制備頭孢菌素衍生物的酶促方法

專利名稱：制備頭孢菌素衍生物的酶促方法
技術領域：
本發明涉及3-頭孢菌素C衍生物的制備方法，本品用于制備β-內酰胺抗生素。具體地，本發明涉及制備3-乙酰氧基-甲基-7-氨基-頭孢-3-烯-羧酸的3-硫醇化的衍生物的制備方法。
背景技術：
所有用于治療用途的頭孢菌素C都是半合成的，且是通過對從產黃支頂孢菌(Acremonium chrysogenum)的發酵液得到的物質中的基本的β-內酰胺結構進行修飾而制備，或對用不同前體從產黃青霉菌(Penicillium chrysogenum)的發酵液得到的產物進行化學轉化后得到。
典型地，通過去除β-內酰胺環側面的氨基脂肪鏈，將頭孢菌素C[3-乙酰氧基甲基-7-(D-5-氨基-5-羧基戊酰氨基)-頭孢-3-烯-4-羧酸]轉化成3-乙酰氧基甲基-7-氨基-頭孢-3-烯-羧酸，通常稱為7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)。將7-ACA純化并結晶，然后用作為隨后在7-和3-位進行結構修飾的起始物質。7-ACA是合成許多當前在生物制藥工業中有價值的重的半合成頭孢菌素抗生素所用的基礎建構單元。
US 3,278,531；US 3,516,997；US 3,647,788；GB 1,400,804；GB 1,565,053和GB 1,566,515已公開了3-硫代甲基頭孢菌素C衍生物。WO-A-9535020和EP 0846695記載了3’-硫代甲基戊二酰7-ACA衍生物的一些例子。
7-ACA是應用最廣泛的與雜環的硫醇反應的中間體，因為它可以通過化學或酶方法以工業規模得到。在一些專利中已公開了這一點，包括US 3,502,665；US 3,954,745；US 3,516,997；US 3,979,383；US4,115,645；US 4,317,907；US 5,387,679；JP 55,139,327；EP 0167651和WO-A-9302085。
US 5,387,679記載了7-氨基頭孢烷酸與2-巰基-5-甲基-1，3，4-噻二唑(MMTD)在有碳酸氫鈉丙酮水溶液存在的條件下，在pH6-7的反應。達到約60-65％的收率。
在US 4,317,907中，當使用醋酸或硝基甲醇作為溶劑時，在有三氟化硼或三氟化硼乙醚合物的條件下，在無水介質中的上述反應的收率增加到約86％。然而純度低，最高為80％，由于它含有未反應的7-ACA和降解產物。在WO-A-9302085中，在有二烷基碳酸酯三氟化物絡合物和脂肪酸存在的條件下使用二烷基碳酸酯，收率增加到最大值為89％。然而，WO-A-9302085顯示出與使用有毒和非常昂貴的氣體例如BF3及處理含有硼化物和氟化硼(fluoroboride)的排放廢物相關的問題。
頭孢菌素C的脫酰作用，即去除7’-側鏈，通常以化學方式進行，例如在有乙腈的條件下使用亞硝酰氯的甲酸溶液(US 3,367,933)。另一種脫酰方法包括保護氨基戊酸鏈的羧基基團，與五氯化磷在-55℃反應，隨后在低溫用水和甲醇的混合物水解(BE 718,824)。這些已知的方法通常必須在低溫下進行，并需要使用昂貴而有毒的溶劑或試劑，所以它們會產生嚴重的環境問題。另外，由于β-內酰胺核的化學不穩定性和環的3與7位基團的反應性，必須采用特定的反應條件，使工業規模進行此方法變得復雜。
為克服制備7-ACA的化學途徑的缺點，已有關于頭孢菌素C的另外的酶裂解的記載。能夠通過使用特定的頭孢菌素酰基轉移酶直接一步去除頭孢菌素C側面的7-氨基脂肪側鏈(FR 2,241,557；US4,774,179；EP 283,248；WO-A-9512680；WO-A-9616174)。然而如專利US 5,296,358所述，這些方法經常不能重復，并具有低收率和長的反應時間的特點。那時未曾報道此技術(將頭孢菌素C一步轉化成7-ACA)的工業應用(Parmar et al，Crit.Rev.Biotechnol.18，1，1998)。
另一方面，從工業角度看，通過兩個酶步驟將頭孢菌素C轉化成7-ACA是重要的。第一階段包括使用不同來源的D-氨基酸氧化酶(E.C.1.4.3.3，下文表示為DAAO)(變異三角酵母(Trigonopsisvariabilis)，GB 1,272,769；纖細紅酵母(Rhodotorula gracilis)，EP 0,517,200；或茄病鐮孢(Fusarium solari)M-0718，EP 0,364,275)。在有分子氧的條件下，DAAO使頭孢菌素C側面的D-5-酰氨基-羧戊酰基鏈氧化，產生7β-(5-羧基-5-氧戊-酰氨基)-頭孢-3-烯-羧酸(或α-酮己二酰-7-氨基頭孢烷酸，下文表示為α-酮己二酰-7-ACA)和過氧化氫，它通過化學途徑使α-酮己二酰-7-ACA去羧基成為7β-(4-羧基丁酰氨基)-頭孢-3-烯-4-羧酸(或戊二酰-7-氨基頭孢烷酸，下文稱為GL-7-ACA)。
在第二階段，使用針對GL-7-ACA的特定的酰基轉移酶，戊二酰-7-ACA酰基轉移酶(E.C.3.5.1.3)，例如在大腸桿菌E.coli中過量表達的假單胞菌屬類微生物的酶(US 3,960,662，EP 0496993)，使GL-7-ACA脫酰基成為7-ACA。
此制備7-ACA的兩步酶方法已經以工業規模被使用(Conlon etal.Biotechnol.Bioeng.46，510，1995)。
EP 0846695公開了制備3’-雜環硫代甲基頭孢烷酸衍生物的對環境有益的另一種方法。在水性介質中戊二酰-7-ACA中3-位的化學親核置換后采用戊二酰-7-ACA酰基轉移酶對3’-戊二酰-7-ACA-衍生物進行酶轉化。衍生物的數量約為65％，且不對環境產生影響。此過程可以定義為酶-化學-酶(ECE)過程，從溶解的頭孢菌素C的生物轉化過程分離產生GL-7-ACA后，使GL-7-ACA與雜環硫醇反應，并最終用GL-7-ACA酰基轉移酶進行3-雜環硫代衍生物的酶反應。如WO-A-9535020所述，此方法的問題是需要分離具有高水溶性的GL-7-ACA，使此方法具有技術困難并且昂貴。
