專利名稱：一種高效篩選T細胞抗原表達肽,制備MHC-肽多聚體(MHC tetramer)的體系的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種高效篩選T細胞抗原表位肽的方法，屬于生物制藥領域。
背景技術：
T細胞是機體免疫系統最重要的細胞之一，是免疫反應的核心。T細胞參與免疫的識別、活化及反應階段。除了可以調節其它細胞，如B細胞的反應以外，還直接參與機體抗傳染、抗腫瘤的免疫過程。T細胞也可以直接攻擊自身組織或同種移植物，產生自身免疫性疾病或移植排斥反應。因而，T細胞的識別、活化及清除可用于疾病的預防、檢測及治療。與B細胞不同，T細胞不能直接識別游離的，誘導免疫反應的物質，抗原。抗原必需經過抗原提呈細胞(APC)如巨噬細胞，處理后，以小肽或其它小分子的形式組裝到其MHCI類或II類的分子上，并且共表達在APC的膜表面。如此形成的MHC-肽復合物才能被T細胞的抗原受體(TCR)結合，從而產生識別和活化。
與抗原肽結合的MHC分子是高度多態性的，可以結合各種不同序列的肽序列。T細胞與MHC-肽復合物的結合是受MHC限制的，即只有T細胞的MHC表型與APC的MHC表型相一致時，識別和活化才是最有效的。
T細胞的TcR與MHC-肽的結合是非常短暫的，天然情況下，還需要APC及T細胞上的輔助粘附分子來加強這種結合。因此，過去直接用抗原或抗原肽，甚至MHC-肽復合物單體都無法檢測抗原特異性的T細胞，阻礙了T細胞的研究和應用。
近年，國外發明了一種MHC-肽四聚體技術(usp5,635,363)，可用于抗原特異性的T細胞檢測、分選、活化及擴增，從而可用于T細胞識別表位的篩選及特異性T細胞的檢測。這一發明是將MHC的α和β鏈膜外段基因重組、并表達在大腸桿菌中，將表達的α和β鏈與抗原肽共同復性，經分離獲得MHC-肽單聚體，在單聚體的重鏈C末端導入一個生物素化位點，并標記上生物素，通過熒光標記的抗生素上的四價生物素結合位點，結合生物素形成MHC-肽四聚體。MHC-肽四聚體可以牢固地結合在抗原表位特異性T細胞的TCR上。從而可以精確地檢測、分選、活化和擴增抗原表位特異性地T細胞。在疫苗研究、疾病診斷、檢測及新藥篩選上具有重要的應用價值。我們在這一基礎上進一步發明了一種新的MHC-肽四聚體的制備工藝及新的MHC-肽多聚體制備方法。不但保持了MHC-肽多聚體識別抗原表位T細胞的特性，而且使制備效率大為提高，商業價值提高(中國專利申請號02153465.9)。然而，MHC-肽四聚體/多聚體的應用價值的核心是結合在其中的抗原肽或稱T細胞表位。篩選制備這類表位肽已成為MHC-肽四聚體/多聚體的主要熱點。T細胞抗原肽表位的篩選制備主要有以下幾種方法1、在抗原氨基酸序列的基礎上，順序合成的小分子肽段2、通過抗原構象分析，合成可模擬相似結構的小分子肽段。
3、通過分離與APC內結合在抗原肽轉運分子(TAP)上或結合在APC表面MHC分子上的抗原小肽，測序后再合成的小分子肽段。由這些技術篩選T細胞表位肽的過程是極為費時、費工及高成本的。因此發明一種能夠更經濟、有效、快速篩選目標T細胞表位肽的方法是具有極大的商業價值的。
近年來，噬菌體展示系統技術發展很快，這一技術的基本特征是將代表各種肽段氨基酸殘基序列的DNA(庫)插入到噬菌體基因中，然后這些肽段可以表達在噬菌體表面，并與相應的受體、抗體、配體結合。通過結合-淋洗過程分選的噬菌體，可以通過再感染宿主細菌而得以擴增，從而可以獲得充足的重組噬菌體載體DNA，進一步確定表達和結合肽段的序列。再通過合成這些肽段，就可以制備出具有各種應用價值的肽分子。同理，這些肽段也可用于MHC-肽四聚體或多聚體的制備，用于各種情況下的T細胞識別、活化及擴增，產生商業價值。
