平行地對具有K16R，K34R，和K40R取代的非PEG化G-CSF變體進行同樣的處理，以獲得一個HPLC參考層析圖。
            
對PEG化G-CSF變體和非PEG化G-CSF變體的降解的HPLC層析作圖比較應該揭示出在PEG化時哪個肽消失。通過對非PEG化G-CSF變體的肽進行N末端氨基酸測序而對這些肽進行的鑒定可間接指出PEG化位置。
            
原則上，優選應用具有K16R，K34R，K40R和H170Q所有這些取代的非PEG化G-CSF變體，但實踐中不必如此。
            
更具體地，將大約1mg具有K16R，K34R，K40R和H170Q取代的PEG化G-CSF變體和大約500μg具有K16R，K34R，和K40R取代的非PEG化G-CSF變體在SpeedVac濃縮器中干燥。將兩種樣品分別溶解在400μl 6M胍，0.3M Tris HCl，pH8.3中，然后37℃變性過夜。變性后，通過加入50μl0.1M DTT的6M胍，0.3M Tris-HCl，pH8.3溶液還原蛋白質中的二硫鍵。室溫下溫育2小時后，加入50μl 0.6M碘乙酰胺的6M胍，0.3M Tris-HCl，pH8.3溶液，使原有巰基烷基化。烷基化在室溫下進行30min，然后用NAP5柱將已還原并烷基化的蛋白的緩沖液換成50mM NH4HCO3。在SpeedVac濃縮器中樣品的體積降低到大于200μl后，分別加入20μg和10μg谷氨酸特異性蛋白酶。谷氨酸特異性蛋白酶的降解在37℃進行16小時。所產生的肽應用Phenomenex Jupiter C18柱(0.2×5cm)以0.1％TFA水溶液中的線性乙腈梯度洗脫，從而進行反相HPLC分離。通過MALDI-TOF質譜法分析所收集的組分，隨后對所選擇的肽進行N末端氨基酸序列分析。
            
對PEG化G-CSF變體和非PEG化G-CSF變體的降解的HPLC層析作圖比較揭示，在PEG化時僅二個組分消失。對非PEG化G-CSF變體的這兩個組分進行N末端氨基酸序列分析顯示，這兩種肽都來源于G-CSF的N末端。其中一種肽由意外切割Gln11之后的殘基所產生的氨基酸殘基1-11組成。另一種肽由按照預期切割Glu19之后的殘基所產生的氨基酸殘基1-19組成。
            
預期G-CSF的N末端肽可用該方法鑒定，因為N末端氨基容易被PEG化。然而，用該方法沒有鑒定出SPA-PEG 5000的其它連接位點。
            
間接鑒定PEG 5000連接位點的另一種做法是直接鑒定PEG化肽中的連接位點。然而，在對降解的PEG化G-CSF變體進行HPLC分離時，包含PEG化肽的組分彼此之間沒有分開且未能與幾個包含非PEG化肽的組分分開。所以，對這些組分的N末端氨基酸序列分析除了提示K23能被部分PEG化外沒獲得任何有用的數據。
            
為克服這些問題，從第一次HPLC分離的組分中制備兩份PEG化肽的匯集物。將這二個匯集物在SpeedVac濃縮器中干燥，溶解在200μl新鮮配制的50mM NH4HCO3中并用1μg糜蛋白酶進一步降解。所產生的肽應用Phenomenex Jupiter C18柱(0.2×5cm)以0.1％TFA水溶液中的線性乙腈梯度洗脫，從而經反相HPLC分離。通過MALDI-TOF質譜法分析所收集的級分，隨后對所選擇的肽進行N末端氨基酸序列分析。
            
經N末端氨基酸序列測定，K23和S159都被部分PEG化。無法確定這兩個位置上PEG化實際程度，但因為從最初的HPLC分離中鑒定出K23和S159未被修飾的肽并已測序，所以可確定PEG化僅僅是部分的。
            
實施例8wt G-CSF和G-CSF變體的糖基化當通過MALDI-TOF質譜分析對純化的wt G-CSF和G-CSF變體進行分析時總是能觀察到比所分析的G-CSF分子的質量大了約324Da的另一組分。因為具有最小質量的組分始終具有G-CSF分子的質量且因為G-CSF分子有正確的N末端氨基酸序列，所以可以得出這樣的結論，上述另外的成分是攜帶二個己糖殘基的經過修飾的G-CSF分子。在許多情況下，未經修飾的G-CSF分子產生最強的信號但在一些情況下經過修飾的G-CSF分子的信號強度是最強的。
            
為鑒定額外PEG化位點而制備的肽在進行分析時，從每次降解中鑒定出兩個可用于鑒定糖基化位點的肽。
            
在兩種HPLC分離中，這兩種肽相繼被洗脫出，MALDI-TOF質譜檢測顯示這兩種肽有約324Da的質量差異。質譜檢測數據提示，該肽跨越氨基酸殘基124-162。對所有4種肽進行的N末端氨基酸序列分析顯示，這種分配是正確的，且Thr133是唯一的修飾位點。在帶有非修飾肽的質量的肽中，Thr133在序列中清晰可見，但在額外帶有324Da質量的肽中第133位未排布氨基酸殘基。因為所有其它氨基酸殘基都能排布在該序列中，所以可以得出這樣的結論，即Thr133是唯一的修飾位點。這個糖基化位點以前曾報道用于表達在CHO細胞中的重組G-CSF中，但此聚糖與酵母中連接的聚糖不同。
            