另一個問題是酶僅可以重復使用少數周期。實際上記載的具有5-巰三唑和MMTD的周期不超過3個，結晶后MMTD的剩余量是2.8mg/ml。其它2個作為示例的硫醇類由于大量硫醇剩余在溶液中而僅使用一個周期。5-巰基-1-甲基四唑(MMTZ)或2，5-二氫-3-巰基-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪(TTZ)屬于這種情況，它們在水中溶解度非常高，因而不能通過降低pH而去除。也記載了在頭孢唑啉的酶合成中，MMTD的硫醇對從大腸桿菌CFC-04017得到的青霉素G酰胺酶的毒性作用(Wonet al，App.Biochem.Biotech.69，1，1998)。為克服此抑制作用，MMTD/7-ACA摩爾比減少到1.2∶1以延長酶的壽命。此低摩爾比降低了3-硫代衍生物的收率，避免使用其他已公開的3-被修飾的頭孢菌素的化學-酶合成方法，在此建議使用D-氨基酸氧化酶-戊二酰-7-ACA酰基轉移酶和與雜環硫醇的化學反應進行酶-酶-化學方法(EEC)(Jistiz et al.，J.Org.Chem.62，9099，1997)。
因此需要改進的3-頭孢菌素C衍生物的制備方法。
發明概述根據本發明，提供制備3-硫醇化的7-氨基頭孢烷酸衍生物的酶反應方法，包括以下步驟將式I的3-硫醇化的頭孢菌素C酶法轉化成式II的3-硫醇化的-戊二酰-7-ACA， 并通過酶法使式II的化合物轉化成式III的3-硫醇化的-7-ACA 其中R是含有至少一個氮原子的雜環基團，且R1和R2都是H原子或其一是H原子，另一是酰基供體。
優選，通過以下步驟，式I的3-硫醇化的頭孢菌素C轉化成式II的3-硫醇化的-戊二酰-7-ACA在有分子氧的條件下使式I化合物與固定的D-氨基酸氧化酶反應；從水性反應混合物中分離載體中的酶；并加入過氧化氫使3-硫醇化的-α-酮己二酰頭孢烷酸轉化成式II化合物。
在本發明的一個實施方案中，式I化合物與固定的D-氨基酸氧化酶反應，反應條件為約2巴絕對壓力，pH 6.0-8.0，溫度20-30℃，反應時間0.5-3小時。
優選此方法包括用濃鹽溶液洗滌載體中的酶，并向由此產生的溶液中加入過氧化氫-優選其數量等于30-50ppm。
最優選此方法包括從溶液中去除過量的過氧化氫的步驟，優選通過向溶液中加入催化劑而完成。
在本發明的一個實施方案中通過向溶液中加入過氧化氫酶去除過量的過氧化氫。優選通過使式II化合物與固定的戊二酰-7-ACA酰基轉移酶接觸，使式II化合物轉化成式III化合物。最優選從式II化合物生成式III化合物的反應條件為環境壓力下，pH 6.0-8.5和20-35℃，在惰性氣體中進行0.5-3小時。
在本發明的一個實施方案中，通過酸化反應介質使式III化合物沉淀，并隨后洗滌和干燥這樣形成的沉淀。
在本發明的另一個實施方案中，用適宜的交聯劑將酶固定在適宜的固態載體上。優選酶為尺寸適于作為生物催化劑的晶體形式。最優選在保持酶分散在底物水溶液中的條件下進行酶處理。
在本發明的一個實施方案中，所述或每個酶處理在色譜柱上進行。
優選此方法包括為重復使用而回收酶的步驟。
在本發明的一個實施方案中，在酸性pH下進行式III化合物的結晶。
本發明的一個方面提供本發明的方法，其中式I的3-硫醇化的頭孢菌素C形成式III的3-硫醇化的-7-ACA的酶轉化在一步進行。
在本發明的一個實施方案中，式I化合物是固體或其無毒鹽的形式。無毒的鹽可以包括在頭孢菌素C結晶中使用的對人無毒的陽離子，例如鋅鹽。
本發明也提供了制備頭孢菌素C抗生素及其衍生物的方法，包括生成式III化合物和隨后的酶反應。優選此抗生素選自以下物質中的任何一種或多種頭孢唑啉、頭孢西酮、頭孢哌酮、頭孢孟多、頭孢三嗪、頭孢替安或頭孢曲松。
在本發明的一個實施方案中，制備3-硫醇化的7-氨基頭孢烷酸衍生物的酶方法包括以下步驟使頭孢菌素C與具有通式IV的硫醇化的合物反應形成式I化合物R-SH (IV)其中R是含有至少一個氮原子的雜環，然后，形成式I化合物后去除過量的式IV的硫醇。
優選通過吸附在陰離子交換樹脂上去除過量的硫醇。最優選陰離子交換樹脂是具有交聯的丙烯酸共聚物結構的多微孔樹脂。優選陰離子交換樹脂含有8％交聯，其中含有功能性的硫代烷基苯甲銨基團。此樹脂可以采用鹽酸鹽、氫氧化物、磷酸鹽或醋酸鹽循環。
在本發明的一個實施方案中通過結晶去除過量的硫醇。優選在酸性pH下進行結晶。最優選通過結晶，然后吸附在陰離子交換樹脂上去除過量的硫醇。
在本發明的一個實施方案中，頭孢菌素C存在于水性介質中。
在本發明的另一個實施方案中，頭孢菌素C是頭孢菌素C濃溶液的形式，它從固體頭孢菌素C得到，或從直接的或經過純化的頭孢菌素C發酵液得到。頭孢菌素C可以為頭孢菌素C濃溶液或濃縮的頭孢菌素C發酵液。
在本發明的一個實施方案中，在pH 5.5-8.0，溫度60℃-80℃的條件下反應1-12小時進行反應過程。優選反應在pH約6.0和溫度約65℃進行反應。最優選硫醇化的合物的濃度為1-5mol/mol頭孢菌素C。
R可以是含有至少一個氮原子及可選硫或氧原子的雜環基。優選R是選自以下任何一個或多個基團的雜環基噻吩基、二唑基、四唑基、噻唑基、三嗪基、噁唑基、噁二唑基、吡啶基、嘧啶基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、苯并噁唑基，或它們的任何衍生物，優選5-甲基-1，3.4-噻二唑-2-基、1-甲基-1H-四唑-5-基或1，2，5，6-四氫-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基。
在本發明的一個實施方案中，式I化合物是固體或其無毒鹽的形式。
本發明提供了下式化合物 其中R是通過本發明的方法得到的含有至少一個氮原子的雜環基團。
本發明還提供了下式化合物 其中，在式I中，R是5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基。
本發明提供了具有下式的化合物 其中，在I中，R是1，2，5，6-四氫-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基。
本發明也提供了制備頭孢菌素C抗生素及其衍生物的方法，包括生成上文定義的式I化合物，并隨后對式I化合物進行酶反應。優選抗生素選自以下的任意一或多種頭孢唑啉、頭孢西酮、頭孢哌酮、頭孢孟多、頭孢三嗪、頭孢替安和頭孢曲松。
發明詳述我們已發現化學-酶-酶處理(CEE)提供了一種改進的制備3-頭孢菌素C衍生物的方法，其中溶液中的頭孢菌素C在酶切除7-位側鏈前首先與雜環硫醇反應。
本發明的此方法可以如下表示第一階段在有氧氣的條件下固定D-氨基酸氧化酶
