專利名稱：丹參丹酚酸b的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種丹參丹酚酸B的制備方法。丹酚酸B的結構式如下
最近幾年，許多專家用現代醫學方法，結合化學、分子生物學和細胞生物學等多學科的技術手段，對丹參進行了較系統的研究，取得了大量的新的認識和實驗結果。丹參水溶性有效成分是丹參的重要活性成分，受到醫學界極大的重視。水溶性成分包括原兒茶醛、丹參素、和丹酚酸A、B、C、D、E等，其中酚酸類的成分活性最強，尤以丹酚酸B的作用顯著，經藥效學實驗證實，它具有顯著的抗脂質過氧化，清除自由基和抗血栓的作用。
心血管系統疾病為中老年人的高發病。成功的開發出丹酚酸B系列產品將會為人類防治心血管病做出具大的貢獻。
近幾年來，關于丹參的提取及丹參復方制劑臨床應用的報道很多。丹參單獨應用的制劑較少，一般是與其它藥物組成復方制劑應用于臨床。出現了很多劑型，如復方丹參片、復方丹參滴丸、復方丹參沖劑、復方丹參膠囊、復方丹參顆粒劑、復方丹參氣霧劑、復方丹參注射液、復方丹參口服液等。這些產品的研制成功為丹參的臨床應用開辟了更為廣闊的前景。但這些產品多是采用水煮醇沉法或醇提取的舊工藝，提取過程中丹參的水溶性有效成分大部分丟失或被破壞，而脂溶性雜質含量較高甚至大多保留了其脂溶性成分，其中以二萜醌類的丹參酮為主。部分產品保留了較多的水溶性成分，但也主要是原兒茶醛、丹參素，因其兩種成分較易從藥材中分離獲得，這兩種成分很可能是丹酚酸類的分解產物，其中原兒茶醛的毒副作用較大。另外傳統的提取工藝所得產品原生藥中非活性成份含量很高，提取物重量一般為原生藥的20％左右，其中大部分為非活性物質。
傳統的丹參制劑多采用醇提法。如根據《中國藥典》(2000年版一部)復方丹參片中丹參需提取三次，第一次加乙醇回流1.5小時，濾過，濾液回收乙醇，濃縮至相對密度為1.30；第二次加50％乙醇回流1.5小時，濾過；第三次加水回流2小時，濾過。合并第二、三次濾液，回收乙醇，濃縮至相對密度為1.40，與第一次的濃縮液合并，混勻，制成清膏。這種醇提工藝所制成的復方丹參片中的丹參有效成分以二萜醌類的丹參酮為主，水溶性成分基本丟失。
《藥物制劑注解》(人民衛生出版社1983.402)公開的復方丹參注射液采用水煮醇沉法，丹參洗凈后用水煎煮提取三次，過濾，合并三次煎液，濃縮至每ml含藥材1.5～2g。加入95％乙醇使藥液含醇量達75％，放置40小時后過濾，濾液回收乙醇并濃縮至每ml含藥材3g，最后加95％乙醇使藥液含醇量達85％，放置4小時過濾，濾液回收乙醇濃縮至每ml含藥材3～5g，沖入13倍的蒸餾水，放置24小時后過濾，濾液回收乙醇并濃縮至無醇味。丹酚酸B為二分子丹參素與一分子原紫草酸縮合而成的四聚咖啡酸類化合物，在攝氏100度極不穩定，易降解成單體丹參素與寡聚咖啡酸的脫水、脫羧產物，或氧化成原兒茶醛、原兒茶酸，水煮三次后有效成份丹酚酸B已大部分被破壞。不同的醇沉濃度對丹參的有效成分含量影響也較大，因酚酸類成份在植物中多以鎂、鉀、氨等鹽的形式存在，在水中易溶而在醇中溶解性差，70％醇沉淀在除去雜質的同時，水溶性酚酸類有效成份損失量可達50％以上。
