神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的生產(chǎn)方法

專利名稱：神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
CNTF最早是在體外發(fā)現(xiàn)具有促進(jìn)雞胚睫狀神經(jīng)節(jié)的存活而被發(fā)現(xiàn)的(Manthorpe et al.，1980，J.Neurochem.3469-75)，在以后的幾十年中，又有許多相關(guān)的生物學(xué)功能被發(fā)現(xiàn)。Hughes等發(fā)現(xiàn)它能促進(jìn)圍產(chǎn)期鼠視覺(jué)和腦神經(jīng)中的神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞分化(Hughes et al.，1988，Nature 33570-73)，而且還發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)雞胚背根神經(jīng)節(jié)的生長(zhǎng)(Skaper and Varon，1986，Brain Res.38939-46)。此外，他還能促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、海馬神經(jīng)元及副交感脊髓神經(jīng)元的生長(zhǎng)和分化(Ip，et al.1991，J.Neurosci.113124-3134；Blottner，et al.1989，Neurosci.Lett.105316-320)。
鑒于rhCNTF的多種生物學(xué)功能，因此他被認(rèn)為在修復(fù)神經(jīng)損傷、治療神經(jīng)萎縮性疾病中能起到一定的作用，因此具有較好的臨床應(yīng)用前景。在進(jìn)一步的研究中也發(fā)現(xiàn)，CNTF在治療肥胖癥，特別是Leptin耐受的肥胖癥中也能起作用，顯示了可能的臨床用途(Isabelle Gloaguen，et al.1997，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào))。因此，開發(fā)一種能高活性、低成本的生產(chǎn)rhCNTF的方法將極具有實(shí)用意義。CNTF曾被細(xì)菌系統(tǒng)克隆并表達(dá)(Masiakowski，et al.1991，J.Neurosci.571003-1012；Annalise Di Marco et al.1996，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào))，但這些方法都只適用于制備少量樣品進(jìn)行科學(xué)研究，而不適合用于大規(guī)模制備。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種適合于工業(yè)化生產(chǎn)的簡(jiǎn)便、快速、高活性回收率的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的生產(chǎn)方法神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的生產(chǎn)方法是通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，對(duì)人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的基因進(jìn)行修飾改造，獲得改造后突變?nèi)私逘钌窠?jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因的cDNA，人工合成該cDNA，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)全自動(dòng)發(fā)酵罐高密度表達(dá)；以切向流超濾方式進(jìn)行復(fù)性；以離子交換層析、疏水層析和分子篩層析順序組合純化，生產(chǎn)得到高純度的睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1)采用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，對(duì)天然密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了突變體在大腸桿菌中的穩(wěn)定高表達(dá)。
