專利名稱：用于含雜合同種型抗體部分的蛋白質的表達技術的制作方法
技術領域：
本發(fā)明一般涉及這樣的方法和組合物，其用于帶有源自兩種或多種同種型的部分的抗體及來自此抗體的融合蛋白質，包括含有具有改變的效應子功能、增強的蛋白質表達和/或降低的寡聚化的抗體部分的蛋白質。本發(fā)明特別涉及這樣的抗體和融合蛋白質，其中鉸鏈區(qū)源自一種同種型而CH2結構域源自不同的同種型。
背景技術：
從遺傳改造細胞中表達蛋白質的效率是一重要的商業(yè)問題。一些商業(yè)上重要的蛋白質最好從真核細胞中產生以保證正確的折疊和糖基化，所述真核細胞如哺乳動物細胞、植物細胞或酵母細胞。但是，維持大規(guī)模真核細胞培養(yǎng)的費用意味著用此方法生產的蛋白質是昂貴的。因此，在本領域內需要對真核細胞內蛋白質的表達水平實現最大化。
一相關的問題是產生于真核細胞的治療性蛋白質必須以正確的構象形態(tài)進行表達。通常，轉錄和翻譯的機制確保了遺傳改造細胞產生的蛋白質的序列由編碼該蛋白質的核苷酸決定。但是，轉錄及翻譯過后，蛋白質可能沒有正確折疊且可能被降解。備選地，蛋白質可以以聚集狀態(tài)產生，結果降低了活性。即使聚集的蛋白質具有活性，由于與非聚集蛋白質相比其免疫原性增加而不能被藥理學接受。這樣，藥理學可接受的蛋白質制品一般應基本不含有聚集的蛋白質。
從遺傳改造的真核細胞中表達的蛋白質的數量取決于編碼基因的轉錄速率、mRNA剪切及移出細胞核的效率及翻譯效率。這些事件在蛋白質表達中起到的作用已被充分理解，遺傳工程和蛋白質表達領域內的技術人員通?？蓪⒑线m的核酸序列加入到表達構建體的設計中，以實現高效的轉錄、剪切、mRNA移出和翻譯。
但是，產生于真核細胞的正確折疊的非聚集蛋白質的數量也取決于蛋白質的氨基酸序列以及決定轉錄、剪切、mRNA移出、翻譯和翻譯后修飾的核酸序列。例如，細胞內合成的相當大一部分蛋白質被認為會發(fā)生降解。蛋白質中決定是否應被降解的特征目前正是一個深入研究的主題，但當前還不可能僅通過檢查蛋白質的序列來預測蛋白質折疊、降解或聚集的效率。一些天然存在的蛋白質以高效率折疊、抵抗蛋白質水解且不發(fā)生聚集。相反，其他的蛋白質折疊效率低、迅速被降解且發(fā)生聚集。
抗體和含抗體一部分的人工蛋白質，此處命名為抗體融合蛋白質或Ig融合蛋白質，對于許多涉及抗體可變區(qū)的靶向能力以及恒定區(qū)結合多種其他蛋白質的能力的目的是有用的。抗體和抗體融合蛋白質制備物當它們正確折疊且非聚集時是非常有用的。因此，本領域內需要能用于生產聚集減少的抗體和抗體融合蛋白質制備物的方法和組合物。
此外，由于抗體和抗體融合蛋白質能結合多種其他蛋白質而導致，例如，引起特異的效應子功能，故所述抗體和抗體融合蛋白質是有用的。在一些情況中可能需要特異效應子功能，但經常的情況是優(yōu)選使效應子功能喪失。通過利用修飾抗體，融合蛋白質的抗體成分可經過改變而減小或消除效應子功能。當抗體和抗體融合蛋白質制備物經過修飾而改變了功能性時也是有用的。因此，本領域內存在對如下方法和組合物的需要，所述方法和組合物可用于生產具有改變的效應子功能的修飾抗體和抗體融合蛋白質。
蛋白質藥物可被蛋白酶降解，因此它們的遞送和藥物動力學特性并非最佳。本領域內存在對改進的蛋白質藥物的需要，所述改進的蛋白質藥物具有某些蛋白質的有用特性，但具有更大的蛋白酶抵抗力。
發(fā)明概述本發(fā)明著重描述用于生產完整抗體、免疫細胞因子、免疫融合體、免疫配體和其他抗體和Fc融合蛋白質的方法和組合物，其可以促進所需融合蛋白質的表達、正確寡聚化、純化和蛋白酶抗性，其中所述所需融合蛋白質任選地具有修飾的、組合的或減弱的Fc效應子功能。特別是，本發(fā)明提供具有雜合同種型的抗體部分，及任選地突變Ig成分在完整的抗體中以及在含抗體部分的融合蛋白質中的應用。
IgG/IgG雜合同種型在一組優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了具有減弱的效應子功能和增強的組裝功能的融合蛋白質。在使用Ig部分增強表達和提高血清半衰期，而又不需要此Ig部分的免疫學功能時，此類融合蛋白質特別有用。
在這些實施方案中，融合蛋白質優(yōu)選地包含IgG2或IgG4的CH1、CH2和/或CH3結構域，以及來自IgG1的鉸鏈區(qū)或來自IgG4的鉸鏈區(qū)，后一鉸鏈區(qū)優(yōu)選包含可在重鏈來源的部分間促進二硫鍵正確形成的突變(Angal S，等.分子免疫學(Mol Immunol)1993年，一月；30(1)105-8)。該實施方案的融合蛋白質將有利于完整抗體和含Fc區(qū)域的Ig融合蛋白質的高水平表達及提高其正確組裝。
在一更為優(yōu)選的實施方案中，融合蛋白質在Ig部分內還含有一個或多個突變。例如，Ig部分可以經過突變而進一步減少不需要的任何殘留的效應子功能。例如，可以對IgG2的CH2結構域內的C1q結合位點實施突變。例如正常的IgG4由于在相應IgG1的331位的脯氨酸處含有絲氨酸而不能夠結合補體(Eu命名法)(Tao，MA等(1993)J.Exp.Med.178661-667；Brekke，OH等(1994)Eur.J.Immunol.242542-2547)；在IgG2中的一個類似突變減弱了C1q結合。也可以對其他已知參與C1q結合的殘基進行修飾，例如對318、320、322和297位的殘基進行修飾(Duncan AR(1988)自然(Nature)332738-740)，導致C1q結合的減弱。
在另外一組優(yōu)選的實施方案中，鉸鏈區(qū)也存在突變。例如，在抗體輕鏈也存在的情況下，優(yōu)選的IgG1鉸鏈區(qū)的形式為在其正常位置存在有正常數目的半胱氨酸殘基。但是，在抗體輕鏈不作為一條獨立多肽鏈存在時，優(yōu)選IgG1鉸鏈的第一個半胱氨酸被突變?yōu)榱硪粋€殘基。例如，在Fc-X蛋白質、X-Fc蛋白質和單鏈抗體中應用此突變的鉸鏈區(qū)是有利的，其中所述單鏈抗體中輕鏈可變區(qū)通過多肽接頭連接重鏈。在此情形下，IgG1鉸鏈中的第一半胱氨酸優(yōu)選地突變?yōu)榻z氨酸。
在涉及突變鉸鏈區(qū)的第二類實施方案中，應用突變形式的IgG4鉸鏈以允許在兩重鏈間有效形成二硫鍵。
在涉及突變鉸鏈區(qū)的第三類實施方案中，在雜合同種型抗體或Ig融合蛋白質中使用突變形式的IgG2鉸鏈(其中頭兩個半胱氨酸每一個均突變?yōu)榱硪话被?。也可方便地將此突變鉸鏈用于完全來自IgG2的抗體或Ig融合蛋白質中。例如，可將具有ERKSSVECPPCP(SEQ ID NO1)序列的修飾IgG2鉸鏈用于抗體或Ig融合蛋白質中。另一有用的鉸鏈類型為IgG2鉸鏈和IgG4鉸鏈的雜合體，例如序列ESKYG-VECPPCP(SEQ IDNO2)，其中破折號前的5個氨基酸來自IgG4而剩余的氨基酸來自IgG2。這些實施方案在抗體和Ig融合蛋白質從真核細胞表達和分泌的情形下特別有用，因為這些鉸鏈實施方案可以促進蛋白質的正確折疊。這些實施方案可用作IgG1鉸鏈的備選。這些抗體鉸鏈實施方案的一個關鍵特征是它們僅含有兩個半胱氨酸殘基。
再一類實施方案涉及雜合同種型Ig融合蛋白質的Ig部分內的突變，突變位于Ig和非Ig部分的連接處。在一個實施方案中，融合蛋白質氨基酸序列內的改變優(yōu)選地位于Ig部分和非Ig部分的連接處，且優(yōu)選地位于連接點的10個氨基酸內。更優(yōu)選地，氨基酸的改變涉及抗體部分C末端的賴氨酸變?yōu)槭杷被?，如丙氨酸或亮氨酸?br>
一備選實施方案用于需要縮短融合蛋白質的半衰期的情形中。IgG3由于位于CH3結構域內的FcRn/FcRp結合位點內發(fā)生修飾(H435變?yōu)镽)而與其他IgG同種型相比半衰期較短(參見Ward，ES.和Gheti，V治療免疫學(Therapeutic Immunology)277-94)。具有IgG3的CH2和CH3結構域的融合蛋白質可用于需要短期暴露的情況。根據該實施方案，應用IgG3 CH3結構域聯合IgG1鉸鏈是有用的；例如IgG1(鉸鏈)-IgG3(CH3)融合蛋白質與含IgG3鉸鏈和IgG3 CH3結構域的Ig融合蛋白質相比具有更佳的表達和組裝特性。
在一更為優(yōu)選的實施方案中，當Ig融合蛋白質被設計為具有短的血清半衰期、減弱的效應子功能和有效的組裝性能時，可以應用雜合Ig區(qū)域，其中鉸鏈區(qū)來自IgG1、CH2結構域來自IgG2且CH3結構域來自IgG3。
IgG/IgA雜合同種型本發(fā)明的一個獨特的實施方案提供了雜合同種型Ig融合蛋白質，其具有增強的蛋白酶抵抗力及延長的血清半衰期。當Ig融合蛋白質將暴露于富含蛋白酶的環(huán)境時，該實施方案特別有用，所述富含蛋白酶的環(huán)境如消化道或其他的粘膜組織，例如口服Ig融合蛋白質藥物的過程中。根據此實施方案，提供了含IgG和IgA恒定區(qū)元件的Ig融合蛋白質。在一優(yōu)選的實施方案中，應用了IgA1的鉸鏈和IgG的CH2和CH3結構域。在一獨特的優(yōu)選實施方案中，編碼IgA Fc區(qū)域內的O-連接糖基化位點的氨基酸片段被移植到IgG的Fc區(qū)域中。
IgG/IgM雜合同種型本發(fā)明的再一實施方案提供了具有IgA或IgM的寡聚化特性但具有IgG的特征效應子功能的雜合同種型抗體和Ig融合蛋白質。例如，提供的蛋白質含IgG1或IgG3的鉸鏈區(qū)以及CH2結構域和與之相融合的IgM的CH3和CH4結構域。在一更為優(yōu)選的實施方案中，提供的抗體包含重鏈和輕鏈可變區(qū)，且還包含融合在一起的IgG鉸鏈及CH2區(qū)域和IgM的CH3及CH4結構域。在一備選更為優(yōu)選的實施方案中，提供了X-Fc形式的Ig融合蛋白質，其中X優(yōu)選地為細胞表面受體的配體，且Fc部分包含IgM的CH3和CH4結構域。此分子將IgG的ADCC效應子功能和IgM的高效價聯合在一起。
在應用IgM或IgA的CH4結構域的雜合同種型的優(yōu)選實施方案中，CH4結構域的C末端半胱氨酸被突變以阻斷與J鏈的二硫鍵連接。這減少了Ig融合蛋白質向消化道的分泌。
優(yōu)選的非-Ig部分本發(fā)明的融合蛋白質內非Ig部分的優(yōu)選類型為這樣的蛋白質或部分，當其不是Ig融合蛋白質的一部分時通常位于細胞外。例如，激素、細胞因子、趨化因子、分泌酶或跨膜受體的胞外部分。
在一優(yōu)選的實施方案中，非免疫球蛋白成分為一種蛋白質，如抗肥胖蛋白質。例如，非免疫球蛋白成分為leptin、CNTF、CLC/CLF-1或Acrp30的一部分。
而在另一優(yōu)選實施方案中，非免疫球蛋白成分為一種蛋白質，如紅細胞生成素或EPO。
在一備選實施方案中，融合蛋白質的非免疫球蛋白成分為激素。例如，非免疫球蛋白成分可為胰島素、生長激素或胰高血糖素樣肽1(GLP-1)。
在另一實施方案中，融合蛋白質的非免疫球蛋白成分為細胞因子。此處應用的術語″細胞因子″用以描述可在具有該細胞因子受體的細胞內誘發(fā)特異反應的天然或重組蛋白質、其類似物和其片段。優(yōu)選的細胞因子為可由細胞產生和分泌的蛋白質。優(yōu)選地，細胞因子包括白介素，如白介素-2(IL-2)、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16和IL-18，造血因子如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、G-CSF和紅細胞生成素，腫瘤壞死因子(TNF)如TNFα、淋巴因子如淋巴毒素，代謝過程的調節(jié)物如leptin，干擾素如α干擾素、β干擾素和γ干擾素，以及趨化因子。優(yōu)選地，本發(fā)明Ig細胞因子融合蛋白質顯示出細胞因子生物活性。
在一備選的優(yōu)選實施方案中，融合蛋白質的非免疫球蛋白成分為具有生物活性的配體結合蛋白質。此配體結合蛋白質可以，例如，(1)阻斷細胞表面的受體配體相互作用；或(2)中和血液的液相中的分子(如細胞因子)的生物活性，從而阻止其到達細胞靶位。優(yōu)選的配體結合蛋白質包括CD4、CTLA-4、TNF受體，或白介素受體如IL-1和IL-4受體。優(yōu)選地，本發(fā)明抗體-受體融合蛋白質顯示出配體結合蛋白質的生物活性。一高度優(yōu)選的實施方案包括用于蛋白質藥物Enbrel中的胞外TNF受體結構域片段，其形式為TNFR-鉸鏈-CH2-CH3或鉸鏈-CH2-CH3-TNFR，其中CH2和CH3結構域源自IgG2或IgG4，且在二聚化Fc中這兩鉸鏈區(qū)域中的每一個具有三個或更少的半胱氨酸，且甚至更優(yōu)選地，具有兩個或更少的半胱氨酸。