本發明丹參丹酚酸B的制備方法，其工藝步驟為1.水提取在0～99℃的溫度下用水提取丹參中的水溶性成份。
所用水可為常水、蒸餾水，去離子水，反滲透水等。水中可含有微量的酸、堿、無機鹽、有機鹽、醇類等。
提取的方法可以采用浸漬法，也可以采用滲濾法、超聲提取法或微波萃取法。
上述浸漬法可以為一次浸漬提取，也可為多次浸漬提取。現以兩次浸漬提取的方法為例進行說明。
第一次浸漬，取丹參原藥材制成飲片，或用其它適當方法粉碎，加水適量，加水量一般為藥材量的6～15倍，低溫或保溫浸漬。可先于40℃以下浸泡(本文中浸泡即浸漬，兩者為同一意義)，然后再加熱至40～99℃保溫浸泡。推薦方案為加水量為丹參量的10倍左右，先常溫浸泡1～4小時，然后加熱至40～70℃，浸泡2～6小時。分離第一次提取液。
第二次浸漬，加水適量，加水量一般為藥材量的4～10倍。在40～99℃保溫浸泡一定時間后，分離得到第二批提取液。推薦方案為加水量為丹參量的8倍，加熱至40～70℃，浸泡2～6小時。
合并兩次提取液，采用過濾、自然沉淀或離心法的方法，初步除去提取液中的固體雜質。
上述滲濾法具體方法是取丹參飲片或用其它方法粉碎后的丹參，裝于一有機玻璃制成的滲濾柱或桶中，邊裝邊適當壓實，滲濾柱或桶上端留出約1/5體積。加水至所有藥材浸沒，靜止浸泡4小時。打開滲濾柱下端閥門，使滲濾液緩緩流出，每小時流出滲濾液的量約為丹參干重的一倍，同時不斷注入水至滲濾柱上端。以FeCl3點樣觀察滲濾液中丹酚酸B的含量，至顯色反應較弱時停止滲濾。
上述超聲法具體方法是在浸漬法的基礎上，提取過程在超聲波下完成。超聲提取技術主要是利用超聲波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超聲波的次級效應，加機械振動、乳化、擴散。擊碎、化學效應等也能加速欲提取成分的擴散釋放并充分與溶劑混合，利于提取。
上述微波法具體方法是在浸漬法的基礎上，提取過程在微波下完成。微波是利用微波能來提高提取率的一種最新發展起來的新技術。它的原理是在微波場中，吸收微波能力的差異使得基體物質的某些區域或萃取體系中的某些組分被選擇性加熱，從而使得被提取物質從基體或體系中分離，進入到介電常數較小、微波吸收能力相對差的溶劑中。
2.酸化提取液將上述浸漬液中加入無機或有機酸調pH，使浸漬液pH值為1～6，采用過濾、自然沉淀或離心法的方法，除去酸化后出現的固體雜質。其中所用酸可為鹽酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸等。最佳為鹽酸或硫酸。
酸化的目的如下(1)丹參中的丹酚酸類成分主要以鹽的形式存在，有鎂鹽，也有鉀鹽、氨鹽等，其成分較復雜。加酸酸化后，可變成單一的丹酚酸B，有利于質量標準的控制。(2)浸漬液中含有大量膠質類雜質，通過酸化，可沉淀除去大部分這類雜質。(3)丹酚酸B為弱酸性類物質，其在酸性條件下易被大孔樹脂吸附，提高分離純化效果。
以上水提取和酸化也可通過用稀酸水溶液提取的方法一步實現丹參飲片或粉碎后的丹參直接用稀酸水溶液提取，稀酸的pH值為1～6，酸的種類可選有機酸或無機酸，方法可用浸漬法或滲濾法等。
