肽的制備方法

專利名稱：肽的制備方法
技術領域：
本發明涉及通過使靶肽以重復連接的前體蛋白質形式穩定地在微生物中表達，然后斷裂該前體蛋白的肽鍵，制備靶肽或其鹽的方法。
背景技術：
在合成肽的方法中已知存在有機化學方法、使用酶的方法以及使用基因重組技術的方法等3種方法。
其中，就使用基因重組技術的方法來說，肽通過直接表達方法合成是非常困難的。其理由是即使可以使肽直接表達，但制備的肽會被菌體內的蛋白酶一個一個地迅速分解。
因此，在使用基因重組技術合成肽時，一般都采用以與保護蛋白形成的融合蛋白形式使其表達的融合蛋白法。作為保護蛋白為了使后面的純化迅速、且有效地進行，使用能夠使用親和層析法的蛋白A、β半乳糖苷酶等有利。但必須從該融合蛋白特異切出靶肽，人們熟知的切出方法有溴化氰(斷裂Met的C末端一側)等化學方法和使用斷裂緊接在所謂的腸激酶斷裂位點(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)或因子Xa斷裂位點(Ile-Glu-Gly-Arg)的序列之后的C末端一側等的酶方法。
將作為融合蛋白的保護蛋白FGF突變蛋白(CS23)與作為特異的化學斷裂法S-氰化反應組合的新的肽合成法已有報道(EP0887417)。該方法利用CS23對肝素的強親和力，可以有效、容易地進行融合蛋白的純化。另外借助于半胱氨酸，通過在該位置的S-氰化反應(對Cys的N末端一側進行斷裂)嘗試進行特異斷裂，是可以切出靶肽的有用方法，而且也是可能制備很多肽生理活性表達所必需的C末端酰胺體的方法。而該方法可適用于分子內不含有半胱氨酸殘基的所有肽。
另一方面，一般來說，融合蛋白法的保護蛋白和靶肽之間的分子量差別大，有時不敢說無浪費地利用微生物(大腸桿菌)的蛋白質合成能力也是事實。在此，嘗試將幾個靶肽基因串聯在一個分子中，在菌體內以穩定前體蛋白形式使其表達，然后切出靶肽的串聯重復法，但該成功的例子少。其原因是由于以往切出靶肽的N末端一側，使其露出的方法(可說是左手剪刀)已知有溴化氰處理、因子Xa法等，而適合用于特異切出C末端，使其露出的方法(可說是右手剪刀)還沒有。

發明內容
本發明目的在于提供利用基因重組法能夠有效地、而且大量制備靶肽的方法。
本發明人等就特異切該C末端，使其露出的方法進行銳意考察，結果意外地發現與先前敘述的S-氰化反應用于融合蛋白法同樣，也可在通過串聯重復法進行肽的合成中有效地利用，從而完成了本發明。
就是說，本發明人等成功地獲得了在串聯重復法中必需的左手用、右手用兩個剪刀，特別是到目前為止用基因重組法合成困難的分子量小的肽的有效、且大量制備成為可能(圖1)。
這樣一來，通過使這兩個斷裂方法組合，使用串聯重復法有效、且大量制備分子量小的肽成為可能(圖2)。
即本發明提供(1)靶肽或其鹽的制備方法(以下，稱為制備法A)，其特征是通過酶或化學方式對在靶肽N末端和C末端附加酶或化學斷裂位點并重復連接的前體蛋白進行斷裂。
(2)上述1記載的制備方法，其特征是通過酶或化學方式對在靶肽的N末端附加酶或化學斷裂位點、在C末端附加化學斷裂位點并重復連接的前體蛋白進行斷裂。
(3)靶肽或其鹽的制備方法(以下，稱為制備法B)，其特征是用溴化氰或蛋白水解酶對在靶肽的N末端一側附加蛋氨酸殘基或蛋白質水解酶斷裂序列、在C末端一側附加半胱氨酸殘基或半胱氨酰肽(其中，半胱氨酰肽的肽部分與靶肽不同，而且當N末端一側附加蛋氨酸殘基時，肽部分沒有蛋氨酸殘基)并重復連接的前體蛋白中的各靶肽的N末端一側進行斷裂，在C末端一側的半胱氨酸或半胱氨酰肽的N末端一側進行斷裂反應。
(4)上述(1)～(3)記載的制備方法，其中前體蛋白是重組型前體蛋白。
(5)上述(3)記載的制備方法，其中斷裂反應是S-氰化反應、然后附加氨分解或水解的反應。
(6)上述5記載的制備方法，其中是在2-硝基-5-硫氰基苯甲酸(NTCB)、1-氰基-4-二甲胺吡啶鎓鹽(DMAP-CN)或CN-離子存在下進行S-氰化反應。
(7)上述(3)記載的制備方法，其中蛋白水解酶是腸激酶、因子Xa或凝血酶。
(8)上述(3)記載的制備方法，其中(イ)當使用溴化氰時，在各靶肽的N末端連接蛋氨酸殘基，靶肽不含有蛋氨酸殘基。
(ロ)當蛋白水解酶為腸激酶時，在各靶肽的N末端連接Asp-Asp-Asp-Asp-Lys等腸激酶斷裂位點，靶肽不含有Asp-Asp-Asp-Asp-Lys等氨基酸序列。
(ハ)當蛋白水解酶為因子Xa時，在各靶肽的N末端連接Ile-Glu-Gly-Arg等因子Xa斷裂位點，靶肽不含有Ile-Glu-Gly-Arg等氨基酸序列。
(ニ)當蛋白水解酶為凝血酶時，各靶肽的N末端連接Gly-Pro-Arg等凝血酶斷裂位點，靶肽不含有Gly-Pro-Arg等氨基酸序列。
(9)上述(1)～(3)記載的制備方法，其中靶肽是KiSS-1肽。
(10)上述(1)～(3)記載的制備方法，其中靶肽是GPR8配體。
(11)GPR8配體或其鹽的制備方法，其特征是用腸激酶對在GPR8配體的N末端附加腸激酶斷裂序列，在C末端附加半胱氨酸殘基后，重復連接3次的前體蛋白中的GPR8配體的N末端一側進行斷裂，以及在C末端一側的半胱氨酸殘基的N末端一側附加斷裂反應。
(12)上述(10)或(11)記載的制備方法，其中GPR8配體是含有與序列44表示的氨基酸序列相同或實質上相同的氨基酸序列的多肽。
(13)上述(10)或(11)記載的制備方法，其中GPR8配體是含有序列44、序列45、序列46、序列47、序列48、序列49或序列50表示的氨基酸序列的多肽。
(14)上述(10)或(11)記載的制備方法，其中GPR8配體是含有序列44氨基酸序列的多肽。
(15)一種DNA，含有編碼以下前體蛋白的DNA，即，在靶肽的N末端一側附加蛋氨酸殘基或蛋白質水解酶斷裂序列、在C末端一側附加半胱氨酸殘基或半胱氨酰肽(其中，半胱氨酰肽的肽部分與靶肽不同，而且當N末端附加蛋氨酸殘基時，肽部分不含有蛋氨酸殘基)并重復連接的前體蛋白。
(16)一種重組載體，含有上述(15)記載的DNA。
(17)上述(16)記載的重組載體，保持在用FERM BP-8023標記的轉化體大腸桿菌MM294(DE3)/pTCGPR3中。
(18)轉化體，用上述(16)記載的重組載體轉化。
(19)上述(18)記載的轉化體，是用FERM BP-8023標記的轉化體大腸桿菌MM294(DE3)/pTCGPR3。
(20)前體蛋白或其鹽，是在靶肽的N末端一側附加蛋氨酸殘基或蛋白質水解酶斷裂序列、在C末端一側附加半胱氨酸殘基或半胱氨酰肽(其中，半胱氨酰肽的肽部分與靶肽不同，而且當N末端一側附加蛋氨酸殘基時，肽部分不含有蛋氨酸殘基)并重復連接的前體蛋白或其鹽。
(21)上述(4)記載的制備方法，其中前體蛋白是對上述(18)記載的轉化體進行培養之后制備的重組型前體蛋白。


圖1表示本發明的肽制備法的概略圖。
圖中，向下的箭頭為左手用剪刀(N末端切出以及露出方法)-A，向上箭頭為右手用剪刀(C末端切出以及露出方法)-B。作為左手用剪刀如通過溴化氰處理、因子Xa法、腸激酶法等在C末端一側斷裂肽，能夠使新的N末端露出的酶。這些方法可以斷裂Met或Ile-Glu-Gly-Arg、Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的C末端一側，使靶肽的N末端露出。右手用剪刀通過進行S-氰化，斷裂Cys的N末端一側，使靶肽C末端露出。
圖2表示本發明的肽制備法的概略圖。
圖3表示使用本發明肽制備法的KiSS-1肽制備法概略圖。
XxxMet(溴化氰)或Ile-Glu-Gly-Arg(因子Xa)，Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(腸激酶)等。
但是，(Xxx)一般來說當靶肽含有Met時除了使用因子Xa或腸激酶進行斷裂之外，而對于(本KiSS-1肽的場合可以不考慮)。①當靶肽不含有Pro時，使用脯氨酸特異的內肽酶，②當靶肽不含有Lys時使用賴氨酰內肽酶，③當靶肽不含有Arg時，使用精氨酰內肽酶，④當靶肽不含有Glu和Asp時，使用V8蛋白水解酶，⑤當靶肽不含有堿性氨基酸時，使用胰蛋白酶，⑥當靶肽不含有芳香族氨基酸時，使用胰凝乳蛋白酶。
圖4表示對實施例1～3中制備的hGPR8L(序列44)對GPR8表達CHO細胞的GTPγS結合活性進行測定的結果。橫軸表示hGPR8L的濃度，縱軸表示GTPγS結合活性。-●-表示使用合成的hGPR8L(序列44)時的結果，-○-表示用本發明的肽制備方法(串聯重復法)制備的hGPR8L(序列44)時的結果。
具體實施例方式
在本發明方法中，作為靶肽(有時簡單稱為“靶肽”)只要是分子內不含有切出中使用的方法涉及到的斷裂部位的肽，無論什么樣的肽都可以，其氨基酸序列只要是通過基因重組技術可以生產的無論什么樣的序列都可以。
靶肽的氨基酸殘基的數目沒有特別限定，但通常約為10～100個左右，約10～50個左右比較好，約20～40個左右更好。
靶肽的分子量也沒有特別限定，通常約1000～10000道爾頓，約1000～5000道爾頓比較好，約2000～4000道爾頓更好。
作為靶肽的具體例子如KiSS-1肽(WO00/24890)、RFRP-1(WO00/29441)、Apelin(WO99/33976)、PrRP(WO97/24436)、GALP(WO99/48920)、GPR8配體(W01/98494)、血管緊張素、緩激肽、降鈣素、蝸牛毒素、促皮質素釋放因子、強啡肽、內啡肽、腦啡肽、促生長激素神經肽、促胃液素、胰高血糖素、生長激素釋放因子、FMRF-酰胺、神經激肽、神經介素、神經肽、nociceptin、nocistatin、阿立新-B、胰泌素、底物P、urocortin、VIP、PACAP、ACTH、各種類鴉片肽類和上述的肽段等，其中KiSS-1肽、RFRP-1、GPR8配體、Apelin、PrRP、GALP等最好。
靶肽按照肽標記的慣例，左端為N末端(氨基端)，右端為C末端(羧基端)。
作為KiSS-1肽可以使用例如WO00/24890記載的人KiSS-1肽，具體來說，在序列1給出的由54個氨基酸殘基構成的氨基酸序列中，如含有從N末端開始的第47～54的氨基酸序列，由8至54個氨基酸殘基構成的肽等。
作為“在序列1給出的氨基酸序列中，含有從N末端第47～54的氨基酸序列，由8至54個氨基酸殘基構成的肽”，只要是含有從序列1氨基酸序列中的N末端開始的第47～54的氨基酸序列，而且由8至54個氨基酸殘基構成的肽，無論什么樣的肽都可以，這意味著肽具有的活性(例如，肽與受體的結合活性、由肽引起的受體表達細胞的細胞刺激活性等)等實質上是同樣的。具體來說，可以使用①序列1氨基酸序列表示的肽，②在C末端含有從本申請序列1氨基酸序列的N末端開始的第47～54位的氨基酸序列，由8至54個氨基酸殘基構成的肽等。
更具體地講，作為KiSS-1肽如①序列1氨基酸序列表示的肽，②由從序列1氨基酸序列的N末端開始的第40～54位構成的氨基酸序列表示的肽，③由從序列1氨基酸序列的N末端開始的第45～54位構成的氨基酸序列(序列2表示的氨基酸序列)表示的肽，④由從序列1氨基酸序列的N末端開始的第46～54位構成的氨基酸序列表示的肽，⑤由從序列1氨基酸序列的N末端開始的第47～54位構成的氨基酸序列表示的肽，⑥由從序列1氨基酸序列的N末端開始的第35～54位構成的氨基酸序列表示的肽等。