另一類型的優(yōu)選配體結合蛋白質具有結合小分子而不是蛋白質的能力。例如，可方便地將抗生物素蛋白融合到雜合同種型Ig部分，如抗體上。然后將雜合同種型抗體-抗生物素蛋白融合體施用給哺乳動物，如鼠或人，由抗體V區(qū)的特異性所決定的，此融合體將集中在機體的靶組織中。在抗體-抗生物素蛋白融合蛋白質被充分地從體內清除后，可施用生物素和治療分子的綴合物。生物素綴合物由于與抗生物素蛋白的結合將集中在靶組織中，這導致減輕了由于非靶組織中治療分子的集中而引起的副作用。該策略可用于其他配體/配體結合蛋白質對。
另一類型的優(yōu)選非免疫球蛋白部分為酶。例如，可將具有獨特特異性的酶融合到雜合同種型Ig部分，如抗體上。然后將雜合同種型抗體-酶融合體施用給哺乳動物，如鼠或人，該融合體將集中于機體的靶組織內(這是由抗體V區(qū)的特異性所決定的)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的治療方法中，在抗體-酶融合蛋白質被充分地從體內清除后，施用可通過該酶裂解成活性形式的前體藥物。此活化的藥物將集中在靶組織內，這就導致減輕了由于在非靶組織中活化藥物分子的集中而引起的副作用。在該實施方案的一高度優(yōu)選的形式中，活化藥物為抗癌藥物，例如細胞毒性劑。在一備選的高度優(yōu)選實施方案中，酶本身具有治療活性。例如，可以將RNAse，如Onconase與雜合同種型抗體融合蛋白質偶聯，且通過抗體V區(qū)域靶向腫瘤。
核酸本發(fā)明也包括新的核酸序列，所述核酸序列將有利于具有雜合同種型的Ig融合蛋白質和完整抗體的表達和分泌；以及包括用于構建此核酸的方法。
編碼抗體蛋白質的基因組序列的一個特別有用的特征是可變區(qū)、CH1、鉸鏈、CH2、CH3和CH4區(qū)域由分別的外顯子編碼。該特征使得可通過′外顯子改組′實現雜合同種型融合蛋白質的工程化(Zuckier等，癌癥研究(Cancer Research) 583905-8；Poon等，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)2708571-7；Jefferis R，等，分子免疫學(Mol Immunol.)271237-40；Chappel MS，Proc Natl Acad Sci U S A. 889036-40；Senior BW，等，感染免疫(Infect Immun.)68463-9.)。
對于Fc融合蛋白質，核酸分子可編碼多種構型的蛋白質。在一組優(yōu)選的實施方案中，核酸分子以5′到 3′方向連續(xù)編碼，(i)信號序列、免疫球蛋白Fc區(qū)域和靶蛋白質序列，或(ii)信號序列、靶蛋白質序列和免疫球蛋白Fc區(qū)域，或(iii)信號序列、第一靶蛋白質、免疫球蛋白Fc區(qū)域和第二靶蛋白質。導致產生的核酸分子由此編碼Fc-X、X-Fc或X-Fc-Y結構，其中X和Y為一種或多種靶蛋白質。例如，X和Y可各自為融合蛋白質。任選地在這些部分間編碼接頭。
類似地，根據本發(fā)明，編碼完整抗體Ig融合蛋白質的核酸也可設計為在每一重鏈部分和每一輕鏈部分的N末端編碼一段信號序列。
本發(fā)明的核酸可以以功能性連接方式加入到復制表達載體中，然后可以將所述載體導入能夠產生融合蛋白質的真核宿主細胞。最終的Ig融合蛋白質得以從真核宿主細胞中有效地產生和分泌。分泌的Ig融合蛋白質可從培養(yǎng)基中收集，而無需裂解真核宿主細胞?？梢詫Φ鞍踪|產物進行活性測試，和/或按需要應用普通試劑進行純化和/或從融合配偶體中切離，前述全部可以應用常規(guī)技術實現。備選地，本發(fā)明的核酸可導入細菌細胞，且產生的Ig融合蛋白質根據標準技術進行純化。
本發(fā)明也提供了提高細胞內抗體和Ig融合蛋白質生產水平的方法。方法優(yōu)選地應用于在真核細胞，優(yōu)選地哺乳動物細胞內的生產。例如，根據本方法，起始抗體或Ig融合蛋白質產量的提高可以通過將編碼Ig部分的結構域的核酸序列與編碼其他抗體同種型的結構域的相應序列或與突變序列進行交換、通過測試如此處描述的改變的蛋白質的產量來比較表達水平，以及選擇可給出最高水平的特定表達構建體而實現。該方法可重復使用。交換鉸鏈區(qū)是特別有用的。
治療本發(fā)明也提供了應用修飾抗體和Ig融合蛋白質進行治療的方法。相應地，本發(fā)明提供了有效且價廉的方法，以及提供了低免疫原性的蛋白質。
本發(fā)明前述的及其他的目的、特征和優(yōu)點將在以下的詳細描述、圖表和實施例中更為彰顯。
附圖簡述
圖1A-D為用于制備本發(fā)明某些方面的融合蛋白質的IgG雜合同種型的示意性圖解；黑線代表連接半胱氨酸殘基的二硫鍵；抗體結構域在圖A中標示；IgG1結構域以黑色顯示，IgG2結構域以白色顯示，且可變區(qū)和輕鏈結構域以條紋顯示。
圖1A顯示IgG1同種型。
圖1B顯示IgG2同種型。
圖1C顯示帶有IgG2和IgG1鉸鏈的同種型雜合體，所述鉸鏈的第一個半胱氨酸發(fā)生了突變。
圖1D顯示IgG雜合體γ1(CH1-H)γ2(CH2-CH3)。
圖2A-C為Ig融合蛋白質的示意性圖解，所述Ig融合蛋白質包含的Fc區(qū)域含有雜合同種型；″X″和″Y″可為任何的非Ig部分。
圖2A顯示Fc-C構象的Ig融合蛋白質，其包含來自一種抗體同種型的鉸鏈和由來自另一種同種型的CH2和CH3結構域組成的Fc部分；在Fc部分的C末端為蛋白質部分″X″。
圖2B顯示X-Fc構象的Ig融合蛋白質，其包含來自一種抗體同種型的鉸鏈和由來自另一種同種型的CH2和CH3結構域組成的Fc部分；在Fc部分的N末端為蛋白質部分″X″。
圖2C顯示X-Fc-Y構象的Ig融合蛋白質，其包含來自一種抗體同種型的鉸鏈和由來自另一種同種型的CH2和CH3結構域組成的Fc部分；在Fc部分的N末端為蛋白質部分″X″，其可為任何的蛋白質，而在Fc部分的C末端為蛋白質部分″Y″圖3A-D為包含可變區(qū)且含有雜合同種型的Ig融合蛋白質的示意性圖解；″X″和″Y″可為任何的非Ig部分。
圖3A顯示Ig融合蛋白質，其包含的鉸鏈來自一種抗體同種型(黑色)而包含的CH1、CH2和CH3區(qū)域來自一不同的同種型；非Ig蛋白質″X″在重鏈的C末端進行融合。
圖3B顯示Ig融合蛋白質，其包含的鉸鏈來自一種抗體同種型(黑色)而包含的CH1、CH2和CH3區(qū)域來自一不同的同種型；非Ig蛋白質″X″在重鏈的C末端進行融合；箭頭顯示了抗體部分內的一部分可能突變位點，見本文描述。
圖3C顯示Ig融合蛋白質，其包含的鉸鏈和CH1區(qū)域來自一種抗體同種型(黑色)而包含的CH2和CH3區(qū)域來自一不同的同種型；非Ig蛋白質″X ″在重鏈的C末端進行融合；從鉸鏈發(fā)出的分枝結構代表糖基化部分。
圖3D顯示Ig融合蛋白質，其包含的鉸鏈來自一種抗體同種型(黑色)而包含的CH1、CH2和CH3區(qū)域來自一不同的同種型；非Ig蛋白質″X″在重鏈的C末端進行融合；第二非Ig蛋白質 ″Y ″在輕鏈的N末端進行融合。
圖3E顯示Ig融合蛋白質，其包含的鉸鏈來自一種抗體同種型(黑色)而包含的CH1、CH2和CH3區(qū)域來自一不同的同種型；非Ig蛋白質″X″在重鏈的C末端進行融合；第二非Ig蛋白質″Y″在重鏈的N末端進行融合。
圖4示意性圖解了這樣的Ig融合蛋白質，其包含可變區(qū)及多種同種型且與IgG相比具有增強的效價；黑色的橢圓代表來自IgM的CH3和CH4結構域；白色的橢圓代表來自IgG的CH1、鉸鏈和CH2結構域；帶條紋的橢圓代表可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)；粗線代表正常存在于IgG1內的二硫鍵；用′s′標記的細線代表正常存在于IgM內的二硫鍵。
定義根據本發(fā)明，同種型意指免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)(C)的種類，所述恒定區(qū)決定了抗體的功能活性。存在五種主要的同種型，包括IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA意指以α重鏈為特征的免疫球蛋白種類。IgD意指以δ重鏈為特征的免疫球蛋白種類。IgE意指以ε重鏈為特征的免疫球蛋白種類。IgM意指以μ重鏈為特征的免疫球蛋白種類。IgG意指以γ重鏈為特征的免疫球蛋白種類。″伽馬a1″或″γ1″是指源自IgG1的重鏈或其部分。同樣，″伽馬2″或″γ2″是指源自IgG2的重鏈或其部分，依此類推。
根據本發(fā)明，同種異型免疫球蛋白意指相同免疫球蛋白重鏈C基因的等位基因多態(tài)性。這些決定因子存在于物種的一些而非全部成員中。
根據本發(fā)明，獨特型意指存在于抗體可變區(qū)(V)上的抗原決定族，其由VH和VL基因的特定重排形成。
根據本發(fā)明，FcRn，也稱作FcRp，意指含β-2微球蛋白的新生兒腸內轉運受體，所述受體調節(jié)IgG的清除，且對于抗體的體內循環(huán)半衰期非常重要。
根據本發(fā)明，FcγR意指可結合IgG分子的Fc部分并能誘發(fā)效應細胞功能的細胞表面受體，包括FcγRI、RII和RIII。FcγR在吞噬細胞、B淋巴細胞、NK細胞和樹突細胞上表達。
根據本發(fā)明，″IgG1″或″IgG2″或其他Ig分子意指包括重鏈或輕鏈的完整抗體，或其部分。
根據本發(fā)明，″二價單體″意指抗體、Fc融合體或抗體融合體，其通常可通過在正?？贵w中形成的二硫鍵而進行二聚化。通?？梢愿鶕現c的蛋白質在變性的非還原SDS膠上作為單一的條帶移動的能力，及其表觀分子量為在還原狀態(tài)下觀察到的表觀分子量的約兩倍，以推斷此二硫鍵的形成。二價單體的存在也可通過在大小排阻層析中存在與正確分子量對應的峰而進行推斷。其他確定蛋白質大小的方法也可用于鑒定二價單體的存在。
根據本發(fā)明，″Ig融合蛋白質″意指這樣的融合蛋白質，其包含與第二部分連接的部分或全部抗體，所述第二部分優(yōu)選地全部或部分為非抗體或非免疫球蛋白(非-Ig)蛋白質。免疫細胞因子、Fc-X蛋白質、X-Fc蛋白質和X-Fc-Y蛋白質均為Ig融合蛋白質的示例。同樣，其中非Ig部分置于兩個Ig部分或結構域之間的融合蛋白質亦構成了Ig融合蛋白質的一種類型。
根據本發(fā)明，蛋白質的″組裝″意指蛋白質正確折疊及寡聚化為正確的多聚體狀態(tài)。組裝可用本領域內建立的多種方法進行監(jiān)測。實際上，就二硫鍵而言，蛋白質的正確組裝可方便地通過比較蛋白質在非還原和還原SDS膠上的遷移進行監(jiān)測如果給定的蛋白質種類在非還原膠上形成多條帶，而在還原SDS膠上形成單一條帶，則可推測出在非還原SDS膠上至多僅有一條帶為正確組裝的蛋白質。備選地，大小排阻層析法也可用于區(qū)別單元蛋白和可由不正確的二硫鍵或非共價鍵相互作用形成的更高級寡聚體和聚合體。
根據本發(fā)明，抗體部分的″結構域″意指結構性結構域，其對應于人類抗體基因中的單個外顯子所編碼的氨基酸片段。例如，IgG的恒定結構域為CH1、鉸鏈、CH2和CH3結構域。在一些例子中，位于鉸鏈和CH2結構域由同一外顯子編碼。在這樣的例子中，鉸鏈和CH2結構域間的連接處通過與其他鉸鏈/CH2連接處進行比對而定義(參見Paul，前面引用的文獻.，46-49頁)。
根據本發(fā)明，結構域、蛋白質、區(qū)域或分子意指完整的結構域、蛋白質、區(qū)域或分子，或其部分、突變體或改造形式，或主要由其來源的形式。所述部分、突變體或改造形式優(yōu)選地具有完整結構域、蛋白質、區(qū)域或分子特有的功能特性。根據本發(fā)明，″主要由其來源″意指衍生物具有的氨基酸序列中至少95％源自天然存在的蛋白質或結構域的特定序列。例如，主要由人IgG2 CH2結構域來源的序列在氨基酸比對中至少有95％與人IgG2CH2結構域的序列相同。
根據本發(fā)明，″修飾的IgG1鉸鏈″意指來自IgG1的鉸鏈區(qū)，在該鉸鏈中半胱氨酸，優(yōu)選地第一個半胱氨酸突變?yōu)榱硪环N氨基酸。該半胱氨酸通常與抗體輕鏈形成二硫鍵。此修飾的IgG1鉸鏈在缺乏輕鏈或具有可結合輕鏈的其它半胱氨酸的蛋白質中特別有用。
根據本發(fā)明，″紅細胞生成素分子″意指這樣的分子，其一般具有與脊椎動物紅細胞生成素相同的結構和類似的氨基酸序列，任選地包括突變。例如實施例18描述了無突變的人紅細胞生成素以及具有四個突變的人紅細胞生成素的應用。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于提高免疫球蛋白融合蛋白質的體內和體外產量的方法和組合物。特別是，本發(fā)明提供了用于提高免疫球蛋白融合蛋白質的表達、聚合和/或折疊特性的有用方法。本發(fā)明部分基于如下令人驚異的發(fā)現，即當應用雜合免疫球蛋白而不是野生型免疫球蛋白作為融合配偶體時，免疫球蛋白融合蛋白質的表達水平提高、聚集減少和/或折疊問題減少。與雜合免疫球蛋白相關的融合蛋白質生產特性的提高是出乎預料的，因為如IgG1和IgG2等野生型免疫球蛋白被認為是可良好折疊的蛋白質且能在體內和體外有效表達。
