專利名稱：一種提取細菌mRNA的方法
技術領域：
本發明涉及一種提取細菌mRNA的方法，具體講是從總RNA當中提取mRNA的方法。
背景技術：
目前對真核生物mRNA的提取方法，一般使用親和層析法或磁捕獲雜交法，但由于大多數細菌mRNA無polyA尾，以上兩種方法對細菌mRNA提取不能奏效。Affymetrix公司曾建立了一種大腸桿菌mRNA的富集方法，但這種方法不能除去5S rRNA，且步驟繁瑣，成本較高，用時較長。本發明針對上述方法的缺陷，發明了一種新的提取mRNA的方法。
發明內容
本發明目的是提供一種提取細菌mRNA的新方法。
本發明提取細菌mRNA的技術方案如下首先設計針對5S、16S和23S rRNA的保守序列寡核苷酸探針，并在合成探針時進行生物素標記。將生物素標記的探針加入到包被鏈霉親和素的順磁顆粒(SA-PMPs)中，通過生物素(biotin)與鏈霉親和素(streptavidin)的親和性結合，這些探針和磁珠結合在一起。洗去未結合的探針后，再加入一定量的細菌的總RNA溶液。總RNA溶液中的5S、16S和23S rRNA就和與磁珠結合的生物素標記的寡核苷酸探針特異性雜交，形成rRNA-SA-PMP復合體，被順磁顆粒捕獲，結合在固相上。這樣，mRNA就留在液相中。然后，用一個磁分離架吸附復合體，收集上清，然后再進行核酸沉淀，洗滌，即得富集的mRNA。
細菌mRNA提取方法技術路線流程圖如圖1所示。
由于16S和23S rRNA的保守性，本發明方法具有廣譜性，設計16S和23S rRNA的保守序列的探針，就可從多種細菌總RNA中提取mRNA，對一些G+和G-菌均適用。產量較高、時間較短、完整mRNA回收率高。純化所得mRNA可用于RT-PCR反應、cDNA合成及生物芯片上的基因表達譜分析。
下面以鼠疫耶爾森氏菌為例，對本發明的方法進行更為具體地說明。
實驗例1鼠疫耶爾森氏菌總RNA的提取實驗材料鼠疫耶爾森氏菌EV76株；離心管；高速冷凍離心機；BECKMANDU-600紫外分光光度計；試劑及其他耗材等。
實驗步驟第一步，核酸提取1.取15mL離心管，加入1.25mL冰預冷苯酚/乙醇阻斷液，加入10mL過夜培養物；2.4℃下8000rpm離心5min集菌，去盡上清；3.加入800μL溶菌酶液，重懸沉淀，加入80μL10％SDS，混勻，64℃水浴2min；
4.加入88μL1mol/L乙酸鈉(pH5.2)，混勻；5.加入1mL水飽和苯酚，混勻，64℃水浴中6min，每40s顛倒10次；6.冰浴上迅速冷卻，4℃下12000rpm離心20min；7.取2個1.5mL離心管中，水相均分至其中，加入與水相等體積的氯仿，顛倒10次，4℃下12000rpm離心10min；8.取上清，分別加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉(pH5.2)和1mmol/LEDTA，加入2.5倍體積的預冷無水乙醇，-80℃下20min。4℃下12000rpm離心30min，小心移去乙醇。
9.加入1mL預冷的80％乙醇洗滌沉淀，4℃下12000rpm離心10min，小心移去乙醇，溫箱中干燥沉淀。
10.加入100μL DEPC處理的水，重懸沉淀，兩管樣品收集于一起。
第二步，除DNA1.200μL的樣品中，依次加入0.5μL的RNA酶抑制劑(40U/μL)、25μL的10×DNA酶I緩沖液、2μL的無RNA酶的DNA酶I(5U/μL)，37℃作用30min。
2.加入等體積的水飽和苯酚，顛倒10次，4℃下12000rpm離心5min。
3.取水相，分別加入等體積的水飽和苯酚氯仿，顛倒10次，4℃下12000rpm離心5min。
4.取水相，加入等體積的氯仿，顛倒10次，4℃下12000rpm離心5min。重復該步驟。
5.取水相，加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積的預冷無水乙醇，-70℃下放置1h。4℃下12000rpm離心30min，小心移去乙醇。