上述KiSS-1肽對WO00/24890記載的受體蛋白OT7T175具有配體活性。
作為上述RFRP-1，如Hinuma et al.，Nature Cell Biology，Vol 2，p703-708(2000)記載的RF amide-related peptides或WO00/29441記載的多肽等，具體的如只要含有序列1或序列9表示的氨基酸序列，對Hinuma etal.，Nature Cell Biology，Vol 2，p703-708(2000)或WO00/29441記載的受體OT7T022具有配體活性的肽無論什么樣肽都可以。
更具體來說，可以使用含有序列6、序列7、序列8、序列9、序列10或序列11的氨基酸序列的多肽等。
作為Apelin，如Biochem Biophys.Res.Commun.，251，471-476，(1998)記載的Apelin-36(含有序列18氨基酸序列的多肽)，Apelin-13(含有序列18中第24～36位的氨基酸序列的多肽)，Apelin-13的N末端的氨基酸(Gln)進行了焦谷氨酸化的肽等，只要是對其受體APJ(O’Dowd，B.F.，et al.，Gene，436，355-359，1993)具有配體活性的肽，無論什么樣肽都可以。具體的如WO99/33976記載的“含有與序列3表示的氨基酸序列相同或實質上相同的氨基酸序列、對受體蛋白具有結合能力的多肽”等。
作為PrRP(19P2配體)，如可以使用WO97/24436記載的多肽，具體的如與牛19P2L(b19P2L或牛PrRP)(序列20)、大鼠19P2L9(r19P2L或大鼠PrRP)(序列21)、人19P2L(h19P2L或人PrRP)(序列22)相同或實質上相同的肽或它們的酰胺、酯或它們的鹽等。
所謂「實質上同質」表示受體結合活性等性質上相同。因此受體結合活性的強度等強弱、肽的分子量等量的要素即使不同也可以。
例如，除了含有序列20、序列21或序列22氨基酸序列的肽等之外，如含有與序列20、序列21或序列22表示的氨基酸序列的同源性分別為約50～99.9％(70～99.9％比較好，80～99.9％更好，90～99.9％最好)的氨基酸序列，具有與含有序列20、序列21或序列22氨基酸序列的肽實質上同質的活性的肽等(但，該肽為氨基酸序列中不含有半胱氨酸的肽)。
作為與含有序列20、序列21或序列22氨基酸序列的肽實質上相同的肽的更具體例子如含有序列23(序列23中，第10位的Xaa代表Ala或Thr、第11位的Xaa代表Gly或Ser、第21位的Xaa代表OH、Gly或Gly-Arg)記載的部分肽的肽等。
更具體的例子如含有序列20、序列21或序列22氨基酸序列中的1個以上15個以下、比較好的是1個以上10個以下、更好的是1個以上5個以下氨基酸缺失的氨基酸序列；在序列20、在序列21或序列22氨基酸序列中附加1個以上80個以下、比較好的是1個以上50個以下、更好的是1個以上10個以下氨基酸的氨基酸序列；在序列20、序列21或序列22氨基酸序列中1個以上15個以下、比較好的是1個以上10個以下、更好的是1個以上5個以下的氨基酸用其它氨基酸置換的氨基酸序列的肽等。
更具體的例子如含有序列23、序列24、序列25、序列26、序列27、序列28、序列29、序列30、序列31、序列32、序列33、序列34、序列35、序列36、序列37、序列38、序列39、序列40、序列41、序列42、序列43氨基酸序列的肽等。
另外在本發明的PrRP中也含有Gln的N端一側在生物體內被斷裂，該Gln進行焦谷氨酸化的產物等。
作為GALP可以使用WO99/48920記載的肽。
作為GPR8配體只要是具有對7次穿膜受體蛋白GPR8(O’Dowd，B.F.etal.、Genomics、28卷、84-91頁、1995年)有配體活性、例如與GPR8的結合活性、對GPR8表達細胞的細胞刺激活性(例如，促進花生四烯酸游離、乙酰膽堿游離、細胞內Ca2+游離、細胞內cAMP生成、肌醇磷酸產生、細胞膜電位變動、細胞內蛋白質的磷酸化、c-fos的活化、pH降低、GTPγS結合活性等的活性)的多肽，無論什么樣的肽都可以，例如可以使用WO01-98494記載的肽等。
作為針對GPR8的配體多肽的更具體的例子如含有與序列44氨基酸序列相同或實質上相同的氨基酸序列的多肽等。
作為實質上與序列44表示的氨基酸序列相同的氨基酸序列，如序列45氨基酸序列、序列46氨基酸序列、序列47氨基酸序列、序列48氨基酸序列、序列49氨基酸序列以及序列50氨基酸序列等。
作為含有與序列44表示的氨基酸序列相同或實質上相同的氨基酸序列的多肽的具體例子如①含有序列44氨基酸序列的GPR8配體、②含有序列45氨基酸序列的GPR8配體、③含有序列46氨基酸序列的GPR8配體、④含有序列47氨基酸序列的GPR8配體、⑤含有序列48氨基酸序列的GPR8配體、⑥含有序列49氨基酸序列的GPR8配體、⑦含有序列50氨基酸序列的GPR8配體等。
作為靶肽的鹽，可以使用與生理學上可接受的堿(例如堿金屬等)或酸(有機酸、無機酸)形成的鹽，當然是生理學上可接受的加酸鹽好。作為這樣的鹽可以使用例如與無機酸(例如鹽酸、磷酸、溴氫酸、硫酸)形成的鹽，或與有機酸(例如醋酸、甲酸、丙酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的鹽等。
在本發明的制備方法A中，作為可附加在靶肽的N末端的酶的斷裂位點，如(1)作為蛋白水解酶的腸激酶的斷裂位點的Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(序列58)(由含有堿基序列GATGACGACGACAAG(序列59)的DNA編碼的)等。
(2)作為蛋白水解酶因子Xa的斷裂位點的Ile-Glu-Gly-Arg(序列60)(由含有堿基序列ATTGAAGGCCGC(序列61)的DNA編碼的)等。
(3)作為蛋白水解酶凝血酶的斷裂位點的Gly-Pro-Arg(序列62)(由含有堿基序列GGCCCGCGC(序列63)的DNA編碼的)等。
作為可附加在靶肽的N末端的化學斷裂位點，如作為溴化氰斷裂位點的蛋氨酸殘基等。
作為可附加在靶肽的C末端的化學斷裂位點，如半胱氨酸殘基或半胱氨酰肽等。
半胱氨酰肽的肽部分由1個或2個以上(例如1～5個左右)的氨基酸殘基構成。氨基酸的種類沒有特別限定，Gly、Ala、Ser、Leu等最好。而半胱氨酰肽的肽部分與靶肽不同。另外當靶肽的N末端附加了蛋氨酸殘基時(使用溴化氰時)，半胱氨酰肽的肽部分不含有蛋氨酸殘基。
所謂在靶肽的N末端和C末端附加酶或化學斷裂位點并重復連接的前體蛋白(含有前體肽)，是指在靶肽的N末端和C末端附加酶和化學斷裂位點的肽被重復連接2個以上(例如2～100個，2～20個比較好，2～10個更好)的蛋白質。
在本發明的制備方法B中，所謂在靶肽的N末端一側附加蛋氨酸殘基或蛋白質水解酶斷裂序列、在C末端一側附加半胱氨酸殘基或半胱氨酰肽(其中，半胱氨酰肽的肽部分與靶肽不同，而且當N末端附加蛋氨酸殘基時(使用溴化氰時)，肽部分不含有蛋氨酸殘基)之后重復連接的前體蛋白(也包括前體肽)，可以是2個以上(例如2～100個，2～20個比較好，2～10個更好)的上述靶肽的N末端含有蛋氨酸殘基或蛋白質水解酶斷裂位點，而C末端含有半胱氨酸殘基或半胱氨酰肽、進而末端還可以含有氨基酸殘基的蛋白質重復連接的蛋白質。
蛋白水解酶斷裂序列和半胱氨酰肽與上述同樣。
本發明的制備法A或B使用的這些前體蛋白最好是利用基因工程手法制備的重組型前體蛋白質。
該重組型蛋白質例如可以通過對下面提到的含有編碼前體蛋白質的DNA的載體的轉化體進行培養，使該前體蛋白表達來制備。
編碼前體蛋白的DNA只要是編碼上述前體蛋白，無論什么樣的都可以，通過化學方法合成整個堿基序列也可以。作為該場合的制備方法，例如可以使用眾所周知的磷酰胺法、磷酸三酯法、二酯法、氫膦酸酯等，如果是短的序列可以一次合成，如果是長的序列，可以分開合成后，再用T4DNA連接酶連接制作。
作為用于制備編碼前體蛋白的DNA所使用的編碼各靶肽的DNA可以使用眾所周知的DNA，也可以使用眾所周知的方法進行克隆。DNA的堿基序列只要是編碼各靶肽的DNA，可以是天然型的堿基序列，也可以是將天然型的堿基序列中的密碼子換成編碼同一氨基酸的其它密碼子后的堿基序列。
編碼靶肽N末端和C末端附加酶或化學斷裂位點之后重復連接的前體蛋白的DNA，是使編碼酶或化學斷裂位點的堿基序列結合于編碼各靶肽的DNA堿基序列的5′端以及3′端，以串聯重復序列構建的。
編碼靶肽N末端一側附加蛋氨酸殘基或蛋白質分解酶斷裂序列、C末端一側附加半胱氨酸殘基或半胱氨酰肽后反復連接的前體蛋白質的DNA，是通過使編碼用于肽鍵的N末端一側斷裂反應的溴化氰或蛋白水解酶的斷裂位點的堿基序列結合在編碼各靶肽的DNA的堿基序列的5′端一側，再使編碼利用1-氰基-4-二甲胺吡啶鎓鹽(DMAP-CN)進行S-氰化反應后通過氨分解或水解進行斷裂的位點的堿基序列(例如，編碼半胱氨酸的TGT或TGC，編碼半胱氨酰肽的堿基序列)結合在編碼各靶肽的DNA的堿基序列的3′端，以重復序列形式構建的。
另外前體蛋白的C末端可以是半胱氨酸殘基或半胱氨酰肽中的任一種。
作為編碼KiSS-1肽的DNA，只要是編碼上述KiSS-1肽的DNA，無論什么樣的都可以，例如①作為編碼含有序列1氨基酸序列的人KiSS-1肽的DNA可以使用含有序列3堿基序列的DNA，②作為編碼含有序列2氨基酸序列的KiSS-1(45-54)肽的堿基序列可以使用含有序列4堿基序列的DNA等。另外，即使將密碼子適當地換成編碼同一氨基酸的其它密碼子也可以。
作為本發明方法中使用的含有編碼KiSS-1肽的DNA的DNA的具體例子，如含有下述堿基序列(序列5)的DNA等。
GGTAGCGCGA TGTATAACTG GAACAGCTTT GGTCTGCGTT TTTGTGGCTCGGCGATGTAC AATTGGAATT CCTTCGGCCT GCGCTTCTGC GGCTCGGCGATGTATAACTG GAACTCCTTT GGCCTGCGCT TTTGCGGTTC TGCT該堿基序列是在編碼KiSS-1(45-54)肽的序列4堿基序列的5′端結合編碼溴化氰斷裂位點的堿基序列(ATG)，以及其3′端結合編碼1-氰基-4-二甲胺吡啶鎓鹽(DMAP-CN)的斷裂位點的堿基序列(TGT)的產物。通過將該堿基序列重復連接，可以制備編碼KiSS-1肽的前體蛋白的DNA。
作為編碼RFRP-1的DNA，只要是編碼RFRP-1的DNA，無論什么樣的都可以，例如①作為編碼含有序列6氨基酸序列的RFRP-1的DNA可以使用含有序列12堿基序列的DNA，②作為編碼含有序列7氨基酸序列的RFRP-1的DNA可以使用含有序列13堿基序列的DNA，③作為編碼含有序列8氨基酸序列的RFRP-1的DNA可以使用含有序列14堿基序列的DNA，④作為編碼含有序列9氨基酸序列的RFRP-1的DNA可以使用含有序列15堿基序列的DNA，⑤作為編碼含有序列10氨基酸序列的RFRP-1的DNA可以使用含有序列16堿基序列的DNA，⑥作為編碼含有序列11氨基酸序列的RFRP-1的DNA可以使用含有序列17堿基序列的DNA。
作為編碼Apelin的DNA，只要是編碼上述的Apelin的DNA，無論什么樣的都可以，例如①作為作為編碼含有序列18氨基酸序列的Apelin的DNA可以使用含有序列19堿基序列的DNA等。