相應地，本發(fā)明的一個方面包括可用于表達包含雜合免疫球蛋白(或雜合Ig)部分的免疫球蛋白融合蛋白質的方法和組合物。優(yōu)選的雜合免疫球蛋白包含IgG1鉸鏈和IgG2的CH2和CH3結構域。其他優(yōu)選的雜合體包含IgG1和IgG4結構域。
抗體結構抗體為Y字形的分子且由兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)組成。每一條重鏈通過二硫鍵連接輕鏈，且兩條重鏈依賴共價和非共價相互作用彼此相對正確定向。這兩條鏈在氨基末端的可變結構域含有抗原結合位點，且與CH1結構域一起，限定了分子的Fab端。
四條鏈應用重鏈間的疏水鍵以及一個或多個鏈間的二硫鍵來穩(wěn)定復合體。這樣，完整的免疫球蛋白為二價，具有兩個相同的抗原結合位點。某些免疫球蛋白通常還要進行多聚化，例如IgM和IgA。
每一多肽鏈具有兩個到五個結構域；輕鏈含兩個結構域而重鏈含四或五個。每條鏈的各氨基末端結構域由于存在大量的序列變異而被命名為可變區(qū)，而幾個羧基端結構域被稱為恒定區(qū)。重鏈區(qū)編號為CH1、鉸鏈、CH2、CH3、CH4，且負責多種重要的抗體功能，包括Fc受體(FcR)結合和補體固定。
重鏈C區(qū)存在五種主要的同種型，分類為IgA、IgG、IgD、IgE、IgM，每一種均具有特征性的效應子功能(IgG分為四種γ同種型亞類γ1、γ2、γ3、γ4)。輕鏈的恒定區(qū)僅含有一個C結構域，其可為Ck和Cλ兩類中的一個，所述結構域不具有已知的明確的功能特性(參見W.E.Paul，ed.，1993，基礎免疫學(Fundamental Immunology)，Raven Press，New York，N.Y)。
所有的免疫球蛋白在它們的重鏈CH1結構域的C末端均存在一鉸鏈區(qū)，所述鉸鏈區(qū)將分子分成Fab和Fc區(qū)域。多數情況下，鉸鏈區(qū)使得在分子的抗原結合(Fab端)組分和效應物-相互作用(Fc)組分間存在很大程度的柔性，由此連接起抗體的兩個主要功能元件。在IgG同種型中，鏈間二硫鍵一般在該鉸鏈區(qū)內形成，從而生成最終的四聚體分子。
除IgM外，鉸鏈區(qū)主要由脯氨酸、絲氨酸和蘇氨酸組成，這些氨基酸趨向于阻止二級結構的形成且被認為可賦予鉸鏈柔性。IgG1同種型常被用于融合蛋白質，在其鉸鏈區(qū)含有的兩個二硫鍵將兩條重鏈彼此連接起來。相反，IgG2同種型具有四個二硫鍵(圖1)。根據本發(fā)明，這些二硫鍵傾向于促使抗體和Ig融合蛋白質的不正確組裝，如在實施例的意外發(fā)現中所證實的。
Ig融合蛋白質的有用構型免疫細胞因子為利用本發(fā)明的方法和組合物靶向腫瘤的融合蛋白質治療劑的唯一一個示例。其他腫瘤毒性分子也可通過融合到本發(fā)明的腫瘤特異抗體上而靶向腫瘤。此外，根據本發(fā)明的抗體融合蛋白質也可攻擊其他類型的病變細胞，例如病毒感染的細胞。
本發(fā)明的方法和組合物也可與Fc-X和X-Fc技術聯用。根據本發(fā)明，在融合蛋白質中使用雜合抗體同種型還進一步提高了連接到免疫球蛋白Fc部分上的靶蛋白或目的多肽的產生和積集。對于Fc-X融合蛋白質，信號肽及隨后的免疫球蛋白基因Fc片段構成了靶蛋白質的N末端融合配偶體。然后融合蛋白質可在宿主細胞內表達，例如哺乳動物細胞，如天然表達免疫球蛋白的細胞。N末端融合配偶體內的信號肽-Fc片段將指導靶蛋白通過分泌路徑，以使融合蛋白質易于分泌。此外，Fc片段通常為糖基化的且在中性pH下高度帶電，這樣Fc片段的應用可提高硫水性較高的蛋白質的溶解性。使Fc-X融合蛋白質定向通過分泌路徑也減輕了與胞內蛋白質毒性相關的問題，且促進了穩(wěn)定細胞系的分離。融合蛋白質產物可容易地進行分析和純化，因為其可容易地以天然構象形式從培養(yǎng)基中得以收集并保留生物活性和酶活性。該技術的功效已經用Fc-leptin和Fc-紅細胞生成素進行了證明。這些優(yōu)點中的一部分也是X-Fc蛋白質所固有的。
根據本發(fā)明，抗體部分的有用融合的示例包括Fc-X、X-Fc和X-Fc-Y蛋白質。此類蛋白質含有Fc區(qū)域，而非抗體蛋白質或蛋白質片段在N末端、C末端或N末端和C末端同時進行融合。與Fc區(qū)域融合的一個有利的效果是融合配偶體的血清半衰期可顯著延長。第二個有利的效果是′X′可通過附著Fc而有效進行二聚化。例如，Enbrel為由TNF受體的一部分和人IgG1 Fc區(qū)域組成的融合蛋白質。
在本發(fā)明的一些實施方案中，沿X-Fc方向設計具雜合同種型的融合蛋白質是特別有利的。這些構建體中靶蛋白質為N末端融合蛋白質且隨后為Fc片段。該方法對一些蛋白質可能是有用的，例如對于淋巴細胞表面的糖蛋白(LHR)(參見美國專利5,428,130)。
根據本發(fā)明，盡管應用基于重組抗體的融合蛋白質進行治療優(yōu)于單獨的蛋白質或細胞因子治療，但這種應用可因融合蛋白質的快速體內循環(huán)清除而受到限制，這是因為抗體融合蛋白質的體內循環(huán)半衰期顯著低于自由抗體的體內循環(huán)半衰期。循環(huán)半衰期的減小可能是通過Fc受體(FcR)的清除增加的結果。已證明同種型的轉換是對半衰期實行改變的一個機制。通過將人重鏈C區(qū)域從IgGγ1或IgGγ3同種型變?yōu)镮gGγ4同種型已經證明可提高兩種免疫細胞因子的半衰期(癌癥研究(Cancer Research)59(9)2159-66，1999)，其中所述IgGγ4為具有降低的FcR結合能力的同種型?；贗gG4的免疫細胞因子和融合蛋白質與起始的基于IgGγ1的融合蛋白質相比，其FcR結合力降低10倍且Fc受體效應子功能如ADCC也降低，但在鼠腫瘤模型中其仍顯示出類似或更好的功效。但是，本發(fā)明提供了基于雜合抗體的融合蛋白質，所述融合蛋白質在一個單一分子內結合了不同抗體類型的功能和結構特性。
相應地，對于某些申請，由于IgG2同種型的Fc受體結合力低得多，IgG2同種型為抗體融合蛋白質賦予了更好的特性(Hulett等.免疫學進展(Adv.Immunol.)571127)。對于整個的抗體融合蛋白質，在僅含Fc區(qū)域的融合蛋白質中應用γ2同種型有時是有利的。原理與用于完整抗體的相同即，通常需要避免由源自其他同種型的Fc區(qū)域介導的與Fc受體的結合。
但是，融合蛋白質中IgG2同種型的應用一般會導致某種程度的不適當組裝，見本文的描述。本發(fā)明的方法和組合物提供了這樣的抗體融合蛋白質，其具有最小化的IgG2同種型的效應子功能，但又不具有該同種型的聚集特性。
根據本發(fā)明，新雜合同種型抗體和融合蛋白質較之基于IgG2的融合蛋白質顯示出增強的表達和改進的組裝。此外，雜合同種型抗體和融合蛋白質可在不需要Fc受體效應子功能的治療中具有提高的功效。
鉸鏈的類型本發(fā)明的雜合同種型抗體也包括其鉸鏈區(qū)為突變鉸鏈區(qū)的抗體，優(yōu)選半胱氨酸殘基數目減少的鉸鏈區(qū)，例如，第一個半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸的修飾IgG1鉸鏈區(qū)。IgG1鉸鏈區(qū)的第一個半胱氨酸通常結合到輕鏈上。在Fc-X蛋白質或X-Fc蛋白質或其他任何缺乏輕鏈的抗體融合蛋白質中，該半胱氨酸不能行使其天然功能，并因此可進行突變。但是，根據本發(fā)明，具有缺失第一個半胱氨酸的IgG1鉸鏈和IgG2的CH1結構域的雜合同種型抗體可與輕鏈連結，因為輕鏈通常會與IgG2的CH1結構域內的半胱氨酸形成二硫鍵。IgG2鉸鏈內的四個半胱氨酸被認為彼此形成二硫鍵。
根據本發(fā)明，抗體或Ig融合蛋白鉸鏈區(qū)中參與重鏈-重鏈同二聚化的半胱氨酸可對抗體或Ig融合蛋白質的表達和組裝產生顯著的影響。特別是，較高數目的半胱氨酸可由于二硫鍵的錯誤形成而導致抗體或Ig融合蛋白質的錯誤組裝。這樣，本發(fā)明公開了對參與重鏈同二聚化的一個或多個半胱氨酸的突變可導致抗體或Ig融合蛋白質表達或組裝的提高。在一優(yōu)選的實施方案中，重鏈同二聚化半胱氨酸可突變?yōu)?，以通常?yōu)選的順序，絲氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、天門冬酰胺、天門冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或硒代半胱氨酸。
應用在最N末端的第一個半胱氨酸發(fā)生突變的IgG1鉸鏈是特別適宜的。該鉸鏈區(qū)的優(yōu)勢在于其僅含有兩個半胱氨酸。IgG1鉸鏈的第一個半胱氨酸通常與輕鏈中的半胱氨酸形成二硫鍵。但是，在缺乏輕鏈的Ig融合蛋白質中，如Fc-X、X-Fc和X-Fc-Y蛋白質，IgG1鉸鏈中的此最N端半胱氨酸不起這樣的作用，因此可進行突變(Lo等.蛋白質工程(ProteinEngineering)11405-500)。如在實施例中所描述，具兩個半胱氨酸的IgG1鉸鏈也可用于其中CH1結構域源自IgG2的完整抗體或完整抗體融合蛋白質，因為IgG2的CH1結構域具有可與輕鏈形成二硫鍵的半胱氨酸。
Fc受體IgG分子可與多種細胞受體相互作用，包括三類對IgG類抗體具特異性的Fcγ受體(FcγR)，即FcγRI、FcγRII和FcyγIII。這些受體負責攝取抗原抗體復合物。Fc上的Fc受體結合位點位于鉸鏈附近的CH2結構域中，且據認為V區(qū)與抗原的結合可幫助輕鏈恒定區(qū)移位以不再在空間上封閉鉸鏈。由此，結合抗原的抗體將優(yōu)先地與Fc受體結合。
第四種受體，又可稱為′保護受體′(FcRp)或′新生兒受體′(FcRn)，負責在抗體抗原復合體被內吞以及它們在內體中解聚后從內體中回收抗體。FcRp的結合位點存在于三維抗體結構中CH2和CH3結構域間的連接處。IgG抗體的血清半衰期取決于與功能性FcRp的生產性相互作用。其他的抗體類型，例如IgM、IgD、IgE和IgA，不與FcRp結合。
某些抗體的另一結合配偶體是C1q，其介導補體固定。
與Fc受體和FcRp的相互作用也影響到含Fc部分的融合蛋白質的生物活性和代謝。
例如，結合FcR的能力較弱的融合蛋白質與具有較好FcR結合能力的相應融合蛋白質相比具有較長的血清半衰期。結合FcRp的能力較弱的融合蛋白質與具有較好FcRp結合能力的相應融合蛋白質相比具有較短的血清半衰期。
例如，含IgG2的CH2和CH3結構域的Ig融合蛋白質比含IgG1的融合蛋白質具較長的血清半衰期。同樣，含源自IgG3的Fc區(qū)域的融合蛋白質比含IgG1或IgG2的相應融合蛋白質具有較短的血清半衰期。含源自IgM、IgD、IgE和IgA的CH2和CH3結構域的融合蛋白質比源自IgG的相應融合蛋白質具有甚至更短的血清半衰期。
為說明本發(fā)明的應用，可方便地將抗體和Ig融合蛋白質分為兩個大類需要免疫球蛋白的效應子功能的蛋白質以及其中Ig部分用作免疫學惰性載體且缺乏效應子功能的蛋白質。在前一類蛋白質中，可方便地構建如下具有雜合同種型的蛋白質，在該蛋白質中產生多種效應子功能的特定集合。在后一類別中，可方便地構建如下具有雜合同種型的蛋白質，所述雜合同型蛋白質包括具有最小效應子功能的某些同種型的區(qū)域和可促進如蛋白質的組裝的來自其他同種型的區(qū)域，見如下描述。
抗體和Ig融合蛋白的組裝本發(fā)明公開了如下發(fā)現，即抗體或Ig融合蛋白質的鉸鏈在融合蛋白質(例如從哺乳動物細胞分泌的Ig融合蛋白質)的正確組裝和減少聚集方面起到重要作用。例如，不希望被理論束縛，認為抗體和Ig融合蛋白質的組裝包括這樣的步驟，其中兩條重鏈首先通過CH3內的疏水斑進行非共價連接。此連接之后，鉸鏈區(qū)進行對齊且鏈間二硫鍵得以形成。鉸鏈區(qū)距CH3結構域的疏水斑約50埃。
在設計抗體或Ig融合蛋白質構建體時，改變鉸鏈區(qū)是有益的。例如，將特定表達構建體中的編碼鉸鏈區(qū)的DNA替換為編碼不同的鉸鏈區(qū)，例如來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD、IgE或IgY的鉸鏈區(qū)的DNA是有益的。