本發明就是利用噬菌體展示系統這一特點及T2樣細胞上MHC分子結合抗原肽的特點，建立一種高效篩選T細胞抗原表位的方法。在這一方法中，噬菌體展示系統可以同時展示大量的可篩選的小分子肽，通過這些肽與T2樣細胞上的MHC分子結合的特點，將含T細胞表位肽的噬菌體。分選出來。通過結合-淋洗的方法進一步挑出親和力高，從而應用價值大的多肽-噬菌體；再根據噬菌體的重組表達載體上的克隆基因序列推算出特異性T細胞表位肽的序列。由于建立了iRNA敲除技術，制備了表達各種MHC等位基因分子的T2樣細胞。這一系統還可以一次篩選各種MHC限制的特異性T細胞抗原表位肽，使T細胞抗原表位肽的篩選效率極大地提高、篩選的T細胞抗原表位肽可用于各種情況下T細胞的識別、分選、活化及擴增具有極大的應用價值。
發明內容
現有的篩選抗原肽的實驗步驟繁復，而且要合成大量的肽段，成本很高。本發明的目的是提供一種能高效篩選T細胞抗原表位肽的體系。
本發明的另一個目的是提供用此體系篩選的肽制備MHC-肽多聚體的應用。本發明的主要內容是利用T2樣細胞不能遞呈內源性抗原表位肽，但其表面的MHC分子卻能結合外源性抗原表位的特點，利用噬菌體展示系統可在噬菌體表面展示各種抗原肽，并與T2樣細胞上的MHC分子結合的特點，建立一種快速篩選T細胞抗原表位肽的方法，所篩選的抗原表位肽可用于制備MHC四聚體或多聚體，后者可用于各種情況下抗原特異性T細胞的檢測、分選、活化及擴增，其步驟如下1、采用RNAi技術使細胞中TAP沉默，從而制備一系列具有不同MHC I II類抗原位點的T2樣細胞；2、制備各種來源的表達9-15肽的cDNA；3、將這些cDNA克隆到噬菌體展示系統中噬菌體表達載體中，cDNA/基因III聚合蛋白可提呈噬菌體顆粒表面，并且與MHC分子結合；4、將噬菌體與T2樣細胞孵育，表面具有MHC分子結合能力的噬菌體結合到T2細胞表面；5、通過不同強度的緩沖液洗滌，未結合的噬菌體被洗去，表達具有MHC分子結合活性的噬菌體留在T2樣細胞表面；6、加入噬菌體敏感宿主大腸桿菌使T2樣細胞上的噬菌體感染大腸桿菌，并得以擴增；7、由大腸桿菌中進一步分離噬菌體質粒，并對其中的cDNA克隆測序、篩選出與MHC分子結合的肽段序列；8、合成所篩選的肽段，結合至T2樣細胞用該細胞刺激T細胞反應，確認肽段T細胞表位活性。
具體實施例方式實施例1制備內源性抗體肽表達缺陷的T2細胞系制備T2細胞的TAP基因，使用Benitec公司的RNAi試劑盒，根據產品實驗說明的步驟，制備出TAP基因缺陷的T2樣細胞。
把上述T2樣細胞破碎，根據《分子克隆》的方法提取T2樣細胞的基因，再用PCR技術用TAP啟動子和終止子進行擴增，再進行凝膠電泳，沒有發現有TAP基因帶。
實施例2制備HCV肽鏈基因庫用專利02117666.3的方法制備大量的HCV病毒，再用常規方法分離RNA，并用試劑盒把RNA逆轉錄成cDNA(Indianapolis，Ind)。第一步制備出來的cDNA再用PCR方法擴增。
把XhoI 2μ和SpeI 2μ加入到上述制備的DNA中，在37℃度水浴下，同時進行酶切24h，并把基因庫加入到噬菌體展示系統里(Dyax公司生產)。得到含有各種HCV肽段的噬菌體系統。
實施例3制備HIV肽鏈基因庫用常規的方法制備HIV病毒粒子，用常規方法分離RNA，并用試劑盒把RNA逆轉錄成cDNA(Indianapolis，Ind)。第一步制備出來的cDNA再用PCR方法擴增。
把XhoI 2μ和SpeI 2μ加入到上述制備的DNA中，在37℃度水浴下，同時進行酶切24h，得到9-15基因的肽鏈DNA。
并把以下已知的HIV肽鏈制備成DNA庫p24(133-147HIBB10)sequencePIVQNIQGQMVHQAIWahren er al.(1989)p24(133-154 SF2)Sequence PIVQNIQGQMVHQAISPRTLNA Tosenberg etal.(1997)p24(143-157)Sequeace VHQAISPRTLNAWVKC Bedford et al.(1997)p24(153-167)Sequence NAWVKVVEEKAFSPEC Bedford et al.(1997)p24(163-177)Sequence AFSPEVIPMFSALSEC Bedford et al.(1997)p24(163-184 SF2)Sequence AFSPEVIPMFSALSEGATPQDL Rosenberg etal.(1997)并把上述基因庫加入到噬菌體展示系統里(Dyax公司生產)。得到含有各種HCV肽段的噬菌體系統。