第二階段固定的戊二酰-7-ACA-酰基轉移酶 其中R是含有至少一個氮原子且有或無硫或氧原子的雜環，例如噻吩基、二唑基、三嗪基、三唑基、四唑基、噻唑基、噻二唑基、噻三唑基、噁唑基、噁二唑基、吡啶基、嘧啶基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、苯并噁唑基或在上述雜環結構的任何可能取代的位置取代的衍生物。
化合物I向3-硫醇化的戊二酰-7-ACA(化合物II)的酶轉化在pH約為6.5-8.0的水溶液中進行，優選在pH 7.0。這避免了頭孢烷酸化合物在高于8的pH水平不穩定性增加的問題。反應溫度可以為15-35℃，通常固定在20℃。3-硫醇化的頭孢菌素C衍生物的濃度可以在35-150mM之間變化。
分子氧作為氧化脫氨基作用的共底物。在適宜的機械攪拌下，它通過底部進氣口以0.01-1vol/vol液體/分鐘的流速噴射到反應溶液中，優選0.1vvm。對本領域的技術人員顯而易見的是攪拌速度可以根據寬范圍的設計參數和反應特性而改變。通常攪拌速度在20-500rpm范圍內。生物反應器的設計優選為包含固定的結晶狀酶的滲濾柱，在其中難于得到足夠的氧傳遞，因此會減少3-硫醇化的戊二酰-7-ACA的最終收率。
根據操作條件，完成轉化所需的時間大約為0.5-3小時，但通常為約1小時。
式I化合物向式II化合物的轉化率高，通常為約98％，成品收率為95％。在反應結束時，反應溶液還含有一些未降解的式IV中間體，用外部的過氧化氫將其轉化成式II化合物。另外，一些式II化合物可以保持結合于固定有酶的樹脂上。
為降低這些潛在損失的影響，在過壓下將反應器中的液體加入儲液槽中，用100mM pH 7.0的磷酸緩沖液洗滌酶。可以使用其他具有相似性質的緩沖溶液。緩沖洗滌液與反應溶液合并，然后用過氧化氫將此混合物滴定，在25℃經30-50分鐘滴定，溶液中過氧化氫的終濃度為30-50ppm，優選35ppm，30分鐘。
在進入下一步驟之前用適當的酶-例如過氧化氫酶，適當的還原劑-例如丙酮酸、堿性亞硫酸鹽或任何其他適當的溶解的或固定形態的催化劑去除過量的H2O2。本發明優選用酶去除H2O2以保持終產品的質量和純度。
通過以上處理，最終化合物(II)的收率為97-98％，比EP 0496993記載的將未修飾的頭孢菌素C向戊二酰-7-ACA的轉化高3％。
在轉入裝有適宜的濕的固定化的或結晶的戊二酰-7-ACA酰基轉移酶制劑的第二生物反應器之前，用濃的有機或無機堿-例如氨水將H2O2滴定后的終溶液調整到pH約7.5-8.5，優選pH 8.0。商業可得的制劑，例如可以從Roche Molecular Biochemicals得到的制劑適于本發明的目的。用自動滴定儀向反應中滴加與上述相同的有機或無機堿使pH固定在約pH 8.0。操作溫度可以為約15℃-25℃，優選20℃。根據操作條件，轉化時間為0.5-2小時，但通常為約1小時。為避免酶制劑的微生物污染，伴隨常規的攪拌，通過底部進氣口以約0.01vol/vol/min的速度輸入氮氣流。
當測定發現3-硫醇化的戊二酰-7-ACA衍生物的轉化不低于97％，或銨的消耗速率降低到初始消耗速率的2％時反應即完成，然后將溶液過濾，優選用100mM pH 7.0的磷酸緩沖液洗滌固定有戊二酰-7-ACA酰基轉移酶的樹脂。
經過兩個酶階段后3-硫醇化的-7-ACA(化合物III)的收率為約94％。然后根據終產物的等電點，在酸性pH 1.7-約5.5條件下，用無機酸-例如鹽酸、硫酸或磷酸，或使用這些酸中的任一種與適宜的有機溶劑以不同比例的組合，通過結晶將后一化合物從最終溶液中回收。
本發明的方法是新的并提供了好的總產品收率、更佳的質量(以顏色和純度而言)、容易的分離、流程的連續操作和重復利用酶，而避免化學反應后酶因剩余雜環硫醇而中毒。
由于溶液中頭孢菌素C首先與雜環硫醇反應，本發明的方法表現出優于已知的得到3-雜環硫醇化的-7-氨基頭孢烷酸的三階段法的意外的進步。對于直接得自發酵液的頭孢菌素C的溶液，可以方便地做到這點。此方法因而避免了需要將頭孢菌素C以金屬鹽方式結晶，并同時不再需要使用和回收有機溶劑。而且它降低了頭孢菌素C整個回收過程的收率損失。因為在溶液中3取代的衍生物比母體頭孢菌素C更穩定，整個發酵過程的收率進一步有效地增加。
高選擇性地去除過量的硫醇允許制備非常高純度的式I化合物，并且出現的雜環硫醇濃度非常低(＜0.2mg/ml)。此方法有一些重要的優勢。它允許式I化合物作為酶處理的底物而不使酶中毒。結果酶可以重復使用。另外本方法不需要使用毒性溶劑，也不需要分離中間體因而提供了連續的流程。
采用強陰離子交換樹脂Amberlite IRA-400(Rohm and Haas制造)的高選擇性的去除步驟，使得到的式I化合物中有非常低水平的雜環硫醇(＜0.2mg/ml)。
通過加入形成水溶性鹽的堿性化合物，例如堿性金屬氫氧化物、氫氧化銨或優選堿性金屬碳酸鹽或碳酸氫鹽，在水中溶解雜環硫醇和任何無毒的頭孢菌素C鹽，3’位親核取代反應在水性介質中進行。一般地，除如上制備的鹽外，可以在本發明的方法中使用頭孢菌素C的和雜環硫醇的任何商業可得的鹽而不改變本方法的基本原理。
在分離的或共同的反應容器中溶解雜環硫醇和頭孢菌素C后，將兩種底物混合在同一反應器中，在此之前或之后在pH 5.5-8.0將溶液加熱到約60℃-80℃。
一旦反應開始，優選將溫度和pH分別保持在約65℃和6.0，進行約1小時-4小時。
對于反應收率而言，雜環硫醇/頭孢菌素C摩爾比是一個重要的變量，必須根據每種所用的雜環硫醇優化此摩爾比。摩爾比在1.0-4.0之間，優選摩爾比約為4。
發現保持這些摩爾比時，頭孢菌素C保持相當穩定，僅有低的β-內酰胺環降解，而沒有硫醇的頭孢菌素C溶液，在80℃在40分鐘內完全降解。
當頭孢菌素C的水平低于初始量的2％時，將反應混合物冷卻到約2℃-10℃，經過或不經過強無機酸-例如氫鹵酸或含氧酸酸化到pH3.0-5.5，優選約5.2。
在一些情況下此酸化步驟導致雜環硫醇結晶，并有可能重復用于新反應。
將有或無酸化步驟的反應后產生的溶液，隨后進行色譜法純化。可以以工業規模使用不同的樹脂和各種類型的色譜。
