專利名稱：分離制備卵磷脂的方法及實施該方法的裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種分離制備高純度卵磷脂的方法和實施該方法的裝置。本發明尤其涉及利用超臨界流體制備色譜的方法從大豆及蛋黃磷脂提取物中分離出單組分卵磷脂，特別是磷脂酰膽堿的工藝。
現有技術商業上廣義的卵磷脂實際上是指包含多種不同化學構造的磷脂質，一般包括磷脂酰膽堿(Phosphotidyl choline，俗稱PC)，磷脂酰乙醇胺(Phosphotidyl ethanolamine，俗稱PE)，磷脂酰肌醇(Phosphotidylinostol，PI)，磷脂酰絲氨酸(Phosphotidyl serine，PS)，磷脂酸(Phosphotidyl acid，PA)等。但是從專業和技術角度狹義的卵磷脂是指磷脂酰膽堿(PC)。
卵磷脂在分子構造上具有兩條疏水性長脂肪酸鏈及親水性磷酸根離子及堿基離子，是一種典型的離子型表面活性劑。由于其本身固有的乳化、軟化、分散、潤濕、抗氧化及生理活性等一系列特性，因此用途十分廣泛，是食品、醫藥、化妝品、皮革制品、輕工、電子等行業中的重要原料。
在本發明以前，卵磷脂的提取和分離方法主要有有機溶劑法、超臨界二氧化碳抽提法等。如專利申請CN1214340，名稱為“高純磷脂精細分離方法”，其中記載了采用大豆油油腳為原料，經己烷萃取、除雜、脫色、回收己烷和丙酮萃取來完成分離磷脂的方法；又如發明專利CN1257660，名稱為“由蛋黃粉獲得尤其是卵磷脂的方法”，公開了用超臨界流體萃取蛋黃粉，通過多步驟方法處理提取物，提取出有用物質，尤其重要的是獲得卵磷脂。這些方法都把重點放在提高磷脂總量上，都沒有涉及如何得到單組分磷脂，也就是說，本發明以前的現有技術的一個共同的缺憾就是難以分離得到高純度PC、PE的卵磷脂且過程復雜。
已知磷脂的性質隨各組分含量的變化而不同，而卵磷脂PC的表面活性強于其他組分，所以在制備靜脈注射劑、合成藥物原料或生化試劑中，都需要高純度的單組分磷脂，尤其是卵磷脂PC。用于制藥目的，高純度蛋黃或大豆磷脂酰膽堿(PC)的分離制備主要采用高效液相色譜。然而到目前為止，所報道的一些方法不是負載能力差，就是溶劑消耗大。由于磷脂產物的熱穩定性差，磷脂產品與溶劑的分離困難，特別是有些方法中還要采用混合溶劑梯度沖洗，使溶劑難以回收利用。
因此，通過可行的工藝方法從磷脂中將PC分離出來，得到純度盡可能高的PC產品，在制藥、制備生化制劑等領域中具有很實際的意義。
總之，現有技術的不足之處在于所生產的卵磷脂為多種磷脂化合物的混合物，不僅工藝復雜且產品中重要組分(例如PC)純度不夠高。本發明所要解決的問題就是避免使用大量有機溶劑和復雜的工藝步驟，采用超臨界流體制備色譜，建立一種生產高純度磷脂產品，尤其是高純度PC的體系。
發明內容
本發明提供了一種利用超臨界流體制備色譜從磷脂提取物中分離制備高純度卵磷脂的方法，通過控制組分切割，不需要繁瑣的工藝過程，就可以收集到基本上是單組分的高純度PC和PE等重要的磷脂產物。
基于上述方法，本發明還提供了用于實施方法的分離純化裝置，即，超臨界流體制備色譜裝置，建立一種生產高純度磷脂產品的體系。
根據本發明的方法，其特征在于采用超臨界流體制備色譜法，對磷脂提取物進行提取，即，以超臨界流體作為流動相將原料帶入色譜柱中進行分離，根據化合物保留時間及其出峰時間進行組分切割和收集，進而實現高純度卵磷脂組分的分離，尤其是可以得到基本上是單組分的磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺等具有高價值的磷脂產品。