2)采用切向流超濾方式復(fù)性，可減少超濾過(guò)程中的極化現(xiàn)象，復(fù)性處于可控制變性劑去除速度的過(guò)程上，縮短復(fù)性時(shí)間，使得復(fù)性收率高達(dá)70％，一次性復(fù)規(guī)模可達(dá)1-10g，所用的超濾材料便于NaOH進(jìn)行原位清洗和消毒，可適應(yīng)藥物蛋白開發(fā)生產(chǎn)的GMP要求。同時(shí)采用此復(fù)性方式，還可在復(fù)性完成后，直接調(diào)整泵的流量差，而將大體積蛋白溶液進(jìn)行濃縮，以便于后續(xù)純化工藝操作的方便與省時(shí)。
3)離子交換層析、疏水層析和分子篩層析三種不同分離機(jī)理層析順序組合，使復(fù)性后的CNTF得以純化精制，經(jīng)反相高效液相層析(HPLC-RP)及毛細(xì)管電泳(CE)檢測(cè)，其純度均大于95％。


圖1是人工合成的突變CNTF cDNA序列圖；圖2是CNTF重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖；圖3是復(fù)性裝置示意圖，圖中1貯罐、2復(fù)性反應(yīng)器、3攪拌器、4超濾膜包、5蠕動(dòng)泵、6廢液缸。
具體實(shí)施例方式
為了提高CNTF蛋白的穩(wěn)定性和生物學(xué)活性，與天然人CNTF相比，對(duì)一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了改變，其特征是第17位半胱氨酸變?yōu)楸彼?Cys17→Ala17)，第63位谷氨酸變?yōu)榫彼?Gln63→Arg63)，并去掉末端15個(gè)氨基酸。同時(shí)針對(duì)大腸桿菌密碼子偏愛(ài)與人不同的特性，將CNTF基因序列進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)[見(jiàn)圖1]。具體而言就是將CNTF天然基因序列中每一個(gè)氨基酸所對(duì)應(yīng)的密碼子改造為大腸桿菌所偏愛(ài)的密碼子，同時(shí)考慮整個(gè)基因序列的G+C/A+T比例平衡，并在基因5’端、3’端及中間分別引入特定的酶切位點(diǎn)，如XhoI，EcoRI，AflIII以方便后續(xù)克隆、拼接。基于密碼子的擺動(dòng)學(xué)說(shuō)，我們所指的CNTF基因序列設(shè)計(jì)還可以有許多變動(dòng)延伸。而不僅限于圖一所列的序列。然后，根據(jù)基因片段人工合成的需要，將設(shè)計(jì)的CNTF基因分段合成，體外拼接成完整的序列。拼接好的CNTF序列，測(cè)序正確后擴(kuò)增獲得較多CNTF cDNA，并構(gòu)建于依賴T7RNA聚合酶的表達(dá)載體pGENS[見(jiàn)圖二]成為表達(dá)型重組體pGENS CNTF，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)plysS，篩選后獲得表達(dá)CNTF的陽(yáng)性克隆，經(jīng)發(fā)酵、離心收集、勻漿破碎后得到含目的蛋白的包含體。
以上克隆、轉(zhuǎn)化、篩選工作都為常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)，具體請(qǐng)參閱《MolecularCloning》J.Sambrook等著；《Short Protocols in Molecular Biology》FrederickM.Ausubel等著，以及其它分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)參考書。
根據(jù)圖3，組成復(fù)性裝置，采用截留分子量為3000-10000的超濾膜包或外壓式中空纖維柱，以切向流方式組合。其中材料超濾膜是醋酸纖維素酯、硝酸纖維素酯、偏四氟乙烯或聚砜。
將待復(fù)性蛋白及起始復(fù)性液置于復(fù)性反應(yīng)器中，用蠕動(dòng)泵抽出蛋白液，流經(jīng)超濾膜功能層側(cè)，變性劑因超濾作用透過(guò)超濾膜并注入廢液缸，而蛋白則應(yīng)其分子量較大，無(wú)法穿過(guò)超濾膜，沿膜壁側(cè)重新回到復(fù)性反應(yīng)器中，同時(shí)以同樣速度將貯液注入復(fù)性反應(yīng)器，使反應(yīng)器內(nèi)體積維持恒定，經(jīng)不斷循環(huán)，反應(yīng)器中變性劑濃度逐步下降，變性蛋白在溫和的條件下完成水合表面的脫水過(guò)程和折疊過(guò)程，直至復(fù)性。