非糖基化wt G-CSF利用反相HPLC與糖基化wt G-CSF分離，具體是應用Vydac C18柱(0.21×5cm)以51％乙腈的0.1％TFA溶液經等度洗脫為一個經MALDI-TOF質譜分析顯示僅含非糖基化wt G-CSF的級分。
            
實施例9分離與不同數量的PEG分子共價連接的G-CSF分子共價偶聯4，5或6個PEG基團的G-CSF分子如下分離。用20mM檸檬酸鈉pH2.5平衡SPsepharose FF柱，然后將20mM檸檬酸鈉，pH2.5中的PEG化蛋白裝載到上述SPsepharose FF柱上。任何未結合的物質都被從柱子上洗掉。洗脫用pH梯度進行。PEG化G-CSF在大約pH3.8時開始從柱子中洗脫且繼續洗脫在pH3.8到4.5的級分中。
            
對這些級分進行SDS-PAGE和質譜分析。這些分析表明PEG化程度最高的G-CSF存在于“低pH級分”中。PEG化程度較低的G-CSF洗脫在“高pH級分”中。
            
對PEG化G-CSF所進行的氨基酸分析顯示，消光系數的理論值與實驗測定值非常一致。
            
實施例10構建hG-CSF變體將hG-CSF中的氨基酸特異性取代為其它氨基酸殘基，例如在上文的一般描述中所討論的特異性取代，是用本領域已知的標準DNA技術引入的。用包含hG-CSF編碼基因、但不帶有HIS標記物的質粒pG-CSFcerevisiae作為PCR反應中的DNA模板，可制備新的G-CSF變體。使這些變體在釀酒酵母中表達，并且如實施例4所述純化。所構建的G-CSF變體有一部分在以下列舉(參見實施例12和13)。
            
實施例11將SPA-PEG與hG-CSF或其變體共價偶聯如上所述(“hG-CSF及其變體在溶液中的PEG化”)使人G-CSF及其變體共價連接SPA-PEG 5000，SPA-PEG 12000和SPA-PEG 20000(Shearwater)。偶聯物的體外活性在實施例13中列舉。
            
實施例12通過定點誘變和隨后對純化變體的PEG化來鑒定G-CSF中的SPA-PEG連接位點可以將SPA-PEG連接到G-CSF中除賴氨酸之外的其它氨基酸殘基上。為確定SPA-PEG是否連接到組氨酸，絲氨酸，蘇氨酸和精氨酸上，制備一些變體，使其中的這些氨基酸被取代為賴氨酸，丙氨酸或谷氨酸。使這些變體在釀酒酵母中表達，純化和PEG化，然后在SDS-PAGE上分析連接的SPA-PEG分子的數量。該分析通過目測SDS-PAGE凝膠來完成，所有凝膠都包含3條主要的帶。根據這些帶的相對大小，估計每條帶的PEG化程度，偏差最接近5％。給定氨基酸被谷氨酸或丙氨酸取代后，連接SPA-PEG的數量的下降，這強有力地提示該氨基酸通過SPA-PEG被PEG化，且這種現象進一步得到將該氨基酸取代成賴氨酸后PEG化程度不變的結果的支持。所分析的變體在以下列舉。
            
     
            
     
            
以上數據顯示除N末端，K16，K34和K40之外，SPA-PEG也可共價結合到H170上。進一步地，上述數據顯示僅僅10％的可利用的K23氨基酸殘基被PEG化，大約10％的S159被PEG化。
            
實施例13非偶聯型和偶聯型hG-CSF及其變體的體外生物學活性如以上“初步試驗2-體外hG-CSF活性檢測”所述對非偶聯型和偶聯型hG-CSF及其變體的體外生物學活性進行檢測。對SPA-PEG 5000與可利用的PEG化位點偶聯和不偶聯所產生的每個變體的體外生物學活性(用EC50測量值來表示)在以下列舉。這些值已經相對于非偶聯的hG-CSF(Neupogen)標準化，即表中數值表示相對于非偶聯hG-CSF的％活性。每次在同樣的檢測條件下檢測該值以及變體的值。在所述檢測中hG-CSF的EC50值是30pM。
            
     
            
     
            
     
            
以上數據顯示K23取代成精氨酸不增加偶聯蛋白的活性。這是由于這樣一個事實，即僅有10％的K23被PEG化，偶聯后的K23R變體基本與hG-CSF具有相同的的PEG基團連接數和相同的PEG化位置。在K16，K34和K40位置上去除賴氨酸產生了在PEG化后具有明顯活性的G-CSF變體。該變體與SPA-PEG5000偶聯后與未偶聯的變體相比不明顯降低活性。所以，用SPA-PEG 5000使N末端和H170發生PEG化(參見實施例12)不降低hG-CSF的活性。由此決定應用hG-CSF K16R K34R K40R作為插入新PEG化位點的主鏈。在該主鏈中，L3和H159殘基之間引入了24個新的PEG化位點。這些殘基分布在hG-CSF中不與G-CSF受體相互作用的部位。在L3，Q70，S76，Q90，T105，Q120，T133和S142位置引入新的PEG化位點，得到被SPA-PEG 5000PEG化后仍保持明顯活性的hG-CSF變體。所以，其中一些這樣的新PEG化位點組合至具有2或3個新PEG化位點的hG-CSF變體中。
            
此外，可使SPA-PEG 12000和SPA-PEG 20000與一組選定的hG-CSF變體連接。體外活性列舉如下(Neupogen的％)。
            
     
            