本發明的方法是以含PC的大豆磷脂或蛋黃磷脂或其他種類的植物磷脂提取物為原料，采用超臨界流體制備色譜來分離純化卵磷脂中的PC(同時可以得到PE及其它相關產物)。超臨界流體中的溶劑可使用常規超臨界流體萃取操作所采用的溶劑，例如二氧化碳、低級烴類等，從產物的安全性角度，優選使用二氧化碳或C2-C4的低級烷烴。本發明的流動相中包括一定體積比的溶劑與攜帶劑，固定相包括粒徑為3-30μ的空白硅膠或鍵合硅膠。其中，攜帶劑在流動相中的體積含量為1-30％。
根據本發明的方法，攜帶劑可以為低級醇，也可以是低級醇+微量強極性組分。所述低級醇為4個碳以內(包括4個碳原子的)的一元醇和二元醇。當其中還包括微量強極性組分時，該組分可以選自水、氨水、三乙胺、三乙醇胺、磷酸、鹽酸、三氟乙酸或它們的混合物。該微量強極性組分的質量含量是0.001m％-1.0m％。
根據本發明的優選方案，所采用的鍵合硅膠固定相可以是C18鍵合相，C30鍵合相、苯基、雙醇基或氨基鍵合相固定相等，通常以勻漿裝填法或壓縮柱技術(軸向或徑向)進行填充，在分離過程中采用動態壓縮技術使色譜填料處于密實狀態。
根據本發明的方法，其原理是利用超臨界流體首先對原料中的磷脂組分進行提取，使之溶解后被送入色譜柱中，混合物中各組分由于受超臨界流體的溶解作用和固定相吸附力的大小不同而得到分離，進而按照不同的先后順序流出，根據各組分的保留時間及其出峰區間，通過微機控制實現組分切割和收集。
根據本發明的方法，先使溶劑和攜帶劑混合成為超臨界流體，然后作為色譜分離的流動相，其將待分離原料帶入色譜柱，溫度為20-80℃，壓力為10.0-45.0Mpa。在適當的溫度(20-80℃)和壓力(10.0-45.0MPa)下，按照保留時間和目標產物的出峰區間將所要分離的組分進行切割，組分的收集采用計算機采集信號并控制接收閥的閥位使不同的組分被收集在不同的收集器中，進樣和產物收集周期性進行，得到的產物經真空干燥脫溶劑，低溫保存。
根據本發明的技術方案，提供了一種超臨界流體制備色譜作為卵磷脂的分離純化設備，其包括溶劑罐和攜帶劑罐；用于超臨界流體及攜帶劑輸送的高壓注射泵；自動控制進樣器；可在線裝填的軸向壓縮色譜柱；在線檢檢測器和多通道切換閥組；用于分離產物與溶劑的分離器；用于分離溶劑與攜帶劑的分離裝置；其中待分離樣品的進樣和分離產物的接收由計算機控制定時或自動切換。
從以上說明可以看出，本發明將超臨界流體技術與制備色譜法結合有效起來，提出了一套可有效分離純化卵磷脂的超臨界制備色譜，同時選擇適當的流動相和固定相，實現卵磷脂的純化和分離。本發明最重要的是建立了一套卵磷脂的分離制備體系(本發明稱之為超臨界流體制備色譜)，以經任何可行方法制備得到的磷脂提取物為原料，對其進一步分離精制，可以得到高純度的單組分磷脂產品，尤其可以得到高純度單組分卵磷脂(PC和PE)，提取純度可達98m％以(質量百分比)上。本發明由于采用超臨界流體，使用例如二氧化碳和低級烴作為色譜流動相，流動相可以循環使用，與現有技術相比具有節省溶劑，樣品回收和后處理簡便，操作條件溫和，工藝簡單等優點。
需要說明的是，根據通常的理解，目前在本領域中所稱的“超臨界流體”包括了在亞臨界態和超臨界態的流體，也就是說，在臨界溫度附近的流體都被稱為超臨界流體。本發明中也沿用這樣的定義，在本發明的權利要求書和說明書中所提到的“超臨界流體”都應理解為包括在臨界溫度附近的亞臨界態和超臨界態流體。