復(fù)性后蛋白仍含有雜蛋白、熱源、核酸，須進(jìn)一步去除，本發(fā)明設(shè)計(jì)了離子交換、層析接疏水層析，后接分子篩層析的順序組合。離子交換層析填料為DEAE，Q或QAE陰離子交換劑。CNTF等電點(diǎn)介于5.8-6.2，pH適于7.0-9.0，可選用20-50mM咪唑鹽酸、巴比妥鹽酸、Tris鹽酸、硼砂-硼酸或磷酸緩沖液，pH的范圍在7.0-9.0，為流動(dòng)相。也可直接以復(fù)性時(shí)稀釋液作為上樣平衡液，平衡離子交換柱，爾后將復(fù)性濃縮好的CNTF蛋白溶液直接上樣，并以上述相應(yīng)的流動(dòng)相加0.01-0.5NaCl梯度進(jìn)行洗脫，通過(guò)離子交換層析，可將復(fù)性過(guò)程產(chǎn)生的錯(cuò)誤折疊的CNTF蛋白以及部分等電點(diǎn)與CNTF不一致的雜蛋白去除，同時(shí)，也可去除相當(dāng)一部分的宿主DNA片段。疏水柱選用butyl-，phenyl-或octyl基的疏水填料，可選用20-50mM Tris鹽酸、咪唑-鹽酸緩沖液或磷酸緩沖液，pH的范圍在6.0-9.0，加入0.4-1.6mol/L(NH4)2SO4或0.4-1.8mol/L Na2SO4為流動(dòng)相A，以不含(NH4)2SO4或Na2SO4的緩沖液為流動(dòng)相B。將離子交換收集的目標(biāo)峰直接補(bǔ)加0.4-1.6mol/L(NH4)2SO4或0.4-1.8mol/L Na2SO4，即可上樣于疏水柱，然后以上述流動(dòng)相加0.1-1.0N(NH4)2SO4或Na2SO4平衡柱子，上樣結(jié)束后以起始緩沖液沖洗將核酸及熱原被充分洗脫，爾后以20-50mM，pH7.0-9.0，Tris鹽酸緩沖液或咪唑緩沖液及水順序地階段洗脫。CNTF目標(biāo)峰在Tris鹽酸或咪唑-鹽酸緩沖液的洗脫峰中。經(jīng)疏水層析后收集的目標(biāo)峰，可直接上樣于以5-50mM磷酸鹽為流動(dòng)相平衡好的Sephacryl或Superdex分子篩層析柱，進(jìn)行精制。
本發(fā)明所用此方法旨在將可能存在的寡聚體及降解蛋白進(jìn)一步去除的同時(shí)，可以將前述疏水條件下的體系改換為5-50mM磷酸鹽，經(jīng)此分子篩層析得到的目標(biāo)蛋白CNTF，可以直接用于制劑的配制，而無(wú)須采用透析等其他改換溶液體系的處理，減少處理步驟中可能的污染與損失。
實(shí)施例CNTF工程菌構(gòu)建由基因合成公司合成克隆于T--載體上并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，經(jīng)純化回收，以NdeI，BamHI酶切后再純化回收；pGENS質(zhì)粒同樣以NdeI，BamHI XhoI，酶切降解，回收大片段；將回收的CNTF基因片段和載體大片段體外連接，構(gòu)成重組質(zhì)粒pGENS CNTF，見(jiàn)圖2。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌受體菌BL21(DE3)pLYSS，經(jīng)酶切、PCR、DNA測(cè)序等驗(yàn)證過(guò)程，從中篩選一個(gè)結(jié)構(gòu)完全正確的轉(zhuǎn)化子。經(jīng)搖瓶表達(dá)篩選，確定pGENS CNTF2為生產(chǎn)用原始工程菌。
pGENS CNTF質(zhì)粒為本公司自行構(gòu)建的表達(dá)型質(zhì)粒，包括以下組成元件E.coli的ColE1復(fù)制子；Ampicillin抗性基因。
包涵體增溶復(fù)性按圖3連接復(fù)性裝置。將包涵體增溶液以一定比例混于復(fù)性起始液中。復(fù)性起始液配方尿素3-6MTris-HCl5-50mM，pH6.5-8.5EDTA5Mm復(fù)性蛋白濃度0.2-1.0mg/ml貯液配方Tris-HCl5-50mM，pH6.5-8.5EDTA5mM貯液與復(fù)性液的體積比控制在1∶3-1∶10，復(fù)性反應(yīng)器置于磁力攪拌器上，均勻攪拌。開啟蠕動(dòng)泵抽出蛋白液，流經(jīng)超濾膜功能層側(cè)，變性劑因超濾作用透過(guò)超濾膜并注入廢液缸，同時(shí)貯液被等體積吸入復(fù)性反應(yīng)器并立即被攪拌均勻。在此過(guò)程中可調(diào)節(jié)泵流量及出口端管路口徑可調(diào)節(jié)變性劑去除的速度。在此循環(huán)過(guò)程中，變性劑濃度逐步下降，蛋白則應(yīng)其分子量較大，無(wú)法穿過(guò)超濾膜，沿膜壁側(cè)重新回到復(fù)性反應(yīng)器中進(jìn)行復(fù)性。整個(gè)復(fù)性過(guò)程約需5-10小時(shí)。
CNTF純化制備用20mM pH8.0Tris-鹽酸為起始流動(dòng)相，5倍柱床體積平衡Q-Sepharose FF離子交換柱，爾后將復(fù)性濃縮好的CNTF蛋白溶液直接上樣，并以2倍柱床體積起始流動(dòng)相沖洗層析柱，然后用起始流動(dòng)相加0.01-0.5NaCl梯度進(jìn)行洗脫，收集目標(biāo)峰。離子交換目標(biāo)峰中加入固體(NH4)2SO4至0.6mol/L，上Phenyl-Sepharose FF柱，用20mM pH8.0Tris-鹽酸緩沖液梯度洗脫，收集目標(biāo)峰，加入固體(NH4)2SO4至2.0mol/L，4℃保存過(guò)夜，10,000rpm，10min離心收集沉淀，用10mM pH7.0磷酸鹽緩沖液溶解，上經(jīng)同樣磷酸鹽緩沖液平衡的Superdex75柱，洗脫收集目標(biāo)峰。
