專利名稱：一種冬凌草甲素的制備方法
技術領域：
本發明涉及植物藥物提取純化的方法，更具體涉及一種冬凌草甲素的制備方法。
背景技術：
傳統的冬凌草甲素的提取方法主要有乙醚提取法、乙醇提取法。
乙醚提取法的步驟是冬凌草原料加3～5倍量乙醚提取2～3小時，回收乙醚，得綠褐色粘稠物用甲醇溶解，加活性炭脫色，將得到的淡黃色澄明甲醇液減壓濃縮，濃縮液靜置過夜，過濾，濾液再濃縮得稠膏狀物，上Al2O3柱，先用苯洗脫，再用乙醚洗脫，乙醚洗脫液回收溶劑后得到粗結晶，經丙酮處理得冬凌草甲素。
該法具有提取收率較高的優點，但由于大量用到乙醚、苯等有毒、易燃易爆的溶劑，極不安全，根本不適于工業生產。
乙醇提取法的步驟是冬凌草原料加10倍量95％乙醇，在提取罐中加熱提取2小時，回收乙醇，得綠褐色粘稠膏體，用無水乙醇溶解，加粉狀活性炭回流脫色1小時，抽濾除去活性炭后濃縮得浸膏，浸膏用乙酸乙酯溶解，再用5％Na2CO3溶液萃取，回收溶劑得糖漿狀物，上硅膠柱，用氯仿、丙酮混合溶劑或石油醚、丙酮混合溶劑洗脫，收集相應流份減壓濃縮，然后結晶得冬凌草甲素。
該法的用工業酒精代替了乙醚和甲醇，比較適于工業生產，但缺點是提取收率低。
上述兩法雖然都考慮將冬凌草提取物進行柱層析分離，但有一個共同的缺陷都未闡明如何將獲得的冬凌草甲素粗晶進一步精制成高純度的冬凌草甲素結晶。
袁珂等在1997年第22卷第8期《中國中藥雜志》上發表的“柱層析法分離制備冬凌草甲素的新工藝”中，比較了以乙醚提取后濃縮至浸膏狀→甲醇溶解并用活性炭脫色→繼續濃縮至一定量后與適量硅膠拌勻裝于柱頂進行層析分離→分別以石油醚、氯仿、丙酮依次洗脫，可得到冬凌草甲素結晶的原工藝，指出該工藝中所用的溶劑乙醚等溶劑有毒易燃爆，且極易揮發，價格較高，洗脫所用的溶劑系統較多，操作費時麻煩。故該法僅適合實驗室少量制備冬凌草甲素，不適于工業化生產。因此，對其分離制備工藝進行了改進。即將冬凌草的乙醇提取物用適量95％乙醇溶解，加入約醇提物干浸膏2倍量(W/W)柱層析硅膠，再加入適量95％乙醇，使硅膠全部被乙醇濕潤后置水浴上拌炒，炒至呈干粉狀后取出，晾至室溫備用。將處理好的柱層析硅膠裝入下方墊有藥棉和濾紙的玻璃柱(柱高150cm，直徑8cm)中。干浸膏與分離用的硅膠用量比例為1∶10(W/W)。以一定比例的石油醚-丙酮為洗脫液進行洗脫。收集冬凌草甲素流份合并蒸干后，加入適量甲醇熱溶放置，即有冬凌草甲素結晶析出。該法雖然較前法所用溶劑系統有所簡化，但仍然將提取液濃縮后再用95％乙醇溶解才能與柱層析硅膠混合，所選用的層析柱徑高比為1∶18.75，工業化生產所要求的設備龐大，洗脫液流速為1/150/分鐘～1/220/分鐘(洗脫液體積/吸附劑體積/分鐘)，太慢，顯然也不是大工業化生產的最佳工藝。
發明內容
本發明的目的在于提供一種冬凌草甲素的制備方法，利用混合溶劑進行萃取，通過短程硅膠柱層析，以混合溶劑系統解吸，然后分步結晶和重結晶，制得高純度的冬凌草甲素。
為了達到上述目的，本發明采用以下技術方案以冬凌草為原料，經二氯甲烷∶丙酮(4∶1～9∶1)或三氯甲烷∶乙醇(4∶1～9∶1)回流萃取，提取液經減壓濃縮得到稠膏狀提取物，加3～5倍石油醚脫脂，濾掉并揮干石油醚得到冬凌草甲素含量為10～15％的提取物浸膏，采用混合溶劑解吸系統，通過硅膠柱短程層析，收集解吸液，濃縮、結晶即可得到含量大于90％的冬凌草甲素。冬凌草Rabdosiarubescens(Hemsl.)Hara為唇形科香茶菜屬植物，我國民間主要用于治療食管癌、賁門癌和原發性肝癌。冬凌草甲素(oridonin)是冬凌草中抗腫瘤的主要成分。實驗證明冬凌草甲素在體外對Hela細胞及食管鱗癌細胞株(CaEs-17)均有明顯的細胞毒作用；在體內對多種動物移植性腫瘤如艾氏腹水瘤(腹水型及實體型)、S-180肉瘤(腹水型及實體型)、肝癌(腹水型及實體型)、網狀細胞肉瘤(ARS)等均有抑制作用；能防止亞硝胺所引起的大鼠食管上皮增生(癌前病變)轉變為癌。臨床試驗證明，對食管癌，賁門癌，肝癌，及乳癌等有明顯的緩解癥狀作用，穩定和縮小瘤體及延長病人生命的效果。與化療合用，可減輕化療藥物的不良反應，提高療效，對食管上皮重度增生亦有一定的療效。