作為編碼PrRP的DNA，只要是編碼上述PrRP的DNA，無論什么樣的都可以，具體來說可以使用WO97-24436號記載的DNA。
作為編碼GALP的DNA，只要是編碼上述GALP的DNA，無論什么樣的都可以，具體來說可以使用WO99/48920號記載的DNA。
作為編碼GPR8配體的DNA，只要是編碼GPR8配體的DNA，無論什么樣的都可以，例如①作為編碼含有序列44氨基酸序列的GPR8配體的DNA可以使用含有序列51堿基序列的DNA，②作為編碼含有序列45氨基酸序列的GPR8配體的DNA可以使用含有序列52堿基序列的DNA，③作為編碼含有序列46氨基酸序列的GPR8配體的DNA可以使用含有序列53堿基序列的DNA，④作為編碼含有序列47氨基酸序列的GPR8配體的DNA可以使用含有序列54堿基序列的DNA，⑤作為編碼含有序列48氨基酸序列的GPR8配體的DNA可以使用含有序列55堿基序列的DNA，⑥作為編碼含有序列49氨基酸序列的GPR8配體的DNA可以使用含有序列56堿基序列的DNA。⑦作為編碼含有序列50氨基酸序列的GPR8配體的DNA可以使用含有序列57堿基序列的DNA。
作為本發明方法中使用的含有編碼GPR8配體的DNA的DNA的具體例子如含有下述堿基序列(序列64)的DNA等。
GATGACGATG ACAAATGGTA TAAACATGTG GCGAGCCCGC GTTATCATAC
CGTGGGCCGC GCGGCCGGTC TGCTGATGGG CCTGTGTCAA TTGGGTGGTGATGACGATGA CAAATGGTAT AAACATGTGG CGAGCCCGCG TTATCATACCGTGGGCCGCG CGGCCGGTCT GCTGATGGGC CTGTGTGAGC TCGGCTCTGACGACGATGAT AAATGGTACA AACACGTTGC CTCCCCGCGC TACCACACGGTTGGTCGTGC CGCGGGCCTG CTGATGGGTC TGTGCGGT該堿基序列是在編碼GPR8配體(23個殘基)肽的序列44堿基序列的5′端結合了編碼腸激酶斷裂序列(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys；序列58)的堿基序列(序列59)，其3′端結合了編碼1-氰基-4-二甲胺吡啶鎓鹽(DMAP-CN)的斷裂位點的堿基序列(TGT)的產物。通過將該堿基序列重復連接，可以制備編碼GPR8配體(23個殘基)的前體蛋白的DNA。
而利用以往的基因技術，例如位點特異性誘變技術可以將編碼重復連接靶肽的前體蛋白的DNA變換為編碼靶肽的突變蛋白的DNA。
位點特異性誘變技術眾所周知，在Lather，R.F.以及Lecoc，J.P.，GeneticEngineering，Academic press社(1983年)第31-50頁等有報道。寡核苷酸指導的誘變在Smith，M.和Gillam.S.Genetic Engineering，原理和方法，Plenum社(1981年)3卷1-32頁等有報道。
用作含有編碼前體蛋白的DNA的載體的質粒的例子，如來自大腸桿菌(Escherichia coli)的pBR322[Gene，2，95(1977)]，pBR313[Gene，2，75(1977)]、pBR324、pBR325[Gene，4，124(1978)]、pBR327，pBR328[Gene，9，287(1980)]、pBR329[Gene，17，79(1982)]、pKY2289[Gene，3，1(1978)]、pKY2700[生化學，52，770(1980)]、pACYC177，pACYC184[Journal of Bacteriology，134，1141(1978)、pKR248，pKR 646，pDF[Methods in Enzymology，68，268(1979)]，pUC18、pUC19[Yanisch-perron等，Gene，33，103(1985)]等。
另外如使用噬菌體，例如λ噬菌體的λgt系的λgt？λC[Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.71，4579(1974)]，·t？λB[Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.72，3461(1975)]、λDam[Gene，1，255(1977)]和卡隆(charon)載體[Science，196，161(1977)，Journal of Virology，29，555(1979)]、使用纖維狀噬菌體的mp系mp18、mp19[Yanisch-perron等，Gene，33，103(1985)]載體等。
上述DNA最好是在ATG上游含有啟動子，該啟動子只要是與轉化體制備中使用的宿主相對應的適當的啟動子，無論什么樣的都可以。例如，宿主為大腸桿菌(Escherichiacoli)時，使用trp啟動子、lac啟動子、recA啟動子、λPL啟動子、Ipp啟動子、T7啟動子等。
使用T7啟動子系列時，作為T7啟動子可以是T7DNA中發現的17種啟動子[J.L.Oakley等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74，4266-4270(1977)，M.D.Rosa，Cell 16815-825(1979)，N.Panayotatos等，Nature，28035(1979)，J.J.Dunn等，J.Mol.Biol.，166477-535(1983)]中的任一種，但最好是φ10啟動子[A.H.Rosenberg等，Gene，56125-135(1987)]。
作為轉錄終止子可以使用在大腸桿菌系中起作用的終止子，最好是Tφ10終止子[F.W.Studier等，J.Mol.Biol.，189113-130(1986)]等。
作為T7RNA聚合酶DNA可以使用T7DNA[F.W.Studier等，J.Mol.Biol.，189113-130(1986)]等。
載體最好是在上述載體中整合了T7啟動子、T7終止子后構建的載體，作為這樣的載體可以使用pET-1、pET-2、pET-3、pET-4、pET-5[A.H.Rosenberg等，Gene，56125-135(1987)]等，最好是使用pTB960-2[EP-A-499990]。
轉化體可以通過眾所周知的方法用上述方法[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.69，2110(1972)]得到的表達用質粒轉化宿主制備。
作為被轉化的微生物宿主的例子如大腸桿菌(E.coli)，具體可以使用大腸桿菌(Escherichia coli)K12DH1[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.60，160(1968)]，JM-103[Nucleic Acids Research，9，309(1981)]，JA221[Journal of Molecular Biology，120，517(1978)]，HB101[Journal of MolecularBiology，41，459(1969)]，C600[Genetic，39，440(1954)]，N4830[Cell，25，713(1981)]，K-12MM294[Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.73，4174(1976)]BL-21等。
使用T7啟動子系列時，作為其轉化體的宿主，可以使用整合了T7RNA聚合酶DNA(T7DNA1)[F.W.Studier等，J.Mol.Biol.，189113-130(1986)]的大腸桿菌菌株(例如，MM294，DH-1，C600，JM109，BL21)，將T7RNA聚合酶DNA(T7DNA1)與其它的質粒一起整合的大腸桿菌菌株等。最好使用整合了T7DNA1的λ噬菌體溶原化的MM294株和BL21株。此時作為T7DNA1的啟動子可以使用用異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(有時省略為IPTG)誘導表達的lac啟動子。
重組型前體蛋白可以在培養基中對上述轉化體進行培養，通過收集產生的重組型前體蛋白進行制備。
培養基的pH希望為約6～8。作為對大腸桿菌屬菌進行培養時的培養基，例如，理想的是含有葡萄糖、酪蛋白氨基酸的M9培養基[Miller，Journalof Experiments in Molecular Genetics，431-433，Cold Spring HarborLaboratory，New York 1972]。此時根據需要，例如可以添加用于使啟動子有效地發揮作用的象3β-吲哚丙稀酸或異丙基-β-D-硫代半乳糖苷那樣的藥物。
宿主是大腸桿菌屬時，培養通常是在約15～43℃下進行約3～24小時，根據需要也可以加上通氣和攪拌。
當使用T7啟動子系時，(1)當使連接在lac啟動子下游的T7DNA(RNA聚合酶DNA)表達時，通過添加IPTG等，或(2)當使連接在λPL啟動子下游連接的T7DNA(RNA聚合酶DNA)表達時，通過使培養的溫度上升等，由生成的T7噬菌體RNA聚合酶1特異地使T7啟動子發揮作用。
培養后，通過眾所周知的方法收集菌體，例如懸浮于緩沖液之后，進行諸如蛋白變性劑處理、超聲處理或溶菌酶等酶處理、玻璃球處理、弗氏壓碎機處理、凍融處理等，破碎菌體，雖然通過離心分離等眾所周知的方法可獲得包涵體或可溶成分(上清)，但包涵體形式是所希望的。
上述得到的包涵體使用變性劑進行溶解，可以進入到下面的工序。在從上清對重組型前體蛋白進行分離時，可以利用通常都知道的蛋白質純化方法。例如可以將凝膠過濾法、離子交換層析、吸附層析、高效液相色譜層析、親和層析、疏水層析、電泳等適當組合用于純化工作。另外該前體蛋白不進行純化，或以部分純化的狀態也可進入到下面的工序。
在對經上述操作得到的重組型前體蛋白中的各靶肽的N末端一側進行斷裂反應時，使用溴化氰或蛋白水解酶等。
作為蛋白水解酶只要是已知的蛋白水解酶無論哪一種都可以，例如腸激酶、因子Xa、凝血酶等比較好，特別是使用腸激酶、因子Xa更好。
相對于每1mg重組型多肽，蛋白水解酶使用量通常為0.01單位到約100單位，約0.1單位至約10單位更好。
在該斷裂反應中使用溴化氰時，將作為溴化氰斷裂位點的蛋氨酸殘基連接在重組型前體蛋白質中靶肽的N末端。而此時最好是靶肽不含有蛋氨酸殘基。
作為蛋白水解酶使用腸激酶時，將代表腸激酶斷裂位點的序列(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys；序列54)等連接在重組型前體蛋白質中靶肽的N末端。而此時靶肽最好是不含有Asp-Asp-Asp-Asp-Lys等氨基酸序列的肽。
作為蛋白水解酶使用因子Xa時，將代表因子Xa斷裂位點的序列(Ile-Glu-Gly-Arg，序列56)等連接在重組型前體蛋白質中的靶肽的N末端。而此時靶肽最好是不含有Ile-Glu-Gly-Arg氨基酸序列的肽。
作為蛋白水解酶使用凝血酶時，將凝血酶斷裂位點的序列(Gly-Pro-Arg，序列58)等連接在重組型前體蛋白質中靶肽的N末端。而此時靶肽最好是不含有Gly-Pro-Arg氨基酸序列的肽。
