一種識別腫瘤細胞的多肽ot3、編碼ot3的多核苷酸及用途的制作方法

專利名稱：一種識別腫瘤細胞的多肽ot3、編碼ot3的多核苷酸及用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的多核苷酸及其編碼的多肽。具體而言，本發明涉及一種能特異性識別卵巢癌的抗原識別受體(gamma delta TCR)互補決定區域(CDR)3多肽(即“OT3”)的氨基酸序列、其活性片斷、類似物或衍生物，以及所述的多肽及編碼該多肽的核苷酸序列在制備用于診斷或治療腫瘤的藥物中的用途。
背景技術：
卵巢癌是婦科常見惡性腫瘤，發病率在婦科生殖系統腫瘤中居第二位，但卻是致死率最高的婦科腫瘤。卵巢癌的臨床治療主要采用手術切除或用順鉑聯合化療，但腫瘤惡性程度高的病人仍會復發，5年存活率僅為25％左右，因此，臨床上客觀要求有更好的手段輔助治療，而免疫治療在此方面的應用前景則受到人們的青睞。近年來，許多學者分別進行了細胞因子治療、TIL及CTL過繼治療、抗體療法、腫瘤疫苗治療等多種免疫治療方法的嘗試，并且也取得了一定的成果，但尚不令人滿意。例如，細胞因子治療目前是以局部治療或與其它生物手段聯合使用為主，盡管IL-2和IFN-α等細胞因子能起到良好的協同作用，但需要有效應細胞存在；過繼治療有一定的應用前景，但CTL識別抗原受主要組織相容性復合體(MHC)分子的限制，而腫瘤細胞不表達或低表達MHC分子，使CTL的功能受限；至于腫瘤疫苗則有賴于腫瘤特異性或相關性抗原的發現；此外，還要克服荷瘤機體的免疫抑制狀態和充分活化腫瘤特異性T細胞等問題。除上述影響腫瘤免疫治療的因素外，αβTIL在TCR-CD3復合體的表達或/和組裝上有缺陷以及腫瘤抗原似乎缺乏普遍性等因素，也在一定程度上制約著腫瘤免疫治療的效果。
與此同時，γδT細胞對腫瘤的免疫治療方面存在優勢。經研究發現γδT細胞獨特的抗腫瘤免疫機制可以彌補上述不足。例如，①γδT細胞主要以MHC非限制性方式識別抗原，可克服αβT細胞抗腫瘤免疫的MHC限制性的局限；②γδTIL細胞表達Fc受體，在TCR-CD3復合體的表達或/和組裝上有缺陷時，仍可傳遞信號，這是αβT細胞所不具備的；③γδT細胞在抗腫瘤免疫中可發揮產生細胞因子和細胞毒兩方面作用，兼具NK、CTL和Th細胞的功能特點。有人推測Vγ9/Vδ2T細胞做為抗腫瘤的天然效應細胞與NK細胞的作用相似，而其對某些腫瘤的特異性識別則是由那些腫瘤攜帶的能被某些γδTCR特異性識別的配體所介導的[1]，因此，γδT細胞可以被看作是從天然免疫和特異性免疫兩方面發揮著抗腫瘤效應機制。因此，若篩選到γδT細胞所識別的卵巢癌抗原及其表位(epitope)，則可用于激活γδT細胞、進而進行卵巢癌的γδT細胞特異性過繼治療，其應用前景應是較理想的。同時，篩選到的抗原肽可做為腫瘤疫苗，進行卵巢癌主動免疫治療的嘗試。因此，發現和尋找可做為卵巢癌腫瘤免疫治療有效靶點的特異性抗原或腫瘤相關抗原，尤其是表位，是攻破腫瘤免疫治療難關的急待解決的問題之一。顯然，從卵巢癌腫瘤組織浸潤的γδT細胞(Tumor infiltratingγδT lymphocyte，γδTIL)中尋找與卵巢癌抗原特異性反應的γδT細胞是合乎邏輯的。由于γδT細胞識別抗原的方式不受MHC限制，與抗體識別抗原的方式相似，能夠直接識別抗原，并且T細胞受體(TCR)與抗原之間特異性反應部位是抗原表位，而與抗原表位特異性結合的是TCR的互補決定區3(Complementary determining regions3，CDR3)。因而從γδTCR CDR3序列的分析入手，尋找能與腫瘤細胞特異性結合的多肽，是解決上述問題的關鍵所在。

發明內容
為了解決上述問題，本發明的一個目的是提供分離的新的多肽——卵巢上皮癌(OEC)識別特異性γδTCR CDR3多肽OT3以及其類似物和衍生物。
本發明涉及一種分離的多核苷酸，選自
c)包含SEQ ID NO.1的多核苷酸；d)SEQ ID NO.1的多核苷酸的反義核苷酸序列；c)一種在嚴緊條件下與SEQ ID NO.1序列或其片斷雜交的多核苷酸序列；d)一種具有與SEQ ID NO.1的多核苷酸序列至少70％同源并且編碼相同功能多肽的多核苷酸序列。
優選地，所述的多核苷酸為與SEQ ID NO.1的多核苷酸具有至少95％同源并且編碼相同功能多肽的多核苷酸序列。
本發明涉及一種重組載體，它含有所述的多核苷酸。
本發明涉及一種轉化的宿主細胞，它含有所述的重組載體。
優選地，所述的重組載體是所述的多核苷酸與細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒和腺病毒、腺相關病毒、單純皰疹病毒、逆轉錄病毒等載體組成的重組載體。
優選地，所述的重組載體是由所述的多核苷酸與編碼其它多肽或蛋白核苷酸序列構建而成的基因重組載體。
優選地，所述的重組載體是一種表達載體。
本發明涉及一種所述的多核苷酸編碼的具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、其活性片段、類似物或衍生物。
本發明涉及一種與所述的多肽、其活性片斷、類似物或衍生物結合的抗體。
本發明涉及所述的多核苷酸在制備用于診斷或治療與γδTCRCDR3多肽相關腫瘤疾病的藥物中的用途。
優選地，所述的腫瘤為卵巢癌。
本發明涉及具有由所述的多核苷酸編碼的如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、其活性片段、類似物或衍生物在制備用于診斷或治療與γδTCR CDR3多肽相關腫瘤的藥物中的用途。
本發明涉及一種模擬或調節所述的多肽表達的化合物，其中所述的化合物可以模擬或促進γδTCR CDR3多肽的活性。