3.柱層析法分離、純化丹酚酸B(1)采用特選填料制備色譜柱；(2)色譜柱活化；(3)將上述丹參的水提液加至色譜柱，用水、稀醇水溶液或水-丙酮溶劑洗脫，除去雜質；(4)以醇類、乙腈或適當濃度的醇-水溶液、水-丙酮或乙腈-水溶液洗脫，得到高純度的丹酚酸B溶液。
在上述步驟(1)中，特選填料是指大孔樹脂類、離子交換樹脂、MCIGEL-CHP-20P、Sephadex LH-20凝膠、或C18、C8鍵合相等色譜柱填料，推薦方案為用非極性或弱極性的大孔樹脂做色譜柱填料。
上述步驟(2)中，色譜柱活化的方法可用丙酮、甲醇、乙醇、乙腈有機溶劑或其與水的混合物，也可用堿-水溶液，或堿-醇溶液活化。
上述步驟(3)中，洗脫用水中可含微量的酸或無機鹽。
上述步驟(3)中，可以單用水洗脫除雜質，或單用稀醇水溶液或低濃度的丙酮-水溶劑洗脫除雜質；也可先用水洗脫然后再用稀醇水溶液或低濃度的丙酮-水溶劑洗脫除雜質。
上述步驟(3)中，稀醇水溶液等溶劑可以為甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等醇的水溶液，也可采用乙腈的水溶液，或它們的混合物。
上述步驟(3)中，稀醇水溶液等溶劑的濃度一般在50％以下，常用為10％-40％，最好用20％-30％的濃度，低濃度的丙酮-水溶液常用丙酮含量一般在60％以下，常用為10％～50％，最好用20％～30％的濃度。洗脫過程也可以采用梯度的方法，即先用低濃度醇或低濃度的丙酮-水溶液洗脫，然后再用較高濃度醇或丙酮溶液等溶劑洗脫。
上述步驟(4)中，適當濃度的丙酮-水、醇-水溶液或乙腈-水溶液中，有機相所占比例一般大于10％，常用為20％-90％，最好用40％-70％的濃度。
4.干燥洗脫液的干燥可采用一步法，也可采用兩步法。兩步法為先在減壓或加熱的條件下將藥液濃縮，然后采用噴霧干燥，或真空干燥，薄膜蒸發等方法干燥；一步法則是采用噴霧干燥，薄膜蒸發等方法直接將上述步驟3所得洗脫液干燥，得到丹酚酸B成品。
洗脫液的干燥除上述方法外，也可根據劑型需要，采用真空冷凍干燥；或直接噴灑在固體粉狀藥用輔料上，再進一步干燥。
本發明丹參丹酚酸B的制備方法，由于用水提取，避免了丹參酮等非水溶性成份的出現；提取時采用低于100℃的溫度，可避免丹酚酸B的破壞；加酸酸化可將丹酚酸B的不同鹽類轉化為單一的丹酚酸B，同時可以沉淀除去從丹參原藥材中提取出的雜質，另外在酸性條件下丹酚酸B的柱層析分離效果較好；由于在洗脫去雜質的過程中采用了水和低濃度醇等溶劑，使提取液中的雜質得到進一步除去；在有效成份丹酚酸B的洗脫過程中，由于采用了適當濃度的丙酮-水、醇-水溶液或乙腈-水溶液，使丹酚酸B與丹參其它成份間得到了較好的分離。最終制得了純度較高的丹酚酸B，可使提取物中丹酚酸B的含量達到90％以上，且質量穩定、工藝成熟、可以大規模生產。與其它含丹參制劑的傳統制備方法相比，避免了丹參中主要有效成分丹酚酸B的流失，對提高丹參療效，充分利用中藥材資源等具有很重要的意義。
實施例一丹參酚酸B的制備方法，其工藝步驟為1.水提取(浸漬法)取丹參飲片，稱量，按其重量的10倍量加水，室溫浸泡4小時，然后60℃保溫3小時(可適當攪拌)，分離提取液；殘渣按原丹參飲片重量的8倍加水，60℃保溫2小時(可適當攪拌)，分離提取液，將兩次提取液合并，用過濾方法除去提取液中的固體雜質。