實施例14非偶聯型和偶聯型hG-CSF及其變體的體內半壽期非偶聯的hG-CSF(Neupogen)，SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16RK34R K40R Q70K Q90K Q120K，以及SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16RK34R K40R Q90K T105K S159K的體內半壽期如上文(測定非偶聯型和偶聯型hG-CSF及其變體的體內半壽期)所述進行檢測。結果見圖1和2。Neupogen的體內半壽期經測定分別為2.01小時和1.40小時。在一項較早的類似實驗(US 5,824,778)中，測得hG-CSF的體內半壽期為1.79小時。本文所述實驗的結論因此可以直接與該實驗進行比較。SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K以及SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q90K T105K S159K的體內半壽期經測定分別為12.15小時和16.10小時。因此，在hG-CSF中引入新的PEG化位點和將它們與SPA-PEG 5000偶聯，都導致體內半壽期顯著增加。
            
在上述較早的實驗(US5,824,778)中，與較大的N-末端結合型PEG分子(10kDa)偶聯的hG-CSF，經測定的體內半壽期為7.05小時。因此，SPA-PEG5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K以及SPA-PEG5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q90K T105K S159K，相比較于Neupogen和具有10kDa的N末端偶聯PEG分子的hG-CSF，體內半壽期顯著增加。SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90KQ120K以及SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q90K T105KS159K都除去了三個內源PEG化位點，并引入了三個新的PEG化位點，因此大小相同。這兩種化合物之間的唯一區別是體外活性，分別是Neupogen的12％和5％。這一區別導致SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34RK40R Q90K T105K S159K比SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34RK40R Q70K Q90K Q120K具有更長的體內半壽期。由于體外活性與這些化合物的受體結合親和力相關，故可以得出結論SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q90K T105K S159K的受體介導的清除比SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K的慢。因此，增加G-CSF的大小并降低其體外活性，這兩方面綜合可以得到比以前所知的G-CSF化合物具有顯著更長體內半壽期的G-CSF化合物。
            
實施例15  
            
在健康大鼠中非偶聯型和偶聯型hG-CSF及其變體的體內生物學活性非偶聯型hG-CSF(Neupogen)，SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16RK34R K40R Q70K Q120K，SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40RQ70K Q90K Q120K，SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q70KQ120K T133K，以及SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q90KQ120K T133K，它們的體內生物學活性如上文(在健康大鼠中測定非偶聯型和偶聯型hG-CSF及其變體的體內生物學活性)所述進行檢測。結果見圖3和4。
            
在t＝0小時每kg體重注射100μg，之后第48小時未檢測出Neupogen的活性。初次注射后，直到72小時都能檢測出SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSFK16R K34R K40R Q70K Q120K、SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34RK40R Q90K Q120K T133K、SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40RQ70K Q120K T133K的活性，而直到96小時，SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSFK16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K仍保留體內活性。故可以看出，這些偶聯變體比Neupogen具有更長時間的體內生物學活性，SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K維持體內活性的時間是Neupogen的兩倍。SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q70KQ120K T133K，以及SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q90KQ120K T133K，這兩者的體外活性者是Neupogen的2％(實施例13)，它們在給藥后的最初12小時內，并不誘導出Neupogen、SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q120K、SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSFK16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K給藥所能見到的相同水平的白細胞形成。因此，僅有Neupogen的2％體外活性或更低活性的化合物不能夠在剛剛給藥后就完成對白細胞形成的刺激。
            
此外，如上文(“在健康大鼠中測定非偶聯型和偶聯型hG-CSF及其變體的體內生物學活性”)所述，對Neupogen，SPA-PEG 12000偶聯型hG-CSFK16R K34R K40R和不同劑量SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34RK40R Q70K Q90K Q120K的體內生物學活性進行了檢測。結果見圖5。與較早時觀察到的一樣，在以每kg體重100μg最初注射后48小時未檢測出Neupogen的活性。每kg體重給藥5μg SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16RK34R K40R Q70K Q90K Q120K與Neupogen相比可使體內生物學活性略微延長，而每kg體重給藥上述化合物25μg和100μg使得hG-CSF活性在最初注射后各自到72和96小時仍維持活性。故SPA-PEG偶聯型hG-CSF化合物的作用時間可通過提高或降低標準劑量方案來控制。SPA-PEG 12000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R在每kg體重給藥100μg后直到72小時仍維持體內活性。如實施例6所述，SPA-PEG 12000偶聯型hG-CSF K16RK34R K40R偶聯有2或3個SPA-PEG 12000基團，而SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K偶聯有5或6個SPA-PEG5000基團。所以，兩種化合物的分子量分別是42-54kDa和43-48kDa。這兩種化合物的體外活性分別是Neupogen的30％和12％。SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K，與具有基本相同分子量的SPA-PEG 12000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R相比，體內生物學活性能維持較長時間，這表明，當G-CSF化合物的大小通過PEG化而超過一個特定的分子量數值時，僅僅可以通過降低G-CSF化合物的比活性、并因此降低受體介導的清除來進一步延長其作用時間(實施例14)。
            
此外，如上文(在健康大鼠中測定非偶聯型和偶聯型hG-CSF及其變體的體內生物學活性)所述，測定Neupogen，SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSFK16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K，SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16RK34R K40R Q90K T105K S159K，以及SPA-PEG 20000偶聯型hG-CSF K16RK34R K40R T105K S159K的體內生物學活性。結果見圖6。
            