6.加入1mL預冷的80％乙醇洗滌沉淀，4℃下12000rpm離心10min，小心移去乙醇，溫箱中干燥沉淀。
7.加入50μL的DEPC處理的水，重懸沉淀。-70℃貯存。
第三步，RNA定量和純度檢測1.取2μL的RNA樣品，用10mmol/LTris-HCl(pH7.0)進行100倍稀釋，測定A260值，按下式計算RNA樣品的濃度RNA濃度(μg/μL)＝A260×100×40÷10002.取2μL的RNA樣品，用10mmol/LTris-HCl(pH7.5)進行100倍稀釋，測定A260和A280值，計算A260/A280值。
結果如下1)提取的總RNA絕對量為223.465μg，濃度為4.4693μg/μL。
2)A260/A280值為2.1。
第四步，總RNA提取物的電泳鑒定提取的總RNA在65℃變性5分鐘，冰浴上冷卻，然后在含甲醛的1.2％瓊脂糖凝膠上5-7V/cm下電泳。
結果如圖3所示可見兩條明亮的條帶，分別代表16S rRNA和23S rRNA。
通過上述實驗，從A260/A280值和電泳結果看，本實驗得到了純凈完整的總RNA。
實驗例2 從鼠疫耶爾森氏菌總RNA中富集mRNA實驗材料鏈霉親和素磁珠和磁分離架(New England BioLabs Inc.生產)；總RNA(由實驗例1提取)；探針(上海生工合成)。
實驗步驟1、合成生物素標記的寡核苷酸探針用Primer Premier 5.0設計鼠疫耶爾森氏菌5S、16S和23S rRNA的探針，分別設計了1條(5S)、3條(16S)、5條(23S)，它們分別是CP-1，CP-2，CP-3，CP-4，CP-5，CP-6，CP-7，CP-8，CP-9。由發明人提供探針序列，委托上海生工合成生物素標記的寡核苷酸探針。本發明設計的寡核苷酸探針具體序列參見本說明書所附的序列表，其中CP-1，核苷酸序列號為SEQ No.1；CP-2，核苷酸序列號為SEQ No.2；CP-3，核苷酸序列號為SEQ No.3；CP-4，核苷酸序列號為SEQ No.4；CP-5，核苷酸序列號為SEQ No.5；CP-6，核苷酸序列號為SEQ No.6；CP-7，核苷酸序列號為SEQ No.7；CP-8，核苷酸序列號為SEQ No.8；CP-9，核苷酸序列號為SEQ No.9。
2、準備磁珠1)于1.5mL離心管中加入250μL(1mg)的親和素磁珠，將離心管置于磁分離架上30s～1min，棄上清。
2)再加入200μL洗滌/結合緩沖液，懸起磁珠。將離心管置于磁分離架上30s～1min，棄上清。重復該步驟。
3、結合生物素標記的捕獲探針
1)將約1.08nmol生物素標記的捕獲探針溶解于200μL的結合緩沖液(0.5×SSC)中，90℃下變性5min，迅速冰浴3min。其中探針濃度為0.6nmol/10μL，每種探針取2μL，9條探針共1.08nmol，相比于磁珠的探針結合能力，探針過量1倍。
2)加入到含有磁珠的離心管中，懸浮磁珠，室溫作用15min，并不時用手搖動。
3)供應磁場，棄上清。
4)加入200μL的洗滌緩沖液(0.5×SSC)，懸浮磁珠，供應磁場，棄上清。
4、磁捕獲雜交與富集mRNA1)將20μg總RNA溶解在200μL的雜交液中(6×SSC；10mmol/LTris-HCl，pH7.5；1mmol/LEDTA)。
2)加入到預先準備好的磁珠中，懸浮磁珠，68℃水浴30min，并不時用手搖動。
3)供應磁場，收集上清。用200μL的洗滌緩沖液(0.5×SSC)洗滌磁珠，收集所有上清于一起。
4)加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積的預冷無水乙醇，-70℃放置1h。4℃下12000rpm離心30min，小心移去乙醇。
5)用預冷的80％乙醇洗滌沉淀兩次，溫箱中干燥沉淀。
6)加入20μL DEPC處理的水，充分溶解沉淀。-70℃保存備用。
5、磁珠的活化
1)于磁珠中加入200μL的新鮮0.1mol/L NaOH，懸浮磁珠，20-25℃下4min(不得超時，否則引起DNA的脫嘌呤化)，供應磁場，棄上清。要求操作迅速，否則引起DNA的脫嘌呤化。