2.提取液酸化在濾液中加入濾液量1～2％的鹽酸調pH，邊加邊攪拌，至濾液的pH值為1，然后靜置約兩小時，使析出物充分沉降，離心或抽濾，保留上清液，棄去沉淀。
3.柱層析法分離、純化丹酚酸B濾液上D101型(天津農藥廠生產)大孔樹脂柱，上柱樣品(以原藥材干重計算)與樹脂量之比為1∶4(W∶W)，先用約30倍柱體積的水洗脫除雜質，再用約20倍柱體積的濃度為30％的乙醇水溶液洗脫除雜質。最后用濃度為50％的乙醇水溶液洗脫，以FeCl3點樣監測洗脫液中丹酚酸B的含量，結合高效液相，至丹酚酸B完全洗脫下來，收集洗脫液。
4.洗脫液在溫度60℃、真空度-0.1Mpa的條件下進行真空濃縮，回收乙醇至濃縮液中含藥量5％左右，濃縮液再經噴霧干燥，制得丹參丹酚酸B。
實施例二與實施例一基本相同，所不同的是，水提取過程為滲濾法。具體方法如下取丹參飲片，稱量，裝于一有機玻璃制成的滲濾柱或桶中，邊裝邊適當壓實，滲濾柱或桶上端留出約1/5體積。加40℃溫水至所有藥材浸沒，靜止浸泡4小時。打開滲濾柱下端閥門，使滲濾液緩緩流出，每小時流出滲濾液的量約為丹參飲片干重的一倍，同時不斷注入約40℃溫水至滲濾柱上端。以FeCl3點樣觀察滲濾液中丹酚酸B的含量，至顯色反應較弱時停止滲濾。
實施例三與實施例一基本相同，所不同的是水提取過程以0.01mol/L稀鹽酸提取，提取和酸化一次完成。
實施例四與實施例二基本相同，所不同的是水提取過程以0.01mol/L稀硫酸提取，提取和酸化一次完成。
實施例五與實施例一基本相同，所不同的是提取過程采用超聲提取法，超聲波能量為0.1瓦。
實施例六與實施例一基本相同，所不同的是提取過程采用微波萃取法，微波能量為1瓦。
實施例七與實施例一基本相同，所不同的是酸化提取液除雜質時，是用硫酸調濾液的pH值為1～4。
實施例八與實施例一基本相同，所不同的是酸化提取液除雜質時，是用醋酸調濾液的pH值為1～4。
實施例九與實施例一基本相同，所不同的是酸化提取液除雜質時，是用磷酸調濾液的pH值為1～4。
實施例十與實施例一基本相同，所不同的是酸化提取液除雜質時，是用甲酸調濾液的pH值為1～4。
實施例十一與實施例一、二、三、四、五或六基本相同，所不同的是，在柱層析法分離、純化丹酚酸B的洗脫過程中，采用的是甲醇水溶液。
實施例十二與實施例十一基本相同，所不同的是，在柱層析法分離、純化丹酚酸B的洗脫過程中，采用的是丙醇水溶液。
實施例十三與實施例一基本相同，所不同的是，在柱層析法分離、純化丹酚酸B的洗脫過程中，采用的是乙腈水溶液。
實施例十四與實施例一基本相同，所不同的是，在柱層析法分離、純化丹酚酸B的洗脫過程中，采用的是丙酮水溶液。
實施例十五與實施例一基本相同，所不同的是，在柱層析法分離、純化丹酚酸B的過程中，采用的是MCI-GEL CHP-20P作色譜柱填料。
實施例十六與實施例一基本相同，所不同的是，在柱層析法分離、純化丹酚酸B的過程中，采用的是C18鍵合相作色譜柱填料。
實施例十七與實施例一基本相同，所不同的是，在柱層析法分離、純化丹酚酸B的過程中，采用的是離子交換樹脂作色譜柱填料。