根據本發(fā)明的理論，例如，含有帶較多半胱氨酸的鉸鏈區(qū)的抗體和Ig融合蛋白質不能與帶有較少半胱氨酸的相應蛋白質一樣有效地組裝。不希望被理論束縛，具有較多半胱氨酸的鉸鏈區(qū)將表現出更多的錯誤匹配半胱氨酸及錯誤形成二硫鍵的機會。結果是，與具有含較少半胱氨酸的鉸鏈區(qū)的相應抗體和Ig融合蛋白質相比，可發(fā)現具有含較多半胱氨酸的鉸鏈區(qū)的抗體和融合蛋白質更易于發(fā)生高度聚集并且其存在多種電泳類型。此現象的舉例說明在實施例中給出。
例如，含具有四個半胱氨酸的鉸鏈區(qū)的抗體和Ig融合蛋白質的組裝效率低于含三個或兩個半胱氨酸的抗體和Ig融合蛋白質的組裝效率。例如，含源自IgG2的鉸鏈區(qū)的蛋白質的組裝效率低于含源自IgG1的鉸鏈區(qū)的相應蛋白質。在一獨特的實例中，含源自IgG3的鉸鏈區(qū)的蛋白質組裝效率低下；IgG3鉸鏈區(qū)含有11個半胱氨酸。
本發(fā)明的用途尤其可在需要最小限度結合Fc受體I的情形下得以闡明。例如，在融合蛋白質的情形中，可方便地應用來自IgG2的CH2和CH3結構域，由于與FcR的結合顯著減少，故可以減少ADCC和延長血清半衰期。但是，IgG2鉸鏈區(qū)的應用導致產生的抗體或Ig融合蛋白質組裝效率低下。而應用IgG2的CH2和CH3區(qū)與IgG1鉸鏈聯合是特別適宜的，見在以下的多個實施例中的闡述。
在一些實施例中還舉例闡明了一個類似發(fā)現，即，特定鉸鏈或其他結構域的選擇可影響抗體或Ig融合體的生產水平。該發(fā)現具有重要的經濟價值，因為諸如完整抗體等蛋白質藥物經常需要大劑量給藥，例如每個病人的每次給藥為幾百毫克。通常發(fā)現，選擇具有最少數目半胱氨酸的鉸鏈，例如具有三個或兩個半胱氨酸的鉸鏈能提高真核表達系統(tǒng)中抗體或Ig融合蛋白質的生產。降低半胱氨酸的數目可通過突變或通過用一種同種型的鉸鏈替換另一同種型的鉸鏈或同時采用二者而實現。
提高蛋白酶抵抗力鉸鏈區(qū)對蛋白酶特別敏感。在經典實驗中，通過在鉸鏈區(qū)進行蛋白酶切割將抗體分成Fab區(qū)和Fc區(qū)。
可方便地構建其鉸鏈區(qū)來自IgA且其他組分來自其他抗體同種型的抗體和Ig融合蛋白質。例如，如果抗體或Ig融合蛋白質需經口或經過另外的粘膜表面，如鼻、肺、子宮或直腸粘膜遞送時，應用具有強蛋白酶抗性的蛋白質可以保護抗體或Ig融合蛋白質免受存在的蛋白酶的作用。例如，構建含IgA鉸鏈和來自IgG的CH2和CH3結構域的抗體或Ig融合蛋白質是有利的，這樣該雜合同種型蛋白質將具有蛋白酶抵抗特性及，在蛋白質進入循環(huán)后，延長的血清半衰期。IgA1鉸鏈為優(yōu)選的鉸鏈，因為IgA1鉸鏈內的糖基化位點具有廣譜的蛋白酶抗性。相反，IgA2的鉸鏈較短且能抵抗特異切割IgA1鉸鏈的細菌蛋白酶。
其他同種型重鏈也含有對抵抗蛋白酶起作用的糖基化位點。例如，IgA、IgD、IgE和IgM在恒定區(qū)含有對抵抗蛋白酶起作用的糖基化位點。例如，IgE的CH1結構域含有三個N連接的糖基化位點。將IgE的CH1結構域與，例如，來自IgA的鉸鏈以及與來自IgG的CH2和CH3結構域結合是有利的。
將來自一種同種型的糖基化位點摻入到另一同種型的CH2或CH3區(qū)中也是有利的。在此情況下，以完整結構域，即由單一外顯子編碼的區(qū)域所限定的結構域，構建抗體或Ig融合蛋白質一般是不夠的，因此構建雜合結構域是有利的。例如，將IgG同種型特有的FcRp結合特性與其他同種型的蛋白酶抵抗特性進行結合是有利的。為獲得此類特性結合，需要構建具有來自兩個不同同種型的氨基酸序列的單一結構域。然后生成的雜合結構域可用于構建Ig與非Ig部分的融合體。
例如，可方便地用來自IgE CH2結構域且包含序列VNLTW(SEQ IDNO3)的一段氨基酸替換IgG CH2結構域內的相應氨基酸。例如，在IgG1中這些氨基酸為VKFNW(SEQ ID NO4)且在IgG3中這些氨基酸為VQFKW(SEQ ID NO5)。根據本發(fā)明，在其他CH2結構域內的相應氨基酸可通過與其他同種型的CH2結構域進行計算機比對或結構比對來確定，或由已發(fā)表文獻確定(Paul，WE基礎免疫學(Fundamental Immunology)，第四版，第3章，46-47頁)。
類似地，將其他糖基化位點摻入到IgG中也是有利的。例如，可以使用來自IgD的含NTSGF(SEQ ID NO6)或LNASR(SEQ ID NO7)序列的序列片段替換抗體或Ig融合蛋白質中源自IgG的Fc區(qū)域內的相應序列。根據本發(fā)明，抗體恒定區(qū)內的其他有用糖基化位點在Paul(基礎免疫學(Fundamental Immunology)，第四版，第3章)及其中的參考文獻中公開。
在本發(fā)明的一些實施方案中，非IgG糖基化位點的摻入減弱了與FcRp的相互作用。在此情況下，需要在提高蛋白酶抗性和降低血清半衰期間作出權衡，且此雜合同種型蛋白質的有用性必須在特定的應用環(huán)境下進行評估。
根據本發(fā)明，特定雜合同種型抗體或Ig融合蛋白質的蛋白酶抗性可以根據標準方法進行測試。蛋白酶可購自供應商且根據生產者的說明書在特定雜合同種型抗體或Ig融合蛋白質存在條件下進行孵育。蛋白水解的檢測，例如，可以通過SDS膠電泳和對起始材料和切割產物進行定量而實現。
根據本發(fā)明，雜合同種型抗體或Ig融合蛋白質與FcRp相互作用的能力也可根據標準方法進行測定。例如，抗體或Ig融合蛋白質的藥物動力學特性可在哺乳動物中進行檢測，所述哺乳動物如小鼠、大鼠、兔、狗、非人靈長類或人?？贵w或Ig融合蛋白質的藥物動力學特性為FcRp結合的一個實際指征，且通常，將FcRp結合特性摻入到抗體或Ig融合蛋白質中是意在提高抗體的藥物動力學特性。也可方便地檢查FcRp-Fc復合體的三維結構以確定特定的雜合同種型抗體或Ig融合蛋白質是否可能與FcRp互相作用(Martin，W.L.，等以2.8A檢測的FcRn/異源二聚體Fc復合體的晶體結構pH-依賴性結合的機制Mol.Cell 7 pp.867；structure ID 1 I1A于http//www.rcsb.org/pdb/)。
根據本發(fā)明的此方面，構建Fc-X形式的蛋白質是特別有用的，其中Fc區(qū)含來自IgA1的鉸鏈區(qū)，且其所含CH2和CH3區(qū)包含IgG2中介導FcRp結合的那些元件以及與其他IgG相比具有減少的效應子功能的那些CH2元件。
提高抗體或Ig融合蛋白質的效價根據本發(fā)明，構建高效價的、但又具有低效價抗體特有的效應子功能或其他特性的雜合同種型抗體或Ig融合蛋白質有時是有利的。IgA和IgM由于通過CH3區(qū)內的鏈間二硫鍵寡聚化而具有高的效價。IgA和IgM在CH4的C末端附近的半胱氨酸到J鏈間也存在二硫鍵。IgA為二聚體而IgM為五聚體或六聚體，這樣IgA具有4個抗原結合位點而IgM具有10或12個抗原結合位點。
但是，IgM和IgA并不介導ADCC。為構建介導ADCC的多價抗體或Ig融合蛋白質，構建具有IgG的CH2結構域和IgM或IgA的CH3和CH4結構域的蛋白質是有利的。通常，優(yōu)選地應用IgM的CH3和CH4結構域，因為產生的雜合同種型蛋白質的效價高于相應的含IgA的雜合同種型蛋白質的效價。
以下的申請闡明了具有增高效價的雜合同種型蛋白質的應用。許多腫瘤細胞在其細胞表面過表達EGF受體。EGF也在許多正常細胞的表面表達，因此正常細胞和腫瘤細胞間EGF受體的表達僅在數量上有區(qū)別。根據本發(fā)明的一個實施方案，有用的IgG-IgM雜合同種型抗體包含與人EGF受體具有弱相互作用的V區(qū)域。對V區(qū)親合力的選擇使得融合蛋白質不能有效的與正常細胞上的EGF-R作用，但由于親合力效應卻可與腫瘤細胞上過表達的EGF受體相互作用。應用IgG的CH2結構域，例如IgG1的CH2結構域可介導抗腫瘤細胞的ADCC。
為提高特異的殺腫瘤細胞效應，將抗EGF-R的IgG-IgM雜合同種型蛋白質與具有抗腫瘤活性的蛋白質進行融合是有利的，所述具有抗腫瘤活性的蛋白質如細胞因子。例如，可應用IL-2。備選地，將放射性原子綴合到雜合同種型蛋白質上是有利的，這樣雜合同種型蛋白質在腫瘤區(qū)的聚積將促成對腫瘤的優(yōu)先輻射。例如，可將釔90綴合到IgG-IgM雜合同種型蛋白質上。將ADCC與IL-2活性或ADCC與放射性結合對殺腫瘤細胞是特別有利的。
在IgG-IgM融合蛋白質，例如以上所描述的抗腫瘤蛋白質中，應用IgG(優(yōu)選的為IgG1)鉸鏈區(qū)一般也是有利的。對于許多應用，來自IgG3的鉸鏈區(qū)為最次的IgG鉸鏈區(qū)，因為該鉸鏈區(qū)趨向于造成可變組裝；此外，IgG3鉸鏈易于發(fā)生蛋白水解(Baici A，等，Scand J Immunol.1241-50)。
前述的實例闡明了本發(fā)明此方面的一般原則即在靶細胞類型上的表達高于正常細胞上的表達的抗原更可能被具有高效價但相對低的單價親合力的抗體或Ig融合蛋白質有效靶向。
例如，在自體免疫性疾病中，某些免疫細胞如T細胞表達較高水平的細胞表面蛋白質，例如細胞因子受體。用高效價的針對此上調的表面蛋白質的IgG1、IgG2或IgG4-IgM抗體或Ig融合蛋白質攻擊此類免疫細胞是有利的。在此方法中，將最小限度地靶向細胞表面存在此蛋白質但此蛋白的量未被上調的細胞。例如，在攻擊自體免疫性疾病的過程中，有用的是，用于治療患者的IgG-IgM融合蛋白質中的V區(qū)指導對抗，例如IL-2受體、IL-12受體或任何的其他上調的受體。鉸鏈區(qū)和CH2結構域優(yōu)選地來自IgG1、IgG2或IgG4，且CH3和CH4區(qū)優(yōu)選地來自IgM。為治療自體免疫性疾病，V區(qū)優(yōu)選與IL-2或IL-12受體弱結合。該治療具有殺傷一個亞類的T細胞而不是整個的T細胞庫的效應。
表達具有雜合同種型的抗體和Ig融合蛋白質的表達質粒的構建本發(fā)明也提供了編碼本發(fā)明的抗體和融合蛋白質的核酸。當編碼核酸也編碼分泌盒子時本發(fā)明可以得到最好的實施，所述盒子在轉錄和翻譯后產生信號肽。信號肽一般從成熟產物中切除。分泌的融合蛋白質可由培養(yǎng)基中收集而不需裂解宿主細胞，然后可測試其活性或按需要應用普通試劑進行純化。在一些情況中，某些融合配偶體的存在，例如細胞因子CNTF，允許在不存在分泌盒子的條件下分泌Ig融合蛋白質。
本領域內的普通技術人員可應用帶有內含子的DNA進行重組DNA的構建，因為天然存在的內含子將編碼鉸鏈的DNA與編碼CH1和CH2結構域的DNA分隔開來?？蓱脙群觾鹊南拗菩晕稽c。備選地，由于鉸鏈區(qū)的長度一般僅為約15-70個氨基酸，故可以構建出編碼整個鉸鏈區(qū)的合成DNA，例如應用寡核苷酸合成、PCR或它們的組合進行。然后可以應用標準重組DNA技術，將合成的編碼鉸鏈的區(qū)域放入編碼Ig融合蛋白質的表達質粒中。
本發(fā)明由以下非限定的實施例進行進一步的闡述。
實施例實施例1表達具有來自不同抗體同種型的鉸鏈區(qū)和CH2結構域的Fc-X融合蛋白質的質粒的構建。
表達HuFcγl-Leptin的質粒的構建已在PCT出版物WO00/040615A2中描述。
如下所述構建具有IgG2來源的Fc和C末端融合配偶體的融合體的表達質粒。
首先，獲得人γ2Fc的基因組序列。編碼人Fcγ2的基因組DNA通過PCR從分離自人PBMC的細胞DNA中獲得。正向引物的序列為5′CCTTAAGC GAG CGC AAA TGT TGT GTC GAG(SEQ ID NO8)，其中AflII限制性位點C TTA AG被導入到γ2鉸鏈編碼區(qū)GAG CGC AAA TGTTGT GTC GAG(SEQ ID NO9)的緊上游。反向引物的序列為5′CCTCGAG TCA TTT ACC CGGGGA CAG GGA G(SEQ ID NO10)，其中XhoI限制性位點CTCGAG被導入到緊接翻譯終止密碼(反密碼子TCA)之后。此外，反向引物也通過沉默突變(劃線的A到G替換)導入了SmaI位點CC CGGG。910 bp的PCR片段克隆到TOPO TA克隆載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，用于確認序列。
第二，將人γ2Fc放入表達載體。存在于編碼CH3上部區(qū)域的DNA序列CTG CCC CCA TCC CGG GAG GAG ATG ACC AAG(SEQ ID NO11)中的天然SmaI限制性位點通過沉默突變得以去除，此沉默突變通過重疊PCR技術導入(Daugherty，B.L.等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)192471-6，1991)。正向引物的序列為5′CTG CCC CCA TCACGG GAG GAGATG ACC AAG(SEQ ID NO12)，其中劃線處為C到A的替換；且反向引物的序列為5′GGT CAT CTC CTC CCGTGATGG GGG CAG GGTGTA C(SEQ ID NO13)，其中劃線處為G到T的替換。確認了序列后，產生的編碼Fcγ2的AflII、XhoI限制性片段在翻譯終止密碼子上游含有唯一的SmaI位點，且在終止密碼子的下游含有一個XhoI位點。然后編碼Fcγ2的AflII-SmaI片段用于替換pdCs-huFcγl-Leptin(PCT出版物WO00/040615A2)中編碼Fcγ1的相應限制性片段以產生pdCs-huFcγ2-Leptin。