對一些樹脂進行試驗，基于吸附、親水-疏水相互作用、陽離子交換和陰離子交換將其分為四類樹脂。所有受試的以吸附為基礎的樹脂(Amberlite XAD-761，Amberlite 7HP，Amberlite 16 HP和AmberliteXAD-4)產生相似的結果，洗脫液含有22％-38％雜環硫醇。疏水-吸水相互作用樹脂Sephadex LH-20不保留任何硫醇(＜5％)。用陽離子交換樹脂AmberliteIRC-50、IR-120和IR-200發現了類似的情況。然而，發現陰離子交換樹脂對雜環硫醇有最好的結合能力，對于弱陰離子交換樹脂，范圍為57-60％(Amberlite IRA-93)。
發現具有8％交聯的含有三烷基苯甲基銨官能團的強多微孔(凝膠類型I)陰離子(堿性)交換樹脂Amberlite IRA-400對雜環硫醇產生最高結合能力(92-98％)，而對3’-位雜環硫代甲基頭孢菌素C衍生物有低的結合能力(2-15％，對于第一循環少于15％，對于以后的循環少于5％)。
這些多微孔樹脂具有某些優勢。它們不易碎，在操作中不需要當心，并有較高的負載容量。由于它們沒有離散的孔，溶液離子通過粒子擴散而與交換位點相互作用。所述樹脂的總交換能力約為1,4meq/ml。
意外地發現Amberlite IRA-400對頭孢菌素C的3-雜環硫代甲基衍生物比對戊二酰-7-ACA和7-ACA的相同的衍生物有更小的結合能力。實際上用MMTD制備的戊二酰-7-ACA的3-雜環硫代甲基衍生物以76.3％的水平與柱結合。對用MMTD制備的7-ACA的3-雜環硫代甲基衍生物發現了同樣的結果，它以92.7％的水平與柱結合。AmberliteIRA-400與這3種相關的β-內酰胺化合物的意外的表現看來是由于與戊二酰-7-ACA和7-ACA相比，頭孢菌素C側鏈5位出現可電離的氨基。
用本發明的方法去除雜環硫醇在工業規模方面具有特別的優勢，因為可以將柱的洗脫液用于酶反應過程中，而無須分離被修飾的頭孢菌素C，這在頭孢菌素中間體領域代表一種新概念，其中雜質與柱結合，而β-內酰胺衍生物能簡單地被水洗脫。
一旦將β-內酰胺衍生物洗脫(少于5％保持結合)，通常用1.5N的強無機酸使柱再生，例如含有可變量有機溶劑-優選10-20％乙腈的鹵化氫。當硫醇在洗脫液中的濃度高于0.2mg/ml時，可以用3N HCl和40％乙腈進行強再生。或者可以依次用NaOH和HCl溶液進行再生。
當洗脫雜環硫醇后，將硫醇濃縮并再使用。在下一循環之前用去離子水清洗柱以去除過量的再生劑。第一柱床體積的清洗應使用再生所用的流速。其余以吸附流速進行。
已發現與未修飾的頭孢菌素C相比，3-硫醇化的衍生物(TXC)是出乎意料的好的底物。本發明的方法因而提供了一種改進的和更經濟的制備頭孢菌素C衍生物的方法。
本發明方法的第二重要方面是以可重復利用的形式使用酶，或固定在固體載體上，或為大的穩定化結晶的形式。這后一需求對于產生以工業規模進行的方法是重要的。
本發明另一重要優勢是在去除和回收過量的硫醇后易于將化學溶液轉移到第一酶反應器中，并從此進入第二酶反應器。這使此方法能以單一液流連續進行，從頭孢菌素C濃縮物或制備的分批的溶液形成3-硫醇化的-7-ACA衍生物，它與未改性的7-ACA相比易于結晶。
以下實施例意在說明本發明的一般原則而非對其限制。
實施例1-5說明從頭孢菌素C生成式I的3-硫醇化的-7-ACA衍生物的制備方法。
實施例6-10說明通過形成式I的3-硫醇化的-戊二酰-7-ACA衍生物而制備式III的3-硫醇化的-7-ACA衍生物的方法。
實施例1制備7-β-(5-氨基-5-羧基戊酰氨基)-3-(5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基硫代甲基)-3-頭孢烯-4-羧酸(TDC)向裝有600ml去離子水的帶玻璃線的反應器中加入31.73g(0.24摩爾)2-巰基-5-甲基-1，3，4-噻二唑(MMTD)，然后將反應器攪拌加熱到約65℃。加入10g碳酸鈉將混合物的pH調節到約6.0。
在一分離的有玻璃線的燒瓶中，在200mL水中溶解33.23g頭孢菌素C的鈉鹽(75％游離酸，0.06摩爾)制備頭孢菌素C鈉鹽的濃溶液(HPLC測定純度98％)。當溶解MMTD后，加入頭孢菌素C的濃溶液并在約65℃攪拌混合物240分鐘，控制反應動力學直至頭孢菌素C的濃度低于2％。發現以下反應動力學參數

然后將反應混合物冷卻到約4℃，此時過量的MMTD開始結晶。伴隨攪拌(150rpm)，用37％鹽酸將pH酸化到pH 5.2然后緩慢攪拌(50rpm)60分鐘使結晶完全。
過濾沉淀的MMTD并在35℃真空干燥。回收得到23g MMTD(HPLC測定純度99％)，回收率約為95％。
濾液中(825ml)含有0.042摩爾TDC和0.016摩爾MMTD，用3M氨水將其調節到pH 7.25，加載到鹽酸鹽循環的Amberlite IRA-400柱上(柱床體積等于180ml)上，用去離子水以20ml/min的流速覆蓋。加載后用去離子水(約100ml)洗脫，直至加載的TDC以94％的HPLC純度達到97％的回收率。洗脫液的pH約為5.4，用3M氨水中和到7.0。剩余的MMTD為0.0009摩爾(＜0.2mg/ml)，少于降低pH結晶后剩余MMTD的6％。有此低水平MMTD(＜化學反應后生成MMTD的1％)，能進行TDC的酶反應。
通常用含10％乙腈的1.5M鹽酸1L將柱再生，并用2升去離子水清洗去除過量的再生劑。當需要時(MMTD＞0.2mg/ml)，可以用有40％乙腈的3M鹽酸1L對樹脂進行強再生。
為進一步表征pH 5.0的TDC溶液，將其加載到Amberlite XAD-2吸附柱上，用水洗滌柱。水洗后，用水洗脫樹脂，按每份25ml分級收集。將HPLC測定含98.5％TDC的流份低溫干燥，然后進行分析對產物C17H20N5O6S3·2H2O(TDC)的元素分析，計算值C 37.42；H 4.43；N 12.84；S 17.63；實測值37.27；H 4.3；N 13.11；S 17.51。
1H-NMR(DMSO/DCl)(δppm)1.57(m，2H，-CH2-)；1.63(m，2H，-CH2-)；2.18(m，2H，-CH2-)；2.64(s，3H，CH3)；3.55，373(J＝18Hz，2H，-CH2-)；3.83(t，1H，-CH-)；4.18-4.46(d，J＝13Hz，2H，-CH2-)；5.02(d，J＝3Hz，1H，C-6)；5.6(d，J＝3Hz，1H，C-7)。
實施例2對比實施例用不同的柱制備7-β-(5-氨基-5-羧基戊酰氨基)-3-(5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基硫代甲基)-3-頭孢烯-4-羧酸如實施例1所述制備TDC衍生物并將含此物質的濾液加載到不同類的樹脂上。
