專利名稱：三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿的提取方法
技術領域：
本發明涉及一種生物成分的提取方法，特別是涉及一種天然抗癌藥物——三尖杉酯堿與高三杉酯堿的提取方法。
背景技術：
隨著科學技術的不斷發展，人們對許多原來是不治之癥的疾病都找到了治療的方法。一種極其稀有的樹種——三尖杉(CephalotaxusLanceolata K.M.Feng)，經臨床醫學測定，其樹皮及其他部位內含有的生物堿——三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿，是天然的抗白血病的良藥，這種生物制劑的問世，給許多瀕于死亡的白血病患者帶來了生命的希望。
傳統的提取工藝是以三尖杉樹皮為原料，采用酒精滲漉，回收酒精，經多次反復酸堿處理，氯仿萃取，再經中性氧化鋁吸附柱層析，硅膠分配柱層析，得到三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿。
上述方法的不足之處在于生產工藝復雜，周期長，可操作性差，生產量極小，環境污染較嚴重，回收率低，無法實現工業化連續操作，且極大破壞珍稀樹種資源，不利于保護生態環境。
中國專利局公布了申請號為99806044.5的“新的三尖杉烷衍生物及其制備方法”的發明(申請日期為1999.03.17)，該發明公布了一種采用側鏈前體構成的酰化物直接酯化天然的三尖杉堿的方式，提供了一種通過化學合成來生成三尖杉酯堿的方法。
該方法投資成本較大，且仍需采用天然三尖杉堿作為原料，同樣具有前述傳統工藝的缺點。
發明內容
本發明的目的在于提供了一種能簡化生產工藝，合理使用珍稀樹種資源，減少廢物排放，并能有效提高制劑產量的方法。
為了達到上述目的，本發明采用了含量較樹皮低但可再生的三尖杉小枝葉為原料，經過打粉并用10％稀氨水堿化→超臨界CO2流體萃取→分離回收三尖杉總生物堿→吸附樹脂連續柱層析→回收三尖杉混合酯堿→制備高速逆流色譜并經紫外檢測得到三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿單體和少量的二者混合物→分別重結晶純化得到供制劑用的純品。
所述原料打粉粉粒度為0.5-3mm，物料堆積密度為228kg/m3。
所述超臨界CO2流體以乙醇為夾帶劑，流量為180-190kg/h；所述超臨界萃取的工藝條件是萃取時間為3h，萃取溫度為40℃，萃取壓力為20Mpa；所述吸附樹脂連續柱層析由四個過程組成一次大孔吸附樹脂柱層析→一次離子交換柱層析→二次大孔吸附樹脂柱層析→二次離子交換柱層析。
所述大孔吸附樹脂為AB8大孔吸附樹脂，一次大孔吸附樹脂柱層析采用解吸劑為6％檸檬酸-甲醇體系，樣品吸附量按干膏和樹脂1∶15-20比例計算，流速為0.5-5ml/cm2/min；二次大孔吸附樹脂柱層析采用解吸劑為pH5.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液與甲醇體系，樣品吸附量按干膏和樹脂1∶10-15比例計算，流速為0.5-5ml/cm2/min。所述離子交換樹脂為100*7#陽離子交換樹脂，一次離子交換樹脂柱層析所采用的解吸劑為不同pH濃度的氫氧化鈉與甲醇體系，樣品交換容量按干膏和樹脂1∶20比例，流速為0.5-3ml/cm2/min；二次離子交換樹脂柱層析采用的解吸劑為pH9.0以上的氫氧化鈉與甲醇體系，樣品交換容量按干膏和樹脂1∶20比例，流速為0.5-3ml/cm2/min。
所述高速逆流色譜按如下方法制備柱體積為1000ml，溶劑系統為氯仿，0.07mol/L磷酸鈉-0.04mol/L檸檬酸組成的pH值為5.0的緩沖液，保留值80％，轉速800轉/min，流速200ml/h，檢測波長為284nm，每2分鐘自動收集每管檢測。