正如較早時觀察到的，偶聯型hG-CSF變體的作用時間顯著長于Neupogen。這三種偶聯型hG-CSF變體，每一種在給藥后，都導致以相同于Neupogen給藥后的最初12小時內觀察到的速率和水平形成白細胞。SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K，SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q90K T105K S159K，以及SPA-PEG 20000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R T105K S159K，它們的體外活性分別是Neupogen的12％，5％和5％，因此具有Neupogen的5％體外活性的化合物能夠在給藥后充分誘導白細胞的形成。
            
Neupogen，SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q70KQ90K Q120K，SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q90K T105KS159K，SPA-PEG 20000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R T105K S159K，它們在SDS-PAGE上的表觀大小分別是18kDa，60kDa，60kDa和＞100kDa。SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q90K T105K S159K，以及SPA-PEG 20000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R T105K S159K的體內作用的持續時間幾乎相同，表明作用的持續時間不因偶聯型hG-CSF化合物的分子大小增加到超過約60kDa而延長。相反，當偶聯型hG-CSF化合物的表觀大小超過約60kDa時，作用的持續時間增加可以降低該化合物的體外活性，并因此降低受體結合親和力。這種情況(上述)的另一個實例可通過比較SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K與SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q90K T105K S159K之間的體內作用維持時間而看出。這兩種化合物的表觀大小都是60kDa，但體外活性卻分別是12％和5％。這種差異直接反映在這兩種化合物的作用的體內維持時間中，它們分別是96小時和144小時。
            
實施例16在具有化療誘導的中性粒細胞減少癥的大鼠中非偶聯型和偶聯型hG-CSF及其變體的體內生物學活性在具有化療誘導的中性粒細胞減少癥的大鼠中，非偶聯型hG-CSF(Neupogen)，SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90KT105K和SPA-PEG 20000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q90K的體內生物學活性按照上文(在具有化療誘導的中性粒細胞減少癥的大鼠中測定非偶聯型和偶聯型hG-CSF及其變體的體內生物學活性)所述，用50mg/kg體重的CPA和單一劑量(100μg/kg體重)的G-CSF進行測量。結果見圖7。三種化合物以相同速率誘導白細胞的最初形成。可見，偶聯型hG-CSF化合物只需有Neupogen的4％體外活性就足以在剛剛給藥后充分刺激白細胞形成。36小時后，經Neupogen處理的大鼠體內的白細胞(WBC)數降至未處理組的水平(＜3×109細胞/升)。這時，大鼠出現中性粒細胞減少。144小時后，兩個組的WBC達到正常水平(9×109細胞/升)。
            
在SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K T105K處理組以及SPA-PEG 20000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40RQ90K處理組中，于48小時后WBC水平降至最低值4×109細胞/升，然后迅速開始回升。96小時后，這兩組的WBC水平都回復至正常值。因此，這兩種偶聯型hG-CSF化合物能夠緩解中性粒細胞減少癥并顯著減少WBC回復至正常水平所需的時間(中性粒細胞減少癥的持續時間)，具體是從Neupogen-處理組的112小時顯著減少為SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40RQ70KQ90K T105K處理組或SPA-PEG 20000偶聯型hG-CSF K16R K34RK40RQ90K處理組的48小時。
            
SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K T105K比SPA-PEG 20000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q90K更有效縮短中性粒細胞減少癥的持續時間。由于這兩種分子的表觀大小都在60kDa以上(分別是60kDa和80kDa)，這就無法解釋為SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16RK34R K40R Q70K Q90K T105K比SPA PEG 20000偶聯型hG-CSF K16RK34R K40R Q90K的腎清除率低。SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34RK40R Q70K Q90K T105K和SPA-PEG 20000偶聯型hG-CSF K16R K34RK40R Q90K的體外活性分別是Neupogen的4％和7％。這意味著，在給藥后的最初48小時內，SPA PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40RQ70K Q90K T105K與SPA PEG 20000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40RQ90K相比，受體結合親和力，以及因此所致的受體誘導型清除偏低，但白細胞水平增加。因此，當大鼠在48小時后出現中性粒細胞減少時，SPA-PEG5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K T105K的體內濃度高于SPA-PEG 20000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40RQ90K的。由于僅Neupogen體外G-CSF活性的4-5％這么低的水平就足以完全活化中性粒細胞始祖細胞表面的G-CSF受體(見上文)，這種在48小時后出現的較高G-CSF濃度，解釋了SPA-PEG 5000偶聯型hG-CSF K16R K34R K40R Q70KQ90K T105K-處理組中WBC水平更快速增加的原因。因此，在具有化療誘導的中性粒細胞減少癥的大鼠中，本發明的表觀大小至少約60kDa、體外活性為Neupogen的4％的偶聯型G-CSF化合物，與具有類似大小的化合物相比更具優勢，體外活性更高。
            
實施例17從釀酒酵母培養上清中純化G-CSF此實施例提供了不同于實施例4的另一種純化hG-CSF和G-CSF變體的方法。
            
細胞通過在5000rpm、4℃離心10min而除去，澄清后的上清用0.22μm濾膜過濾。將澄清并過濾后的上清濃縮，用10kDa的膜，在50mM乙酸鈉，pH4.5中通過切線流過濾(Tangential Flow Filtration)進行滲濾所得的超濾液加載至已經用至少5個柱體積的50mM乙酸鈉平衡過的SP-sepharose柱(200ml裝填床)上。樣品以大約20ml/min的流速加載。柱用平衡液洗滌，直至通過測定280nm的吸光度確定獲得了穩定的洗脫物(effluent)。利用逐級緩沖液梯度(例如10％，20％，30％和35％的緩沖液)，G-CSF在環境流速(ambient flow rate)時在35％緩沖液條件下洗脫，所述緩沖液是750mM NaCI的50mM乙酸鈉溶液。
            