實施例4制備鼻煙癌肽鏈基因庫用常規的方法制備鼻煙癌病毒，再用常規方法分離RNA，并用試劑盒把RNA逆轉錄成cDNA(Indianapolis，Ind)。第一步制備出來的cDNA再用PCR方法擴增。
把XhoI 2μ和SpeI 2μ加入到上述制備的DNA中，在37℃度水浴下，同時進行酶切24h，并把基因庫加入到噬菌體展示系統里(Dyax公司生產)。得到含有各種HCV肽段的噬菌體系統。
實施例5；篩選親和性高的HIV肽把T2樣細胞固定到細胞板上，用PBS洗滌細胞，把沒有結合的噬菌體洗去，再增加洗滌液的離子強度，繼續洗滌，把結合不緊密的噬菌體洗去，不斷增加洗滌液的離子強度，不斷進行洗滌去除結合不緊密的噬菌體，最后篩選出和T2樣細胞親和力高的噬菌體。
實施例6擴增親和力高的噬菌體在實施例5中篩選出的和T2樣細胞親和力高的噬菌體和細胞的混合液中加入噬菌體敏感宿主大腸桿菌使T2樣細胞上的噬菌體感染大腸桿菌，然后把混合液放到LB培養基中，37℃培養24-48小時，收集大腸桿菌，由大腸桿菌中進一步分離噬菌體質粒，并對其中的cDNA克隆測序、篩選出與MHC分子結合的肽段序列(如PIVQNIQGQMVHQAI、PIVQNIQGQMVHQAISPRTLNA、VHQAISPRTLNAWVKC、NAWVKVVEEKAFSPEC、AFSPEVIPMFSALSEC、AFSPEVIPMFSALSEGATPQDL)。
實施例7檢測篩選出來的肽段PIVQNIQGQMVHQAI的表位活性把肽段PIVQNIQGQMVHQAI于T2樣細胞結合，并刺激T細胞反應，用細胞計數器檢測T細胞的數量，明顯增加，表明此肽段有表位活性。
實施例8檢測篩選出來的肽段PIVQNIQGQMVHQAISPRTLNA的表位活性把肽段PIVQNIQ6QMVHQAISPRTLNA于T2樣細胞結合，并刺激T細胞反應，用細胞計數器檢測T細胞的數量，明顯增加，表明此肽段有表位活性。
實施例9用HCV肽段合成MHC-肽抗體多聚體水浴或冰凍孵箱預冷1L折疊緩沖液(裝于有攪拌子的1L的燒杯中)，在折疊緩沖液加入還原型谷胱酐肽至5mM，氧化型谷胱酐肽至0.5mM，PMSF至0.2mM。計算加入1uM重鏈、2uM輕鏈和30mg/L肽的必需量，將重鏈和輕鏈加入5ml注射緩沖液中，于室溫抽入5ml注射器中。并根據人組織相容性抗原多肽的氨基酸序列(疏水性)于500ul雙蒸水或DMSO中稀釋人組織相容性抗原多肽。將1L重懸緩沖液放于攪拌器上高速攪拌(避免反應液起泡)，用移液器逐滴加人組織相容性抗原多肽于攪拌的反應液中。用26號針頭在盡可能接近攪拌子的位置猛烈將重鏈和輕鏈注射于攪拌的反應液中。加入輕鏈后，折疊緩沖液應變得輕微不透明。存放于10℃，過夜。
將復性反應物超濾濃縮至7ml。用Superdex75凝膠過濾純化MHC-HCV抗原肽單聚體。用SDS-PAGE檢測，并用ELISA法鑒定其構象。
將MHC-I單聚體與制備的熒光標記的卵黃抗體按比例混合，37℃溫浴1h，用Superdex200凝膠過濾純化。FPLC檢測。
將MHC-I單聚體與制備的熒光標記的單克隆抗體按比例混合，37℃溫浴1h，用Superdex200凝膠過濾純化。FPLC檢測。
實施例10用HIV肽段合成MHC-肽抗體多聚體水浴或冰凍孵箱預冷1L折疊緩沖液(裝于有攪拌子的1L的燒杯中)，在折疊緩沖液加入還原型谷胱酐肽至5mM，氧化型谷胱酐肽至0.5mM，PMSF至0.2mM。計算加入1uM重鏈、2uM輕鏈和30mg/L肽的必需量，將重鏈和輕鏈加入5ml注射緩沖液中，于室溫抽入5ml注射器中。并根據HIV多肽的氨基酸序列(疏水性)于500ul雙蒸水或DMSO中稀釋HIV多肽。將1L重懸緩沖液放于攪拌器上高速攪拌(避免反應液起泡)，用移液器逐滴加HIV多肽于攪拌的反應液中。用26號針頭在盡可能接近攪拌子的位置猛烈將重鏈和輕鏈注射于攪拌的反應液中。加入輕鏈后，折疊緩沖液應變得輕微不透明。存放于10℃，過夜。