以下通過圖示說明和具體實施例詳細說明本發明的有益效果。
圖1是本發明提供的超臨界流體制備色譜流程圖。
參看圖1，本發明超臨界流體制備色譜分離純化卵磷脂的原理和過程如下。溶劑和攜帶劑分別由溶劑罐001和攜帶劑罐003經高壓泵101、102成為超臨界流體，經輸出混合作為色譜流動相，進入烘箱201中被加熱到預定的溫度。待分離原料由泵103抽出送入高壓進樣器301，并被流動相帶入色譜柱401中，該高壓進樣器由計算機控制脈沖進樣，混合物中各組分由于受超臨界流體的溶解作用力和固定相吸附力的大小不同得到分離，按不同的先后順序流出，通過檢測器501得到產物流出的信號，由計算機901控制多通道閥組601-602切換到指定的收集器701-706中，在進入收集器前降低超臨界流體流動相的壓力，將產物分離出來。溶劑經冷卻器801循環回溶劑罐，攜帶劑在溶劑罐中分離后回到攜帶劑罐003，002是超臨界流體儲罐。
在操作前利用PC、PE等化合物組分的標準品，將相關信息輸入計算機，這樣，原料的進樣和產物的收集都由計算機901控制完成。
實施例下面的具體實施例用于幫助閱讀者理解本發明的實現和所帶來的有益效果，并不能構成對本發明實施范圍的限定。
各實施例的具體操作參見圖1所示流程圖及上面結合圖1的描述。
原料中PC和PE的含量測定可以采用柱薄層色譜分析法(TLC-FID)。TLC-FID薄層色譜分析法以膽固醇乙酰酯(Cholesterol acetate choA)為內標物，標準液和樣品液均以Folch溶劑(氯仿∶甲醇＝2∶1)配制，蛋黃卵磷脂的分析用兩種展開劑，展開劑A氯仿∶甲醇∶水＝10∶5∶0.5，展開至5cm；展開劑B正己烷∶乙醚∶甲酸＝54∶6∶0.08，展開至10cm，然后用FID掃描檢測并計算PC，PE等各譜峰面積及含量。大豆卵磷脂的兩種展開劑分別為，展開劑A氯仿∶甲醇∶冰醋酸∶丙酮∶水＝35∶25∶4∶14∶2，展開劑B正己烷/乙醚＝4∶1，同樣方法展開后用FID掃描檢測并計算PC，PE等各譜峰面積及含量。
實施例1利用Φ25*250mm硅膠(5μ)制備柱上對大豆磷脂提取物進行分離，測定該提取物中PC質量含量為34％，色譜填料以40MPa壓力軸向動態壓縮。操作壓力25MPa，溫度為40℃，流動相流速為8ml/min，攜帶劑體積含量為20％。流動相中溶劑使用二氧化碳，攜帶劑為乙醇+三乙胺+三乙醇胺，攜帶劑中三乙胺+三乙醇胺的濃度為0.1m％，且三乙胺∶三乙醇胺＝75m％∶25m％。每次循環為12分鐘，每天40次循環，進樣量1.4g，收集PE、PC組分，經脫除其中的微量溶劑，測得PE純度為95m％，PC純度為97m％，原料中PE和PC的總回收率為90m％。
實施例2在Φ25*500mm C18硅膠鍵合相(10μ)制備柱上對大豆磷脂提取物進行分離，該大豆磷脂提取物中的PC質量含量為53％，色譜填料以35MPa壓力軸向動態壓縮。操作壓力15MPa，溫度為80℃，流動相流速15ml/min，攜帶劑加入量為10％。流動相中的溶劑是丙烷，攜帶劑為乙醇+三氟乙酸+磷酸，攜帶劑中三氟乙酸+磷酸濃度為0.05m％，且三氟乙酸∶磷酸濃度＝40m％∶60m％。每次循環為6分鐘，每天80次循環，原料處理量為3.0g，收集PC組分，經色譜檢驗PC純度為98m％，回收率為92m％。