這種一步法產生＞95％純的G-CSF(經SDS-PAGE測定)。
            
實施例18分離多重-PEG化的G-CSF上面的實施例9描述了分離與不同數量的PEG基團相連的G-CSF分子的方法。本實施例提供了另一種分離這類多重PEG化G-CSF的方法，以便獲得在所連接的PEG基團數目方面具有所需一致性程度的G-CSF產物。
            
將上述與例如SPA-PEG 5000(Shearwater)共價連接(“hG-CSF及其變體在溶液中的PEG化”)的PEG化G-CSF的混合物用20mM檸檬酸鹽緩沖液pH2.5稀釋。導電性應＜3.5mS/cm。根據需要用稀釋的鹽酸將pH調整為2.5。用以下緩沖液進行分離緩沖液A20mM檸檬酸鈉，pH2.5(平衡液和洗滌液)。
            
緩沖液B20mM檸檬酸鈉，pH2.5；750mM氯化鈉(洗脫緩沖液)將需要分離的樣品以2ml/min的流速加載至已經平衡過的SP-sepharose HP柱(7ml)。用緩沖液A洗柱，直到通過A280監測獲得了穩定的基線。
            
多重-PEG化種類如下分離以4ml/min的流速應用0-50％緩沖液B的線性梯度過柱180分鐘，收集2ml的級分。所收集的級分用SDS-PAGE進行分析，將具有所需數目的偶聯型PEG基團的級分匯總。這使得有可能對包含那些最初與例如3-6個PEG基團偶聯的PEG化G-CSF在內PEG化G-CSF混合物進行純化，從而得到具有例如4或5個偶聯型PEG基團的產物，或具有僅單一數量的偶聯型PEG基團的產物。
            
實施例19肽作圖用類似于實施例7的方法，但在胰蛋白酶降解的基礎上，本發明G-CSF偶聯物的PEG化模式通過肽作圖來確定。在這種情況下，多肽在CHO細胞(見實施例3)中產生，它們與天然人G-CSF的序列相比，具有取代K16R，K34R，K40R，T105K和S159K。用5kDa SPA-PEG如上所述進行PEG化，得到經過修飾的蛋白，其中大部分帶有3，4或5個PEG組分，少部分帶有6個PEG組分。6個可能的PEG連接位點有5個是已知的，它們是N-末端氨基Lys23，Lys105，Lys159和His170。
            
這一肽作圖分析顯示，偶聯蛋白基本上在N-末端以及Lys105和Lys159充分PEG化，但Lys23僅部分PEG化。盡管His170在前面的實驗中顯示為部分PEG化，但很意外的是在本實驗中未發現這種結果。一個可能的解釋是，PEG與His170殘基之間的鍵在肽作圖之前進行的樣品制備期間不穩定。可能的不穩定PEG化(就象這里所述的情況)，可以通過將組氨酸殘基取代為另一種殘基來避免，尤其是取代為賴氨酸殘基(當希望獲得更穩定的PEG化時)，或者取代為谷氨酰胺或精氨酸殘基(當希望避免PEG化時)。
            
實施例20在具有化療誘導的中性粒細胞減少癥的大鼠中的體內生物學活性在具有化療誘導的中性粒細胞減少癥的大鼠中檢驗本發明兩種PEG化G-CSF變體的體內生物學活性。所述變體與SEQ ID NO1相比，分別是具有氨基酸取代K16R，K34R，K40R，T105K和S159K(下文稱“105/159”)，以及具有K16R，K34R，K40R，Q90K，T105K和S159K(下文稱“90/105/159”)。這兩種變體都在酵母(釀酒酵母)中產生，都如上所述與SPA-PEG-5000偶聯。檢驗這兩種變體采用單一劑量時的體內生物學活性，與采用每日劑量的非偶聯型hG CSF(Neupogen)和對照(賦形劑)相比較。
            
給藥G-CSF樣品的24小時之前，對大鼠給藥50mg/kg體重的CPA。本發明的PEG化變體以100μg/kg體重的單一劑量在0小時給藥，而Neupogen以30μg/kg體重的每日劑量給藥5天(從0小時到96小時)。
            
體內生物學活性如上文所述進行測量(“在具有化療誘導的中性粒細胞減少癥的大鼠中測定非偶聯型和偶聯型hG-CSF及其變體的體內生物學活性”)。結果見圖8(白細胞計數，WBC)和圖9(絕對中性粒細胞計數，ANC)。
            
如圖8所示，105/159、90/105/159以及Neupogen給藥都導致在最初12小時內白細胞水平增加，之后白細胞水平由于化療而下降，于大約48小時后達到最小值。48小時后，所有三個處理組的白細胞數目都增加，但用本發明兩種PEG化變體處理的小組的增加速率明顯大于用Neupogen處理的小組。用PEG化變體105/159和90/105/159處理在96小時后白細胞水平正常(超過10×109/L)，而Neupogen處理組在120小時后白細胞水平仍低于10×109/L。由于5日Neupogen處理的最后一次是在96小時的時候，故該組的白細胞水平在120小時后再次下降。相反，在用單一劑量的本發明PEG化變體進行處理的兩個組中，從96小時開始，直到216小時實驗結束時，白細胞水平都相對穩定在10×109/L以上。
            