在柱使用的第一循環中用100ml水洗脫得到以下數據

Amberlite IRA-400得到最好的結果。TDC的洗脫率高，而MMTD的洗脫率低。用其他陰離子交換柱也能洗脫更大量的MMTD。其他陰離子交換樹脂顯示與硫醇和TDC的高的雙重結合。
實施例3TDC對Amberlite IRA-400的特異性按實施例1用戊二酰-7-ACA和7-ACA作為起始物質制備戊二酰-7-ACA衍生物(TDG)和7-ACA衍生物(7-TDA)。從Amberlite IRA-400的濾液得到以下數據

*在pH 7.8以避免TDA在柱中的沉淀。
與TDC相反，TDG和TDA顯示結合保留在Amberlite IRA-400中，與MMTD相同。
實施例4制備7-β-(5-氨基-5-羧基戊酰氨基)-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)-硫代甲基]-頭孢烷酸(TZC)向裝有600ml去離子水的帶玻璃線的反應器中加入28.16g(0.24摩爾)5-巰基-1-甲基四唑(MMTZ)，然后將反應器攪拌加熱到約70℃。加入約12g碳酸鈉將混合物的pH調節到約5.7-5.8。
在一分離的有玻璃線的燒瓶中，在200mL水中溶解33.23g頭孢菌素C的鈉鹽(75％游離酸，0.06摩爾，HPLC測定純度98％)制備頭孢菌素C鈉鹽的濃溶液。當溶解MMTZ后，加入頭孢菌素C的濃溶液并在約70℃攪拌混合物120分鐘，控制反應的進行直至頭孢菌素C的濃度低于3％。

將反應混合物冷卻到約4℃，但即使pH降低時，過量的MMTZ也不開始結晶。用3M氨水將含有衍生自MMTZ的0.04摩爾TZC衍生物和0.19摩爾MMTZ的溶液調節到pH 7.25，并加載到采用鹽酸鹽循環的Amberlite IRA-400柱上(柱床體積等于150ml)，用去離子水以20ml/min的流速覆蓋。首次經過柱后，剩余的MMTZ高于初始量(0.032摩爾)的13％。
由于此原因，在上述相同的條件下將洗脫液加載到另一AmberliteIRA-400(柱床體積等于60ml)柱上以降低MMTZ的水平。
加載后用去離子水(約90ml)洗脫，直至加載的TZC以87％的HPLC純度達到97％的回收率。流出液的pH約為5.4，用3M氨水中和到7.0。剩余的MMTZ濃度為0.0013摩爾，少于化學反應后得到MMTZ的1％。有如此低水平的MMTZ，能夠進行衍生物的酶反應而不使酶中毒。
用含10％乙腈的1.5M鹽酸1L將柱再生，并用2升去離子水清洗去除過量的再生劑。
實施例5制備7-β-(5-氨基-5-羧基戊酰氨基)-3-[(1，2，5，6-四氫-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基)-硫代甲基]-頭孢烷酸(TTC)向裝有600ml去離子水的帶玻璃線的反應器中加入37.96g(0.24摩爾)2，5-二氫-3-巰基-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪(以下稱為TTZ)，然后將反應器攪拌加熱到75℃。加入約12g碳酸鈉將混合物的pH調節到約6.7。
在一分離的有玻璃線的燒瓶中，在200mL水中溶解33.23g頭孢菌素C的鈉鹽(75％游離酸，0.06摩爾，HPLC測定純度98％)制備頭孢菌素C鈉鹽的濃溶液。當TTZ溶解后，加入頭孢菌素C的濃溶液并在約75℃攪拌混合物75分鐘，控制反應的動力學直至頭孢菌素C的濃度低于2％。

將反應混合物冷卻到約4℃，但即使pH降低時，過量的TTZ也不開始結晶。用3M氨水將含有0.036摩爾TTC和0.19摩爾TTZ的溶液調節到pH 7.25，并加載到采用鹽酸鹽循環的Amberlite IRA-400柱上(柱床體積等于209ml)，用去離子水以20ml/min的流速覆蓋。首次經過柱后，剩余的TTZ為0.015摩爾。
由于此原因，在上述相同的條件下將洗脫液加載到另一AmberliteIRA-400(柱床體積相同)柱上以降低TTZ的水平。
加載后用去離子水(約120ml)洗脫，直至加載的TTC以90％的HPLC純度達到60％的回收率。流出液的pH約為5.4，用3M氨水中和到7.0。剩余的TTZ濃度為0.00096摩爾，少于化學反應后得到TTZ的1％。有如此低水平的TTZ，能夠進行衍生物的酶反應而不使酶中毒。
用含10％乙腈的1.5M鹽酸1L將柱再生，并用2升去離子水清洗去除過量的再生劑。
實施例6合成7-氨基-3-[(5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基)-硫代甲基]-頭孢烷酸(TDA)從實施例1的強陰離子交換樹脂AmberliteIRA-400得到的濾液(925ml)，含有0.041摩爾7β-(5-氨基-5-羧基戊酰氨基)-3-[(5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基)-硫代甲基]-頭孢烷酸，以下稱為TDC，有94.4％純度(HPLC)及濃度低于0.2mg/mL的2-巰基-5-甲基-1，3，4-噻二唑(MMTD)，用3M氨水將其調節至pH7.0。
將TDC溶液輸入1.5升攪拌反應器中，其中有82.5g(30.3Roche’s單位/g)能從Roche Molecular Biochemicals得到的按WO-A-9516773所述方法制備的濕的固定化的D-氨基酸氧化酶。
在20℃、400rpm進行轉化，有氧氣流在2巴的絕對壓力下以0.1vol/vol/min的速度通過底部進氣口。借助自動滴定儀用3M氨水將pH滴定到pH7.0。
用HPLC控制轉化，使用反相柱Nucleosil 120 3-C18 125×8×4mm，移動相為含有4％乙腈的20mM醋酸銨，pH5.5，流速為1ml/min，使用260nm檢測器。在7.0分鐘時出現TDC，α-酮己二酰-中間體在8.5分鐘出現，TDG(3-硫醇化的戊二酰-7-ACA)在11.5分鐘。
提取反應混合物中除酶以外的代表性的樣品，所得結果示于下表


當TDC轉化高于98％時，停止反應，過濾去除反應溶液。剩余的生物催化劑用100mM pH 7.0的磷酸緩沖液100ml洗滌。后者加到第一濾液中。