本發明涉及一種藥物組合物，它含有治療有效量的所述的多核苷酸或其編碼的所述的多肽或其活性片斷、類似物或衍生物和藥學上可以接受的載體。
本發明涉及一種腫瘤疫苗，其特征在于它含有所述的多核苷酸編碼的多肽所識別的免疫有效量腫瘤抗原表位、完整腫瘤抗原或編碼上述腫瘤抗原及其表位的多核苷酸以及包含該序列的基因重組載體和藥學上可以接受的佐劑。
為了表述方便，以下將本發明多肽稱作“OT3”。
本發明提供了一種新的多肽——一種特異性識別卵巢癌的γδTCR CDR3多肽OT3，以及編碼此多肽的氨基酸序列，本發明還涉及此多核苷酸和多肽的制備及應用。
本發明提供了一種新的多肽——一種特異性識別卵巢癌的γδTCR CDR3多肽OT3，其基本上是由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列組成的。本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或是用重組技術從原核或真核宿主，如細菌、酵母、高等植物、昆蟲以及哺乳動物細胞中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化或非糖基化的。還可以包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發明還包括特異性識別卵巢癌的γδTCR CDR3OT3多肽的片段、衍生物和類似物。如本發明所用，術語“片段”“衍生物”和“類似物”是指基本上保持與本發明的特異性識別卵巢癌的γδTCR CDR3OT3多肽相同的生物學功能或活性的多肽。本發明多肽的片段、衍生物和類似物可以是(1)其中一個或多個氨基酸被保守或非保守的氨基酸殘基取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的。(2)或者是其中一個或多個氨基酸殘基上的某個基團被其它基團所取代。(3)或者是屬于成熟多肽與其它化合物融合；或者是通過其中附加的氨基酸序列融合成熟多肽，如前導序列、分泌序列，或者用于純化此多肽的序列。通過對本文的闡述，這樣的片段、衍生物和類似物被認為是在本領域技術人員的知識范圍內。
本發明提供了分離的多核苷酸，基本由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸組成。本發明的多核苷酸序列包括SEQ IDNo.1的核苷酸序列。本發明的多核苷酸是通過提取卵巢上皮癌中組織浸潤的γδT細胞的總RNA，經RT-PCR擴增而得到的。它包含的多核苷酸序列的全長為69個堿基，編碼了23個氨基酸。
本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、重組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈或是雙鏈。也可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區可以與SEQ ID No.1所示的序列相同或是簡并的變異體。如本發明所用，“簡并的變異體”是指具有SEQ ID No.2序列的多肽，但與SEQ ID No.1所示的序列有差別的多核苷酸序列。
編碼SEQIDNO2的成熟多肽的多核苷酸包括只有成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語“編碼多肽的多核苷酸”是指包括編碼此多肽的多核苷酸和包括附加和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述描述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發明還涉及與上述描述的序列雜交的多核苷酸(兩個序列之間具有至少50％，優選具有70％的相同性)。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加用變性劑，如50％(V/V)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在95％以上，更好是97％以上時才發生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQIDNO2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發明還涉及與上述序列雜交的核酸片段。如本發明所用，“核酸片段”的長度至少含10個核苷酸，較好是至少15-20個核苷酸，最好是40個核苷酸以上。核酸片段也可用于核酸的擴增技術，如PCR，以確定和/或分離編碼OT3的多核苷酸。
本發明的編碼特異性識別卵巢癌的γδTCR CDR3OT3多肽的多核苷酸序列可通過多種方法獲得。例如，用本領域熟知的雜交技術分離多核苷酸。這些技術包括但不限于1)用探針與基因組或cDNA文庫雜交以檢出同源的多核苷酸序列；2)表達文庫的抗體篩選以檢出具有共同結構特型的克隆的多核苷酸片段。3)經化學合成DNA序列以獲得所述多肽的雙鏈DNA。4)從基因組DNA分離上述雙鏈DNA序列。
上述提到的方法中，經常選用的方法是DNA序列的直接化學合成，更經常使用的方法是cDNA序列的分離。其標準方法是從表達該基因的供體細胞分離mRNA并進行逆轉錄，形成質粒或噬菌體cDNA文庫，從而應用常規方法從上述文庫中篩選本發明的基因，這些方法包括但不限于(1)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(2)測定人OT3轉錄本的水平；(3)通過免疫學技術或測定生物活性的方法，來檢測基因表達的蛋白/多肽產物。上述方法即可單用，也可多種方法聯合使用。