將復性反應物超濾濃縮至7ml。用Superdex75凝膠過濾純化MHC-HIV抗原肽單聚體。用SDS-PAGE檢測，并用ELISA法鑒定其構象。
將MHC-I單聚體與制備的熒光標記的卵黃抗體按比例混合，37℃溫浴1h，用Superdex200凝膠過濾純化。FPLC檢測。
將MHC-I單聚體與制備的熒光標記的單克隆抗體按比例混合，37℃溫浴1h，用Superdex200凝膠過濾純化。FPLC檢測。
實施例11用鼻煙癌肽段合成MHC-肽抗體多聚體水浴或冰凍孵箱預冷1L折疊緩沖液(裝于有攪拌子的1L的燒杯中)，在折疊緩沖液加入還原型谷胱酐肽至5mM，氧化型谷胱酐肽至0.5mM，PMSF至0.2mM。計算加入1uM重鏈、2uM輕鏈和30mg/L肽的必需量，將重鏈和輕鏈加入5ml注射緩沖液中，于室溫抽入5ml注射器中。并根據鼻煙癌多肽的氨基酸序列(疏水性)于500ul雙蒸水或DMSO中稀釋鼻煙癌多肽。將1L重懸緩沖液放于攪拌器上高速攪拌(避免反應液起泡)，用移液器逐滴加人組織相容性抗原多肽于攪拌的反應液中。用26號針頭在盡可能接近攪拌子的位置猛烈將重鏈和輕鏈注射于攪拌的反應液中。加入輕鏈后，折疊緩沖液應變得輕微不透明。存放于10℃，過夜。
將復性反應物超濾濃縮至7ml。用Superdex75凝膠過濾純化MHC-鼻煙癌抗原肽單聚體。用SDS-PAGE檢測，并用ELISA法鑒定其構象。
將MHC-I單聚體與制備的熒光標記的卵黃抗體按比例混合，37℃溫浴1h，用Superdex200凝膠過濾純化。FPLC檢測。
將MHC-I單聚體與制備的熒光標記的單克隆抗體按比例混合，37℃溫浴1h，用Superdex200凝膠過濾純化。FPLC檢測。
權利要求
1.一種高效篩選T細胞抗原表位肽，制備MHC-肽多聚體(MHC tetramer)的方法，其步驟如下(1)用RNAi技術使細胞中TAP沉默，從而制備一系列具有不同MHC I、II類抗原位點的T2樣細胞；(2)制備各種來源的表達9-15肽的cDNA；(3)將這些cDNA克隆到噬菌體展示系統中噬菌體表達載體中，cDNA/基因的聚合蛋白可提呈到噬菌體顆粒表面，并且與MHC分子結合；(4)將(3)步驟制備出的噬菌體與T2樣細胞孵育，表面具有MHC分子結合能力的噬菌體結合到T2細胞表面；(5)通過不同強度的緩沖液洗滌，未結合的噬菌體被洗去，表達具有MHC分子結合活性的噬菌體留在T2樣細胞表面；(6)加入噬菌體敏感宿主大腸桿菌使T2樣細胞上的噬菌體感染大腸桿菌，并得以擴增；(7)由大腸桿菌中進一步分離噬菌體質粒，并對其中的cDNA克隆測序、篩選出與MHC分子結合的肽段序列；(8)合成所篩選的肽段，結合至T2樣細胞用該細胞刺激T細胞反應，確認肽段T細胞表位活性；
2.權利要求1所述的一種高效篩選T細胞抗原表位肽，制備MHC-肽多聚體的方法，其步驟(2)所述的肽鏈基因庫來自于病毒、細菌、人體和動物細胞基因組或cDNA文庫，以及人工設計合成的cDNA。
3.權利要求1所述的一種高效篩選T細胞抗原表位肽，制備MHC-肽多聚體的方法，其步驟(5)所述的洗脫液為陽離子洗脫劑。
4.權利要求1所述的一種高效篩選T細胞抗原表位肽，制備MHC-肽四聚體或多聚體的方法，得到的肽鏈在制備MHC多聚體中的應用。
全文摘要
本發明采用內源性抗原肽提呈表達缺陷的T2樣細胞系及帶特殊報告基因的噬菌體肽展示體系建立了一種新的、高效篩選可與T細胞表面MHC分子結合的T細胞識別表位肽的技術體系。篩選的T細胞表位肽可用于制備有效的MHC－肽四聚體(MHC tetramer)，后者可用于各種條件下特異性T細胞的檢測、分選和活化。
文檔編號C07K16/44GK1511959SQ0215997
公開日2004年7月14日 申請日期2002年12月31日 優先權日2002年12月31日
發明者徐小寧, 王小寧 申請人:王小寧