第三，編碼Fcγ2鉸鏈的DNA由來自γ1的改變的鉸鏈替換。γ2鉸鏈區(qū)含有四個半胱氨酸二硫鍵。以下顯示的是含γ2鉸鏈外顯子的AflII-StuI片段。AflII位點(C TTA AG)位于編碼信號肽的DNA序列之后。谷氨酸(E)為γ2鉸鏈的第一個氨基酸殘基。小寫字母代表γ2鉸鏈外顯子之后的內含子序列。由于C甲基化存在于序列ccagg和反向鏈cctgg中，StuI限制性位點(aggcct)在大多數的大腸桿菌菌株中由DCM甲基化酶進行了C-甲基化；當甲基化時，該位點不能被StuI切割。
E R K C C V E C P P C P(SEQ ID NO14)C TTA AGC GAG CGC AAA TGT TGT GTC GAG TGC CCA CCG TGC CCA Ggtaagccagcccaggcct(SEQ ID NO15)pdCs-huFcγ2-Leptin中含γ2鉸鏈外顯子的AflII-StuI片段被來自pdCs-huFcγ1-Leptin的含γ1鉸鏈外顯子的相應AflII-StuI片段替換，此相應片段的序列如下所示E P K SSD K T H T C P P C P(SEQ ID NO16)C TTA AGC GAG CCC AAA TCTTCTGAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA GGtaagccagcccaggcct(SEQ ID NO17)pdCs-huFcγ1中的γ1鉸鏈序列含有Cys到Ser突變(劃線處)，這就消除了與IgG1輕鏈形成二硫鍵的Cys殘基(Lo等，(1998)蛋白質工程(Protein Engineering)11495-500)。由于在γ1和γ2外顯子內的StuI位點均發(fā)生C-甲基化且StuI限制性內切酶對甲基化敏感，故在用StuI酶消化之前，從DCM陰性的細菌菌株中分離這兩種質粒。產生的具有來自pdCs-huFcγ1的鉸鏈區(qū)的pdCs-huFcγ2-Leptin命名為pdCs-huFcγ2h-Leptin(γ2h具有改變的鉸鏈的γ2)。
實施例2表征huFcγ2-leptin和huFcγ2h-leptin免疫融合體的寡聚化狀態(tài)。
我們對應用具γ1、γ2和γ2h同種型的表達載體pdCs-huFc-huLeptin從NS/0細胞中表達蛋白質進行了評估。并評估了不同形式的huFc-hu-Leptin的物理狀態(tài)，其中HuFc部分源自γ1、γ2和γ2h同種型。
根據標準方法，用如上和如在Lo等的描述中所產生的DNA構建體轉染NS/0細胞并產生穩(wěn)定的表達細胞系。
在此實施例和以下的實施例中，穩(wěn)定的轉染子按以下的方法產生。質粒DNA通過電穿孔導入鼠骨髓瘤NS/0細胞。NS/0細胞生長在Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基中，此培養(yǎng)基補充了10％的胎牛血清、2mM谷氨酰胺和青霉素/鏈霉素。約5×106個細胞用PBS洗滌一次并重懸于0.5ml的PBS中。10μg的線性化質粒DNA與細胞在Gene電擊杯(0.4cm的電極間隙，BioRad)中冰上孵育10min。應用Gene電穿孔儀(BioRad，Hercules，CA)進行電穿孔，設置條件為0.25V和500μF。細胞在冰上復蘇10min后重懸在生長培養(yǎng)質中并接種兩個96孔板。在100nM氨甲蝶呤(MTX)存在下通過生長來篩選穩(wěn)定轉染的克隆，所述氨甲喋呤在轉染后兩天加入。每3天飼喂細胞共兩到三次或更多次，且抗MTX的克隆在兩到三周內形成。來自克隆的上清液用抗Fc ELISA試驗測定以鑒定高產克隆。分離高產克隆并在含100nM MTX的生長培養(yǎng)基中繁殖。
應用抗huFc抗體(辣根過氧化物酶連接的山羊抗-huIgG、Fcγ1或Fcγ2，來自Jackson ImmunoResearch)通過抗huFc ELISA測定上清中HuFc-hu-Leptin的濃度。γ1和γ2h構建體在瞬時和穩(wěn)定轉染中都以高水平表達，而γ2構建體上清中檢測到的表達水平相對較低。用編碼huFcγ2-huLeptin和huFcγ2h-huLeptin的等價表達載體進行的瞬時轉染中，huFcγ2h-huLeptin的產量高8倍。
對于純化，使組織培養(yǎng)上清中的融合蛋白質結合到蛋白質ASepharose上，然后在磷酸鈉緩沖液(100mM NaH2PO4，pH3，和150mMNaCl)中洗脫。然后洗脫物用0.1體積的2M Tris-鹽酸pH8)中和，并用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和HPLC-大小排阻層析(SEC)評估。
融合蛋白質在非還原條件下用SDS-PAGE檢測。通過考馬斯染色觀察到的蛋白質條帶顯示HuFcγ1-huLeptin的表觀分子量為96kD，這表明其為二價單體。SDS-PAGE分析顯示多數huFcγ2-huLeptin融合蛋白質為較高分子量形式，遷移時顯示為梯形條帶，表觀分子量比Fc-Leptin的分子量高得多。相反，huFcγ2h-huLeptin主要為單一種類，遷移到96kD處。
huFeγ2h構建體的大小排阻層析(SEC)分析與SDS-PAGE的結果相關聯，且顯示出huFcγ2h-leptin和huFcγ1-leptin均有約83％為單體，而類似的huFcγ2-huLeptin融合蛋白質有約55％為單體。
用固定的J774細胞(所述細胞富含FcγR類受體)進行的研究表明，僅huFcγ1-huLeptin融合蛋白質顯示有Fc結合。此外，還應用了BAF-3細胞，該細胞經過轉染可表達leptin受體，這樣leptin可刺激這些細胞的增殖(Gainsford，T.，等.PNAS9314564-14568)。對BAF3/leptin受體細胞的研究表明huFcγ1-huLeptin、huFcγ2-huLeptin和huFcγ2h-huLeptin具有等價的leptin生物活性。
我們還鑒定了表達huFcγ2-huLeptin和huFcγ2h-huLeptin的穩(wěn)定哺乳動物細胞克隆。在基本相同的條件下轉染細胞且克隆了相同數目的穩(wěn)定轉染的細胞并測試了huFcγ2-huLeptin和huFcγ2h-huLeptin的產生。對于huFcγ2h-huLeptin的最佳表達克隆，其huFc-huLeptin產量約比huFcγ2-huLeptin的最佳表達克隆的產量多5倍。
實施例3具有來自不同抗體同種型的鉸鏈區(qū)和CH2區(qū)的X-Fc融合蛋白質的表達質粒的構建。
編碼胰高血糖素樣肽1(GLP-1)第7到37位氨基酸殘基(SEQ ID NO19)的合成DNA序列(SEQ ID NO18)如以下公開。
H A E G T F T S D V S S Y L E GC TTA AGC CAT GCT GAA GGG ACC TTT ACT AGT GAT GTA AGT TCT TAT TTG GAA GGCQ A A K E F I A W L V K G R GCAA GCT GCC AAG GAA TTC ATT GCT TGG CTG GTG AAA GGC CGA GGA GGA TCC TTAAGC編碼GLP-1肽的DNA之前為C TTA AGC，在此處應用AflII限制性位點將此DNA片段與編碼信號肽序列的DNA片段(Lo等.蛋白質工程(Protein Engineering))進行連接。在3′末端，編碼GLP-1的DNA之后為BamHI限制性位點(GGA TCC，其編碼氨基酸殘基G和S)和AflII限制性位點(所述位點用于連接具有翻譯終止密碼子的編碼Fcγ2(或Fcγ2h)的AflII-XhoI限制性片段(參見實施例1))。
實施例4GLP1-huFcγ2和GLP1-huFcγ2h免疫融合體的寡聚化狀態(tài)表征。
由實施例3產生的載體pdCs GLP-1 huFcγ1、pdCs GLP-1 huFcγ2和pdCs GLP-1 huFcγ2h用于瞬時和穩(wěn)定轉染哺乳動物細胞，以表達GLP-1(7-37)huFcγ1、GLP-1(7-37)huFcγ2和GLP-1(7-37)huFcγ2h。
在用蛋白質A Sepharose純化后，對每一GLP-1 huFc融合蛋白質的聚集狀態(tài)和總蛋白質表達通過SDS-PAGE和HPLC-SEC進行評估，所述評估應用在實施例2中描述的一般方法進行。蛋白質條帶用考馬斯染色顯示。GLP-1 huFcγ2和GLP-1 huFcγ2h的SDS-PAGE表觀分子量約為60kD。上清中的GLP-1 huFc變體的濃度由抗huFc ELISA測定。用編碼GLP1-huFcγ2和GLP1-huFcγ2h的等價表達載體的瞬時轉染中，GLP1-huFcγ2h的產量約提高1.5倍。
總細胞裂解物的SDS-PAGE分析表明，約一半的GLP1-huFcγ2融合蛋白質具有不正確的二硫鍵，這由存在多條表觀分子量為100到200KD的高分子量遷移形式所證明。相反，基本上所有可檢測的GLP1-huFcγ2h融合蛋白質都以約60kD的表觀分子量進行移動。當樣本在進行SDS-PAGE前被還原，GLP1-huFcγ2和GLP1-huFcγ2h蛋白質以基本相同的約34KD的表觀分子量移動。
γ1、γ2和γ2h融合蛋白質的HPLC-SEC比較分析表明，修飾的γ2h融合蛋白質的單體形式顯著多于其他融合蛋白質。如由單峰所顯示，修飾的GLP1-huFcγ2h融合蛋白質有84％為二價單體，而GLP1-huFcγ1和GLP1-huFcγ2融合蛋白質具有分別對應于約42％和33％的二價單體的多峰。
由此證實，具有IgG1的鉸鏈和IgG2的CH2和CH3結構域的GLP-1-Fc融合蛋白質的組裝特性令人驚奇地優(yōu)于具有來自IgG1或IgG2的完整Fc區(qū)域的GLP1-Fc融合蛋白質。
實施例5含IgG2的CH1、CH2和CH3結構域和IgG1鉸鏈的特異針對病變細胞的完整抗體的構建。
應用分離自人PBMC的細胞DNA通過PCR獲得編碼免疫球蛋白γ2恒定區(qū)(CH1、鉸鏈、CH2和CH3)的基因組DNA。正向引物的序列為5′CAAGCTTTCTGGGGCGAGC(SEQ ID NO20)，其中HindIII限制性位點AAGCTT導入到距CH1外顯子上游約220bp處的內含子序列內。反向引物序列為5′CCTCGAG TCA TTT ACC CGGGGA CAG GGA G(SEQ ID NO21)，其中XhoI限制性位點CTCGAG導入到緊接翻譯終止密碼子(反密碼TCA)之后，且通過沉默突變產生SmaI CCCGGG，如已在實施例1中描述的。編碼CH3上部區(qū)域的DNA序列中的天然SmaI限制性位點也通過沉默突變進行消除，所述突變通過重疊PCR引入，如在實施例1中所描述的。本領域內的技術人員將認識到，通過利用實施例1中獲得的編碼Fcγ2的限制性片段，可容易地構建出編碼CH1、鉸鏈、CH2和CH3區(qū)及含有單一SmaI限制性位點的約1810堿基對(bp)的HindIII-XhoI限制性片段。進行序列確認之后，用編碼γ2恒定區(qū)的HindIII-XhoI片段置換pdHL7-huKSγ1-IL2中編碼γ2恒定區(qū)的HindIII-XhoI片段，以產生pdHL7-huKSγ2抗體。
huKSγ2h抗體的表達載體的構建如下所示。質粒pdCs-huFcγ2h-Leptin用作PCR模板以產生～130bp的PstI-PvuII限制性片段，所述限制性片段僅編碼修飾的γ1鉸鏈區(qū)，該區(qū)中半胱氨酸改變?yōu)榻z氨酸。正向引物的序列為5′CTGCAGAGCCCAAATCTTC(SEQ ID NO22)，其中在γ1鉸鏈外顯子的起始處(具有如上所述的C到S的突變)恢復了天然的PstI(CTGCAG)限制性位點。反向引物的序列為5′CAGCTGGGGCCTGTCCCTG(SEQ ID NO23)，其與鉸鏈和CH2外顯子間的內含子中的Pvu II位點(CAGCTG)對應。確證了序列后，用該～130 bpPstI-PvuII限制性片段替換pdHL7-huKSγ2抗體中的相應片段以產生pdHL7-huKSγ2h抗體。