圖9的中性粒細胞數目有類似的變化，該圖顯示，PEG化變體105/159處理組的中性粒細胞水平增加的速度顯著快于Neupogen處理組(未檢測90/105/159組的ANC)。
            
實施例21在具有化療誘導的中性粒細胞減少癥的大鼠中的體內生物學活性在具有化療誘導的中性粒細胞減少癥的大鼠中，比較非偶聯hG-CSF(Neupogen)、具有單個N-末端連接型20kDa PEG基團的hG-CSF(NeulastaTM)與本發明的兩種PEG化G-CSF變體的體內生物學活性。這兩種變體分別在酵母(釀酒酵母)和CHO細胞中產生，它們具有相對于hG-CSF的相同氨基酸取代K16R，K34R，K40R，T105K和S159K，而且它們都與SPA-PEG 5000偶聯。本發明的PEG化變體最初由具有3-6個PEG組分的多重PEG化種類構成，經過分離后得到更為單一的僅具有4-5個偶聯PEG組分的產物。這些變體在下文中稱“G20”(產自酵母)和“G21”(產自CHO細胞)。
            
G-CSF樣品在給藥CPA的24小時后給與(90mg/kg體重)。PEG化變體，即NeulastaTM，G20和G21以100μg/kg體重的單一劑量給藥，Neupogen以10μg/kg體重的每日劑量給藥7日。
            
體內生物學活性如上文(在具有化療誘導的中性粒細胞減少癥的大鼠中測定非偶聯型和偶聯型hG-CSF及其變體的體內生物學活性)所述進行測量。結果見圖10(白細胞計數，WBC)和圖11(絕對中性粒細胞計數，ANC)。
            
圖10和11顯示，所有G-CSF化合物在最初12小時內以幾乎相同的速率誘導白細胞和中性粒細胞的最初形成，然后由于化療導致白細胞和中性粒細胞的水平下降。96小時后，白細胞和中性粒細胞的水平在所有實例中再次升高，但經過G20或G21處理的大鼠的升高速率顯著大于經過Neupogen或NeulastaTM處理的大鼠。圖10顯示，經G20或G21處理的大鼠在144小時后白細胞水平正常(約109/L)，而經Neupogen或NeulastaTM處理的大鼠在168小時后白細胞未達到該水平。圖11顯示，中性粒細胞計數有類似變化，即經過G20或G21處理的大鼠比經過Neupogen或NeulastaTM處理的大鼠提早24小時達到中性粒細胞計數的正常水平。因此可以得出結論，本發明這些PEG化G-CSF變體與現有G-CSF產物Neupogen或NeulastaTM的治療相比，能在大鼠中將化療誘導的中性粒細胞減少癥的持續時間縮短大約24小時。
            
序列表<110>馬克西根控股公司(Maxygen Holdings Ltd.)<120>G-CSF偶聯物<130>0258<150>US09/904,196<151>2001-07-11<150>DK PA 2002 00447<151>2002-03-22<150>DK PA 2002 00708<151>2002-05-08<160>15<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>174<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1   5   10  15Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln20  25  30Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val35  40  45Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys50  55  60Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser65  70  75  80Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser85  90  95Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp100 105 110Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro115 120 125Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe  
            
130 135 140Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe145 150 155 160Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro165 170<210>2<211>525<212>DNA<213>人工的<220>  
            
<221>misc_feature<223>編碼hG-CSF的DNA，具有大腸桿菌的密碼子使用特性<400>2acccctctgg gcccggccag cagtctgcct cagagttttt tactgaaatg cttagaacag 60gtgcgtaaaa tccagggcga tggcgcggcc ctgcaggaaa aactgtgcgc gacctataaa120ctgtgccatc ctgaagaact ggtcctgtta ggccatagct taggcatccc gtgggcgcct180ctgagtagct gcccgagtca ggccctgcag ctggccggct gcctgagtca gttacatagt240ggcttatttt tatatcaggg cttactgcag gcgttagaag gcattagtcc ggaactgggc300ccgaccctgg ataccttaca gttagatgtc gcggattttg ccaccaccat ttggcagcag360atggaagaat taggcatggc gcctgcgtta cagcctaccc agggcgccat gcctgcgttt420gcgagtgcgt ttcagcgtcg cgccggcggc gtgttagtgg ccagccatct gcagagcttt480ctggaagtga gttatcgtgt gttacgccat ctggcccagc cttaa525<210>3<211>21<212>PRT<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>3Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala1   5   10  15Thr Val Ala Gln Ala20<210>4  
            
<211>63<212>DNA<213>人工的<220>  
            
<221>misc_feature<223>編碼OmpA信號序列的DNA序列<400>4atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtagcgcag60gcc  63<210>5<211>15<212>PRT<213>人工的<220>  
            
<221>PEPTIDE<222>(1)..(15)<223>合成標記物<400>5Met Lys His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln Gln1   5   10  15<210>6<211>45<212>DNA<213>人工的<220>  
            
<221>misc_feature<223>編碼SEQ ID NO5標記物的DNA<400>6atgaaacacc aacaccaaca tcaacatcaa catcaacatc aacag45<210>7<211>30<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>  
            
<221>SIGNAL<222>(1)..(30)<223>  
            
<400>7Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gln1   5   10  15Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gln Glu Ala20  25  30<210>8<211>615<212>DNA<213>人工的<220>  
            