為將剩余的α-酮己二酰-硫醇化的衍生物(TDK)轉化成TDG，在25℃用1M過氧化氫滴定所得溶液30分鐘使過氧化氫濃度達35ppm。用HPLC控制轉化直至得到TDG的最大產量(見上表)。處理后的純度為TDG 92.65％，其他β-內酰胺7.34％。
加入10μl可溶的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)過氧化氫酶(650kU，從Roche Molecular Biochemicals得到)5分鐘去除殘余的過氧化氫。
用3M氨水將產生的TDG溶液調節到pH 8.0，并轉移到1.5L攪拌反應器中，其中含有57.08g(87.6 Roche’s單位/g)濕的固定化的戊二酰-7-ACA酰基轉移酶(能從Roche Molecular Biochemicals得到)。在以下條件下進行轉化20℃，250rpm，有氮氣流在環境壓力下以0.01vol/vol/min的流速通過底部進氣口。借助自動滴定儀用3M氨水將pH滴定到pH 8.0。用與D-AAO反應相同的HPLC條件控制轉化。產物7-氨基-3-[(5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基)-硫代甲基]-頭孢烷酸的保留時間(以下稱為TDA)為7.2分鐘。
提取反應混合物中代表性的樣品，所得結果示于下表

當TDG轉化高于97％時，停止反應，過濾去除反應溶液。剩余的酶用100mM pH7.0的磷酸緩沖液100ml洗滌，使生物催化劑能夠重新使用。后者加到濾液中，其中含有TDA，并冷卻到10℃。用濃硫酸將pH調節到5.2，并在慢速攪拌下結晶60分鐘。
將沉淀過濾，并依次用50％丙酮水溶液250ml和丙酮100ml洗滌，再次過濾，并在35℃真空干燥，得到13.91g(K.F.1.81％)基本純的7-氨基-3-[(甲基-1，3，4-噻二唑-2-基)-硫代甲基]-頭孢烷酸，HPLC純度98.2％，且在420nm的透光度為87(用2％NaHCO3中1％的溶液測定；比色皿1cm)。
在此CEE過程中，從初始底物頭孢菌素C溶液(24.92活性克游離酸(activity grams of free acid))開始制備TDA的總收率為64.6％。TDA1H-NMR(DMSO/HCl)(δppm)2.59(s，3H，-CH3)；3.68(寬峰，2H，-CH2-)；4.2-4.48(J＝13.2Hz，2H，-CH2-)；5.03(d，J＝4.8Hz，1H，C-6)；5.11(d，J＝4.8Hz，1H，C-7)。
元素分析對C11H12N4S3O3的計算值C38.36％；H3.51％；S27.93％；N16.27％。
實測值C38.35％；H3.4％；S28.00％；N16.04％。
實施例7TDC溶液中出現的雜環硫醇對酶再生的影響為顯示在TDC的兩步酶反應中剩余雜環硫醇的毒性作用，使用經過或不經過強陰離子交換樹脂AmberliteIRA-400的色譜法除雜環硫醇的TDC。結晶步驟后MMTD的水平為2.56mg/ml。在經過AmberliteIRA-400強陰離子交換樹脂上的色譜步驟后，MMTD的量低于0.2mg/mL，少于初始所用MMTD的1％。
下表顯示了不經過色譜步驟，D-氨基酸氧化酶時間如何在4個循環后增倍，然而當TDC中有痕量MMTD時，此時間在12個循環后保持相同(約100分鐘)。


對于第二酶戊二酰-7-ACA-酰基轉移酶，似乎在第一反應之后產生和加入的過氧化氫破壞痕量的MMTD，在反應時間約為50分鐘時保存其催化活性。
實施例8合成7-氨基-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)-硫代甲基]-頭孢烷酸(TZA)從實施例4的強陰離子交換樹脂AmberliteIRA-400得到的濾液(1000ml)，含有0.039摩爾純度為91.3％(HPLC)的7-(5’-氨基己二酰二胺)-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)-硫代甲基]-頭孢烷酸(TZC)的，并含有少于0.2mg/ml的5-巰基-1-甲基四唑(MMTZ)，用3M氨水將此濾液調節到pH7.25。
將TZC溶液加入1.5升攪拌反應器中，其中有82.5g(30.3 Roche’s單位/g)能從Roche Molecular Biochemicals得到的按WO-A-9516773公開的方法制備的濕的固定化的D-氨基酸氧化酶。
在20℃、400rpm進行轉化，有氧氣流在2巴的絕對壓力下以0.1vol/vol/min的速度通過底部進氣口。借助自動滴定儀用3M氨水將pH滴定到pH 7.25。
用HPLC控制轉化，使用反相柱Nucleosil 120 3-C18 125×8×4mm，移動相為含有4％乙腈的20mM醋酸銨，pH 5.5，流速為1ml/min，使用260nm檢測器。在3.0分鐘時出現TZC，α-酮己二酰-中間體在3.6分鐘出現，TZG(3-硫醇化的戊二酰-7-ACA)在4.6分鐘。
提取反應混合物中除酶以外的代表性的樣品，所得結果示于下表


當TZG轉化高于99％時，停止反應，過濾去除反應溶液。剩余的生物催化劑用100mM pH 7.0的磷酸緩沖液100ml洗滌。后者加到最初的濾液中。
為將剩余的α-酮己二酰-硫醇化的衍生物(TZK)轉化成TZG，將得到的溶液用1M過氧化氫在25℃滴定30分鐘，使其中的過氧化氫濃度達35ppm。用HPLC控制反應(見上表)。處理后的純度為89.45％的TZG，10.55％的其他β-內酰胺。
加入10μl可溶的谷氨酸棒桿菌的過氧化氫酶(650kU，從RocheMolecular Biochemicals得到)5分鐘去除殘余的過氧化氫。
用3M氨水將產生的TZG溶液調節到pH 8.0，并轉移到1.5L攪拌反應器中，其中含有57.08g(87.6 Roehe’s單位/g)濕的固定化的戊二酰-7-ACA酰基轉移酶(能從Roche Molecular Biochemicals得到)。在以下條件下進行轉化20℃，250rpm，有氮氣流在環境壓力下以0.01vol/vol/min的流速通過底部進氣口。借助自動滴定儀用3M氨水將pH滴定到pH 8.0。用與D-AAO反應相同的HPLC條件控制轉化。產物7-氨基-3-[(5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基)-硫代甲基]-頭孢烷酸(以下稱為TZA)的保留時間為3.2分鐘。