實施例6非還原狀態(tài)下抗病變細胞的γ2抗體和相應γ2h抗體的表征。
帶有IgGγ1、γ2和γ2h同種型的KS抗體的載體pdHL7用Lipofectamine Plus(Life Technologies，Gaithersburg，MD)通過脂轉染導入哺乳動物細胞以用于瞬時轉染，所述操作根據供應商的實驗指南進行。穩(wěn)定轉染子的產生如在實施例2中的描述。
條件培養(yǎng)基(10％血清)中的KS抗體用蛋白質A Sepharose(Repligen，Cambridge，MA)捕獲，并在用SDS-PAGE表征前通過在含或不含2-巰基乙醇的蛋白質上樣緩沖液中煮沸而得以洗脫。考馬斯染色可見非還原的KSγ2抗體以幾種形式遷移，分子量約為150kD。相反，KSγ2h抗體以一條主要帶遷移，表觀分子量為150kD。當KSγ2抗體和KSγ2h抗體在SDS-PAGE前用巰基乙醇還原時，對于KSγ2抗體和KSγ2h抗體可觀察到對應于重鏈和輕鏈條帶的相同條帶圖形。
不被理論所束縛，這些觀察結果暗示KSγ2所表現的多個不同遷移種類是二硫鍵接合模式變化的結果。
表達KSγ2抗體和KSγ2h抗體的穩(wěn)定哺乳動物細胞克隆也得以鑒定。在基本相同的條件下進行細胞轉染且克隆了類似數目的穩(wěn)定轉染細胞并測試huFc KSγ2抗體和KSγ2h抗體的產量。四株最佳表達KSγ2h抗體的克隆在每ml組織培養(yǎng)上清中約產生114、98、85和49毫克的抗體，而在相同的條件下，四株最佳表達huFc KSγ2抗體的克隆在每ml組織培養(yǎng)上清中約產生36、34、15和13毫克的抗體。
實施例7包括完整抗體的融合蛋白質的構建，所述完整抗體含IgG2的CH1、CH2和CH3結構域和IgG1鉸鏈。
在此實施例中，測試了抗體融合蛋白質的有用性，所述融合蛋白質中的抗體部分具有雜合同種型。
用分離自pdHL7-huKS-IL2的SmaI-XhoI限制性片段替換pdHL7-huKSγ2抗體中的SmaI-XhoI限制性片段，以構建出用于huKSγ2-IL2的表達載體pdHL7-huKSγ2-IL2，所述pdHL7-huKSγ2抗體中的SmaI-XhoI片段含序列GGGTAAATGA(SEQ ID NO24)，隨后為XhoI粘性末端。pdHL7-huKS-IL2中的SmaI-XhoI限制性片段含有序列GGGTAAA及其后緊隨的編碼成熟IL2的DNA序列，包括翻譯終止密碼子。產生的表達載體pdHL7-huKSγ2-IL2用于轉染細胞以表達蛋白質。
同樣，用前一自然段所描述的分離自pdHL7-huKS-IL2的SmaI-XhoI限制性片段替換pdHL7-huKSγ2h抗體中的SmaI-XhoI限制性片段，以構建出用于huKSγ2h-IL2的表達載體pdHL7-huKSγ2h-IL2，所述pdHL7-huKSγ2h抗體中的SmaI-XhoI片段含序列GGGTAAATGA(SEQID NO24)，隨后為XhoI粘性末端。產生的表達載體pdHL7-huKSγ2h-IL2用于轉染細胞以表達蛋白質。
實施例8非還原狀態(tài)的γ2-抗體融合蛋白質和相應γ2h抗體融合蛋白質的表征。
編碼KSγ2-IL2和KSγ2h-IL2的質粒用Lipofectamine Plus(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)通過脂轉染導入哺乳動物細胞以實現瞬時轉染，所述操作根據供應商的實驗指南進行。
為獲得穩(wěn)定轉染的克隆，質粒DNA通過電穿孔導入鼠骨髓瘤NS/0細胞，如在實施例2中所描述的。
具有γ2和γ2h同種型的KS-IL2融合蛋白質通過SDS-PAGE進行表征，如在實施例6中所描述的。條件培養(yǎng)基(10％血清)中的抗體融合蛋白質被捕獲在蛋白質A Sepharose(Repligen，Cambridge，MA)上，并在用SDS-PAGE表征前通過在含或不含2-巰基乙醇的蛋白質上樣緩沖液中煮沸而得以洗脫?？捡R斯染色可見非還原的KSγ2-IL2以幾個種類遷移，分子量大小約為180kD。相反，KSγ2h-IL2以一條主要帶遷移，表觀分子量為約180kD。當KSγ2-IL2和KSγ2h-IL2在SDS-PAGE前用巰基乙醇還原時，對于KSγ2-IL2和KSγ2h-IL2觀察到對應于重鏈-IL2和輕鏈的相同條帶圖形。
不被理論所束縛，這些觀察結果暗示KSγ2-IL2所表現出的多個不同遷移種類是二硫鍵接合模式變化的結果。
對修飾的γ2h免疫細胞因子進行了動物試驗，且在動物腫瘤模型中與起始的基于IgGγ1的免疫細胞因子比較而言，修飾的γ2h免疫細胞因子具有延長的半衰期和更好的功效。
我們還鑒定出表達KSγ2-IL2和KSγ2h-IL2的穩(wěn)定哺乳動物細胞克隆。在基本相同的條件下轉染細胞且克隆了類似數目的穩(wěn)定轉染細胞，并測試KSγ2-IL2和KSγ2h-IL2的產量。四株最佳表達KSγ2h-IL2的克隆在每ml組織培養(yǎng)上清中約產生52、37、31和30毫克的融合蛋白質，而在相同的條件下四株最佳表達KSγ2-IL2的克隆在每ml組織培養(yǎng)上清中約產生31、27、27和17毫克的融合蛋白質。
實施例9表達抗體融合蛋白質的質粒的構建，所融合蛋白質具有雜合同種型和影響融合蛋白質活性的第二突變HuKSγ2-Ala-IL2對huKSγ2h-Ala-IL2用分離自pdHL7-huKSγ1-Ala-IL2的相應SmaI-XhoI限制性片段分別替換pdHL7-huKSγ2抗體和pdHL7-huKSγ2h抗體中的SmaI-XhoI限制性片段，以構建pdHL7-huKSγ2-Ala-IL2和pdHL7-huKSγ2h-Ala-IL2表達載體(如上所描述)，所述pdHL7-huKSγ2抗體和pdHL7-huKSγ2h抗體中的SmaI-XhoI片段含序列GGGTAAATGA(SEQID NO24)，隨后為XhoI粘性末端。pdHL7-huKSγl-Ala-IL2的SmaI-XhoI片段含有序列GGGTGCA，其后緊隨編碼成熟IL2的DNA序列，所述DNA序列包含翻譯終止密碼子。在融合蛋白質的連接處，GCA編碼賴氨酸到丙氨酸的替換。產生的載體用于轉染細胞以生產huKSγ2-Ala-IL2和huKSγ2h-Ala-IL2。
實施例10非還原狀態(tài)下攜帶影響融合蛋白質功能的第二突變的γ2-抗體融合蛋白質和相應的γ2h抗體融合蛋白質的表征。
編碼KSγ2-Ala-IL2和KSγ2h-Ala-IL2的質粒用LipofectaminePlus(Life Technologies，Gaithersburg，MD)通過脂轉染導入哺乳動物細胞以實現瞬時轉染，所述操作根據供應商的實驗指南進行。
我們還鑒定出表達KSγ2-Ala-IL2和KSγ2h-Ala-IL2的穩(wěn)定哺乳細胞克隆，如在實施例2中描述。在基本相同的條件下進行細胞轉染且克隆了類似數目的穩(wěn)定轉染細胞并測試KSγ2-Ala-IL2和KSγ2h-Ala-IL2的產量。三株最佳表達KSγ2h-Ala-IL2的克隆在每ml組織培養(yǎng)上清中約產生39、38和29毫克的融合蛋白質，而在相同條件下三株最佳表達KSγ2-Ala-IL2的克隆在每ml組織培養(yǎng)上清中約產生22、17和6毫克的融合蛋白質。具有γ2和γ2h同種型的KS-Ala-IL2融合蛋白質通過SDS-PAGE進行表征，如在實施例6中的描述。條件培養(yǎng)基(10％血清)中的KS-Ala-IL2融合蛋白質被捕獲在蛋白質A Sepharose(Repligen，Cambridge，MA)上，并在SDS-PAGE實驗前通過在含或不含2-巰基乙醇的蛋白質上樣緩沖液中煮沸而得以洗脫?？捡R斯染色可見非還原的KSγ2-Ala-IL2以幾個種類遷移。相反，KSγ2h-Ala-IL2以一條主要帶遷移。當KSγ2-Ala-IL2和KSγ2h-Ala-IL2在SDS-PAGE前用巰基乙醇還原時，對于KSγ2Ala-IL2和KSγ2h-Ala-IL2觀察到對應于重鏈-IL2和輕鏈的相同條帶圖形。
不被理論所束縛，這些觀察結果暗示KSγ2-Ala-IL2所出現的不同遷移種類是由于二硫鍵接合模式變化的結果。
實施例11具有源自不同同種型的恒定區(qū)的抗體融合蛋白質的表達。
在一些情況中，可能還需要構建這樣的Ig融合蛋白質，其中除了鉸鏈區(qū)，不同的恒定區(qū)也源自不同的重鏈同種型。為檢測此類分子的特性，進行了以下實驗。
huKS(γ1CH1-H)(γ2CH2-CH3)-Ala-IL2蛋白質為抗體-IL2融合蛋白質，具有含KS VH、來自IgG1的CH1和鉸鏈區(qū)以及來自IgG2的CH2-CH3區(qū)的IgG重鏈(在融合連接處具有賴氨酸到丙氨酸的替換，如以上所描述)及隨后的IL-2，該蛋白質按如下進行表達。通過用來自pdHL7-KS-IL2的含CH1和鉸鏈區(qū)的相應HindIII-AflIII限制性片段替換pdHL7-KSγ2-Ala-IL中的HindIII-AflIII限制性片段構建出表達載體pdHL7-huKS(γ1CH1-H)(γ2CH2-CH3)-Ala-IL2。將該表達載體轉染導入培養(yǎng)的哺乳動物細胞，如上所述，以產生具有雜合同種型的抗體融合蛋白質。
HuKS(γ1CH1-H)(γ2CH2-CH3)(Ala)-IL2雜合體和HuKSγ2(Ala)-IL2抗體-細胞因子融合蛋白質通過非還原SDS-PAGE進行表征，如在實施例6中所描述的。HuKS(γ1CH1-H)(γ2CH2-CH3)(Ala)-IL2雜合同種型融合蛋白質遷移為一主要條帶，分子量約為180kD。相反，HuKSγ2(Ala)-IL2抗體-細胞因子融合蛋白質在180 kD大小范圍內以多條帶遷移。
當HuKS(γ1CH1-H)(γ2CH2-CH3)(Ala)-IL2雜合體和HuKS(γ2)(Ala)-IL2抗體-細胞因子融合蛋白質通過還原SDS-PAGE進行表征時，兩種蛋白質給出相同的帶形，與輕鏈和重鏈-IL2融合多肽對應。
不被理論所束縛，看起來HuKS(γ2)(Ala)-IL2抗體-細胞因子融合蛋白質存在至少兩種不同的異構體構型，其中差異是由于二硫鍵結合模式的不同而引起。
實施例12具有非蛋白質抗原特異性和多亞單位融合配偶體的雜合同種型抗體融合蛋白質的表達。
14.18抗體結合糖脂抗原GD2。白介素-12為異源二聚體細胞因子，包括p35和p40亞單位，它們通過二硫鍵共價結合。
如以上所描述，雜合同種型，例如IgGI/IgG2雜合體的應用導致與天然同種型如IgG2相比組裝增強。組裝增強可由表達水平提高證實。
在一個例子中，構建出14.18(γ2)-Ala-IL12和14.18(γ2h)-Ala-IL12表達質粒并在相同的條件下平行瞬時轉染導入細胞，如在以上和Gillies等(W009929732)中所描述的。應用了人IL-12。用14.18(γ2h)-Ala-IL12表達質粒轉染的培養(yǎng)物比用14.18(γ2)-Ala-IL12轉染的培養(yǎng)物在組織培養(yǎng)上清中蛋白質的水平約高40％。
14.18(γ2)-Ala-IL12和14.18(γ2h)-Ala-IL12表達質粒也穩(wěn)定轉染導入細胞，如以上所描述，且對每一轉染的四株最佳表達克隆進行了進一步的研究。對于14.18(γ2h)-Ala-IL12，四株最佳表達克隆的平均值比源自14.18(γ2)-Ala-IL12表達質粒的四株最佳表達克隆約高45％。
在第二個例子中，構建了14.18(γ2)-IL12和14.18(γ2h)-IL12表達質粒并在相同的條件下平行瞬時轉染導入細胞，如以上所描述的。應用了鼠IL-12。用14.18(γ2h)-IL12表達質粒轉染的培養(yǎng)物比用14.18(γ2)-IL12轉染的培養(yǎng)物在組織培養(yǎng)上清中蛋白質的水平約高40％。
應用鼠IL-12的14.18(γ2)-IL12和14.18(γ2h)-IL12表達質粒也通過穩(wěn)定轉染導入細胞，如以上所描述，且對每一轉染的四株最佳表達克隆進行了進一步的研究。對于14.18(γ2h)-IL12，四株最佳表達克隆的平均值比源自14.18(γ2)-IL12表達質粒的四株最佳表達克隆約高35％。
這些結果表明在融合蛋白質中應用雜合同種型導致表達增強，甚至應用與先前實施例中不同的抗體和不同的非Ig部分也是如此。在此實施例中，將IL-12用作非Ig部分預期可使Ig融合蛋白質的組裝明顯變得復雜，因為IL-12為異源二聚體。然而，雜合同種型的應用具有有利的效應。
實施例13應用來自IgA的鉸鏈區(qū)的雜合同種型抗體融合蛋白質的表達。