用蛋白水解酶進行肽鍵的斷裂反應的反應溫度通常約0℃～60℃，最好是0℃～40℃。
使用的溶劑沒有特別限定，例如Tris-HCl緩沖液、Tris-醋酸緩沖液、磷酸緩沖液、硼酸緩沖液等。
該反應中pH通常約1～12，最好是約4～8。
重組型前體蛋白質中靶肽的C末端一側的斷裂反應例如可以使用EP887417記載的方法進行。即在重組型前體蛋白質中靶肽的C末端一側附加斷裂反應。
作為該斷裂反應例如S-氰化反應后進行水解反應。當作為最終產物要得到靶肽的酰胺或它的鹽時，作為該斷裂反應，例如可先進行S-氰化反應，然后進行氨分解反應。該S-氰化反應可以通過使S-氰化試劑作用于原料化合物來進行。
作為S-氰化試劑例如2-硝基-5-硫氰基苯甲酸(NTCB)、1-氰基-4-二甲胺吡啶鎓鹽(DMAP-CN)或CN-離子等。
該S-氰化試劑的量其摩爾數為總巰基的約2倍至50倍的量，最好是約5倍～10倍量。
反應溫度只要是處于約0℃～80℃之間，哪一個溫度都可以，處于約0℃～50℃之間更好。作為使用的溶劑只要是與S-氰化試劑不反應的溶劑，無論哪一種緩沖液都可以，例如Tris-HCl緩沖液、Tris-醋酸緩沖液、磷酸緩沖液、硼酸緩沖液等。另外有機溶劑只要是與S-氰化試劑不反應的溶劑，也可以存在。
該反應在pH1～12之間進行比較好。特別是在使用NTCB時，pH7～10比較好，使用DMAP-CN時為防止S-S交換反應，pH2～7之間比較好。另外在反應液中即使存在鹽酸胍等變性劑也可以。
作為上述氨分解或水解反應，例如附加堿處理。
該堿處理是通過將含有原料的水溶液的pH調到7～14來進行的。
該pH的調整可以通過將適量的氨、氫氧化鈉、氨基化合物、Trizma Base(三[羥甲基]-氨基甲烷)、磷酸氫二鈉、氫氧化鉀、氫氧化鋇等溶液加入到含有原料化合物的水溶液中，氨特別好。
作為上述反應時的溶液的濃度，例如在使用氨或氨基化合物時約0.01～15N，0.1～3N最好，使用氫氧化鈉時約0.01～2N，0.05～1N最好，使用Trizma Base時約1mM～1M，20mM～200mM最好，使用磷酸氫二鈉時約1mM～1M，10mM～100mM最好，使用氫氧化鉀時約0.01～4N，0.1～2N最好，反應溫度只要是處于約-20℃～80℃之間，哪一個溫度都可以，處于約-10℃～50℃之間更好。
反應時間，S-氰化反應約為1～60分鐘，最好是約15～30分鐘；水解反應約5分鐘～100小時，最好是約10～15小時；氨分解反應約5分鐘～24小時，最好是約10～180分鐘。
作為該氨基化合物如以R1-(NR2)-H(式中R1和R2相同或不同，代表(i)氫原子，(ii)C1-20烷基，C3-8環烷基，C6-14芳(aryl)基或C6-14芳基-C1-3烷基(這些基團在碳原子上可以不含有取代基或含有1～3個氨基、羥基等)、(iii)可以被取代的氨基，(iv)羥基或C1-6烷氧基。)式表示的化合物等。
為了對通過該斷裂反應切出的靶肽進行分離，可以依據通常都知道的肽的純化方法。例如可以將凝膠過濾法、離子交換層析、高效液相色譜層析、親和層析、疏水層析、薄層層析、電泳等適當組合用于純化。
另外，該靶肽根據需要也可以通過冷凍干燥將它做成粉末。在進行冷凍干燥時，可以加山梨糖醇、甘露糖醇、右旋糖、麥芽糖、海藻糖、甘油醛等穩定劑。
用本發明制備方法得到的靶肽的C末端可以是酰胺(-CONH2)、羧基(-COOH)、羧酸鹽(-COO-)、烷酰胺(-CONHR)或酯(-COOR)。作為酯或烷酰胺的R如甲基、乙基、正丙基、異丙基或正丁基等C1-6烷基；環戊基、環己基等C3-8環烷基；苯基、α-萘基等的C6-12芳基；芐基、苯乙基、二苯甲基等苯-C1-2烷基；或α-萘甲基等的α-萘基-C1-2烷基等的C7-14芳烷基之外，作為口服用酯被廣泛使用的三甲基乙酰氧甲基等。
用本發明制備方法得到的靶肽、或其酰胺、或其酯、或其鹽可以與滅菌水、人血清清蛋白(HSA)、生理鹽水以及眾所周知的生理學上可接受的載體混合，作為安全的藥物，可以對哺乳動物(例如，人、猴、牛、馬、山羊、豬、大鼠、小鼠、土撥鼠等)通過非口服或局部給藥。例如1天給藥量每人約0.01mg～約50mg、最好是約0.1mg～10mg，通過靜脈或肌肉注射非口服方式給藥。
含有本發明靶肽的制劑也可以含有鹽、稀釋劑、佐劑、其它載體、緩沖液、結合劑、表面活性劑、保存劑那樣生理上可接受的溶劑。非口服給藥制劑可以使用與滅菌水溶液或生理學上可接受的溶劑形成的懸浮液針劑、或以用生理學上可接受的稀釋液在用時稀釋后可以使用的滅菌粉末(通常對肽溶液進行冷凍干燥后得到)安瓿[劑]提供。
在本說明書以及附圖中，氨基酸、肽、保護基團、活性基團、以及其它分子用略號表示時，它們都來自IUPAC-IUB(Commission onBiochemical Nomenclature)的略號或該領域中慣用的略號，以下給出了一些例子。氨基酸等有時存在光學異構體，沒有特別指出時，都表示L異構體。
DNA脫氧核糖核酸
A腺嘌呤T胸腺嘧啶G鳥嘌呤C胞嘧啶RNA核糖核酸EDTA乙二胺四乙酸Gly甘氨酸Ala丙氨酸Val纈氨酸Leu亮氨酸Ile異亮氨酸Ser絲氨酸Thr蘇氨酸Met蛋氨酸Glu谷氨酸Asp天冬氨酸Lys賴氨酸Arg精氨酸His組氨酸Phe苯丙氨酸Tyr酪氨酸Trp色氨酸Pro脯氨酸Asn天冬酰胺Gln谷氨酰胺ATP腺苷三磷酸T7PT7啟動子T7TT7終止子本說明書的序列號代表以下序列。
表示人KiSS-1肽的氨基酸序列。
表示人KiSS-1(45-54)肽的氨基酸序列。
表示編碼序列1給出的人KiSS-1肽的DNA堿基序列。
表示編碼序列2給出的人KiSS-1(45-54)肽的DNA堿基序列。
表示含有編碼人KiSS-1(45-54)肽的前體蛋白DNA的DNA堿基序列。
表示由9個氨基酸殘基構成的RFRP-1的氨基酸序列。
表示由12個氨基酸殘基構成的RFRP-1的氨基酸序列。
表示由20個氨基酸殘基構成的RFRP-1的氨基酸序列。
表示由37個氨基酸殘基構成的RFRP-1的氨基酸序列。
表示由9個氨基酸殘基構成的RFRP-1的氨基酸序列。
表示由17個氨基酸殘基構成的RFRP-1的氨基酸序列。
表示編碼序列6氨基酸序列表示的肽的DNA的堿基序列。
表示編碼序列7氨基酸序列表示的肽的DNA的堿基序列。
表示編碼序列8氨基酸序列表示的肽的DNA的堿基序列。
表示編碼序列9氨基酸序列表示的肽的DNA的堿基序列。
表示編碼序列10氨基酸序列表示的肽的DNA的堿基序列。
表示編碼序列11氨基酸序列表示的肽的DNA的堿基序列。
表示apelin-36的氨基酸序列。
表示編碼apelin-36的DNA堿基序列。
表示馬PrRP的氨基酸序列。
表示大鼠PrRP的氨基酸序列。
表示人PrRP的氨基酸序列。
表示與含有序列20、序列21或序列22氨基酸序列的肽實質上相同的肽的具體例子。
表示WO97/24436記載的對來自牛丘腦下部配體多肽進行純化，對P-3級分的N末端序列進行分析后得到的氨基酸序列。
表示WO97/24436記載的對來自牛丘腦下部配體多肽進行純化，對P-2級分的N末端序列進行分析后得到的氨基酸序列。
表示WO97/24436記載的來自牛丘腦下部配體多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436記載的來自牛丘腦下部配體多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436記載的來自牛丘腦下部配體多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436記載的來自牛丘腦下部配體多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436記載的來自牛丘腦下部配體多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436記載的來自牛丘腦下部配體多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436記載的大鼠型丘腦下部配體多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436記載的大鼠型丘腦下部配體多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436記載的大鼠型丘腦下部配體多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436記載的大鼠型丘腦下部配體多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436記載的大鼠型丘腦下部配體多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436記載的大鼠型丘腦下部配體多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436記載的人型丘腦下部配體多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436記載的人型丘腦下部配體多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436記載的人型丘腦下部配體多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436記載的人型丘腦下部配體多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436記載的人型丘腦下部配體多肽的氨基酸序列。
表示WO97/24436記載的人型丘腦下部配體多肽的氨基酸序列。
表示相對GPR8的配體多肽(人型·1-23)的氨基酸序列。
表示相對GPR8的配體多肽(豬型·1-23)的氨基酸序列。
表示相對GPR8的配體多肽(大鼠·小鼠型·1-23)的氨基酸序列[序列47]表示相對GPR8的配體多肽(人型·1-30)的氨基酸序列。
表示相對GPR8的配體多肽(豬型·1-30)的氨基酸序列。
表示相對GPR8的配體多肽(大鼠型·1-30)的氨基酸序列。
表示相對GPR8的配體多肽(小鼠型·1-30)的氨基酸序列。
表示編碼對于GPR8的配體多肽(人型·1-23)的DNA的堿基序列。
表示編碼對于GPR8的配體多肽(豬型·1-23)的cDNA的堿基序列。
表示編碼對于GPR8的配體多肽(大鼠·小鼠型·1-23)的DNA的堿基序列。
表示編碼對于GPR8的配體多肽(人型·1-30)的DNA的堿基序列。
表示編碼對于GPR8的配體多肽(豬型·1-30)的DNA的堿基序列。
表示編碼對于GPR8的配體多肽(大鼠型·1-30)的DNA的堿基序列。
表示編碼對于GPR8的配體多肽(小鼠型·1-30)的DNA的堿基序列。
表示代表腸激酶斷裂序列的氨基酸序列。
表示編碼腸激酶斷裂序列的DNA的堿基序列。
表示代表因子Xa酶斷裂序列的氨基酸序列。
表示編碼因子Xa酶斷裂序列的DNA的堿基序列。
表示代表凝血酶斷裂序列的氨基酸序列。
表示編碼凝血酶斷裂序列的DNA的堿基序列。
表示含有編碼人GRPR8配體(序列44)的前體蛋白DNA的DNA堿基序列。