提取反應混合物中除酶以外的代表性的樣品，所得結果示于下表

當TZG轉化高于99％時，停止反應，過濾去除反應溶液。剩余的酶用100mM pH 7.0的磷酸緩沖液100ml洗滌，使剩余催化劑可以重新使用。后者加到濾液中，其中含有TZA，并冷卻到10℃。用濃硫酸將pH調節到5.2，并在慢速攪拌下結晶60分鐘。
將沉淀過濾，并依次用50％丙酮水溶液250ml和丙酮100ml洗滌，再次過濾，并在35℃真空干燥，得到9.94g(K.F.1.4％)基本純的7-氨基-3-[(甲基-1，3，4-噻二唑-2-基)-硫代甲基]-頭孢烷酸，具有HPLC純度96.60％。
在此ECC過程中，從初始底物頭孢菌素C溶液(24.92活性克游離酸)開始制備TZA的總收率為48.05％。
TZA1H-NMR(D2O/Na2CO3)(δppm)3.45-3.78(J＝17.7Hz，2H，-CH2-)；4.01-4.3(J＝13.2Hz，2H，-CH2-)；4.03(s，3H，-CH3)；4.72(d，J＝4.8Hz，1H，C-6)；5.00(d，J＝4.8Hz，1H，C-7)。
實施例9TZC溶液中出現的雜環硫醇對酶再生的影響為顯示在TZC的兩步酶反應中剩余雜環硫醇的毒性作用，使用經過或不經過強陰離子交換樹脂AmberliteIRA-400色譜法除雜環硫醇的TZC。化學反應后MMTZ的水平為27.6mg/ml。經過在AmberliteIRA-400強陰離子交換樹脂上的色譜步驟后，MMTZ的量為0.2mg/mL，少于所用MMTZ的1％。
下表顯示了不經過兩個色譜步驟，D-氨基酸氧化酶時間如何在2個循環中有些增加，而顯著地影響戊二酰-7-ACA酰基轉移酶，使它在第二個循環中不能完成第二個反應。

然而，有色譜步驟的循環的時間，在上表中顯示兩種酶在5個循環中都保持大致相同。這清楚地顯示去除硫醇對酶穩定性的必要性。
實施例10制備7-氨基-3-[(1，2，5，6-四氫-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基)-硫代甲基]-頭孢烷酸(TTA)從實施例5的強陰離子交換樹脂AmberliteIRA-400得到的濾液(1000ml)，含有0.032摩爾純度為88％(HPLC)的7β-(5-氨基-5-羧基戊酰氨基)-3-[(1，2，5，6-四氫-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基)-硫代甲基]-頭孢烷酸(以下稱為TTC)，并含有少于0.2mg/ml的2，5-二氫-3-巰基-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪(TTZ)，用3M氨水將此濾液調節到pH 7.25。
將TTC溶液加入1.5升攪拌反應器中，其中有82.5g(30.3 Roche’s單位/g)能從Roche Molecular Biochemicals得到的按WO95/16773公開的方法制備的濕的固定化的D-氨基酸氧化酶。
在20℃、400rpm進行轉化，有氧氣流在2巴的絕對壓力下以0.1vol/vol/min的速度通過底部進氣口。借助自動滴定儀用3M氨水將pH滴定到pH 7.25。
用HPLC控制轉化，使用反相柱Nucleosil 100-5 C18 250×8×4.6mm，移動相為10mM四丁基銨硫酸氫鹽和15mM磷酸二氫鉀中的25％甲醇溶液，流速為1ml/min。使用260nm檢測器。TTC在4.3分鐘出現，α-酮己二酰-中間體在6.8分鐘出現，3-硫醇化的戊二酰-7-ACA(TTG)在8.2分鐘。
提取反應混合物中除酶以外的代表性的樣品，所得結果示于下表


當TTC轉化高于97％時，停止反應，過濾去除反應溶液。剩余的生物催化劑用100mM pH 7.0的磷酸緩沖液100ml洗滌。后者加到最初的濾液中。
為將剩余的α-酮己二酰-硫醇化的衍生物(TTK)轉化成TTG，將得到的溶液用1M過氧化氫在25℃滴定30分鐘，使其中的過氧化氫濃度達35ppm。用HPLC控制反應(見上表)。處理后的純度為80.77％TTG，19.23％的其他β-內酰胺。
加入10μl可溶的谷氨酸棒桿菌的過氧化氫酶(650kU，從RocheMolecular Biochemicals得到)5分鐘去除殘余的過氧化氫。
用3M氨水將產生的TTG溶液調節到pH 8.0，并轉移到1.5L攪拌反應器中，其中含有57.08g(87.6 Roche’s單位/g)濕的固定化的戊二酰-7-ACA酰基轉移酶(能從Roche Molecular Biochemicals得到)。在以下條件下進行轉化20℃，250rpm，有氮氣流在環境壓力下以0.01vol/vol/min的流速通過底部進氣口。借助自動滴定儀用氨水將pH滴定到pH 8.0。
用與D-AA0反應相同的HPLC條件控制轉化。產物7-(5’-氨基己二酰二胺)-3-[(1，2，5，6-四氫-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基)-硫代甲基]-頭孢烷酸的保留時間(以下稱為TTA)為5.2分鐘。
提取反應混合物的代表性的樣品，所得結果示于下表

當TTG轉化高于99％時，停止反應，過濾去除反應溶液。剩余的酶用pH 7.0的磷酸緩沖液100ml洗滌，使生物催化劑可以重新使用。后者加到濾液中，其中含有TTA，并冷卻到10℃。用濃鹽酸將pH調節到4.2，并在慢速攪拌下結晶60分鐘。
將沉淀過濾，并依次用50％丙酮水溶液250ml和丙酮100ml洗滌，再次過濾，并在40℃真空干燥，得到8.53g(K.F.5.95％)基本純的7-(5’-氨基己二酰二胺)-3-[(1，2，5，6-四氫-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基)-硫代甲基]-頭孢烷酸，HPLC純度為98.28％。
在此ECC過程中，從初始的頭孢菌素C溶液(24.92活性克游離酸)開始制備TTA的總收率為40.01％。
TTA1H-NMR(D2O/Na2CO3)(δppm)3.43-3.7(J＝17.7Hz，2H，-CH2-)；3.63(s，3H，-CH3)；4.02-4.33(J＝13.8Hz，2H，-CH2-)；4.73(d，J＝4.5Hz，1H，C-6)；5.02(d，J＝4.5Hz，1H，C-7).