<221>misc_feature<223>編碼帶有SEQ ID NO7信號肽的hG-CSF的序列<400>8atggccggcc ctgccacaca gtcccccatg aagctgatgg ccctgcagct gctgctgtgg 60cactccgccc tgtggacagt gcaggaggcc acccctctgg gccccgccag ctccctgcct120cagtccttcc tgctgaagtg cctggagcag gtgagaaaga tccagggcga cggcgccgcc180ctgcaggaga agctgtgcgc cacatacaag ctgtgccacc ctgaggagct ggtgctgctg240ggccacagcc tgggcatccc ctgggcccct ctgtccagct gcccctccca ggccctgcag300ctggccggct gcctgtccca gctgcactcc ggcctgttcc tgtaccaggg cctgctgcag360gccctggagg gcatctcccc cgagctgggc cccacactgg ataccctgca gctggacgtg420gccgatttcg ccaccacaat ctggcagcag atggaggagc tgggcatggc ccctgccctg480cagcctaccc agggcgccat gcctgccttt gcctccgcct ttcagagacg ggccggcggc540gtgctggtgg ccagccacct gcagagcttt ctggaggtgt cctacagagt gctgcggcac600ctggcccagc cttga 615<210>9<211>6<212>PRT<213>人工的<220>  
            
<221>PEPTIDE<222>(1)..(6)<223>合成標記物<400>9  
            
His His His His His His1   5<210>10<211>8<212>PRT<213>人工的<220>  
            
<221>PEPTIDE<222>(1)..(8)<223>合成標記物<400>10Met Lys His His His His His His1   5<210>11<211>10<212>PRT<213>人工的<220>  
            
<221>PEPTIDE<222>(1)..(10)<223>合成標記物<400>11Met Lys His His Ala His His Gln His His1   5   10<210>12<211>14<212>PRT<213>人工的<220>  
            
<221>PEPTIDE<222>(1)..(14)<223>合成標記物<400>12Met Lys His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln1   5   10  
            
<210>13<211>10<212>PRT<213>人工的<220>  
            
<221>PEPTIDE<222>(1)..(10)<223>合成標記物<400>13Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu1   5   10<210>14<211>8<212>PRT<213>人工的<220>  
            
<221>PEPTIDE<222>(1)..(8)<223>合成標記物<400>14Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys1   5<210>15<211>9<212>PRT<213>人工的<220>  
            
<221>PEPTIDE<222>(1)..(9)<223>合成標記物<400>15Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala1   權利要求
            
1.一種顯示G-CSF活性的多肽偶聯物，它包含一種多肽，該多肽與SEQ ID NO1所示的hG-CSF氨基酸序列相比，包含選自K16R/Q，K34R/Q和K40R/Q的至少一個取代，以及選自T105K和S159K的至少一個取代，或者在與SEQ ID NO1有至少80％序列同一性的氨基酸序列的相應位置具有上述取代，并且所述偶聯物有2-6個分子量約1000-10,000Da的聚乙二醇組分與該多肽的連接基團相連。
            
2.權利要求1的多肽偶聯物，包含3，4，或5個所述取代。
            
3.權利要求1或2的多肽偶聯物，還包含取代H170K，H170Q或H170R。
            
4.權利要求1-3之一的多肽偶聯物，包含選自下組的取代Q70K+S159K，Q70K+H170K，Q90K+S159K，Q90K+H170K，T105K+S159K，T105K+H170K，Q120K+S159K，Q120K+H170K，T133K+S159K，T133K+H170K，S159K+H170K，Q70K+Q90K+S159K，Q70K+Q90K+H170K，Q70K+T105K+S159K，Q70K+T105K+H170K，Q70K+Q120K+S159K，Q70K+Q120K+H170K，Q70K+T133K+S159K，Q70K+T133K+H170K，Q70K+S159K+H170K，Q90K+T105K+S159K，Q90K+T105K+H170K，Q90K+Q120K+S159K，Q90K+Q120K+H170K，Q90K+T133K+S159K，Q90K+T133K+H170K，Q90+S159K+H170K，T105K+Q120K+S159K，T105K+Q120K+H170K，T105K+T133K+S159K，T105K+T133K+H170K，T105K+S159K+H170K，Q120K+T133K+S159K，Q120K+T133K+H170K，Q120K+S159K+H170K，T133K+S159K+H170K，Q70K+Q90K+T105K+S159K，Q70K+Q90K+T105K+H170K，Q70K+Q90K+Q120K+S159K，Q70K+Q90K+Q120K+H170K，Q70K+Q90K+T133K+S159K，Q70K+Q9OK+T133K+H170K，Q70K+Q90K+S 159K+H170K，Q70K+T105K+Q120K+S159K，Q70K+T105K+Q120K+H170K，Q70K+T105K+T133K+S159K，Q70K+T105K+T133K+H170K，Q70K+T105K+S159K+H170K，Q70K+Q120K+T133K+S159K，Q70K+Q120K+T133K+H170K，Q70K+T133K+S159K+H170K，Q90K+T105K+Q120K+S159K，Q90K+T105K+Q120K+H170K，Q90K+T105+T133K+S159K，Q90K+T105+T133K+H170K，Q90K+T105+S159K+H170K，Q90K+Q120K+T133K+S159K，Q90K+Q120K+T133K+H170K，Q90K+Q120K+S159K+H170K，Q90K+T133K+S159K+H170K，T105K+Q120K+T133K+S159K，T105K+Q120K+T133K+H170K，T105K+Q120K+S159K+H170K，T105K+T133K+S159K+H170K和Q120K+T133K+S159K+H170K。
            