在第(1)種方法中，雜交所用的探針是與本發明的多核苷酸的任何一部分同源，其長度至少是10個核苷酸，最好是15-20個核苷酸；其所用探針通常是在本發明的基因序列信息的基礎上化學合成的DNA序列。
在方法(3)中，可用免疫學常規技術，包括但不限于免疫印跡(Western Blot)，放射免疫沉淀法或ELISA等，利用合成或表達的本發明的多肽對其結合產物進行檢測。
本發明中，編碼特異性識別卵巢癌的γδTCR CDR3OT3多肽的多核苷酸序列可插入到載體中，以合成含有本發明所述多核苷酸的重組載體。術語“載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒和腺病毒、逆轉錄病毒和其它基因轉運工具。在本發明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達基于T7啟動子的表達載體；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體和在昆蟲細胞中表達的來源與桿狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內復制和穩定任何質粒和載體都可以用于構建重組表達載體。表達載體的一個重要特征是通過含有復制起始點、啟動子、標記基因和翻譯調控元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含編碼特異性識別卵巢癌的γδTCR CDR3OT3多肽的DNA序列和合適的轉錄/翻譯調控元件的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體的PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核細胞或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子等。在載體中插入增強子序列將會使其在高等真核細胞中的轉錄得到增強。增強子是在DNA表達的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用與啟動子以增強基因的轉錄。可舉的例子包括在復制起始點晚期一側的100到270個堿基對的SV40增強子、在復制起始晚期一側的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
此外，表達載體優選地包含一個有多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環素或氨芐青霉素抗性等。
本發明中，編碼特異性識別卵巢癌的γδTCR CDR3OT3多肽的多核苷酸或含有該多核苷酸的重組載體可轉化或轉導入宿主細胞，以構成含有該多核苷酸或重組載體的基因工程化宿主細胞。術語“宿主細胞”指原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；細菌細胞如鼠傷寒沙門氏菌；真核細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞如果蠅S2或Sf9；動物細胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤細胞等。
通過常規的重組DNA技術，利用本發明的多核苷酸序列可用來表達或生產重組的編碼特異性識別卵巢癌的γδTCR CDR3OT3多肽，以及與該多肽融合表達的特異蛋白。一般來說有以下步驟用本發明的編碼特異性識別卵巢癌的γδTCR CDR3OT3多肽的多核苷酸(或變異體)、或包含有該核苷酸序列基因重組蛋白核苷酸，或用含有該核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；在合適的培養基中培養宿主細胞；從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。(放在一起)本發明提供了多肽，及其片段、衍生物、類似物或它們的細胞作為抗原以生產抗體的辦法。這些抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。本發明還提供了針對編碼特異性識別卵巢癌的γδTCR CDR3OT3多肽抗原決定簇的抗體。從而用于測定與OT3結合蛋白親合力的大小及特異性。
本發明還可以用于設計針對體內某一特殊部位的免疫毒素。如編碼特異性識別卵巢癌的γδTCR CDR3OT3多肽可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結合。一種通常的方法是用巰基交聯劑如(SPDP)，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結合與抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅OT3特異性識別的細胞。
本發明還可用于設計合成特異性靶向如卵巢癌等腫瘤的基因工程重組蛋白，該融合蛋白包括但不限于細胞因子、免疫毒素、免疫抑制劑和調節劑等，其具體方法是通過構建基因重組表達載體，如pET-JV127，轉化大腸桿菌，按照常規方法進行表達、篩選和純化。
本發明還涉及利用本發明多肽以基因重組的方式表達融合蛋白，該蛋白包括但不限于細胞因子、免疫毒素、免疫調節劑等的形式；或以嵌合受體或抗體的形式，利用所述多肽/多核苷酸序列進行對卵巢癌等γδTCR CDR3多肽OT3相關的腫瘤疾病的免疫治療或診斷方法。