提取冬凌草甲素的步驟如下1、將冬凌草粉碎至20～100目，先后用6～8倍、4～6倍、3～5倍、4∶1～9∶1的二氯甲烷、丙酮或三氯甲烷、乙醇的混合溶劑進行回流萃取，每次3～5小時；2、提取液經減壓濃縮得到稠膏狀提取物，加3～5倍石油醚脫脂，濾掉并揮干石油醚得到冬凌草甲素含量為10～15％的提取物浸膏；3、加1～3倍丙酮或乙醇處理，按1∶1～2∶1比例與200～300目柱層析硅膠拌混均勻，攤于陰涼通風處干燥，使溶劑揮發干凈；4、取4～6倍拌混硅膠的新鮮硅膠裝柱，再將拌混硅膠裝于其上，用于柱層析分離的層析柱的徑高比為1∶1.5～1∶4，層析柱用不銹鋼、搪瓷、玻璃或其它耐腐蝕材料制作，先用5～8倍體積的二氯甲烷洗脫，再用4∶1～9∶1的二氯甲烷、丙酮混合溶劑解吸，洗脫液流速控制在1/60～1/70/分鐘；5、在混合溶劑洗出5～7倍裝柱體積時，開始收集含冬凌草甲素的流份，收集解吸液的體積為裝柱體積的1.5～2.5倍時停止解吸，解吸液在溫度為45～55℃、真空度0.5～0.6Mpa條件下濃縮10～15倍；6、濃縮液置結晶罐中靜置8～12小時結晶，待達到飽和結晶狀態時進行離心，使冬凌草甲素晶體與母液分離，母液可繼續減壓濃縮分步結晶，直至冬凌草甲素從母液中分離完全；7、上述工藝制備的冬凌草甲素結晶可用10～15倍的甲醇溶液進行重結晶精制。
本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果(1)萃取冬凌草原料的溶劑用的是二氯甲烷∶丙酮(4∶1～9∶1)或三氯甲烷∶乙醇(4∶1～9∶1)混合溶劑；(2)由于柱程短、浸膏冬凌草甲素含量高，故用較少的硅膠就能完成冬凌草甲素的柱層析分離；(3)由于層析柱徑高比僅為1∶1.5～1∶4，即可節約設備投資，又可減少車間占用空間和面積；(4)洗脫液流速控制在1/60/分鐘～1/70/分鐘(洗脫液體積/吸附劑體積/分鐘)，較高的生產效率大大縮短了生產周期；(5)選用二氯甲烷和丙酮(4∶1～9∶1)混合溶劑系統進行硅膠柱層析，使解吸的冬凌草甲素流份較為集中；(6)選用二氯甲烷、丙酮或三氯甲烷、乙醇等溶劑系統，相對使用安全；(7)在前述工藝的基礎上，所用結晶和重結晶技術可以制備出質量穩定、高純度的冬凌草甲素，含量可達90％以上。(8)層析柱短程，操作方便，分離速度快，效果好，成本低，色澤微黃色至白色，進一步精制可得含量大于99％的純品。
具體實施例方式
實施例1.取冬凌草30千克，粉碎至40～80目，先后加220千克、160千克、130千克三氯甲烷∶乙醇(9∶1)溶液回流三次，每次3.5小時，提取液經減壓濃縮得到冬凌草甲素含量11.3％的冬凌草浸膏1千克，用乙醇處理均勻，與200～300目硅膠1.5千克拌混，攤干，取8千克新鮮硅膠裝柱，將拌混硅膠加于其上。先用50升二氯甲烷洗柱除前雜，再用二氯甲烷和丙酮(4∶1)的混合溶劑解吸，待65升混合溶劑洗過柱體之后，開始收集冬凌草甲素流份至15升，在溫度50℃、真空度0.6Mpa條件下濃縮至1.5升，濃縮液于搪瓷盤中靜置10小時結晶，經0.8Mpa真空抽濾，濾液繼續減壓濃縮分步結晶3次，使冬凌草甲素從母液中分離完全，得到的冬凌草甲素結晶合并后用1.6升甲醇溶液溶解，進行重結晶，揮干溶劑，在45℃下真空(0.9Mpa)干燥3小時，得到0.05千克冬凌草甲素。經檢測冬凌草甲素含量為92％。