為構建具有增強的蛋白酶抗性的Ig融合蛋白質，生產了IgA/IgG融合蛋白質。
例如，構建Fc-X融合蛋白質，其含人IgA1的鉸鏈區(qū)和IgG2的CH2和CH3區(qū)。
以下所示為構建產生Fc-X融合蛋白質的表達載體的一個例子，該蛋白質包含來自人IgA1的鉸鏈區(qū)和IgG2的CH2和CH3區(qū)。實施例1中的質粒pdCs-huFcγ2-Leptin用作載體。
pdCs-huFcγ2-Leptin的含γ2鉸鏈區(qū)外顯子的AflII-StuI片段被相應的含IgA1鉸鏈區(qū)外顯子的AflII-StuI片段(SEQ ID NO25，顯示如下)替換(AflII) P S T P P T P S P S T PCTTAAG T CCC TCA ACT CCA CCT ACC CCA TCT CCC TCA ACT CCAP T P S P S C C H (SEQ ID NO26)(StuI)CCT ACC CCA TCT CCC TCA TGC TGC CAC Ggtaagccagcccaggcct具體地，合成了以下寡核苷酸上鏈5′-TTAAGTCCCTCAACTCCACCTACCCCATCTCCCTCAACTCCACCTACCCCATCTCCCTCATGCTGCCACGGTAAGCCAGCCCAGG-3′(SEQ ID NO27)下鏈5′-CCTGGGCTGGCTTACCGTGGCAGCATGAGGGAGATGGGGTAGGTGGAGTTGAGGGAGATGGGGTAGGTGGAGTTGAGGGAC-3′ (SEQ ID NO28)
將這些寡核苷酸退火，并用于替換pdCs-huFcγ2-Leptin中的相應片段。
由于γ2外顯子中StuI位點存在C-甲基化且StuI限制性內切酶對甲基化敏感，因此從DCM陰性細菌菌株分離質粒后用StuI酶消化。產生的具有IgA1鉸鏈區(qū)的pdCs-huFcγ2-Leptin命名為pdCs-huFcα1/γ2-Leptin。
將質粒pdCs-huFcα1/γ2-Leptin轉染導入真核細胞，且α1(鉸鏈)-γ2(CH2，CH3)-leptin形式的Fc-X蛋白質將以分泌蛋白質形式得以表達。例如，利用實施例2中的細胞和方法。對產生的α1-γ2-leptin蛋白質進行純化、表征，發(fā)現其具有l(wèi)eptin活性且在鉸鏈區(qū)對蛋白酶切割相對不敏感。
實施例14應用IgG和多價免疫球蛋白的組分的雜合同種型抗體融合蛋白質的表達。
為構建具有IgG(如IgG1或IgG3)效應子功能且效價提高的抗體融合蛋白質，可用IgG的CH1、鉸鏈和CH2區(qū)以及IgA或IgM的CH3和CH4區(qū)構建雜合同種型Ig融合蛋白質。圖4顯示了IgG-IgM雜合同種型融合抗體的結構。可方便地將非Ig部分融合到IgA或IgM的CH4結構域的C末端。
也可方便地在最C末端的半胱氨酸前截短IgA或IgM重鏈或突變該半胱氨酸，特別是在IgG/IgA或IgG/IgM雜合同種型融合蛋白質在缺乏J鏈的情況下進行表達時。該C末端半胱氨酸的正常功能是與J鏈形成二硫鍵。通常需要在缺乏共表達J鏈的條件下表達IgG/IgA或IgG/IgM雜合同種型融合蛋白質，特別是當將非Ig部分融合到重鏈的C末端上時。
例如，IgG-IgM雜合同種型融合蛋白質可按如下所示構建。質粒pdHL7-huKSγ1-IL2表達的抗體具有可結合上皮細胞粘附分子的可變區(qū)和人IgG1的恒定區(qū)。該質粒在IgG1 CH2和CH3編碼序列間的內含子內含有單一的Ngo M IV位點，并在IgG1 CH3和IL-2部分的編碼序列間的連接處含有單一的XmaI位點。編碼人IgM CH3和CH4序列的DNA片段通過PCR擴增從人類基因組DNA中產生，所述擴增應用以下的引物5’-GCA GCCGGC CCTGAGCCTTGGCTTCCCAGAGCG-3’(SEQ ID NO29)；和5’-GCT CCCGGGTCAGTAGCAGGTGCCAGCTGTGTCG-3’(SEQ ID NO30)備選地，可應用以下的引物；這些引物的特征在于在IgM部分內最靠C末端的半胱氨酸被突變?yōu)榻z氨酸。
5’-GCA GCCGGC CCTGAGCCTTGGCTTCCCAGAGCG-3’；(SEQ ID NO31)和5’-GCT CCCGGGTCAGTAGCTGGTGCCAGCTGTGTCG-3’(SEQ ID NO32)；產生的DNA片段用Ngo M IV和XmaI切割，然后直接或間接連入已經用Ngo M IV和XmaI切割的pdHL7-huKSγ1-IL2中。例如，可以將編碼IgM CH3和CH4結構域的PCR片段首先亞克隆到載體，如TA克隆載體(Invitrogen，Carlsbad CA)中，確認插入的序列，然后用Ngo M IV和XmaI將插入物移出并連入pdHL7-huKSγ1-IL2。產生的雜合同種型重鏈的氨基酸序列融合到人IL-2上，見SEQ ID No33中顯示。劃線處為融合蛋白質的IgM部分。由于人IgM重鏈中天然存在多態(tài)性，也可能產生功能類似的密切相關序列。
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY(SEQ ID NO33)
許多備選的DNA構建策略也是可能的。例如，編碼IgM CH3和CH4結構域的DNA序列可從表達IgM的細胞系或細胞群中通過RT-PCR產生。3′PCR引物可與如上所示的相同，但5′引物在Ngo M IV位點和IgM CH3編碼序列開頭之間摻入一個人工5′剪切位點。
然后用產生的質粒pdHL7-huKSγ1/μ-IL2轉染真核細胞，產生的蛋白質從細胞中表達和分泌。例如，應用在先前的實施例中描述的細胞和方法。測試純化的蛋白質，例如通過電鏡或通過大小排阻層析，可發(fā)現其具有多聚體結構。對純化的蛋白質進行進一步的研究，例如通過肽作圖，可發(fā)現序列…ASICEDD…(SEQ ID NO34)中的半胱氨酸與其他IgG/IgM雜合同種型亞單位形成鏈間二硫鍵。此連接的一個實例在圖4中說明。除了圖4中的五聚體結構，IgG/IgM雜合同種型蛋白質的最終形式可為六聚體或一些其他類型的多聚體結構。
可發(fā)現產生的IgG/IgM雜合同種型融合蛋白質結合Fcγ受體。例如，融合蛋白質將以和人IgG競爭的方式結合J774細胞。
實施例15應用IgG1和IgG4的組分的雜合同種型抗體的表達。
實施例15-17中的實驗目的部分是為了證明雜合同種型抗體在提高主要由IgG4組成的分子的組裝中的效用。通常，一般優(yōu)選形式的IgG分子為H2L2形式，具有兩條重鏈和兩條輕鏈。但是，相當大部分的IgG4抗體合成為HL″半分子″，具有一條重鏈和一條輕鏈。Angal等(1993；Molec.Immunol.30105)描述了絲氨酸到脯氨酸的替換，此替換減少了存在于分泌的人IgG4中的″半分子″的數量。
此實施例比較了含相同V區(qū)的三種抗體的組裝特性，所述三種抗體為IgG4形式，具有IgG1鉸鏈和IgG4的CH1、CH2和CH3結構域的IgG形式，以及在鉸鏈區(qū)具有突變的IgG4形式(Angal等，出處同上)。
應用標準質粒構建技術，構建出名為pdHL7-KS-γ4的質粒。除了該質粒編碼IgG4重鏈恒定區(qū)而不是IgG2重鏈恒定區(qū)之外，該質粒與在實施例5中描述的質粒pdHL7-huKSγ2相同。
為構建pdHL7-KS-γ4h，將質粒pdHL7-KS-γ2h生長在dcm(-)大腸桿菌菌株中，分離質粒DNA，且分離編碼修飾的IgG1鉸鏈區(qū)的60bpPstI-StuI片段用于替換pdHL7-KS-γ4中的相應片段。
為實施比較，按如下構建出鉸鏈區(qū)具有突變的IgG4形式(Angal等，出處同上)。設計編碼γ4鉸鏈的寡核苷酸雙鏈體，其具有絲氨酸到脯氨酸的替換、5′PstI粘性末端和3′StuI鈍性末端，所述寡核苷酸雙鏈體如下PstI E S K Y G P P C PPC P(SEQ ID NO35)GAG TCC AAA TAT GGT CCC CCA TGC CCACCTTGC CCA GGTAAGACGT CTC AGG TTT ATA CCA GGGGGT ACG GGT GGA ACG GGT CCATTCStuICCAACCCAGG(SEQ ID NO36的互補鏈)GGTTGGGTCC(SEQ ID NO36)該寡核苷酸雙鏈體用于替換pdHL7-KS-γ4中相應的DNA片段以產生pdHL7-KS-γ4(S到P)。
根據如在Lo等，(1998；蛋白質工程(Protein Engineering)11495-500)中所描述的常規(guī)方法，將質粒pdHL7-KS-γ4、pdHL7-KS-γ4h和pdHL7-KS-γ4(S到P)轉染導入哺乳動物細胞。從轉染細胞的上清中純化由pdHL7-KS-γ4、pdHL7-KS-γ4h和pdHL7-KS-γ4(S到P)編碼的抗體蛋白質，并通過SDS凝膠電泳進行表征，其中對還原和非還原樣本進行比較。
通過檢測非還原分子，發(fā)現KS-γ4抗體群中存在約50％的HL″半分子″和50％的H2L2分子。相反，KS-γ4h抗體群和KS-γ4(S到P)抗體群幾乎全部以H2L2分子存在。HL半分子的比例在KS-γ4h抗體群和KS-γ4(S到P)抗體群中基本相同。當檢測還原分子時，KS-γ4、KS-γ4h和KS-γ4(S到P)所顯示的重鏈和輕鏈圖形無可區(qū)分的差異。
實施例16應用IgG1和IgG4的組分的雜合同種型抗體融合蛋白質的表達。
質粒pdHL7-KS-γ4-IL2在Gillies等(癌癥研究(CancerResearch) 592159)中描述。該質粒編碼的抗體融合蛋白質具有識別EpCAM抗原的V區(qū)且包含在C末端融合有白介素-2的IgG4重鏈。
通過與實施例15中所用類似的重組DNA方法，構建出質粒pdHL7-KS-γ4h-IL2和pdHL7-KS-γ4(S到P)-IL2。將質粒pdHL7-KS-γ4-IL2、pdHL7-KS-γ4h-IL2和pdHL7-KS-γ4(S到P)-IL2轉染導入哺乳動物細胞，并根據標準方法表達和純化相應蛋白質，所述方法例如在Lo等。(參考文獻)中描述的方法。從轉染細胞的上清中純化由pdHL7-KS-γ4-IL-2、pdHL7-KS-γ4h-IL-2和pdHL7-KS-γ4(S到P)-IL-2編碼的融合蛋白質，并通過SDS凝膠電泳進行表征，其中對還原和非還原樣本進行比較。
通過測試非還原分子，發(fā)現KS-γ4-IL-2融合蛋白質群體中存在約50％的HL″半分子″和50％的H2L2分子。相反KS-γ4h-IL-2融合蛋白質群體和KS-γ4(S到P)-IL-2融合蛋白質群體幾乎全部以H2L2分子存在。HL半分子的比例在KS-γ4h-IL-2融合蛋白質群體和KS-γ4(S到P)-IL-2融合蛋白質群體中大約相同。當檢測還原分子時，KS-γ4-IL-2、KS-γ4h-IL-2和KS-γ4(S到P)-IL-2所顯示的重鏈和輕鏈圖形無可區(qū)分的差異。
實施例17應用IgG1和IgG4的組分的雜合同種型Fc融合蛋白質的表達。
進行以下的步驟，以產生表達融合蛋白質的一組質粒，所述蛋白含鉸鏈區(qū)、CH2和CH3結構域和非Ig部分，其中的Ig部分源自IgG4和IgG1。
首先，應用與實施例1中所述類似的方法，通過將pdCs-huFcγ1中IgG1來源的DNA序列(Lo等，蛋白質工程(Protein Engineering)11495-500)替換為編碼IgG4相應部分的序列以產生編碼IgG4的Fc區(qū)域的表達載體。具體地，以下的寡核苷酸序列
E S K Y G P P C P S C(SEQ ID NO37)CTTA AGC GAG TCC AAA TAT GGT CCC CCA TGC CCA TCA TGC(SEQ ID NO38)在其5′端編碼一AflII位點，用作擴增編碼IgG4鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的DNA片段的5′引物。3′引物在其5′端含有一XhoI位點，與用于實施例1中擴增IgG2 Fc區(qū)的引物類似。產生的AflII-XhoI片段插入到XhoI+AflII切割的pdCs-huFcγ1中以生成pdCs-huFcγ4。
為促進編碼非IgG部分的核酸在Fcγ4的C末端插入，通過在pdCs-huFcγ4中于Fcγ4編碼區(qū)C末端附近導入以下的Leu到Pro的改變而產生一個SmaI位點，見如下S L G K STOP SPG K STOP(SEQ ID NO39) (SEQ ID NO40)TCT CTG GGT AAA TGA改變?yōu)? TCCCCG GGT AAA TGA.