表示在實施例1的結構基因制備中使用的DNA寡聚物的堿基序列。
表示在實施例1的結構基因制備中使用的DNA寡聚物的堿基序列。
表示在實施例1的結構基因制備中使用的DNA寡聚物的堿基序列。
表示在實施例1的結構基因制備中使用的DNA寡聚物的堿基序列。
表示在實施例1的結構基因制備中使用的DNA寡聚物的堿基序列。
表示在實施例1的結構基因制備中使用的DNA寡聚物的堿基序列。
表示在實施例1的結構基因制備中使用的DNA寡聚物的堿基序列。
表示在實施例1的結構基因制備中使用的DNA寡聚物的堿基序列。
表示在實施例1的結構基因制備中使用的DNA寡聚物的堿基序列。
表示在實施例1的結構基因制備中使用的DNA寡聚物的堿基序列。
在以下實施例1中得到的轉化體大腸桿菌(Escherichia coli)MM294(DE3)/pTCGPR3，從平成14(2002)年4月17日開始以寄存號FERMBP-8023寄存于茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6(郵政編碼305-8566)的獨力行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄存中心，從平成14(2002)年3月14日開始以寄托號IFO 16773寄存于大阪府大阪市淀川區十三本町2丁目17番85號(郵政編碼532-8686)的財團法人·發酵研究所(IFO)。
以下給出實施例，對本發明進行更詳細地說明，但本發明并不限定于這些實施例。
實施例1(a)編碼人GPR8配體(hGPR8L；序列44)3次串聯的基因的制備利用以下所示的10種DNA片段(序列表中序列65～74)制備編碼人hGPR8L配體3次串聯的結構基因。
#15’-TATGGATGACGATGACAAATGGTAAAAACATGTGGCGAGCCCGCGTTATCATACCG(序列65)#25’-GCGCGGCCCACGGTATGATAACGCGGGCTCGCCACATGTTTATACCATTTGTCATCGTCATCCA(序列66)#35’-TGGGCCGCGCGGCCGGTCTGCTGATGGGCCTGTGTCAATTGGGTTTGAACTTCTCTGTCTCCGCCGCCGGAG(序列67)#45’GATCCTCCGGCGGCGGAGACAGAGAAGTTCAAACCCAATTGACACAGGCCCATCAGCAGACCGGCC(序列68)#55’-
AATTGGGTGGTGATGACGATGACAAATGGTATAAACATGTGGCGAGCCCGCGTTATCATACCG(序列69)#65’-CGGCCCACGGTATGATAACGCGGGCTCGCCACATGTTTATACCATTTGTCATCGTCATCACCACCC(序列70)#75’-TGGGCCGCGCGGCCGGTCTGCTGATGGGCCTGTGTGAGCTCGGCTCTGACGACGATGATAAATGGTAC(序列71)#85’-CAACGTGTTTGTACCATTTATCATCGTCGTCAGAGCCGAGCTCACACAGGCCCATCAGCAGACCGGCC(序列72)#95’-AAACACGTTGCCTCCCCGCGCTACCACACGGTTGGTCGTGCCGCGGGCCTGCTGATGGGTCTGTGCGGTTGAG(序列73)#105’-GATCCTCAACCGCACAGACCCATCAGCAGGCCCGCGGCACGACCAACCGTGTGGTAGCGCGGGGAGG(序列74)使#2和#3的各個DNA寡聚物于25μl的磷酸化反應液[DNA寡聚物10μg、50mMTis-HCl，pH7.6，10mM MgCl2、1mM精脒、10mM二硫蘇糖醇(以后略記為DTT)、0.1mg/ml牛血清清蛋白(以后略記為BSA)、1mMATP、10單位T4聚核苷酸激酶(寶酒造)]中在37℃下反應1小時，對各個寡聚物的5′末端進行磷酸化。進行酚處理后，加2倍量的乙醇，于-70℃下冷卻后，經離心使DNA沉淀。
上述得到的DNA片段和#1以及#4合并，使總體積為120μl。將該混合液于90℃下保持10分鐘，然后慢慢冷卻到室溫進行退火后，使用TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2(寶酒造)進行連接反應。將II液30μl加到退火液30μl中，充分混合后，加入I液60μl于16℃下反應1小時，進行連接。進行酚處理后，回收水層，加入2倍量的乙醇，冷卻到-70℃后，離心使DNA沉淀。這樣得到的DNA片段利用T4聚核苷酸激酶(寶酒造)進行磷酸化，做成結構基因。
表達用的載體pTCII(WO00/20643)用NdeI和BamHI(寶酒造)于37℃下消化4小時后，進行1％瓊脂糖凝膠電泳，然后使用QIAquick GelExtraction Kit(QIAGEN公司)提取4.4kb的DNA片段，溶解于25μl的TE緩沖液中。使用TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2(寶酒造)對上述pTCII的NdeI、BamHI片段和上述制備的結構基因進行連接反應。使用10μl該反應液轉化大腸桿菌JM109感受態細胞(東洋紡)，接種到含有10μg/ml的四環素的LB瓊脂培養基上，于37℃下培養過夜，選擇活的四環素抗性菌落。將該轉化體于LB培養基中培養過夜，使用QIAprep8Miniprep Kit(QIAGEN公司)制備質粒pTCGPR 1。將該pTCGPR 1用MunI以及BamHI(寶酒造)于37℃下消化4小時后，進行1％瓊脂糖凝膠電泳，然后使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司)提取4.4kb的DNA片段，溶解于25μl的TE緩沖液中。
#6、#7、#8、#9的各個DNA寡聚物在25μl的磷酸化反應液[DNA寡聚物10μg、50mMTis-HCl，pH7.6，10mM MgCl2、1mM精脒、10mMDTT、0.1mg/ml BSA、1mM ATP、10單位T4聚核苷酸激酶(寶酒造)]中于37℃下反應1小時，對各個寡聚物的5′末端進行磷酸化。進行酚處理后，加2倍量的乙醇，于-70℃下冷卻后，經離心使DNA沉淀。將該DNA片段和#5以及#10合并，總體積為120μl。將該混合液于90℃下保持10分鐘，然后慢慢冷卻到室溫進行退火后，使用TaKaRa DNALigation Kit ver.2(寶酒造)進行連接反應。將II液30μl加到退火液30μl中，充分混合后，加入I液60μl于37℃下反應1小時，進行連接。酚處理后，回收水層，加入2倍量的乙醇，冷卻到-70℃后，離心使DNA沉淀。這樣得到的DNA片段利用T4核苷酸激酶(寶酒造)進行磷酸化。該結構基因部分和pCTGPR 1的MunI、BamHI片段使用TaKaRa DNALigation Kit ver.2(寶酒造)進行連接反應。使用10μl該反應液轉化大腸桿菌JM109感受態細胞(東洋紡)，接種到含有10μg/ml的四環素的LB瓊脂培養基上，于37℃下培養過夜，選擇活的四環素抗性的菌落。將該轉化體于LB培養基中培養過夜，使用QIAprep8 Miniprep Kit(QIAGEN公司)制備質粒pTCGPR3。使用Applied Biosystem公司標本377DNA序列對該pTCGPR 3的前體蛋白質結構基因部分的堿基序列進行確認。用質粒pTCGPR 3轉化大腸桿菌MM294(DE3)，得到前體蛋白表達株MM294(DE3)/pTCGPR 3。
(b)前體蛋白的制備將MM294(DE3)/pTCGPR 3用30ml含有10mg/L的四環素的LB瓊脂培養基(1％胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉)在200ml燒瓶中于37℃下振蕩培養8小時。將得到的培養液15ml接種到加有300ml主發酵培養基(1.68％磷酸氫二鈉、0.3％磷酸二氫鉀、0.1％氯化銨、0.05％氯化鈉、0.025％硫酸鎂、0.00025％鹽酸硫胺、1.5％葡萄糖、1.5％酪蛋白氨基酸)的1000ml容量燒瓶之后，于37℃下開始振蕩培養。當培養液的濁度達到150Klett單位時添加最終濃度為10mg/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，再培養3小時。培養結束后，對培養液(300ml)進行離心分離，獲得約2g濕菌體。
實施例2向實施例1得到的2g菌體中加10ml 10mM EDTA(pH6.0)，經超聲處理(BRANSON SONIFIER MODEL450)后，進行離心分離(15000rpm15分鐘)。對沉淀物再進行同樣操作。向沉淀物中加入5ml 7M胍溶液(pH5.0)后，攪拌2小時，然后進行離心分離(15000rpm 15分鐘)。向上清液中添加17mg Tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride(TCEP-HCl)，于50℃下進行10分鐘還原處理，然后使其通過用0.1％TFA平衡的C4P-50(1cm×25cm、昭和電工)，經吸附、清洗后，以2ml/分的流速進行20-60％B(B80％乙腈/0.1％三氟乙酸)的梯度洗脫，收集前體蛋白級分(洗脫時間約27分鐘)，進行冷凍干燥，得到前體蛋白的冷凍干燥粉末。
實施例3將實施例2得到的前體冷凍干燥粉末用0.1M醋酸、6M尿素溶液1ml溶解后，添加3.5mg的DMAP-CN，于25℃下反應15分鐘。反應結束后，然后使其通過用0.1％TFA平衡的C4P-50(1cm×25cm、昭和電工)，進行吸附、清洗后，以2ml/分的流速進行20-60％B(B80％乙腈/0.1％三氟乙酸)的梯度洗脫，收集S-氰化的前體蛋白級分(洗脫時間約27分鐘)，進行冷凍干燥，得到S-氰化的前體蛋白的冷凍干燥粉末。將該冷凍干燥粉末用6M尿素溶液0.8ml溶解后，添加1N氫氧化鈉溶液0.2ml，于0℃下反應15分鐘。反應結束后用醋酸調到pH7.4。向該斷裂反應液添加9ml的50mMNaCl、2mMCaCL2、20mMTris/HCl(pH7.4)溶液后，加入10單位腸激酶(Novagen公司)，于25℃下反應20小時。反應結束后，然后使其通過用0.1％TFA平衡的C4P-50(1cm×25cm、昭和電工)，進行吸附、清洗后，以2ml/分的流速進行20-60％B(B80％乙腈/0.1％三氟乙酸)的梯度洗脫，收集hGPR8L級分(洗脫時間約22分鐘)，進行冷凍干燥，得到約70μg的hGPR8L冷凍干燥粉末。
實施例4(hGPR8L特征的確定)a)N末端氨基酸序列分析使用氣相蛋白序列儀(PE Applied Biosystem型號491)確定N末端氨基酸序列。結果與從hGPR8L的DNA堿基序列預想的N末端氨基酸序列一致(表1)。
N末端氨基酸序列殘基號 檢測的PTH-氨基酸1)由hGPR8配體的堿基序列預測的氨基酸1 TrpTrp2 TyrTyr3 LysLys4 HisHis5 ValVal6 AlaAla7 SerSer8 ProPro9 ArgArg10 TyrTyr1)苯基硫乙內酰脲b)質量分析對得到的hGPR8L的質量進行分析，測定結果為2583.7Da(理論值2584.0)c)活性使用與WO01/98494號記載的實施例6同樣的方法，進行利用GPR8表達CHO細胞的膜級分的GTPγS結合活性的測定，確認與化學合成品一樣。