實施例2.將市售藥材冬凌草500千克，粉碎至40～80目，先后用3000千克、2000千克、1000千克二氯甲烷∶丙酮(4∶1)溶液回流三次，每次3小時，合并提取液經減壓濃縮，得到冬凌草甲素含量12.8％的浸膏約10千克，用丙酮處理均勻，拌混到18千克200～300目柱層析硅膠中，攤晾使溶劑揮干，先在15個層析柱中各預裝8千克新鮮硅膠，然后將樣品拌混硅膠均勻地裝于15個層析柱的上部，每個層析柱分別先用60升二氯甲烷洗脫，再用二氯甲烷和丙酮(4∶1)混合溶劑解吸，當混合溶劑洗出大約70升時，開始收集含冬凌草甲素流份的解吸液，每個層析柱收集解吸液18升，將解吸液合并后在溫度50℃、真空度0.55Mpa條件下濃縮至18升，濃縮液置結晶罐中靜置10小時結晶，待達到飽和結晶狀態時進行離心，使冬凌草甲素結晶與母液分離，母液可繼續減壓濃縮分步結晶，直至冬凌草甲素從母液中分離完全，合并分離出的冬凌草甲素結晶，用20升甲醇溶液溶解，進行重結晶，離心分離，在45℃下真空(0.9Mpa)干燥3小時，得到92.5％冬凌草甲素0.78千克。
權利要求
1.一種冬凌草甲素的制備方法，包括下列步驟A、將冬凌草粉碎至20～100目，先后用6～8倍、4～6倍、3～5倍、4∶1～9∶1的二氯甲烷、丙酮或三氯甲烷、乙醇的混合溶劑進行回流，每次3～5小時；B、提取液經減壓濃縮得到稠膏狀提取物，加3～5倍石油醚脫脂，濾掉并揮干石油醚得到冬凌草甲素含量為10～15％的提取物浸膏；C、加1～3倍丙酮或乙醇處理，按1∶1～1∶2比例與200～300目柱層析硅膠拌混均勻，攤于陰涼通風處干燥；D、取4～6倍拌混硅膠的新鮮硅膠裝柱，再將拌混硅膠裝于其上，用5～8倍裝柱體積的二氯甲烷洗脫，再用4∶1～9∶1的二氯甲烷、丙酮混合溶劑解吸；E、收集含冬凌草甲素的流份，收集解吸液體積為裝柱體積的1.5～2.5倍時停止解吸，解吸液在溫度為45～55℃、真空度0.5～0.6Mpa條件下濃縮10～15倍；F、濃縮液置結晶罐中靜置8～12小時結晶，離心，使冬凌草甲素晶體與母液分離，母液可繼續減壓濃縮分步結晶，直至冬凌草甲素從母液中分離完全；G、冬凌草甲素結晶用10～15倍的甲醇溶液進行重結晶精制。
2.根據權利要求1所述的一種冬凌草甲素的制備方法，其特征在于用于柱層析分離的層析柱徑高比為1∶1.5～1∶4。
3.根據權利要求2所述的一種冬凌草甲素的制備方法，其特征在于層析柱用不銹鋼、搪瓷、玻璃制作。
4.根據權利要求1所述的一種冬凌草甲素的制備方法，其特征在于洗脫液流速控制在1/60～1/70/分鐘。
全文摘要
本發明公開了一種冬凌草甲素的制備方法，將冬凌草粉碎，用二氯甲烷、丙酮或三氯甲烷、乙醇的混合溶劑進行回流，提取液經減壓濃縮得到稠膏狀提取物，加石油醚脫脂，濾掉并揮干石油醚得到浸膏，加丙酮或乙醇處理，用柱層析硅膠拌混，然后均勻地將拌混硅膠裝于上層，用二氯甲烷洗脫，再用二氯甲烷和丙酮的混合溶劑解吸，收集含冬凌草甲素的解吸液流份，減壓濃縮，濃縮液置結晶罐中靜置結晶，使冬凌草甲素晶體與母液分離，母液可繼續減壓濃縮分步結晶，直至冬凌草甲素從母液中分離完全，冬凌草甲素結晶用甲醇溶液進行重結晶精制。本發明層析柱程短，分離速度快、效果好，產品純度高，生產成本低，冬凌草甲素含量達到90％以上。
文檔編號C07C49/00GK1482115SQ02139049
公開日2004年3月17日 申請日期2002年9月13日 優先權日2002年9月13日
發明者王有為, 盧大炎, 王躍進, 龔復俊, 斯纓, 王暐, 葉晚成, 丁時東 申請人:中國科學院武漢植物研究所