本發明可以將OT3多肽與毒素如白喉毒素進行基因重組，以構建、表達、純化該重組蛋白，使OT3識別與γδTCR CDR3多肽相關的腫瘤以使與OT3相連的毒素表達達到抑制相關腫瘤細胞或腫瘤組織的生長的目的。其方法可以是例如，將人工合成OT3編碼核苷酸與白喉毒素(DT)A鏈基因加入連接子后整合入pET30a和pET42a載體，然后轉化到BL21(DE3)表達菌株中，通過IPTG誘導，可以得到融合蛋白。將融合蛋白通過HisTrap純化柱加以純化，然后，用凝血酶Xa因子分別將OT3與白喉毒素(DT)A鏈融合肽片段切割下來，并加以純化，凍干后，-20℃保存。
總之，本發明通過篩選γδT細胞所識別的卵巢癌抗原及其表位(epitope)，提供了一種能特異性識別卵巢癌的抗原識別受體(gammadelta TCR)互補決定區域(CDR)3的多肽OT3的核苷酸序列與氨基酸序列，該多肽可用于激活γδT細胞、進而進行卵巢癌的γδT細胞特異性過繼治療，在特異抑制腫瘤的生長的相關治療方面具有廣闊的應用前景。同時，篩選到的抗原肽可做為腫瘤疫苗，進行卵巢癌主動免疫治療的嘗試。


圖1 不同pH值的固定反應緩沖液對OT3的靜電吸附的影響。曲線1為OT3反應曲線，固定反應緩沖液的pH值依次為pH6.00、pH5.50、pH5.75和pH6.22；圖2 不同濃度對OT3的靜電吸附的影響。曲線1為OT3反應曲線，OT3溶液的濃度依次為0.05，0.10，和0.01μg/μl；圖3 利用EDC/NHS將CDR3肽固定在CM-Dextran表面。曲線1為OT3固定反應曲線，用“開始”和“結束”標注了固定反應的起始和結束。
圖4利用IasysPlus生物傳感器監測OEC細胞、對照細胞及其蛋白與CDR3短肽間的反應。曲線1為OT3與細胞或蛋白質反應的生物傳感器檢測曲線，它們分別由4種或5種不同濃度的同一種細胞或蛋白的相對應的4種或5種反應結果組成，用“開始”和“結束”分別標注了一種濃度的細胞或蛋白與OT3反應的開始及結束。圖4A-J依次為SKOV3細胞，SKOV3細胞蛋白提取物，OEC1、OEC3、OEC4和OEC10組織蛋白提取物，PBMC，Hep-2細胞，803細胞和正常Balb/C小鼠卵巢組織蛋白提取物與CDR3短肽的反應結果。其中不同濃度的803細胞的加入按濃度由高到低順序進行，余者均為由低到高順序加樣。
圖5 去除生物素化的OT3短肽中游離生物素及脫鹽的層析圖。
圖6 ELISA方法檢測OT3短肽與一些細胞蛋白的反應。
圖7 Dot-ELSIA檢測OT3短肽與一些細胞蛋白的反應。
圖8 免疫組織化學方法檢測OT3短肽與卵巢癌組織的反應，其中結果表明，OT3能識別卵巢癌腫瘤組織中的上皮細胞，但不與間質細胞發生反應(圖8A，8B，8C)，并且不加生物素標記的OT3對照組未發生陽性反應(圖8G)；它們與因子宮切除而獲得的正常卵巢組織的上皮對照細胞不發反應(圖8D，8E，8F)。上述結果表明OT3肽能特異性地識別卵巢癌上皮細胞抗原。
圖9 OT3所識別的噬菌體的篩選效率。篩選效率用產率表示，產率等于洗脫回收的噬菌體的滴度(單位為pfu)與用于篩選的噬菌體滴度的比值。SA-PMPs表示用SA-PMPs進行第一輪篩選時CDR3肽反應性噬菌體的產率，而一、二、三分別代表使用Reacti-Bind Neutravidin包被聚苯乙烯反應板進行第一輪、第二輪和第三輪篩選時CDR3肽反應性噬菌體的產率。
圖10 利用Iasys生物傳感器監測第三輪篩選的噬菌體與CDR3多肽的反應。曲線1為OT3與噬菌體反應的生物傳感器檢測曲線，它們分別由1種或5種不同濃度的同一種噬菌體洗脫液相對應的1種或5種反應結果組成，用“起始”和“結束”分別標注了一種濃度的噬菌體的加入及結束。A為第三次篩選的噬菌體與CDR3短肽的反應結果；B為第一次篩選時非結合噬菌體與CDR3短肽的反應結果，做為對照。
圖11 利用IAsysPlus生物傳感器監測用CDR3肽釣取的噬菌體與CDR3肽的反應。曲線1為OT3與噬菌體反應的生物傳感器檢測曲線，它們由3種、4種或5種不同濃度的同一種噬菌體洗脫液相對應的3、4、5種反應結果組成，用“起始”和“結束”分別標注了一種濃度的噬菌體的加入及結束。A，B為P3-1和P3-7噬菌體與OT3的反應結果。
具體實施例方式
本發明的其他方面由于本發明技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
實施例實施例1、編碼OT3多肽基因的克隆與序列分析取人卵巢上皮癌的新鮮組織(臨床資料見表1)，提取總RNA；使用特異性引物(Vδ15′-CAGCCTTACAGCTAGAAGATTCAGC-3′，Vδ25′-GCACCATCAGAGAGAGATGAAGGG-3′，Vδ35′-TCACTTGGTGATCTCTCCAGTAAGG-3′，Cδ5′AAACGGATGGTTTGGTATGAGGC-3′。(其中Vδ1，Vδ2，Vδ3為5′端特異性引物，分別與3′端共用引物Cδ配對使用，可分別擴增出δ1、δ2及δ3亞型CDR3基因片段)對γδT細胞受體δ1、δ2及δ3鏈CDR3基因片段進行RT-PCR擴增。擴增條件如下在50μl反應體系中含有100mM Tris-HCl(PH9.0)，100mM KCL，100mM(NH4)2SO4，20mMMgSO4，1％TritonX-100，2.5mM dNTP10pM引物，1U的TaqDNA聚合酶(上海生物工程公司產品)。按下列條件進行PCR反應94℃預變性5分鐘，然后94℃變性40秒，63.5℃退火50秒，72℃延伸1分鐘，共進行35個循環，最后72℃延伸10分鐘結束反應。