實施例3在Φ100*500mm苯基硅膠鍵合相(10μ)制備柱上對蛋黃卵磷脂提取物進行分離，該提取物中PC質量含量80m％，色譜填料以45MPa壓力軸向動態壓縮。操作壓力30MPa，溫度為35℃，攜帶劑加入量為5m％。流動相中的溶劑是二氧化碳，攜帶劑為乙醇+水+磷酸，攜帶劑中水+磷酸的濃度為0.01m％，且水∶磷酸＝70m％∶30m％。流動相流速150ml/min，每次循環為10分鐘，每天進行50次進樣，處理樣品約為50.0g。收集PC組分，經色譜檢驗純度大于98.5m％，回收率為95m％。
實施例4在Φ100*500mm C30硅膠鍵合相(20μ)制備柱上對PC含量70m％的大豆磷脂提取物進行分離，色譜填料以40MPa壓力軸向動態壓縮。流動相中的溶劑是二氧化碳，壓力30MPa，溫度為55℃，攜帶劑加入量為8m％，攜帶劑為乙醇+水+鹽酸，攜帶劑中水+鹽酸的濃度為1.0m％，且水∶鹽酸＝90m％∶10m％。流動相流速150ml/min。每次循環為12分鐘，每天進行40次進樣，處理樣品為80g。收集PE、PC組分，經檢驗PE組分純度為95m％，PC純度為97m％，PE和PC的總回收率為93m％。
權利要求
1.卵磷脂的分離制備方法，其特征在于以磷脂提取物為原料，采用超臨界流體制備色譜法，以超臨界流體作為流動相將原料帶入色譜柱中進行分離，根據各化合物保留時間及其出峰時間進行組分切割和收集。
2.權利要求1所述的方法，其中，所述超臨界流體制備色譜的流動相中包括溶劑和攜帶劑，所述溶劑選自二氧化碳或C2-C4烷烴，所述攜帶劑中含有C1-C4的一元醇或含有C2-C4的二元醇，攜帶劑在流動相中的體積含量為1-30％；固定相包括粒徑為3-30μ的空白硅膠或鍵合硅膠。
3.權利要求2所述的方法，其中，所述攜帶劑中還含有強極性組分，其質量含量為0.001-1.0m％。
4.權利要求3所述的方法，其中，所述強極性組分為水、氨水、三乙胺、三乙醇胺、磷酸、鹽酸、三氟乙酸或它們的混合物。
5.權利要求2所述的方法，其中，所述鍵合固定相為C18鍵合相，C30鍵合相，苯基、雙醇基或氨基鍵合相固定相。
6.權利要求1或2所述的方法，其中，所述磷脂提取物中的磷脂酰膽堿的質量含量在10％以上。
7.權利要求1或2所述的方法，其中，待分離原料經加壓后被流動相帶入色譜柱，超臨界流體流動相的溫度為20-80℃，壓力為10.0-45.0Mpa。
8.權利要求1所述的方法，其中，組分的切割和收集通過多通道切換閥完成。
9.前述任一項所述的方法，其中，采用超臨界色譜周期進樣，連續收集組分。
10.前述任一項所述的方法，經組分切割和制備的產物包括基本上是單組分的磷脂酰膽堿。
11.用于分離純化卵磷脂的超臨界流體制備色譜裝置，其設置有—溶劑罐和攜帶劑罐；—用于形成超臨界流體及攜帶劑輸送的高壓注射泵和自動控制進樣器；—可在線裝填的軸向動態壓縮色譜柱；—在線檢測器和多通道切換閥組；—用于分離產物與流動相的分離器；其中待分離樣品的進樣和分離產物的接收由計算機控制定時或自動切換。
全文摘要
本發明涉及一種分離制備高純度卵磷脂的方法和實施該方法的裝置。尤其是利用超臨界流體制備色譜的方法從大豆及蛋黃磷脂提取物中分離出單組分卵磷脂，特別是磷脂酰膽堿的工藝。本發明是以磷脂提取物為原料，采用超臨界流體制備色譜法，以超臨界流體作為流動相將原料帶入色譜柱中進行分離，根據各化合物保留時間及其出峰時間進行組分切割和收集。本發明建立了一種生產高純度磷脂產品的體系，不需要繁瑣的工藝過程，就可以收集得到基本上是單組分的高純度PC和PE等重要的磷脂產物。
文檔編號C07F9/00GK1502619SQ0214917
公開日2004年6月9日 申請日期2002年11月25日 優先權日2002年11月25日
發明者趙鎖奇, 王仁安, 王學軍, 石鐵磐 申請人:石油大學(北京)