(SEQ ID NO41) (SEQ ID NO42)應用標準定點誘變技術將SmaI位點導入pdCs-huFcγ4中。
名為pdCs-huFcγ4h的質粒編碼修飾的IgG1鉸鏈及隨后IgG4的CH2和CH3結構域，為生成pdCs-huFcγ4h質粒，將編碼IgG2的CH2和CH3結構域的pdCs-huFcγ2h(實施例1)中的StuI-XhoI片段，替換為pdCs-huFcγ4中的相應片段。在此構建中，每一親本質粒都來自dcm(-)大腸桿菌菌株。由于在編碼γ4的DNA中存在一額外的StuI位點，質粒pdCs-huFcγ4用XhoI作徹底消化并用StuI作部分消化，產生約300、500和800堿基對的片段。約800堿基對的片段用于替換pdCs-huFcγ2h中的相應片段。
應用PCR克隆IFNβcDNA，應用的有義引物為CCCGGGT ATGAGC TAC AAC TTG CTT GGA TTC(SEQ ID NO43)，其中的ATG為成熟蛋白質的N末端殘基且CCCGGG為引入的SmaI限制性位點，反向引物為CTCGAG TCA GTT TCG GAG GTA ACC TGT AAG(SEQ ID NO44)，其中TCA為翻譯終止密碼子的反密碼子且CTCGAG為引入的XhoI限制性位點。模板DNA為pLG117R(Taniguchi等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 775230-5233)且購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC編號31903)。對序列進行確認之后，克隆的SmaI-XhoI片段連入pdCs-huFcγ4表達載體的SmaI和XhoI位點間以產生pdCs-huFcγ4-IFNβ。類似的pdCs-huFcγ4h-IFNβ表達質粒也通過相似的方法構建。
為構建pdCs-huFcγ4(S到P)-IFNβ表達質粒，合成了編碼γ4鉸鏈的寡核苷酸雙鏈體，所述雙鏈體具有絲氨酸到脯氨酸的替換和5′ AflII粘端和3′StuI鈍端，見如下AflIIE S K Y G P P C PPC P(SEQ ID NO45)TTA AGC GAG TCC AAA TAT GGT CCC CCA TGC CCACCTTGC CCA GGTG CTC AGG TTT ATA CCA GGG GGT ACG GGT GGA ACG GGT CCAStuIAAGCCAACCCAGG(SEQ ID NO46)TTC GGTTGGGTCC(SEQ ID NO46的互補鏈)該DNA用于替換pdCs-Fc-g4-IFN β中的相應DNA片段以生成pdCs-huFcγ4(S到P)-IFNβ。
將質粒pdCs-huFcγ4-IFNβ、pdCs-huFcγ4h-IFNβ和pdCs-huFcγ4(S到P)-IFNβ分別轉染導入哺乳動物細胞。純化含Fc的表達蛋白質并用還原和非還原SDS凝膠電泳進行檢測。發(fā)現從哺乳動物細胞中表達的huFcγ4-IFNβ蛋白質中有相當大部分為單體半分子而不是二聚體的正?？贵w。但是，表達的huFcFγ4h-IFNβ和huFcγ4(S到P)-IFNβ融合蛋白質幾乎全部為正確組裝的二聚體。對于huFcγ4h-IFNβ和huFcγ4(S到P)-IFNβ融合蛋白質，單體的比例幾乎相同。
總之，實施例15、16和17的結果表明，對于主要由IgG4組成但具有修飾的IgG1鉸鏈的雜合同種型抗體和Ig融合蛋白質，其具有的組裝特性優(yōu)于完全源自IgG4的相應蛋白質。此外，實施例15-17的結果與其他實施例一道表明，雜合同種型蛋白質的組裝提高可以以幾個不同的方式顯現。例如，在一些情況中，雜合同種型抗體或融合蛋白質與相應單一同種型抗體或Ig融合蛋白質相比顯示出聚集減少；而在其他情況中雜合同種型抗體或融合蛋白質與相應的單一同種型抗體或Ig融合蛋白質相比顯示出增強的正確寡聚化。
實施例18應用IgG1和IgG4的組分的雜合同種型Fc融合蛋白質的表達。
為產生從哺乳動物細胞中表達時最低限度聚集的Fc-紅細胞生成素融合蛋白質，應用標準分子生物學技術構建以下的表達質粒。應用在WO01/36489中公開的XmaI-XhoI DNA片段，該片段含一種形式的人紅細胞生成素編碼序列，所述序列具有導致His32Gly、Cys33Pro、Trp88Cys和Pro90Ala氨基酸替換的突變。相應的蛋白質序列顯示在SEQ ID NO47中APPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEGPSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPCEGLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR將該XmaI-XhoI DNA片段插入到編碼IgG1鉸鏈區(qū)和IgG2 CH2和CH3區(qū)的質粒載體中，該載體除了存在兩組突變導致在CH3 C末端產生了氨基酸替換外與在實施例1中構建的載體基本相同，這樣CH3 C-末端和Epo N-末端的連接處的序列如下....TQKSATATPGA-APPRLI....(SEQ ID NO48)第一組突變將IgG2的CH3區(qū)序列KSLSLSPG(SEQ ID NO49)改變?yōu)镵SATATPG(SEQ ID NO45)，所述突變在美國專利申請系列No.60/280，625中公開。用Ala-Thr-Ala-Thr(SEQ ID NO50的3位到6位)替換Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ ID NO49的3位到6位)的作用是除去潛在人非己T細胞抗原表位，該表位可以因為人Fc和人紅細胞生成素間的連接處含有非己肽序列而產生。第二組突變由CH3區(qū)C末端氨基酸的K到A的單氨基酸替換組成，在美國專利申請系列No.09/780,668中公開。
將產生的質粒轉染導入NS/0細胞并根據實施例1和2中的方法表達和純化Fc-Epo融合蛋白質?；谂c蛋白質A的結合進行純化之后，含如上所述的IgG2 CH3和紅細胞生成素替換的huFcγ2h-huEpo蛋白質通過大小排阻層析表征，發(fā)現在兩個獨立制備物中此蛋白質由97％的單體及90％的單體組成。發(fā)現以摩爾為基礎，在檢測紅細胞生成素蛋白質刺激TF-1細胞分裂的能力的基于細胞的試驗中，包含如上所述的IgG2 CH3和紅細胞生成素替換的huFcγ2h-huEpo蛋白質具有與人促紅細胞生成素幾乎一樣的活性。試驗的進行如在WO01/36489中的描述。
此外，表征了非突變人紅細胞生成素與Fc區(qū)C末端的融合物，所述Fc區(qū)由IgG1(鉸鏈-CH2-CH3)、IgG2(鉸鏈-CH2-CH3)或IgG1(鉸鏈)-IgG2(CH2-CH3)組成。構建了含非突變人Fc序列和非突變紅細胞生成素序列的表達質粒，所用方法類似于構建上述及實施例1的質粒的方法。用Fcγ1-Epo、Fcγ2-Epo和Fcγ2h-Epo表達質粒轉染NS/0細胞，并對于每一質粒在篩選了大約相同數目的克隆后分離穩(wěn)定的克隆。產量最佳的克隆產生50μg/ml的Fcγ1-Epo、20μg/ml的Fcγ2-Epo和120μg/ml的Fcγ2h-Epo。
等價方案本發(fā)明可以以其他特定的形式體現，而不偏離其精神和本質特征。因此認為前述的實施方案在所有的方面均為例證性的而非限定在此描述的發(fā)明。本發(fā)明的范圍因此由附屬的權利要求而不是前面的描述來說明，并且所有的在此權利要求的等價范圍和意義內的變化均意在包括于其中。
參考引入所有以上提及的專利、專利申請和科學出版物均完整引入本申請作為參考。
序列表 圖1
圖2
圖3
圖4
<110>默克專利有限公司<120>用于含雜合同種型抗體部分的蛋白質的表達技術<130>LEX-016PC<150>US 60/274,096<151>2001-03-07<160>50<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>IgG2鉸鏈序列<400>1Glu Arg Lys Ser Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro1 5 10<210>2<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>IgG2-IgG4雜合鉸鏈序列<400>2Glu Ser Lys Tyr Gly Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro1 5 10<210>3<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>IgE-CH2結構域序列<400>3Val Asn Leu Thr Trp1 5<210>4<211>5
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>IgG1 CH2結構域序列<400>4Val Lys Phe Asn Trp1 5<210>5<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>IgG3 CH2結構域序列<400>5Val Gln Phe Lys Trp1 5<210>6<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>來自IgD的糖基化位點<400>6Asn Thr Ser Gly Phe1 5<210>7<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>來自IgD的糖基化位點<400>7Leu Asn Ala Ser Arg1 5<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于人Fcγ2的正向引物<400>8ccttaagcga gcgcaaatgt tgtgtcgag 29<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人Fcγ2鉸鏈編碼區(qū)<400>9gagcgcaaat gttgtgtcga g 21<210>10<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于人Fcγ2的反向引物<400>10cctcgagtca tttacccggg gacagggag 29<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>針對CH3上部區(qū)域的DNA序列<400>11ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 30<210>12<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于在CH3上部區(qū)域中引入C到A的替換的正向引物<400>12ctgcccccat cacgggagga gatgaccaag30<210>13<211>34<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于在CH3區(qū)域中引入C到A的替換的反向引物<400>13ggtcatctcc tcccgtgatg ggggcagggtgtac 34<210>14<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>γ2鉸鏈<400>14Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro1 5 10<210>15<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>γ2鉸鏈外顯子<400>15cttaagcgag cgcaaatgtt gtgtcgagtg cccaccgtgc ccaggtaagc cagcccaggc 60ct 62<210>16<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有Cys到ser突變的γ1鉸鏈序列<400>16Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro1 5 10 15<210>17<211>71<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有γ1鉸鏈外顯子的DNA片段<400>17cttaagcgag cccaaatctt ctgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc caggtaagcc60agcccaggcc t 71
<210>18<211>112<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>編碼胰高血糖素樣肽1的序列<400>18cttaagccat gctgaaggga cctttactag tgatgtaagt tcttatttgg aaggccaagc 60tgccaaggaa ttcattgctt ggctggtgaa aggccgagga ggatccttaa gc 112<210>19<211>31<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>胰高血糖素樣肽1<400>19His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>20<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于免疫球蛋白γ2恒定區(qū)的正向引物<400>20caagctttct ggggcgagc19<210>21<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于免疫球蛋白γ2恒定區(qū)的反向引物<400>21cctcgagtca tttacccggg gacagggag 29<210>22<211>19<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>用于γ1鉸鏈區(qū)的正向引物<400>22ctgcagagcc caaatcttc 19<210>23<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于γ1鉸鏈區(qū)的反向引物<400>23cagctggggc ctgtccctg 19<210>24<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pDHL2-huKS抗體中的序列<400>24gggtaaatga 10<210>25<211>89<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IgA1鉸鏈外顯子<400>25cttaagtccc tcaactccac ctaccccatc tccctcaact ccacctaccc catctccctc 60atgctgccac ggtaagccag cccaggcct 89<210>26<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>IgA1鉸鏈區(qū)<400>26Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser1 5 10 15
Pro Ser Cys Cys His20<210>27<211>85<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>上置換鏈<400>27ttaagtccct caactccacc taccccatct ccctcaactc cacctacccc atctccctca 60tgctgccacg gtaagccagc ccagg 85<210>28<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>下置換鏈<400>28cctgggctgg cttaccgtgg cagcatgagg gagatggggt aggtggagtt gagggagatg 60gggtaggtgg agttgaggga c 81<210>29<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于IgM CH3和CH4的引物<400>29gcagccggcc ctgagccttg gcttcccaga gcg 33<210>30<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于IgM CH3和CH4的引物<400>30gctcccgggt cagtagcagg tgccagctgt gtcg 34<210>31<211>33<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于將IgM中最C端的Cys突變?yōu)閟er的引物<400>31gcagccggcc ctgagccttg gcttcccaga gcg33<210>32<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于將IgM中最C端的Cys突變?yōu)閟er的引物<400>32gctcccgggt cagtagctgg tgccagctgt gtcg 34<210>33<211>460<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>IgG1-IgM雜合體的恒定區(qū)<400>33Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys1 5 10 15Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr20 25 30Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser35 40 45Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser50 55 60Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr65 70 75 80Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys85 90 95Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys100 105 110Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro15 120 125Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys130 135 140Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asr Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu165 170 175Glu Gln Tyr Asn ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu180 185 190His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn195 200 205Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Asp210 215 220Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser225 230 235 240Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu245 250 255Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu260 265 270Ala Val Lys Thr His Thr Asn Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr275 280 285Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser290 295 300Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro305 310 315 320Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro325 330 335Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu340 345 350Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val355 360 365Phe Val Gln Trp Met Gln Arg Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr370 375 380Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe385 390 395 400Ala His Ser Ile Leu Thr Val Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu405 410 415Thr Tyr Thr Cys Val Val Ala His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr420 425 430Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val435 440 445Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr450 455 460
<210>34<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>IgG1-IgM雜合體中的肽序列<400>34Ala Ser Ile Cys Glu Asp Asp1 5<210>35<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有ser到Pro的突變的IgG4鉸鏈區(qū)<400>35Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro1 5 10<210>36<211>56<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸雙鏈體<400>36acgtctcagg tttataccag ggggtacggg tggaacgggt ccattcggtt gggtcc56<210>37<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>IgG4鉸鏈<400>37Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys1 5 10<210>38<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于IgG4鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的引物
權利要求
1.融合蛋白質，其包含與非免疫球蛋白部分融合的免疫球蛋白部分，其中所述免疫球蛋白部分包含來自第一抗體同種型的第一結構域和來自第二抗體同種型的第二結構域。
2.權利要求1的融合蛋白質，其中所述免疫球蛋白區(qū)包含來自第一抗體同種型的鉸鏈區(qū)和來自第二抗體同種型的恒定區(qū)。
3.權利要求2的融合蛋白質，其中所述恒定區(qū)為CH2結構域。
4.權利要求3的融合蛋白質，其中所述CH2結構域來自人IgG2重鏈，且所述鉸鏈區(qū)含有三個或更少的半胱氨酸殘基。
5.權利要求3的融合蛋白質，其中所述CH2結構域來自人IgG4重鏈。
6.權利要求2的融合蛋白質，其中鉸鏈區(qū)不是IgG2鉸鏈區(qū)。
7.權利要求2的融合蛋白質，其中鉸鏈區(qū)來自人IgG1。
8.權利要求3-6的融合蛋白質，其中鉸鏈區(qū)具有兩個或更少的半胱氨酸。
9.權利要求1的融合蛋白質，其中所述免疫球蛋白結構域缺乏抗原結合位點。
10.權利要求1的融合蛋白質，其中所述免疫球蛋白結構域包含抗原結合位點。
11.權利要求1的融合蛋白質，其中非Ig部分通過遺傳工程融合到Ig結構域重鏈的C末端。
12.權利要求1的融合蛋白質，其中非Ig部分通過遺傳工程融合到Ig結構域重鏈的N末端。
13.權利要求1的融合蛋白質，其中非Ig部分與輕鏈多肽融合。
14.權利要求2的融合蛋白質，其中鉸鏈區(qū)來自人IgA。
15.權利要求1的融合蛋白質，其中所述第一免疫球蛋白結構域為CH2結構域且所述第二免疫球蛋白結構域為CH3結構域。
16.權利要求15的融合蛋白質，其中第一抗體同種型為IgG且第二抗體同種型為IgM或IgA。
17.包含IgG2抗體部分的抗體或Ig融合蛋白質，其中IgG2鉸鏈經過突變包含兩個半胱氨酸。
18.包含針對腫瘤相關抗原的V結構域的免疫球蛋白部分，該免疫球蛋白部分包含來自第一抗體同種型的第一結構域和來自第二抗體同種型的第二結構域。
19.權利要求18的蛋白質，其包含失活的Fc受體I結合位點和具有三個或更少的半胱氨酸的鉸鏈區(qū)。
20.編碼權利要求1、17或18的融合蛋白質的核酸。
21.表達權利要求1、17或18的蛋白質的穩(wěn)定轉染細胞。
22.用于提高抗體或Ig融合蛋白質的組裝的方法，所述方法包括步驟a.用不同的鉸鏈區(qū)替換該蛋白質的鉸鏈區(qū)；和b.檢測改變的蛋白質的組裝。
23.權利要求22的方法，其中所述蛋白質和所述改變的蛋白質通過遺傳工程技術得以產生。
24.權利要求1的融合蛋白質，其中免疫球蛋白部分包含Fc重鏈區(qū)且非免疫球蛋白部分包含紅細胞生成素分子。
25.編碼權利要求24的融合蛋白質的核酸。
26.權利要求1的融合蛋白質，其中非免疫球蛋白部分包含紅細胞生成素分子。
27.用于提高細胞中抗體或Ig融合蛋白質產生的方法，所述方法包括步驟a.用不同的鉸鏈區(qū)替換所述蛋白質的鉸鏈區(qū)；和b.檢測改變的蛋白質的產量。
28.權利要求27的方法，其中所述蛋白質和所述改變的蛋白質通過遺傳工程技術產生。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于有效表達抗體融合蛋白質的方法和組合物。本發(fā)明的抗體融合蛋白質包括一雜合抗體部分，所述雜合抗體部分含有來自一種以上抗體的序列和/或突變體抗體序列。本發(fā)明的雜合抗體融合蛋白質可以高水平產生，且除了非抗體部分的功能活性外還可以將不同抗體類型的特征性功能活性組合在一起。
文檔編號C07K19/00GK1509293SQ02806064
公開日2004年6月30日 申請日期2002年3月7日 優(yōu)先權日2001年3月7日
發(fā)明者S·D·吉利斯, J·韋, 勞健明, S D 吉利斯 申請人:默克專利有限公司