擴增產物用玻璃奶DNA回收試劑盒(博大公司產品)進行純化，然后應用連接反應試劑盒(包含T4連接酶及其相應的緩沖液，Promega生產，美國)將RT-PCR擴增片段重組到pGEM-T easy載體(Promega生產，美國)上，轉化DH5α菌株(轉化條件如下將5μl連接產物和90μl感受態細菌共同冰浴30分鐘，然后42℃熱激活90秒，立即冰浴5分鐘，加入200μl不含氨芐青霉素的LB培養基中于37℃，180轉/分鐘搖菌1小時，最后將其涂布于含有氨芐青霉素的LB平板中37℃培養過夜。)，挑選陽性克隆增殖并提取質粒DNA，經EcoR I酶切及PCR鑒定為CDR3基因陽性重組質粒后，進行序列測定。根據基因測序結果推導出相應的γδTIL TCRδ鏈CDR3短肽的氨基酸序列。如表2所示。由于所設計的引物是針對TCRδ鏈CDR3區兩端的保守的側翼序列的，而CDR3區本身在序列上又存在著高度的多態性，因此氨基酸序列的分析結果顯示，所有已測序的CDR3片段不存在共同的保守序列。我們經上述實驗共克隆得到了14條TCRδ鏈CDR3區序列；依據后續實驗的技術要求，我們選擇適宜的片段長度及等電點等合成OT3多肽。經HPLC分析其純度為90％以上。
表1.卵巢癌組織標本臨床病理資料編號 年齡 病案號病理診斷OEC1 50C693107 雙側高分化漿液性乳頭狀癌OEC2 59C685632 雙側高分化粘液腺癌，不排除轉移性OEC3 70C693829 雙側中-低分化移行細胞癌OEC4 55C694101 雙側中-低分化子宮內膜樣癌，部分為透明細胞癌OEC5 53C692651 右側低分化漿液性乳頭狀癌OEC6 47C694852 雙側低分化癌(可能為鱗癌或癌肉瘤，不除外轉移性)OEC7 55C700353 雙側低分化漿液性乳頭狀癌，部分呈移行細胞癌分化OEC8 48C696652 左卵巢透明細胞癌OEC9 48C690257 雙側中分化漿液性乳頭狀癌OEC10 49C696543 右側低分化漿液性乳頭狀癌實施例2、OT3多肽與卵巢上皮癌結合特異性的驗證(1)OT3的固定按照IAsys生物傳感器(Affinity Sensor，Franklin，法國)的使用說明書，首先對固定反應緩沖液(5mM馬來西酸)的pH值(6.00，5.50，5.75，6.22；)及OT3短肽的濃度(0.05，0.10，和0.01μg/μl)進行了優化篩選。通過EDC/NHS活化CM-Dextran兩孔反應池(Affinity Sensor，Franklin，法國)后，在最佳的反應緩沖液及CDR3多肽濃度條件下，將OT3固定在反應池的CMD表面上。經優化篩選，OT3固定反應緩沖液(5mM馬來西酸)的最佳pH值均為6.00(圖1)，最適濃度分別為0.10μg/μl和0.50μg/μl(圖2)。采用上述最佳pH值的固定反應緩沖液及最適肽濃度，經EDC/NHS作用，分別將OT3固定至CM-Dextran兩孔反應池的CMD表面上；按200arcseconds相對應每平方毫米CMD表面結合1ng蛋白計算，固定在CMD表面上的OT3分別約為10ng/mm2(圖3)。
(2)利用BIA技術檢測OT3與完整細胞的反應性將培養的卵巢癌腫瘤細胞SKOV3、OVCA3、胃癌細胞803及喉表皮樣癌細胞hep-2，經胰蛋白酶消化后，用反應緩沖液PBS/T(10mMPBS，0.05％Tween-20，pH7.4)分別稀釋成2×104、5×104、1.5×105、2×105或1×106cell/ml，待檢。同時取人外周血，通過常規方法制備外周血單核細胞(PBMC)，用于正常細胞對照。用50μlPBS/T洗curvette3次后，開始收集數據，約5-10分鐘，此時段為基線(baseline)；待基線平穩后，移去反應池內的PBS/T，迅速加入45μlPBST及5μl細胞懸液，反應5-10分鐘，此時段為結合曲線(bindingcurve)；待結合曲線幾乎水平后，用PBS/T洗3次，在第3次加入PBS/T后，作用約1分鐘，此時段為洗脫曲線(dissociation curve)；待洗脫曲線趨于水平后，用1M甲酸洗3次，此時為再生曲線(regenerationcurve)。上述步驟為一個反應過程，重復上述過程可檢測不同濃度或不同細胞與OT3之間的反應。當冼脫效果不好時，可以重復洗脫。
(3)利用BIA技術檢測OT3與提取的腫瘤細胞粗蛋白的反應用哺乳動物細胞蛋白提取試劑(M-PER Mammalian ProteinExtraction Reagent，Pierce公司生產，美國)提取腫瘤細胞粗蛋白。取卵巢癌腫瘤細胞SKOV3和OVCA3接種到培養瓶中，待其長滿單層后，加入1ml該試劑，并按其說明書提取相應細胞蛋白。取正常Balb/C雌鼠卵巢組織，提取其組織蛋白，做為對照。按材料與方法3所介紹的步驟，檢測上述粗蛋白與OT3的反應。結果示卵巢癌腫瘤細胞SKOV3及其蛋白提取物以及人卵巢癌組織OEC1、OEC3、OEC4及OEC10的蛋白提取物，均能與OT3發生反應，且隨著其濃度的升高，其反應性也在增強(圖4A-F)；而人正常外周血單核細胞(PBMC)、喉表皮樣癌細胞hep-2、胃癌細胞803及正常Balb/C鼠卵巢蛋白提取物等與OT3均不發生反應(圖4G-J)。其中803細胞注入的濃度由高到低，余者均為由低到高的順序，故803細胞的濃度反應曲線與其它細胞或蛋白的反應曲線不同。