5.權利要求1-4之一的多肽偶聯物，包含選自下組的取代K16R+K23R，K16R+K34R，K16R+K40R，K23R+K34R，K23R+K40R，K34R+K40R，K16R+K23R+K34R，K16R+K23R+K40R，K23R+K34R+K40R，K16R+K34R+K40R和K16R+K23R+K34R+K40R。
            
6.權利要求5的多肽偶聯物，包含取代K16R+K34R+K40R，并且在第23位包含賴氨酸殘基。
            
7.權利要求1-6之一的多肽偶聯物，其中所述取代的位置對應于與SEQ ID NO1有至少約90％序列同一性的氨基酸序列中的相應位置。
            
8.權利要求7的多肽偶聯物，其中所述取代的位置對應于與SEQ IDNO1有至少約95％序列同一性的氨基酸序列中的相應位置，所述序列同一性例如是至少約96％，97％，98％或99％。
            
9.權利要求1-8之一的多肽偶聯物，其中所述聚乙二醇組分與至少一個賴氨酸殘基相連，并且還可以與N-末端氨基相連。
            
10.權利要求1的多肽偶聯物，它包含一種多肽，該多肽與SEQ ID NO1所示的hG-CSF氨基酸序列相比，包含選自K16R，K34R，K40R，T105K和S159K的取代，并且所述偶聯物有2-6個分子量約1000-10,000Da的聚乙二醇組分與該多肽的連接基團相連。
            
11.權利要求1-10之一的多肽偶聯物，它在T133位發生糖基化。
            
12.權利要求1-11之一的多肽偶聯物，連接有3-5，4-6，3-4，4-5或5-6個PEG組分。
            
13.權利要求12的多肽偶聯物，連接有3-6個，例如4-5個，分子量約5000-6000Da的聚乙二醇組分。
            
14.權利要求13的多肽偶聯物，連接有4個分子量約5kDa的聚乙二醇組分。
            
15.權利要求13的多肽偶聯物，連接有5個分子量約5kDa的聚乙二醇組分。
            
16.權利要求1-15之一的多肽偶聯物，其體外生物學活性經本文所述螢光素酶試驗測定，為非偶聯hG-CSF生物學活性的大約2-30％。
            
17.顯示G-CSF活性的多肽偶聯物，它包含一種多肽，該多肽包含與SEQ ID NO1所示的hG-CSF氨基酸序列有至少一個氨基酸殘基不同的氨基酸序列，并且有至少一個非多肽組分與該多肽的連接基團相連，所述偶聯物的體外生物學活性經本文所述螢光素酶試驗測定，為非偶聯hG-CSF生物學活性的大約2-30％。
            
18.權利要求17的多肽偶聯物，它與SEQ ID NO1相比，在選自11-41位(螺旋A)，71-95位(螺旋B)，102-125位(螺旋C)，和145-170位(螺旋D)的氨基酸位置包含至少一個氨基酸改變。
            
19.權利要求17或18的多肽偶聯物，它包含2-6個分子量約1000-10,000Da的聚乙二醇組分與該多肽的連接基團相連。
            
20.制備G-CSF偶聯物的方法，所述偶聯物與hG-CSF相比，受體介導的清除減少，和/或中性粒細胞減少癥的持續時間縮短，所述方法包括制備一種多肽，該多肽具有與SEQ ID NO1所示的hG-CSF氨基酸序列相比至少有一個氨基酸殘基不同的氨基酸序列，并且所述多肽的連接基團物與至少一個非多肽組分相連，所得偶聯物的體外生物學活性經本文所述螢光素酶試驗測定，為非偶聯hG-CSF生物學活性的大約2-30％。
            
21.權利要求20的方法，其中所需體外生物學活性是通過，相對于氨基酸序列SEQ ID NO1而言，在選自11-41位(螺旋A)，71-95位(螺旋B)，102-125位(螺旋C)，和145-170位(螺旋D)的氨基酸位置改變，通常是取代，至少一個氨基酸殘基，并將至少一個非多肽組分與所述至少一個改變的氨基酸殘基偶聯，來獲得。
            
22.一種組合物，包含權利要求1-19之一的多肽偶聯物和至少一種可藥用載體或賦形劑。
            
23.一種治療中性粒細胞水平不足的患者的方法，包括對需要這種治療的哺乳動物給藥治療有效量的權利要求1-19之一所述多肽偶聯物或權利要求22所述組合物。
            
24.權利要求1-19之一所述多肽偶聯物作為藥物的用途。
            
25.權利要求1-19之一所述多肽偶聯物在制備用于治療中性粒細胞水平不足的藥物組合物中的用途。
            
26.權利要求25的用途，其中所述藥物組合物用于預防和/或治療由于化療或放療，或者由于HIV或另一種病毒感染所引起的中性粒細胞減少癥。
            
全文摘要
            
本發明涉及具有G－CSF活性的多肽偶聯物，它包含一種多肽，該多肽與人G－CSF的序列相比，至少引入并去除一個賴氨酸殘基，并且該多肽與2－6個聚乙二醇組分偶聯。所述偶聯物具有較低的體外生物學活性，較長的體內半壽期，由受體介導的清除減少，比未偶聯的重組人G－CSF更快地刺激白細胞和中性粒細胞的生成。
            
文檔編號C07K14/53GK1729018SQ02813972 
            
公開日2006年2月1日 申請日期2002年7月10日 優先權日2001年7月11日
            
發明者托本·L·尼森, 金·V·安德森, 克里斯琴·K·漢森, 簡·M·米克爾森, 漢斯·T·沙拜 申請人:馬克西根控股公司
            
                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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