實施例5大腸桿菌中的KiSS-1肽前體蛋白表達質粒的構建象下述那樣構建相當于序列1氨基酸的第35至54位的KiSS-1(35-54)肽前體蛋白表達質粒。
與實施例1記載的方法同樣，使用10種DNA片段制備編碼KiSS-1(35-54)肽串聯3次的結構基因。使用TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2(寶酒造)對該結構基因與pTCII載體的NdeI以及BamHI片段和上述結構基因進行連接反應。使用10μl該反應液轉化大腸桿菌JM109感受態細胞(東洋紡)，接種到含有10μg/ml的四環素的LB瓊脂培養基上，于37℃下培養過夜，選擇活的四環素抗性菌落。將該轉化體于LB培養基中培養過夜，使用QIAprep8 Miniprep Kit(キアゲン公司)制備質粒pTCKiSS3554。使用Applied Biosystem公司型號377 DNA序列儀對該多肽DNA的堿基序列進行確認。用質粒pTCKiSS3554轉化大腸桿菌(Escherichia coli)MM294(DE3)，得到前體蛋白表達株Escherichia coliMM294(DE3)/pTCKiSS3554。
實施例6前體蛋白的制備將實施例5的Escherichia coli MM294(DE3)/pTCKiSS3554用1L含有5.0mg/L的四環素的LB瓊脂培養基(1％胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉)在2L燒瓶中于37℃下振蕩培養8小時。將得到的培養液接種到加有19L的主發酵培養基(1.68％磷酸氫二鈉、0.3％磷酸二氫鈉、0.1％氯化銨、0.05％氯化鈉、0.05％硫酸鎂、0.02％消泡劑、0.00025％硫酸亞鐵、0.0005％鹽酸硫胺、1.5％葡萄糖、1.5％Hy-Case Amino)的50L容量燒瓶之后，于30℃下開始通氣攪拌。當培養液的濁度達到500 Klett單位時添加最終濃度為10mg/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，再培養4小時。培養結束后，對培養液進行離心分離，獲得濕菌體，保存在-80℃下。
實施例7KiSS-1(35-54)的獲得向實施例6得到的100g菌體中加200ml 10mM EDTA(pH6.0)，超聲處理(BRANSON SONIFIER MODEL450)后，進行離心分離(10000rpm60分鐘)。對沉淀物再進行同樣操作。向沉淀物中加入50ml 0.1M醋酸、8M尿素后，攪拌2小時，然后進行離心分離(10000rpm 60分鐘)。向上清液中添加200mg 1-氰基-4-二甲胺吡啶鎓鹽(DMAP-CN)，于室溫下反應15分鐘。反應結束后，將反應液通過用10％醋酸平衡的Sephadex G-25柱(46mmID×600mmL、Pharmacia)，以6ml/min的流速使平衡用的10％醋酸展開，得到S-氰化的多肽。該溶液用Pellicon MiniCassette(Millipore公司)進行濃縮和脫鹽，添加尿素使最終濃度為6M，再添加25％氨水使終濃度為3M，于15℃下反應15分鐘。反應結束后，用醋酸調到pH6.0。使該反應液通過用0.1％三氟乙酸(TFA)平衡的ODS-120T(21.5mm×300mm、東洋曹達)，經吸附、清洗后，進行20-60％B(B80％乙腈/0.1％TFA)的梯度洗脫，收集C末端被酰胺化的肽級分，將該級分冷凍干燥，得到肽冷凍干燥粉末。將該肽用10ml的70％甲酸溶液溶解，添加溴化氰10mg，于室溫下反應24小時。反應結束后，使反應液通過用0.1％三氟乙酸(TFA)平衡的ODS-120T(21.5mm×300mm、東洋曹達)、經吸附、清洗后，進行20-60％B(B80％乙腈/0.1％TFA)的梯度洗脫，收集KiSS-1(35-54)的肽級分，冷凍干燥，得到KiSS-1(35-54)冷凍干燥粉末。
實施例8KiSS-1(45-54)的制備根據實施例1記載的方法，構建相當于序列1氨基酸的第45至54位的KiSS-1(45-54)肽前體蛋白表達質粒pTCKiSS4554。該質粒含有編碼KiSS-1(45-54)肽串聯9次的結構基因。用質粒pTCKiSS4554轉化大腸桿菌(Escherichia coli)MM294(DE3)，得到前體蛋白表達株Escherichia coli MM294(DE3)/pTCKiSS4554。對該表達株進行培養，象實施例6那樣樣操作可以從經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導表達后的菌體中得到KiSS-1(45-54)。
對基于右手剪刀(S-氰化反應)和左手用剪刀(溴化氰處理、腸激酶、因子Xa處理等)切出靶肽和串聯重復法進行組合的本發明方法，可用于大量合成基于基因重組技術的肽、特別是低分子量的肽。
序列表<110>武田藥品工業株式會社<120>肽的制備方法<130>P02-0061PCT<150>JP 2001-147341<151>2001-05-17<160>75<210>1<211>54<212>PRT<213>人<220>
<223>多肽的C末端是酰胺(-CONH2)形式<400>1Gly Thr Ser Leu Ser Pro Pro Pro Glu Ser Ser Gly Ser Arg Gln Gln15 10 15Pro Gly Leu Ser Ala Pro His Ser Arg Gln Ile Pro Ala Pro Gln Gly20 25 30Ala Val Leu Val Gln Arg Glu Lys Asp Leu Pro Asn Tyr Asn Trp Asn35 40 45Ser Phe Gly Leu Arg Phe50<210>2<211>10<212>PRT<213>人<220>
<223>多肽的C末端是酰胺(-CONH2)形式<400>2Tyr Asn Trp Asn Ser Phe Gly Leu Arg Phe5 10<210>3<211>162<212>DNA<213>人<400>3
ggtacttctc tgtctccgcc gccggaatct tctggttctc gtcagcagcc gggtctgtct 60gctccgcact ctcgtcagat cccggctccg cagggtgctg ttctggttca gcgtgaaaaa120gacctgccga actacaactg gaactctttc ggtctgcgtt tc 162<210>4<211>30<212>DNA<213>人<400>4tataactgga acagctttgg tctgcgtttt30<210>5<211>144<212>DNA<213>人<400>5ggtagcgcga tgtataactg gaacagcttt ggtctgcgtt tttgtggctc ggcgatgtac 60aattggaatt ccttcggcct gcgcttctgc ggctcggcga tgtataactg gaactccttt120ggcctgcgct tttgcggttc tgct 144<210>6<211>9<212>PRT<213>人<400>6Ser Phe Ala Asn Leu Pro Leu Arg Phe1 5<210>7<211>12<212>PRT<213>人<400>7Met Pro His Ser Phe Ala Asn Leu Pro Leu Arg Phe1 5 10<210>8<211>20<212>PRT<213>人<400>8Met Ser Thr Pro Ala Val Asn Lys Met Pro His Ser Phe Ala Asn Leu
1 5 10 15Pro Leu Arg Phe20<210>9<211>37<212>PRT<213>人<400>9Ser Leu Asn Phe Glu Glu Leu Lys Asp Trp Gly Pro Lys Asn Val Ile1 5 10 15Lys Met Ser Thr Pro Ala Val Asn Lys Met Pro His Ser Phe Ala Asn20 25 30Leu Pro Leu Arg Phe35<210>10<211>8<212>PRT<213>人<400>10Val Pro Asn Leu Pro Gln Arg Phe1 5<210>11<211>17<212>PRT<213>人<400>11Asn Met Glu Val Ser Leu Val Arg Arg Val Pro Asn Leu Pro Gln Arg1 5 10 15Phe<210>12<211>27<212>DNA<213>人<400>12agctttgcga atctgccgct gcgtttt 27<210>13<211>36<212>DNA<213>人
<400>13atgccgcata gctttgcgaa tctgccgctg cgtttt36<210>14<211>60<212>DNA<213>人<400>14atgagcaccc cggcggtgaa taaaatgccg catagctttg cgaatctgcc gctgcgtttt 60<210>15<211>111<212>DNA<213>人<400>15agcctgaact ttgaagaact gaaagattgg ggtccgaaaa atgtgattaa aatgagcacc 60ccggcggtga ataaaatgcc gcatagcttt gcgaatctgc cgctgcgttt t 111<210>16<211>24<212>DNA<213>人<400>16gttcctaacc tgccccaaag gttt24<210>17<211>51<212>DNA<213>人<400>17aatatggagg tgagcctcgt gagacgtgtt cctaacctgc cccaaaggtt t 51<210>18<211>36<212>PRT<213>人<400>18Leu Val Gln Pro Arg Gly Ser Arg Asn Gly Pro Gly Pro Trp Gln Gly1 5 10 15Gly Arg Arg Lys Phe Arg Arg Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly20 25 30Pro Met Pro Phe35