權(quán)利要求
1.一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的生產(chǎn)方法，其特征在于通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，對(duì)人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的基因進(jìn)行修飾改造，獲得改造后突變?nèi)私逘钌窠?jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因的cDNA，人工合成該cDNA，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)全自動(dòng)發(fā)酵罐高密度表達(dá)；以切向流超濾方式進(jìn)行復(fù)性；以離子交換層析、疏水層析和分子篩層析順序組合純化，生產(chǎn)得到高純度的睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的生產(chǎn)方法，其特征在于所說(shuō)的人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因進(jìn)行修飾改造是對(duì)其編碼的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了改變第17位半胱氨酸變?yōu)楸彼?，?3位谷氨酸變?yōu)榫彼?，并去掉末?5個(gè)氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的生產(chǎn)方法，其特征在于所說(shuō)的對(duì)其編碼的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了改變是選用了大腸桿菌偏愛(ài)密碼子改造修飾，使其獲得高表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的生產(chǎn)方法，其特征在于所說(shuō)的切向流超濾的超濾膜材質(zhì)采用醋酸纖維素酯、硝酸纖維素酯、偏四氟乙烯或聚砜等低蛋白吸附材料；截留分子量在1000-10000之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的生產(chǎn)方法，其特征在于所說(shuō)的離子交換層析、疏水層析和分子篩層析中離子交換填料為DEAE、Q陰離子交換基團(tuán)、疏水填料為butyl-、phenyl-或octyl基的介質(zhì)，分子篩填料為低蛋白吸附的Sephacryl S200或Superdex75。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的生產(chǎn)方法。它通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，對(duì)人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的基因進(jìn)行修飾改造，獲得改造后突變?nèi)私逘钌窠?jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因的cDNA，人工合成該cDNA，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)全自動(dòng)發(fā)酵罐高密度表達(dá)；以切向流超濾方式進(jìn)行復(fù)性；以離子交換層析、疏水層析和分子篩層析順序組合純化，生產(chǎn)得到高純度的睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1)采用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，對(duì)天然密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了突變體在大腸桿菌中的穩(wěn)定高表達(dá)。2)采用切向流超濾方式復(fù)性，可減少超濾過(guò)程中的極化現(xiàn)象。3)離子交換層析、疏水層析和分子篩層析三種不同分離機(jī)理層析順序組合，使復(fù)性后的CNTF得以純化精制，其純度均大于95％。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1403481SQ0213603
公開日2003年3月19日 申請(qǐng)日期2002年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月12日
發(fā)明者黃巖山, 王昌梅, 裘霽宛, 李輝, 孫瑛, 鄒曄, 孫漢棟, 丁海 申請(qǐng)人:杭州九源基因工程有限公司