由于采用上述工藝，使本發明具有了如下優點(1)使用了含量較樹皮低但可易再生且資源遠比樹皮豐富的三尖杉小枝葉代替樹皮作為原料，解決了三尖杉樹皮的稀缺問題，保護了物種資源；(2)使用了來源廣泛且能回收的CO2代替有毒溶劑，可在近常溫條件下進行操作，利于生物活性物質的提取，且減少了工藝步驟，降低污染和能耗；(3)使用吸附樹脂連續柱層析的技術，既可以降低能耗，實現工業化連續生產，又能減少有機溶劑的排放，保護人類的生態環境，且吸附樹脂可以再生反復利用，極大地降低了生產成本；(4)采用逆流色譜不用固態支撐體，完全排除了支撐體對樣品組分的吸附、玷染、變性、失活等不良影響，能避免不可逆吸附所造成的溶質色譜峰拖尾現象，可實現很高的回收率；本發明的提出簡化了生產工藝，減少了對環境的污染，提高了生產效率，滿足了日益增長的天然抗癌藥物的市場需求，保護了珍貴的自然資源和生態環境，使得人與自然能夠協調發展。
附圖所示是本發明工藝流程圖。
具體實施例方式
下面結合附圖對本發明的最佳實施方式作進一步的詳細描述。
原料先用破碎機打成粗粉，粉粒度為0.5-3mm。粉狀物料用10％稀氨水堿化后，裝入1000升料筐內，堆積密度為228kg/m3。
把裝有物料的料筐吊入萃取釜內，關閉并鎖緊卡箍，將以85％乙醇為夾帶劑的液體CO2，經預熱器加熱后，打入萃取釜，對物料進行正向超臨界萃取，CO2流量為180-190kg/h，萃取時間為3h，萃取溫度為40℃，萃取壓力為20Mpa；攜帶有效成份的超臨界流體，經截流閥減壓、降溫后，進入分離器中分離，其中有效成份經高效液相色譜儀測定收集，即得總生物堿，CO2氣體經冷凝器液化后，流入回收罐，再經高壓泵加壓循環使用。
選擇AB8大孔吸附樹脂和100*7#陽離子交換樹脂為柱層析的載體，樹脂需預先處理，以乙醇連續洗滌數次，至洗滌液加適量水無白色渾濁(1ml乙醇液加5ml水)時，然后以大量的蒸餾水洗去乙醇，備用。上樣液經預先沉淀，PH值調節至7.5-8.0，過濾，乙醇濕法裝柱，開啟蠕動泵，以干膏和樹脂的比例為1∶15-20上樣，以6％檸檬酸-甲醇緩沖液體系作為洗脫液解吸，流速為0.5-5ml/cm2/min，用高效液相色譜儀測定。
繼續進行離子交換樹脂柱層析，將備好的陽離子交換樹脂裝柱，以干膏和樹脂的比例為1∶10-15上樣，以氫氧化鈉-甲醇體系按不同pH值制成的梯度洗脫液連續不斷地流過柱體洗脫，流速為0.5-3ml/cm2/min，分段收集，用高效液相色譜儀測定。
選擇pH7-8流份，旋轉蒸發器濃縮體積的六分之一，第二次上大孔吸附樹脂柱，以pH值為5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液與甲醇體系作為洗脫液連續不斷地流過柱體，樣品吸附量按干膏和樹脂1∶10-15比例計算，流速仍為0.5-5ml/cm2/min，用高效液相色譜儀測定。
第二次上離子交換樹脂柱層析，以干膏和樹脂的比例為1∶20上樣，以pH值為9.0以上的氫氧化鈉與甲醇體系的洗脫液連續不斷地流過柱體，流速仍為0.5-3ml/cm2/min，收集流份，用高效液相色譜儀測定，蒸干，即得混合酯堿。
制備高速逆流色譜，選擇溶劑系統為氯仿、0.07mol/L磷酸鈉-0.04mol/L檸檬酸組成的pH值為5.0緩沖液，將選好的兩相互不相溶的溶劑在分液漏斗中充分振搖后靜置分層。取上相作為固定相，下相作為流動相，先將固定相注滿管柱，柱體積為1000ml，再將流動相以200ml/h的流速泵入，待流動相從管柱出口流出，基線穩定后，將樣品由進樣器注入，進樣量為15ml，此時按800r/min的轉動速度啟動主機，管柱流出物經UV(紫外線)檢測，檢測波長為284mm，收集峰I、II、III，每2分鐘自動收集每管檢測；洗脫液收集300ml后，以下相溶劑反向洗脫，按如上述方式又收集峰a、b、c，即得三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿和少量二者混合物。
二種單體經不同的溶劑重結晶純化，可得到供制劑用的純品。
通過以上工藝方式得到的二種單體，其純度可達98％以上，比原工藝純度提高約3％左右，回收率達80％，比原工藝提高了20％左右。