<210>19<211>108<212>DNA<213>人<400>19ctggtgcagc ccagagggtc aaggaatggg ccagggccct ggcagggagg tcggaggaaa 60ttccgccgcc agcggccccg cctctcccat aagggaccca tgcctttc 108<210>20<211>31<212>PRT<213>牛<400>20Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn15 10 15Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe20 25 30<210>21<211>31<212>PRT<213>大鼠<400>21Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Thr Arg Thr Pro Asp Ile Asn15 10 15Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe20 25 30<210>22<211>31<212>PRT<213>人<400>22Ser Arg Thr His Arg His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn15 10 15Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe20 25 30<210>23<211>21<212>PRT<213>牛<220>
<221>
<222>
<223>第10位的Xaa代表Ala或Thr、第11位的Xaa代表Gly或Ser、第21位的Xaa代表OH、Gly或GlyArg<400>23Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Xaa Xaa Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe Xaa20<210>24<211>29<212>PRT<213>牛<400>24Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn1 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly20 25<210>25<211>19<212>PRT<213>牛<400>25Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg19<210>26<211>31<212>PRT<213>牛<400>26Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn1 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe20 25 30<210>27<211>32<212>PRT<213>牛<400>27
Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn1 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly20 25 30<210>28<211>33<212>PRT<213>牛<400>28Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn1 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly20 25 30Arg<210>29<211>20<212>PRT<213>牛<400>29Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe20<210>30<211>21<212>PRT<213>牛<400>30Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe Gly20<210>31<211>22<212>PRT<213>大鼠<400>31Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe Gly Arg
20<210>32<211>31<212>PRT<213>大鼠<400>32Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Thr Arg Thr Pro Asp Ile Asn1 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe20 25 30<210>33<211>32<212>PRT<213>大鼠<400>33Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Thr Arg Thr Pro Asp Ile Asn1 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly20 25 30<210>34<211>33<212>PRT<213>大鼠<400>34Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Thr Arg Thr Pro Asp Ile Asn1 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly20 25 30Arg<210>35<211>20<212>PRT<213>大鼠<400>35Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe20<210>36<211>21
<212>PRT<213>大鼠<400>36Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe Gly20<210>37<211>22<212>PRT<213>人<400>37Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe Gly Arg20<210>38<211>31<212>PRT<213>人<400>38Ser Arg Thr His Arg His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn1 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe20 25 30<210>39<211>32<212>PRT<213>人<400>39Ser Arg Thr His Arg His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn1 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly20 25 30<210>40<211>33<212>PRT<213>人<400>40Ser Arg Thr His Arg His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn
1 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly20 25 30Arg<210>41<211>20<212>PRT<213>人<400>41Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe20<210>42<211>21<212>PRT<213>人<400>42Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe Gly20<210>43<211>22<212>PRT<213>人<400>43Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe Gly Arg20<210>44<211>23<212>PRT<213>人<400>44Trp Tyr Lys His Val Ala Ser Pro Arg Tyr His Thr Val Gly Arg Ala1 5 10 15Ala Gly Leu Leu Met Gly Leu20
<210>45<211>23<212>PRT<213>豬<400>45Trp Tyr Lys His Thr Ala Ser Pro Arg Tyr His Thr Val Gly Arg Ala1 5 10 15Ala Gly Leu Leu Met Gly Leu20<210>46<211>23<212>PRT<213>大鼠/小鼠<400>46Trp Tyr Lys His Val Ala Ser Pro Arg Tyr His Thr Val Gly Arg Ala1 5 10 15Ser Gly Leu Leu Met Gly Leu20<210>47<211>30<212>PRT<213>人<400>47Trp Tyr Lys His Val Ala Ser Pro Arg Tyr His Thr Val Gly Arg Ala1 5 10 15Ala Gly Leu Leu Met Gly Leu Arg Arg Ser Pro Tyr Leu Trp20 25 30<210>48<211>30<212>PRT<213>豬<400>48Trp Tyr Lys His Thr Ala Ser Pro Arg Tyr His Thr Val Gly Arg Ala1 5 10 15Ala Gly Leu Leu Met Gly Leu Arg Arg Ser Pro Tyr Met Trp20 25 30<210>49<211>30<212>PRT<213>大鼠
<400>49Trp Tyr Lys His Val Ala Ser Pro Arg Tyr His Thr Val Gly Arg Ala1 5 10 15Ser Gly Leu Leu Met Gly Leu Arg Arg Ser Pro Tyr Leu Trp20 25 30<210>50<211>30<212>PRT<213>小鼠<400>50Trp Tyr Lys His Val Ala Ser Pro Arg Tyr His Thr Val Gly Arg Ala1 5 10 15Ser Gly Leu Leu Met Gly Leu Arg Arg Ser Pro Tyr Gln Trp20 25 30<210>51<211>69<212>DNA<213>人<400>51tggtacaagc acgtggcgag tccccgctac cacacggtgg gccgcgccgc tggcctgctc60atggggctg69<210>52<211>69<212>DNA<213>豬<400>52tggtacaagc acacggcgag tccccgctac cacacggtgg gccgcgccgc gggcctgctc60atggggctg69<210>53<211>69<212>DNA<213>大鼠/小鼠<400>53tggtacaagc acgtggcgag ccctcgctat cacacagtgg gtcgtgcctc cgggctgctc60atggggctg69<210>54<211>90<212>DNA<213>人