2)加入200μL的洗脫緩沖液(10mmol/L Tris-HCl，pH7.5；1mmol/LEDTA)，懸浮磁珠，供應磁場，棄上清。重復此步驟。
3)加入200μL的洗滌緩沖液(0.5×SSC)，懸浮磁珠，供應磁場，棄上清。
4)加入200μL的洗滌緩沖液(0.5×SSC)，懸浮磁珠，4℃下貯存備用。
6、RNA定量取4μL富集的mRNA，溶于76μLDEPC處理的水中(即進行20倍稀釋)，混勻。用分光光度計測其OD260值。
計算含量RNA濃度(μg/μL)＝A260×40÷1000×稀釋倍數結果濃度＝0.11μg/μL；總量＝2.22μg。
即每20μg總RNA能除去17.78μg rRNA。
7、RNA電泳鑒定將1μg總RNA和1μg富集mRNA同時電泳，結果如圖4所示。從定量結果和電泳結果看磁捕獲雜交法適于細菌mRNA的提取和純化。
實驗例3對富集的mRNA進行RT-PCR實驗目的檢驗mRNA提取過程中有無降解實驗材料引物(軍科院八所合成)；mRNA(實驗例2獲得)；Marker(DL2000)；反轉錄試劑盒(SuperScriptTMFirst-Strand SynthesisSystem for RT-PCR(Life Technologies生產)。
實驗步驟1、設計引物選擇鼠疫耶爾森氏菌染色體上的6個基因，代碼分別為YPO0085、YPO0216、YPO2394、YPO3516、YPO3750和YPO4128；其ORF長度分別為768bp、699bp、635bp、237bp、939bp、705bp。基因選擇的原則是(1)現有培養條件下表達的基因(2)表達豐度不同的基因(3)片段大小不同的基因然后，用Array Designer 2.0軟件進行引物設計，引物設計原則是盡量擴增全長。引物序列參見所附序列表。設計的引物分別是YPO0085F，序列號為SEQ No.10；YPO0085R，序列號為SEQ No.11，擴增片段682bp；YPO0216F，序列號為SEQNo.12；YPO0216R，序列號為SEQ No.13，擴增片段635bp；YPO2394F，序列號為SEQNo.14；YPO2394R，序列號為SEQNo.15，擴增片段206bp；YPO3516F，序列號為SEQ No.16；YPO3516R，序列號為SEQ No.17，擴增片段908bp；YPO3750F，序列號為SEQNo.18；YPO3750R，序列號為SEQ No.19，擴增片段691bp；YPO4128F，序列號為SEQNo.20；YPO4128R，序列號為SEQNo.21，擴增片段340bp。
2、對富集的mRNA進行RT-PCR選用SuperScriptTMFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR(Life Technologies)試劑盒，用我們設計的6對引物，對富集的mRNA按試劑盒說明書進行反轉錄，即cDNA第一鏈合成。同時，做了Control RNA和No RT-Control的對照。在做PCR時，每一反應管都做了陰性對照。
3、對RT-PCR產物進行電泳鑒定結果是除了陰性對照(No RT-Control及PCR的陰性對照)沒有條帶外，其它均見明亮的條帶。可見，RNA提取和mRNA富集過程中沒有發生降解。電泳圖片如圖5所示。
實驗例4磁珠的重復利用實驗將富集過mRNA的磁珠活化后(活化方法見本發明實驗例2)再用來富集mRNA，同時用一份新磁珠做對照。由于活化過程就是用0.1MNaOH將探針和rRNA之間的鍵打開，去除rRNA。這樣，探針還留在親和素標記的磁珠上。所以，用活化之后的磁珠不必再結合探針。實驗材料實驗例2中用過并活化的磁珠(標記為舊磁珠)以及NewEngland BioLabs Inc.生產的新磁珠各一份；磁分離架；總RNA各用20μg。
實驗方法同前。