(4)ELISA驗證BIA技術的檢測結果a.OT3的生物素化用EZ-Link TM Sulfo-NHS-LC-BiotinylationKit(PIERCE生產，美國)將1.5mgOT3進行生物素標記，方法按該試劑盒使用說明書操作。生物素化的OT3用D-Salt Dextran Desaltingcolumn(PIERCE生產，美國)脫鹽，并用紫外分光光度計檢測洗脫過程，收集洗脫峰。(圖5)b.ELISA檢測取用于BIA技術檢測的卵巢癌腫瘤細胞SKOV3、OVCA3、胃癌細胞803、喉表皮樣癌細胞hep-2的粗提蛋白、正常人PBMC及正常Balb/C雌鼠卵巢組織粗提蛋白的相同樣品100μl，包被ELISA檢測板，設空白對照，4℃過夜。PBS/T洗液(0.02MpH7.4PBS，0.05％Tween-20)洗3遍；加入10,000×生物素化的OT3100μl，37℃1小時；PBS/T洗3遍；加入0.1μg/ml辣根過氧化物酶連接的鏈親合素(Horseradishperoxidase conjugated streptavidin，PIERCE生產，美國)100μl，37℃1小時；PBS/T洗3遍；加入底物(0.5μg/ml鄰苯二胺，0.04％H2O2，0.05M檸檬酸-磷酸鹽緩沖液，pH5.5)，37℃作用10分鐘；加2MH2SO4終止反應，酶聯自動讀數儀測OD490值。利用生物素-親和素標記系統建立了用于檢測CDR3與其所識別的抗原間反應的ELISA方法。用該方法檢測了OT3與卵巢癌腫瘤細胞SKOV3、胃癌細胞803、喉表皮樣癌細胞hep-2的粗提蛋白、正常人PBMC及正常Balb/C雌鼠卵巢組織以及人卵巢癌組織OEC1、OEC3、OEC4、OEC10粗提蛋白之間的反應，每個樣品檢測3次求平均值。其中OT3與SKOV3及人卵巢癌組織OEC1、OEC3、OEC4、OEC10的粗提蛋白反應均為陽性，余者皆為陰性，見圖6。這與BIA技術檢測結果相一致。
(5)Dot-ELISA檢測及其結果利用生物素-親和素標記系統建立了用于檢測CDR3與其所識別的抗原間反應的Dot-ELISA方法。用該方法檢測了OT3與卵巢癌腫瘤細胞SKOV3、胃癌細胞803、喉表皮樣癌細胞hep-2的粗提蛋白、正常人PBMC及正常Balb/C雌鼠卵巢組織以及人卵巢癌組織OEC3、OEC4、OEC10粗提蛋白之間的反應。點樣順序相同的膜分別用DAB和化學發光底物染色，二者的結果是一致的，見圖7，其中OT3與SKOV3、人卵巢癌組織OEC3、OEC4、OEC10粗提蛋白反應均為陽性，余者皆為陰性，這與BIA技術檢測結果相一致。盡管2種方法染色結果是一致的，但化學發光底物染色方法的靈敏度遠遠高于DAB方法，本實驗中，其底片爆光時間僅為5秒。
(6)免疫組化用常規方法制備卵巢上皮癌及正常卵巢組織(臨床資料見表1)切片；常規脫蠟至無水乙醇；用3％H2O2處理10min以清除內源性過氧化物酶的活性；水化，PBS沖洗5min×3次；將切片置微波爐中微波輻射，93℃10min；用0.05~0.1％胰蛋白酶消化15min；PBS沖洗5min×3次；10％正常兔血清(PBS稀釋)，室溫孵育10min；PBS沖洗5min×3次；向玻片上滴加10,000×生物素化的OT3反應液，使其恰好覆蓋細胞，室溫孵育1h；PBS沖洗5min×3次；滴加0.1μg/ml鏈親合素標記的辣根過氧化物酶，37℃，孵育30min；PBS沖洗，5min×3；滴加DAB顯色液，適時自來水沖洗終止反應；蘇木素復染，顯微鏡下觀察，明膠封片，照相。另設不加生物素化的OT3做為對照。
對卵巢癌腫瘤組織及因子宮切除而獲得的正常卵巢組織的免疫組織化學染色結果表明，OT3能識別卵巢癌腫瘤組織中的上皮細胞，但不與間質細胞發生反應(圖8A，8B，8C)，并且不加生物素標記的OT3的對照組未發生陽性反應(圖8G)；它們與因子宮切除而獲得的正常卵巢組織的上皮對照細胞不發反應(圖8D，8E，8F)。上述結果表明OT3肽能特異性地識別卵巢癌上皮細胞抗原。
實施例3OT3多肽與白喉毒素的體外偶聯及細胞毒性試驗(1)OT3多肽與白喉毒素衍生物的體外偶聯應用短臂氨基-巰基交聯劑BMPS(PIERCE生產，美國)對OT3多肽和低毒的白喉毒素衍生物進行交聯，具體操作過程參見試劑說明進行。
(2)細胞毒性實驗SKOV3、Ho8910、OVOA及原代培養的卵巢上皮癌細胞分別用含有10％胎牛血清的Myco5A和1640培養基進行培養。將上述細胞系以1×105/ml的濃度加入96孔培養板，每孔100μl；將白喉毒素偶聯OT3多肽調至終濃度為1×10-7～1×10-10/M，并設定相應濃度的OT3多肽和白喉毒素的對照各3復孔，37℃，5％CO2培養18小時后收獲上清，使用CytoTox96非放射性細胞毒性分析試劑盒(Promega生產，美國)進行分析，對比各組的殺傷百分比。
(3)荷瘤裸鼠體內抑瘤實驗采用4周齡雌性Balb/c裸鼠，隨機分成3組白喉毒素偶聯OT3治療組、白喉毒素治療組和對照組，每組8只。取傳代生長良好的人卵巢上皮癌細胞系SKOV3細胞，以RPMI-1640培養基洗滌2次，重懸于無血清RPMI-1640培養基，調細胞濃度為5×106個細胞/ml，裸鼠皮下接種，100μl/只(荷瘤細胞數量為5×105個細胞/只)。接種腫瘤細胞3天后，以1×10-3mM100μl局部注射，對照組用同體積的RPMI-1640培養基注射；腫瘤長出后(接種腫瘤細胞后，7天左右開始有腫瘤結節形成)，觀察腫瘤結節生長情況，每2～3天用游標卡尺測量腫瘤瘤體直徑并記錄。待出瘤裸鼠數及腫瘤個數不再增加時，確定30天為一觀察時段，每3天測量瘤體直徑，共測量10次，結果以各組腫瘤瘤體體積大小來評價。瘤體體積計算公式為瘤體體積(mm3)＝a×b2×0.4(其中a為瘤體長徑，b為瘤體短徑，單位均以mm計)。
實施例4應用OT3多肽篩選噬菌體隨機肽庫以獲得腫瘤相關模擬表位(1)噬菌體滴度測定挑取ER2738菌株原始菌種在LB-Tet平板上進行劃線，于37℃培養過夜。挑取ER2738單菌落，接種于50或100ml燒瓶內的5-10mlLB液體培養基中，于37℃搖床上振蕩培養至對數生長中期(OD600的值約為0.5)。用LB液體培養基對噬菌體進行連續10倍稀釋。擴增的噬菌體培養上清的稀釋倍數一般為108-1011；未擴增的富集篩選的噬菌體洗脫液的稀釋倍數一般為101-104；當培養的細菌處于對數生長中期時，取200μl分裝到EP管中。取10μl各個稀釋倍數的噬菌體，分別加入到分裝了細菌的EP管中，做好標記，輕輕搖動或振蕩，使之混勻，室溫溫育1~5分鐘。將噬菌體與細菌的混合物加入至含有45℃頂層瓊脂的試管中，快速振蕩混勻，立即將管內混合物傾入裝有預熱的LB/IPTG/Xgal平板中，輕輕旋動平皿以確使頂層瓊脂及細菌分布均勻。蓋上平皿，于室溫放置5分鐘，使瓊脂凝固，翻轉后于37℃培養過夜。檢查平板，對藍色噬斑數大約為102的平板進行噬斑計數。噬斑數乘以稀釋倍數等于10μl噬菌體原液的滴度。
(2)、噬菌體擴增從最新劃線的LB-Tet平板上挑取ER2738單菌落，接種于250ml燒瓶內的20mlLB液體培養基中，于37℃搖床上振蕩培養約2小時，至對數生長早期(A600的值小于0.01)。將待擴增的噬菌體洗脫液加入到上述燒瓶中，于37℃持續振搖培養4.5小時。將培養物轉移到離心管中，于4℃，12,000×g離心10分鐘。將上清液轉入另一離心管中，于4℃，12,000×g再次離心10分鐘。取80％的上清液轉入新的離心管中，并加入1/6體積的PEG/NaCl。于4℃放置至少1小后于4℃，12,000×g離心15分鐘，棄上清，再次離心30秒，用微量進樣器移去殘余液體。用1mlTBS懸浮沉淀物，并將其轉移至微量離心管中，于4℃，12,000×g離心5分鐘，使混雜的少量細菌沉淀。將上清轉入新的離心管中，用1/6體積的PEG/NaCl再次沉淀噬菌體，冰浴15-60分鐘。于4℃，12,000×g離心10分鐘，去上清，離心30秒，用微量進樣器移去殘余液體。用200μlTBS懸浮沉淀物。離心1分鐘，以沉淀不溶的物質。將上清轉移到1個新的微量離心管中。這便是擴增的噬菌體懸液。對其進行滴度測定，于4℃保存，備用。
(3)Ph.D.-12噬菌體隨第一輪篩選取100μl生物素化的OT3加入Reacti-Bind Neutravidin包被的聚苯乙烯板的反應孔中，放4℃冰箱，過夜。棄掉反應孔中的反應液，每孔加入200μl封閉液，4℃封閉至少1小時。棄掉封閉液，用TBST(TBS+0.1％Tween-20)快速洗6遍。取20μl噬菌體庫原液(約8×1010的噬菌體)，加入180μlTBST，混勻后，分別加入到結合了OT3的反應孔中，100μl/孔，室溫反應1小時。加入生物素至終濃度0.1mmol/L，室溫反應5分鐘。回收未結合的噬菌體，進行噬斑滴度測定并作為陰性對照。用TBST快速洗10遍，用含有1mg/mlBSA的0.2mol/L的Glycine-HCl(pH2.2)洗脫噬菌體，100μl/孔，時間不能超過10分鐘。最后加入1mol/LTris-HCl(pH9.1)對酸性洗脫液進行中和，10μl/孔。取部分的洗脫液用于噬菌體滴度測定及SPR生物傳感器檢測，余者進行擴增，用于下一輪的篩選。
或者取生物素化的OT3100μl，與4×1010pfu的噬菌體庫原液混合，放4℃冰箱，過夜。輕彈且倒轉裝有TheStretavidinMagnesphere磁珠(SA-PMPs)的微量離心管(0.6ml/管)，使SA-PMPs(10mg/ml)分散均勻后，將其旋轉于磁性架上，使SA-PMPs被吸附于管臂側面，約30秒。然后，小心移出液體部分。用PBST洗3次，每次用磁性架捕獲SA-PMPs，并小心移出液體部分。用200μlPBST重懸SA-PMPs，加入OT3與噬菌體的反應液，室溫作用30分鐘。通過磁性架吸附結合噬菌體的SA-PMPs。用PBST洗3次，每次用磁性架捕獲SA-PMPs，并小心移出液體部分。加入生物素至終濃度0.1mmol/L，室溫反應5分鐘。用PBST洗10次，每次用磁性架捕獲SA-PMPs，并小心移出液體部分。用含有1mg/mlBSA的0.2mol/L的Glycine-HCl(pH2.2)洗脫噬菌體，400μl/管，時間不能超過10分鐘。加入1mol/LTris-HCl(pH9.1)對酸性洗脫液進行中和，40μl/管。通過磁性架捕獲SA-PMPs，收集含有噬菌體的洗脫液。12000×g離心5分鐘，去掉SA-PMPs，收集上清。取部分上清用于噬菌體滴度測定，余者進行擴增，用于下一輪的篩選。
第二輪及第三輪篩選的方法與第一輪相同。只不過噬菌體是由其上一輪篩選洗脫噬菌體的增殖產物，為了提高篩選的嚴緊度，其加入量依次為4×109和4×108pfu，并且提高了TBST中的Tween-20的比例，由原來的0.1％變為0.5％。在第一輪篩選中，同時使用TheStretavidinMagnesphere磁珠和Reacti-Bind Neutravidin包被聚苯乙烯板進行篩選，檢測洗脫液中噬菌體的滴度，并計算出其產率，二者的篩選結果相似(圖9)，故第二輪和第三輪只用Reacti-Bind Neutravidin包被聚苯乙烯板進行親和篩選。如圖9所示，經過3輪篩選，親和洗脫的噬菌體回收率顯著提高，說明OT3反應性噬菌體出現了明顯的富集。
(4)SPR生物傳感器檢測親和篩選的噬菌體與OT3之間的反應將OT3進行親和篩選的每一輪所富集洗脫的噬菌體，用反應緩沖液PBS/T(10mMPBS，0.05％Tween-20，pH7.4)分別稀釋成1×104、2×104、4×104、6×104或8×105pfu/ml，將回收的第一輪未結合的噬菌體分別稀釋為1×105pfu/ml，設為對照。并將篩選到的OT3特異性反應噬菌體P3-1擴增后的噬菌體分別稀釋成1×103、2×103、4×103、6×103或8×103pfu/ml。從而用SPR生物傳感器檢測親和篩選的噬菌體與OT3之間的反應。SPR生物傳感器檢測了OT3與第三輪篩選的噬菌體之間的反應，結果見圖10，OT3與其所對應的第三輪篩選的噬菌體均能發生特異性反應，而用于對照的第一輪篩選時未結合的噬菌體與OT3幾乎不發生反應。所有檢測的用于測序的噬菌體與其所對應的OT3的反應結果均為陽性反應，見圖11。