本發明不僅局限于上述具體實施方案，而可以在細節上有所改變。
權利要求
1.制備3-硫醇化的7-氨基頭孢烷酸衍生物的酶反應方法，包括以下步驟式I的3-硫醇化的頭孢菌素C酶轉化成式II的3-硫醇化的-戊二酰-7-ACA 并將式II化合物酶轉化成式III的3-硫醇化的-7-ACA 其中R是含有至少一個氮原子的雜環，且R1和R2都是氫原子，或其一是氫原子，另一是酰基供體。
2.根據權利要求1所述的方法，其中通過以下步驟將式I的3-硫醇化的頭孢菌素C轉化成式II的3-硫醇化的-戊二酰-7-ACA在有分子氧的條件下使式I化合物與固定的D-氨基酸氧化酶反應；從水性反應混合物中分離載體支持的酶；并加入過氧化氫使3-硫醇化的-α-酮己二酰頭孢烷酸轉化成式II化合物。
3.根據權利要求2所述的方法，其中式I化合物與固定的D-氨基酸氧化酶反應，反應條件為2巴絕對壓力，pH6.0-8.0，溫度為20℃-30℃，反應時間0.5-3小時。
4.根據權利要求2或3所述的方法，包括以下步驟用鹽的濃溶液洗滌載體支持的酶，并向形成的溶液中加入過氧化氫，優選加入量相當于30-50ppm。
5.根據前述任一權利要求所述的方法，包括以下步驟從溶液中去除過量的過氧化氫，優選通過向溶液中加入催化劑來實現。
6.根據權利要求5所述的方法，其中通過向溶液中加入過氧化氫酶去除過量的過氧化氫。
7.根據前述任一權利要求所述的方法，其中通過使式II化合物與固定的戊二酰-7-ACA酰基轉移酶接觸將式II化合物轉化成式III化合物。
8.根據權利要求7所述的方法，其中從式II化合物形成式III化合物的反應在如下條件下進行環境壓力，pH6.0-8.5，溫度20℃-35℃，反應時間0.5-3小時，在惰性氣氛中。
9.根據權利要求7或8所述的方法，其中通過酸化反應介質使式III化合物沉淀，并隨后將沉淀洗滌和干燥。
10.根據前述任一權利要求所述的方法，其中用適宜的交聯劑將酶固定在適宜的固體載體中。
11.根據權利要求10所述的方法，其中的酶為尺寸適于作為生物催化劑的晶體形式。
12.根據前述任一權利要求所述的方法，其中在保持酶分散于底物水溶液中的條件下進行酶反應。
13.根據前述任一權利要求所述的方法，其中在柱上進行所述或每個酶處理。
14.根據前述任一權利要求所述的方法，其包括為重復使用而回收酶的步驟。
15.根據前述任一權利要求所述的方法，其中式III化合物在酸性pH進行結晶。
16.根據前述任一權利要求所述的方法，其中在一個反應罐中進行式I的3-硫醇化的頭孢菌素C形成式III的3-硫醇化的-7-ACA的酶轉化。
17.根據前述任一權利要求所述的方法，其中R是含有至少一個氮原子及可選硫或氧原子的雜環。
18.根據前述任一權利要求所述的方法，其中R是選自以下任何一個或多個基團的雜環基噻吩基、二唑基、四唑基、噻唑基、三嗪基、噁唑基、噁二唑基、吡啶基、嘧啶基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、苯并噁唑基，或它們的任何衍生物，優選5-甲基-1，3.4-噻二唑-2-基、1-甲基-1H-四唑-5-基或1，2，5，6-四氫-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基。
19.根據前述任一權利要求所述的方法，其中式I化合物為固體或其無毒鹽的形式。
20.用前述任一權利要求所述的方法制備的式III的3-硫醇化的-7-ACA。
21.制備頭孢菌素C抗生素及其衍生物的方法，包括形成如前述任一權利要求定義的式III化合物及隨后的酶反應。
22.根據權利要求21所述的方法，其中的抗生素是頭孢唑啉、頭孢西酮、頭孢哌酮、頭孢孟多、頭孢三嗪、頭孢替安或頭孢曲松。
23.權利要求1所述的制備3-硫醇化的7-氨基頭孢烷酸衍生物的酶反應方法，包括以下步驟使頭孢菌素C與式IV的硫醇化的合物反應R-SH(IV)其中R是含有至少一個氮原子的雜環基團，形成式I化合物并在形成式I化合物后去除過量的式IV的硫醇。
24.根據權利要求23所述的方法，其中通過吸附于陰離子交換樹脂而去除過量的硫醇。
25.根據權利要求24所述的方法，其中陰離子交換樹脂是具有交聯的丙烯酸共聚物結構的微孔樹脂。
26.根據權利要求25所述的方法，其中陰離子交換樹脂包含8％的交聯，含有功能性的硫代烷基苯甲銨基團。
27.根據權利要求25或26所述的方法，其中的樹脂采用鹽酸鹽、氫氧化物、磷酸鹽或醋酸鹽循環。
28.根據權利要求23至27中任一權利要求所述的方法，其中通過結晶去除過量的硫醇。
29.根據權利要求28所述的方法，其中在酸性pH條件下進行結晶。
30.根據權利要求23至29中任一權利要求所述的方法，其中通過結晶后吸附于陰離子交換樹脂而去除過量的硫醇。
31.根據權利要求23至29中任一權利要求所述的方法，其中頭孢菌素C在含水介質中。
32.根據權利要求23至29中任一權利要求所述的方法，其中頭孢菌素C為頭孢菌素C濃溶液的形式。
33.根據權利要求23至32中任一權利要求所述的方法，其中的反應在如下條件下進行pH5.5-8.0，溫度60℃-80℃，反應時間1-12小時。
34.根據權利要求33所述的方法，其中反應在如下條件下進行pH約6.0，溫度約65℃。
35.根據權利要求23至34中任一權利要求所述的方法，其中硫醇化的合物以1-5mol/mol頭孢菌素C的量存在。
36.根據權利要求23所述的方法，其中R是含有至少一個氮原子及可選硫或氧原子的雜環。
37.根據權利要求23至36中任一權利要求所述的方法，其中R是選自以下任何一個或多個基團的雜環基噻吩基、二唑基、噻唑基、四唑基、噻二唑基、三嗪基、噁唑基、噁二唑基、吡啶基、嘧啶基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、苯并噁唑基，或它們的任何衍生物，優選5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基、1-甲基-四唑-5-基或1，2，5，6-四氫-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基。
38.根據權利要求23至37中任一權利要求所述的方法，其中式I化合物是固體或其無毒鹽的形式。
39.由上述任一權利要求所述的方法得到的下式化合物 其中R是含有至少一個氮原子的雜環基團。
40.下式化合物 其中在式I中，R是5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基。
41. 下列化合物；其中在式I中，R是1，2，5，6-四氫-2-甲基-5，6-二氧-1，2，4-三嗪-3-基。
42.制備頭孢菌素C抗生素及其衍生物的方法，包括形成上述任一權利要求所述的式I化合物，以及隨后對式I化合物的酶反應。
43.權利要求42所述的方法，其中所述的抗生素是頭孢唑啉、頭孢西酮、頭孢哌酮、頭孢孟多、頭孢三嗪、頭孢替安或頭孢曲松。
全文摘要
制備3－硫醇化的7－氨基頭孢烷酸衍生物的酶方法，包括以下步驟將式(I)的3－硫醇化的頭孢菌素C酶轉化成式(II)的3－硫醇化的－戊二酰－7－ACA，并酶轉化式(II)的化合物形成式III的3－硫醇化的－7－ACA，其中R是含有至少一個氮原子的雜環基團，且R
文檔編號C07D501/12GK1531598SQ02809766
公開日2004年9月22日 申請日期2002年4月18日 優先權日2001年4月19日
發明者A·桑切茲－法勒爾, J·A·洛佩茲－馬斯, F·加西亞－卡蒙納, A 桑切茲-法勒爾, 洛佩茲-馬斯, 餮 卡蒙納 申請人:碧歐弗瑪穆爾西亞股份有限公司