實驗結果舊磁珠富集總量為7.2315μg；新磁珠富集總量為6.5765μg。電泳結果如圖6所示。其中1代表新磁珠富集的1μg mRNA；2代表舊磁珠富集的1μg mRNA；3代表1μg總RNA。
從上述實驗的定量和電泳結果看，舊磁珠不如新磁珠效果好，但也能除去大部分rRNA。所以，舊磁珠能重復利用，尤其在大量提取mRNA時。
本發明的方法與現有技術相比，具有操作快速、簡單、產量高、完整mRNA回收率高的優點。而且，不需要一些酶的反應，反應條件易于控制，成本較低。
現有技術當中用于真核生物mRNA提取的方法一般是親和層析法和磁捕獲雜交法。但由于細菌mRNA的自身的特點，大多數細菌mRNA無polyA尾，使得以上兩種方法對細菌mRNA提取不能奏效。
Affymetrix公司建立的大腸桿菌mRNA的富集方法，為一系列酶的反應，這種方法不能除去5S rRNA，且步驟繁瑣，成本較高，用時較長。
本發明設計的磁捕獲雜交法提取mRNA的方法，結合了真核生物的mRNA的磁捕獲雜交法快速、簡單的優點以及從總RNA中去除rRNA從而獲得mRNA的思路，由于16S和23S rRNA的保守性，這種方法具有廣譜性，設計16S和23S rRNA的保守序列的探針，就可從多種細菌總RNA中提取mRNA，對一些G+和G-菌均適用。純化所得mRNA可用于RT-PCR反應、cDNA合成及生物芯片上的基因表達譜分析。這將極大的促進原核生物的功能基因組學的研究。
圖1是細菌mRNA提取方法技術路線流程圖；
圖2是磁捕獲雜交示意圖，其中1代表磁珠，2代表親和素，3代表生物素，4代表5′端生物素標記的探針；圖3是總RNA提取物的電泳圖譜；圖4是將1μg總RNA和1μg富集mRNA同時電泳的圖譜；圖5是對富集的mRNA進行RT-PCR，所得產物進行電泳鑒定的電泳圖譜。
圖6是對新磁珠富集的mRNA、舊磁珠富集的mRNA和總RNA進行電泳的圖譜。
具體實施例方式
實施例1大腸桿菌JM109株mRNA的提取第一步，提取大腸桿菌JM109株總RNA。
取15mL離心管，加入1.25mL冰預冷苯酚/乙醇阻斷液，加入10mL過夜培養物；4℃下8000rpm離心5分鐘集菌，去盡上清；加入800μL溶菌酶液，重懸沉淀，加入80μL 10％SDS，混勻，64℃水浴2分鐘；加入88μL 1mol/L乙酸鈉(pH5.2)，混勻；加入1mL水飽和苯酚，混勻，64℃水浴中6分鐘，每40s顛倒10次；冰浴上迅速冷卻，4℃下12000rpm離心20min；取2個1.5mL離心管中，水相均分至其中，加入與水相等體積的氯仿，顛倒10次，4℃下12000rpm離心10min；取上清，分別加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉(pH5.2)和1mmol/L EDTA，加入2.5倍體積的預冷無水乙醇，-80℃下20min。4℃下12000rpm離心30min，小心移去乙醇。加入1mL預冷的80％乙醇洗滌沉淀，4℃下12000rpm離心10min，小心移去乙醇，溫箱中干燥沉淀。加入100μLDEPC處理的水，重懸沉淀，兩管樣品收集于一起。
200μL的樣品中，依次加入0.5μL的RNA酶抑制劑(40U/μL)、25μL的10×DNA酶I緩沖液、2μL的無RNA酶的DNA酶I(5U/μL)，37℃作用30分鐘。加入等體積的水飽和苯酚，顛倒10次，4℃下12000rpm離心5分鐘。取水相，分別加入等體積的水飽和苯酚氯仿，顛倒10次，4℃下12000rpm離心5分鐘。取水相，加入等體積的氯仿，顛倒10次，4℃下12000rpm離心5分鐘。重復該步驟。取水相，加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積的預冷無水乙醇，-70℃下放置1h。4℃下12000rpm離心30min，小心移去乙醇。加入1mL預冷的80％乙醇洗滌沉淀，4℃下12000rpm離心10min，小心移去乙醇，溫箱中干燥沉淀。加入50μL的DEPC處理的水，重懸沉淀。-70℃貯存。