權利要求
1.一種提取三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿的方法，其特征在于采用含量較低的可再生的三尖杉小枝葉為原料，以如下加工工藝過程制備而成打粉并用10％稀氨水堿化→超臨界CO2流體萃取→分離回收三尖杉總生物堿→吸附樹脂連續柱層析→回收三尖杉混合酯堿→制備高速逆流色譜并經紫外檢測得到三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿單體和少量的二者混合物→分別重結晶純化得到供制劑用的純品。
2.根據權利要求1所述的三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿的提取方法，其特征是，原料打粉粉粒度為0.5-3mm，物料堆積密度為228kg/m3。
3.根據權利要求1所述的三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿的提取方法，其特征是，超臨界CO2流體加以乙醇為夾帶劑，流量為180-190kg/h；
4.根據權利要求1所述的三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿的提取方法，其特征是，超臨界萃取的工藝條件是萃取時間為3h，萃取溫度為40℃，萃取壓力為20Mpa；
5.根據權利要求1所述的三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿的提取方法，其特征是，吸附樹脂連續柱層析由四個過程組成一次大孔吸附樹脂柱層析→一次離子樹脂交換柱層析→二次大孔吸附樹脂柱層析→二次離子交換樹脂柱層析。
6.根據權利要求1或5所述的三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿的提取方法，其特征是，所采用的大孔吸附樹脂為AB8大孔吸附樹脂，一次大孔吸附樹脂柱層析采用解吸劑為6％檸檬酸-甲醇體系，樣品吸附量按干膏和樹脂1∶15-20比例計算，流速為0.5-5ml/cm2/min；二次大孔吸附樹脂柱層析采用解吸劑為pH5.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液與甲醇體系，樣品吸附量按干膏和樹脂1∶10-15比例計算，流速為0.5-5ml/cm2/min。
7.根據權利要求1或5所述的三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿的提取方法，其特征是，所采用的離子交換樹脂為100*7#陽離子交換樹脂，一次離子交換樹脂柱層析所采用的解吸劑為不同pH濃度的氫氧化鈉與甲醇體系，樣品交換容量按干膏和樹脂1∶20比例，流速為0.5-3ml/cm2/min；二次離子交換樹脂柱層析采用的解吸劑為pH9.0以上的氫氧化鈉與甲醇體系，樣品交換容量按干膏和樹脂1∶20比例，流速為0.5-3ml/cm2/min。
8.根據權利要求1所述的三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿的提取方法，其特征是，高速逆流色譜按如下方法制備柱體積為1000ml，溶劑系統為氯仿，0.07mol/L磷酸鈉-0.04ml/L檸檬酸組成的pH值為5.0的緩沖液，保留值80％，轉速800轉/min，流速200ml/h，檢測波長為284nm，每2分鐘自動收集每管檢測。
全文摘要
本發明提供了一種能簡化生產工藝，合理使用珍稀樹種資源，減少廢物排放，并能有效提高制劑產量的方法。本發明采用了含量較低的可再生的三尖杉小枝葉為原料，經過打粉并用10％稀氨水堿化→超臨界CO
文檔編號C07D491/00GK1493572SQ0215032
公開日2004年5月5日 申請日期2002年11月1日 優先權日2002年11月1日
發明者李國平, 吳雪平 申請人:福建廣生堂藥業有限公司