(5)噬菌體的序列測定取第3輪篩選后的噬菌體懸液，適當稀釋，按每個平板含有20個噬斑的量進行噬斑培養。待形成噬斑后，隨機挑取獨立的噬斑擴增純化后，制備成噬菌體懸液，進行噬斑滴定。取200μl噬菌體溶液(約1011顆粒數)用酚和氯仿各抽提一次。最后的上清轉至一新管，加入250μlTE和40μl3mol/LNaCl、1ml乙醇，4℃作用1小時以上。12000×g離心30分鐘，或獲得噬菌體單鏈DNA沉淀。用70％乙醇洗一次沉淀，棄盡殘雜液體至完全干燥，用7.5μlddH2O溶解，-20℃保存備用。將純化的噬菌體單鏈DNA送華大生物公司測序。測序引物為-96gIII測序引物。序列分析結果表明，基因序列的同源性很小，但氨基酸序列的同源性較高，并且OT3反應性的噬菌體分別存在完全相同或部分共同的序列。
(6)噬菌體肽序列的驗證人工合成上述實驗所得肽序列，與BSA偶聯后免疫小鼠制備單克隆抗體，然后經生物素化后與FITC偶聯，利用激光共聚焦顯微鏡檢測其與卵巢癌細胞系SKOV3、HO8910、OVCA，以及原代培養的卵巢癌細胞系是否有特異性結合；并在此基礎上提取上述細胞系的膜蛋白，經免疫印跡(Western Blot)進一步驗證與單抗結合的蛋白成分，最后經質譜分析確定該組分。
序列表<110>中國醫學科學院基礎醫學研究所<120>一種識別腫瘤細胞的多核苷酸、其編碼的多肽及用途<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>72<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)..(69)<223>
<400>1tgt gac ttt ccg agt cac acg ttc cac agt act ggg gga cac acg acc 48Cys Asp Phe Pro Ser His Thr Phe His Ser Thr Gly Gly His Thr Thr1 5 10 15gat aaa ctc atc ttt gga aaa gga 72Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys20<210>2<211>23<212>PRT<213>人<400>2Cys Asp Phe Pro Ser His Thr Phe His Ser Thr Gly Gly His Thr Thr1 5 10 15Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys20
權利要求
1.一種分離的多核苷酸，選自a)包含SEQ ID NO.1的多核苷酸；b)SEQ ID NO.1的多核苷酸的反義核苷酸序列；c)一種在嚴緊條件下與SEQ ID NO.1序列或其片斷雜交的多核苷酸序列；d)一種具有與SEQ ID NO.1的多核苷酸序列至少70％同源并且編碼相同功能多肽的多核苷酸序列。
2.一種具有與SEQ ID NO.1的多核苷酸具有至少95％同源并且編碼相同功能多肽的多核苷酸序列。
3.一種重組載體，它含有權利要求1所述的多核苷酸。
4.一種轉化的宿主細胞，它含有權利要求3所述的重組載體。
5.根據權利要求3所述的重組載體，它是由權利要求1或2所述的多核苷酸與細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒和腺病毒、腺相關病毒、單純皰疹病毒、逆轉錄病毒等載體所組成的重組載體。
6.根據權利要求3所述的重組載體，它是由權利要求1或2所述的多核苷酸與編碼其它多肽或蛋白核苷酸序列構建而成的基因重組載體。
7.根據權利要求3所述的重組載體，它是一種表達載體。
8.一種如權利要求1所述的多核苷酸編碼的具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、其活性片段、類似物或衍生物。
9.一種與權利要求8所述的多肽、其活性片斷、類似物或衍生物結合的抗體。
10.權利要求1所述的多核苷酸在制備用于診斷或治療與γδTCRCDR3多肽相關腫瘤疾病的藥物中的用途。
11.根據權利要求10所述的用途，其中所述的腫瘤為卵巢癌。
12.具有由權利要求1所述的多核苷酸編碼的如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、其活性片段、類似物或衍生物在制備用于診斷或治療與γδTCR CDR3多肽相關腫瘤的藥物中的用途。
13.一種模擬或調節權利要求8所述的多肽表達的化合物，其中所述的化合物可以模擬或促進γδTCR CDR3多肽的活性。
14.一種藥物組合物，它含有治療有效量的如權利要求1或2所述的多核苷酸或其編碼的如權利要求8所述的多肽或其活性片斷、類似物或衍生物和藥學上可以接受的載體。
15.一種腫瘤疫苗，其特征在于它含有權利要求1所述的多核苷酸編碼的多肽所識別的免疫有效量腫瘤抗原表位、完整腫瘤抗原或編碼上述腫瘤抗原及其表位的多核苷酸以及包含該序列的基因重組載體和藥學上可以接受的佐劑。
全文摘要
本發明涉及一種新的多核苷酸及其編碼的多肽。具體而言，本發明涉及一種能特異性識別卵巢癌的抗原識別受體(gamma delta TCR)互補決定區域(CDR)3多肽(即“OT3”)的氨基酸序列、其活性片斷、類似物或衍生物，以及所述的多肽及編碼該多肽的核苷酸序列在制備用于診斷或治療腫瘤的藥物中的用途。
文檔編號C07K16/00GK1504476SQ0215392
公開日2004年6月16日 申請日期2002年12月5日 優先權日2002年12月5日
發明者何維, 何洪彬, 徐涌, 牛海濤, 姚一洲, 張惠媛, 崔蓮仙, 何 維 申請人:中國醫學科學院基礎醫學研究所