第二步，從大腸桿菌JM109株總RNA中富集mRNA本實施例所用上述探針，仍然是委托上海生工合成。但是，通過BLAST發現，本發明設計的9條探針中，只有6條與大腸桿菌的rRNA同源。所以，本實施例只使用同源的6條探針。它們的代號和用量分別為16SrRNA探針CP-2 2μL；CP-3 4μL；CP-6 4μL；23SrRNA探針CP-7 2μL；CP-8 4μL；CP-9 2μL。
共18μL，即1.08nmol。
這些探針的具體序列同前，即CP-2，核苷酸序列號為SEQ No.2；CP-3，核苷酸序列號為SEQ No.3；CP-6，核苷酸序列號為SEQ No.6；CP-7，核苷酸序列號為SEQ No.7；CP-8，核苷酸序列號為SEQ No.8；CP-9，核苷酸序列號為SEQ No.9。
于1.5mL離心管中加入250μL(1mg)的親和素磁珠，將離心管置于磁分離架(New England BioLabs Inc.生產)上30s～1min，棄上清。再加入200μL洗滌/結合緩沖液，懸起磁珠。將離心管置于磁分離架上30s～1min，棄上清。重復該步驟。
將約1.08nmol生物素標記的捕獲探針溶解于200μL的結合緩沖液(0.5×SSC)中，90℃下變性5min，迅速冰浴3min。其中探針濃度為0.6nmol/10μL，每種探針取2μL，6條探針共1.08nmol，相比于磁珠的探針結合能力，探針過量1倍。加入到含有磁珠的離心管中，懸浮磁珠，室溫作用15min，并不時用手搖動。供應磁場，棄上清。加入200μL的洗滌緩沖液(0.5×SSC)，懸浮磁珠，供應磁場，棄上清。
將25μg總RNA溶解在200μL的雜交液中(6×SSC；10mmol/LTris-HCl，pH7.5；1mmol/LEDTA)。加入到預先準備好的磁珠中，懸浮磁珠，68℃水浴30min，并不時用手搖動。供應磁場，收集上清。用200μL的洗滌緩沖液(0.5×SSC)洗滌磁珠，收集所有上清于一起。加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積的預冷無水乙醇，-70℃放置1h。4℃下12000rpm離心30min，小心移去乙醇。
用預冷的80％乙醇洗滌沉淀兩次，溫箱中干燥沉淀。加入20μL DEPC處理的水，充分溶解沉淀。-70℃保存備用，即得。富集mRNA的總量為6.5147μg。
序列表SEQ No.15′-Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTCGTTTCACTTCTGAGTTCGGCATGGGAT-3′SEQ No.25′-Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGC-3′SEQ No.35′-Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTCACATCTGACTTAACAAACCGCCTGCGT-3′SEQ No.45′-Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTCCCACCATTACGTGCTGGCAACAAAG-3′SEQ No.55′-Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTGCGACTTTCCAGACGCTTCCACTAACA-3′SEQ No.65′-Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTCATTAGTCGGTTCGGTCCTCCAGTTAGTGT-3′SEQ No.75′-Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTCAACATTAGTCGGTTCGGTCCTCCAGT-3′SEQ No.85′-Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTCATTCGCACTTCTGATACCTCCAGCAAC-3′SEQ No.95′-Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTATTCGCACTTCTGATACCTCCAGCAACCC-3′SEQ No.105′-ATGCGACATCCATTAGTTATG-3′SEQ No.115′-CAATATCTGGCTGAGTGAAC-3′SEQ No.125′-AAGTACATCCTAATGGTATTC-3′SEQ No.135′-GTTCAACAGCAGCCATAC-3′SEQ No.145′-TAATTCTGGCTTCTACAATGC-3SEQ No.1 55′-TTACTTCTTGTAAGCTTGAGC-3′SEQ No.165′-CCGCTGGTGGGATTGG-3′SEQ No.175′-AACGAACTTCTCACCTAACTC-3′SEQ No.185′-ATGGCTAAGCTGACCAAG-3′SEQ No.195′-CAGTCAGGCCGCTTTG-3′
SEQ No.205′-ATGCCTGTATCCCTTTAC-3′SEQ No.215′-CAATCAGCACCGATAAATAG-3′
權利要求
1.一種提取細菌mRNA的方法，其特征在于該方法包括如下步驟首先，分別設計針對5S、16S和23S rRNA的保守序列寡核苷酸探針，并在合成探針時進行生物素標記；然后，將生物素標記的探針加入到包裹著鏈霉親和素的順磁顆粒中，將探針和磁珠結合在一起；再加入細菌總RNA溶液，其中的5S、16S和23S rRNA與磁珠結合的生物素標記的寡核苷酸探針特異性雜交，形成的復合體被順磁顆粒捕獲，結合在固定相上，使mRNA就留在液相中；用一個磁分離架吸附復合體，收集上清，然后再進行核酸沉淀，洗滌，即得富集的mRNA。
2.根據權利要求1的方法，其特征在于將富集過mRNA的磁珠活化后，再用于以后富集mRNA的過程，不必再結合探針。
3.根據權利要求2的方法，其特征在于所說的磁珠活化過程是于磁珠中加入0.1mol/L NaOH，懸浮磁珠，供應磁場，棄上清。
4.根據權利要求1所說的方法，其特征在于所述的針對5S rRNA的探針是CP-1，核苷酸序列號為SEQ No.1。
5.根據權利要求1所說的方法，其特征在于所述的針對16S rRNA的探針是CP-2，CP-3，CP-4，核苷酸序列號分別為SEQ No.2、SEQNo.3和SEQ No.4。
6.根據權利要求1所說的方法，其特征在于所述的針對23S rRNA的探針是CP-5，CP-6，CP-7，CP-8，CP-9，核苷酸序列號分別為SEQ No.5、SEQ No.6、SEQ No.7、SEQ No.8和SEQ No.9。
7.根據權利要求1所說的方法，其特征在于所使用的探針是只針對16S和23S rRNA的保守序列寡核苷酸探針。
8.根據權利要求1所說的方法，其特征在于所說的細菌總RNA是從多種細菌中提取獲得的。
9.根據權利要求1所說的方法，其特征在于所說的細菌總RNA是從鼠疫耶爾森氏菌中提取獲得的。
10.根據權利要求1所說的方法，其特征在于所說的細菌總RNA是從大腸桿菌中提取獲得的。
全文摘要
本發明公開了一種新的提取細菌mRNA的方法，該方法是先設計針對5S、16S和23S rRNA的保守序列寡核苷酸探針，并進行生物素標記，標記的探針加入到包被鏈霉親和素的順磁顆粒中，再加入細菌總RNA提取液，5S、16S和23SrRNA與探針特異性雜交，形成的復合體被結合在固相上，使mRNA留在液相中，分離吸附復合體，收集上清，進行核酸沉淀，洗滌，即得富集的mRNA。
文檔編號C07H21/00GK1491955SQ0214602
公開日2004年4月28日 申請日期2002年10月25日 優先權日2002年10月25日
發明者龐昕, 周冬生, 楊瑞馥, 龐 昕 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所, 中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物