實施例十八與實施例一基本相同，所不同的是，在柱層析法分離、純化丹酚酸B的過程中，采用的是C8鍵合相作色譜柱填料。
實施例十九與實施例一基本相同，所不同的是，在柱層析法分離、純化丹酚酸B的過程中，采用的是Sephadex LH-20作色譜柱填料。
本發明所要求保護的具體技術方案，不限于上述實施例所表達的技術方案的具體組合。
權利要求
1.一種丹參丹酚酸B的制備方法，其工藝步驟為步驟一、水提取水提取過程為將丹參飲片或粉碎的丹參采用浸漬法、滲濾法、超聲法或微波萃取法提取，分離出主要含有丹參水溶性成分的提取液；采用過濾、自然沉淀或離心方法初步除去提取液中的固體雜質；步驟二、酸化提取液在提取液中加入無機酸或有機酸調PH值，使浸漬液PH值為1～6，采用過濾、自然沉淀或離心法除去酸化后出現的固體雜質；步驟三、柱層析法分離、純化丹酚酸Ba、采用填料制備色譜柱，所采用的填料為大孔樹脂類、離子交換樹脂、MCIGEL-CHP-20P、SephadexLH-20凝膠、C18鍵合相或C8鍵合相色譜柱填料；b、色譜柱活化；c、將提取液加至色譜柱，用水、稀醇水溶液或水－丙酮溶劑洗脫，除去雜質；d、用醇類、丙酮、乙腈、醇水溶液、水－丙酮溶液或乙腈－水溶液洗脫，得到高純度的丹酚酸B溶液；步驟四、干燥。
2.權利要求1所述的丹參丹酚酸B的制備方法，其特征是水提取和酸化提取液可以通過用稀酸水溶液提取的方法一步實現，即丹參飲片或粉碎后的丹參直接用稀酸水溶液提取，稀酸的PH值為1～6，酸的種類為無機酸或有機酸；提取的方法可以是浸漬法、滲濾法、超聲法或微波萃取法，分離出提取液，用過濾、自然沉淀或離心法除去提取液中的固體雜質。
3.權利要求1或2所述的丹參丹酚酸B的制備方法，其特征是步驟三、柱層析法分離、純化丹酚酸B的步驟C為，先用水洗脫除雜質，然后再用稀醇水溶液或丙酮－水溶劑洗脫，除雜質。
4.權利要求1或2所述的丹參丹酚酸B的制備方法，其特征是步驟三、柱層析法分離、純化丹酚酸B的步驟C為先用水洗脫除雜質，然后用低濃度醇或低濃度的丙酮溶液洗脫，再用較高濃度醇或丙酮溶液洗脫除雜質。
5.權利要求1或2所述的丹參丹酚酸B的制備方法，其特征是步驟四采用一步干燥法或兩步干燥法；一步干燥法是采用噴霧干燥，薄膜蒸發方法直接將上述步驟3所得的洗脫液干燥；兩步法為先在減壓或加熱的條件下蒸發，藥液濃縮，然后采用噴霧干燥。
6.權利要求1或2所述的丹參丹酚酸B的制備方法，其特征是步驟四采用真空冷凍干燥。
7.權利要求1或2所述的丹參丹酚酸B的制備方法，其特征是步驟四采用直接噴灑在固體粉狀藥用輔料上，再進一步干燥。
全文摘要
本發明公開了一種丹參丹酚酸B的制備方法。其工藝步驟為1.水提取；2.酸化提取液；3.柱層析法分離、純化丹酚酸B；4.干燥。用本發明方法制備丹酚酸B提取率高、純度高，提取物中丹酚酸B的含量可達到90％以上，且質量穩定，可大規模生產。
文檔編號C07D307/00GK1425659SQ0216077
公開日2003年6月25日 申請日期2002年12月31日 優先權日2002年12月31日
發明者張鳳俠, 王家平, 談學兵 申請人:南京虹橋醫藥技術研究所