<400>54tggtacaagc acgtggcgag tccccgctac cacacggtgg gccgcgccgc tggcctgctc60atggggctgc gtcgctcacc ctatctgtgg 90<210>55<211>90<212>DNA<213>豬<400>55tggtacaagc acacggcgag tccccgctac cacacggtgg gccgcgccgc gggcctgctc60atggggctgc gccgctcgcc ctacatgtgg 90<210>56<211>90<212>DNA<213>大鼠<400>56tggtacaagc acgtggcgag ccctcgctat cacacagtgg gtcgtgcctc cgggctgctc60atggggctgc gccgctcgcc ctacctgtgg 90<210>57<211>90<212>DNA<213>小鼠<400>57tggtataagc acgtggcgag tccccgctat cacacagtgg gtcgtgcctc cgggctgctc60atggggctgc gccgctcgcc ctaccagtgg 90<210>58<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>58Asp Asp Asp Asp Lys1 5<210>59<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>59gatgacgacg acaag 15<210>60<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>60Ile Glu Gly Arg1<210>61<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>61attgaaggcc gc12<210>62<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>62Gly Pro Arg1<210>63<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>63
ggcccgcgc 9<210>64<211>288<212>DNA<213>人<400>64gatgacgatg acaaatggta taaacatgtg gcgagcccgc gttatcatac cgtgggccgc 60gcggccggtc tgctgatggg cctgtgtcaa ttgggtggtg atgacgatga caaatggtat120aaacatgtgg cgagcccgcg ttatcatacc gtgggccgcg cggccggtct gctgatgggc180ctgtgtgagc tcggctctga cgacgatgat aaatggtaca aacacgttgc ctccccgcgc240taccacacgg ttggtcgtgc cgcgggcctg ctgatgggtc tgtgcggt 288<210>65<211>56<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚物<400>65tatggatgac gatgacaaat ggtataaaca tgtggcgagc ccgcgttatc ataccg 56<210>66<211>64<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚物<400>66gcgcggccca cggtatgata acgcgggctc gccacatgtt tataccattt gtcatcgtca 60tcca 64<210>67<211>72<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚物<400>67tgggccgcgc ggccggtctg ctgatgggcc tgtgtcaatt gggtttgaac ttctctgtct 60ccgccgccgg ag 72
<210>68<211>66<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚物<400>68gatcctccgg cggcggagac agagaagttc aaacccaatt gacacaggcc catcagcaga60ccggcc 66<210>69<211>63<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚物<400>69aattgggtgg tgatgacgat gacaaatggt ataaacatgt ggcgagcccg cgttatcata60ccg 63<210>70<211>66<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚物<400>70cggcccacgg tatgataacg cgggctcgcc acatgtttat accatttgtc atcgtcatca60ccaccc 66<210>71<211>68<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚物<400>71tgggccgcgc ggccggtctg ctgatgggcc tgtgtgagct cggctctgac gacgatgata60aatggtac 68<210>72
<211>68<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚物<400>72caacgtgttt gtaccattta tcatcgtcgt cagagccgag ctcacacagg cccatcagca60gaccggcc 68<210>73<211>73<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚物<400>73aaacacgttg cctccccgcg ctaccacacg gttggtcgtg ccgcgggcct gctgatgggt60ctgtgcggtt gag 73<210>74<211>67<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡聚物<400>74gatcctcaac cgcacagacc catcagcagg cccgcggcac gaccaaccgt gtggtagcgc60ggggagg6權利要求
1.一種靶肽或其鹽的制備方法，其特征是通過酶或化學方式對在靶肽的N末端和C末端附加酶或化學上的切斷位點并重復連接的前體蛋白進行斷裂。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征是通過酶或化學方式對在靶肽的N末端附加酶或化學上的切斷位點、在C末端附加化學上的切斷位點并重復連接的前體蛋白進行斷裂。
3.一種靶肽或其鹽的制備方法，其特征是用溴化氰或蛋白水解酶對在靶肽的N末端一側附加蛋氨酸殘基或蛋白質水解酶斷裂序列、在C末端一側附加半胱氨酸殘基或半胱氨酰肽(其中，半胱氨酰肽的肽部分與靶肽不同，而且當N末端一側附加蛋氨酸殘基時，肽部分沒有蛋氨酸殘基)并重復連接的前體蛋白中的各靶肽的N末端一側進行斷裂，在C末端一側的半胱氨酸或半胱氨酰肽的N末端一側附加斷裂反應。
4.根據權利要求1～3中任一項所述的制備方法，其中前體蛋白是重組型前體蛋白。
5.根據權利要求3所述的制備方法，其中切斷反應是S-氰化反應、然后附加氨分解或水解反應的反應。
6.根據權利要求5所述的制備方法，其中在2-硝基-5-硫氰基苯甲酸(NTCB)、1-氰基-4-二甲胺吡啶鎓鹽(DMAP-CN)或CN-離子存在下進行S-氰化反應。
7.根據權利要求3所述的制備方法，其中蛋白水解酶是腸激酶、因子Xa或凝血酶。
8.根據權利要求3所述的制備方法，其中(1)當使用溴化氰時，在各靶肽的N末端連接蛋氨酸殘基，靶肽不含有蛋氨酸殘基；(2)當蛋白水解酶為腸激酶時，各靶肽的N末端連接Asp-Asp-Asp-Asp-Lys，靶肽不含有Asp-Asp-Asp-Asp-Lys氨基酸序列；(3)當蛋白水解酶為因子Xa時，各靶肽的N末端連接Ile-Glu-Gly-Arg，靶肽不含有以Ile-Glu-Gly-Arg表示的氨基酸序列；(4)當蛋白水解酶為凝血酶時，各靶肽的N末端連接Gly-Pro-Arg，靶肽不含有Gly-Pro-Arg氨基酸序列。
9.根據權利要求1～3所述的制備方法，其中靶肽是KiSS-1肽。
10.根據權利要求1～3所述的制備方法，其中靶肽是GPR8配體。
11.一種GPR8配體或其鹽的制備方法，其特征是用腸激酶對在GPR8配體的N末端附加腸激酶斷裂序列、在C末端附加半胱氨酸殘基后重復連接3次的前體蛋白中的GPR8配體的N末端一側進行斷裂，以及在C末端一側的半胱氨酸殘基的N末端一側附加斷裂反應。
12.根據權利要求10或11所述的制備方法，其中GPR8配體是含有與序列44表示的氨基酸序列相同或實質上相同的氨基酸序列的多肽。
13.根據權利要求10或11所述的制備方法，其中GPR8配體是含有以序列44、序列45、序列46、序列47、序列48、序列49或序列50所示的氨基酸序列的多肽。
14.根據權利要求10或11所述的制備方法，其中GPR8配體是含有以序列44所示的氨基酸序列的多肽。
15.一種DNA，含有編碼以下前體蛋白的DNA，即，在靶肽的N末端一側附加蛋氨酸殘基或蛋白質水解酶斷裂序列、在C末端一側附加半胱氨酸殘基或半胱氨酰肽(其中，半胱氨酰肽的肽部分與靶肽不同，而且當N末端附加蛋氨酸殘基時，肽部分不含有蛋氨酸殘基)并重復連接的前體蛋白。
16.一種重組載體，含有權利要求15所述的DNA。
17.根據權利要求15所述的重組載體，被保持在以FERM BP-8023標示的轉化體大腸桿菌MM294(DE3)/pTCGPR3中。
18.一種轉化體，用權利要求16所述的重組載體轉化。
19.根據權利要求18所述的轉化體，是以FERM BP-8023標示的轉化體大腸桿菌MM294(DE3)/pTCGPR3。
20.一種前體蛋白或其鹽，是在靶肽的N末端一側附加蛋氨酸殘基或蛋白質水解酶斷裂序列、在C末端一側附加半胱氨酸殘基或半胱氨酰肽(其中，半胱氨酰肽的肽部分與靶肽不同，而且當N末端一側附加蛋氨酸殘基時，肽部分不含有蛋氨酸殘基)并重復連接的前體蛋白或其鹽。
21.根據權利要求4所述的制備方法，其中前體蛋白是對權利要求18所述的轉化體進行培養之后制備的重組型前體蛋白。
全文摘要
本發明目的在于提供能夠利用基因重組法，有效地、而且大量制備靶肽的方法。對基于右手剪刀(S－氰化反應)和左手用剪刀(溴化氰處理、腸激酶、因子Xa處理等)切出靶肽和串聯重復法進行組合的本發明方法，可用于大量合成基于基因重組技術的肽、特別是低分子量的肽。
文檔編號C07K5/00GK1509336SQ0280997
公開日2004年6月30日 申請日期2002年5月16日 優先權日2001年5月17日
發明者西村紀, 末永正人, 伊藤隆司, 北田千惠子, 人, 司, 惠子 申請人:株式會社島津制作所