專利名稱：艾滋病毒原位核酸芯片及其制備方法
技術領域：
本發明涉及艾滋病的診斷和篩查裝置和制備方法，特別適用于艾滋病毒快速、定量檢測。
生物芯片技術以其效率高、信息量大的特點在艾滋病毒檢測中有重要的應用前景。目前已有報道的涉及艾滋病毒診斷的生物芯片技術主要有兩類。
一類是對待測的基因進行序列分析。如美國Affymetrix公司1999年1月19日申請公開的美國專利US Patent 5,861,242“Array of nucleic acidprobes on biological chips for diagnosis of HIV and methods of usingthe same”，公開了一種用于HIV序列分析的由上萬個寡核苷酸構成的高密度寡核苷酸探針陣列芯片，該探針陣列中對HIV保守序列的每個核苷酸有至少四個與之互補的寡核苷酸探針。探針采用光導化學合成法，生成固定在固體支撐物上。
另一類是用待測病原體的特征基因片段作為探針，與血樣中提取的、經擴增標記熒光的DNA或RNA進行雜交，判斷陰陽性。如武漢大學申請國家知識產權局2000年10月25日公開的發明專利“性病的集成診斷芯片及其制備方法”，公告號CN1271098，該發明公開了一種性病的集成診斷芯片以及這種芯片的制備方法，它是在玻璃或硅片上光刻有微坑陣列，這些陣列分為八個區域，依次在這些微坑中采用通常的化合鍵合法固定有包含愛滋病等八種性病病原的具診斷意義的特征基因或其引物。上海博道基因技術有限公司申請國家知識產權局于2001年8月29日公開的發明專利“用于感染性疾病乙肝病毒、梅毒螺旋體、愛滋病毒和丙肝病毒診斷的基因芯片”，公告號CN1310236，該發明公開了一種用于感染性疾病HBV、TP、HIV和HCV診斷的基因芯片，該基因芯片包括檢測監控和疾病診斷兩個系統，其中疾病診斷系統設有選自上述四種感染性疾病病原體核酸的保守區序列的探針，可以同時對上述四種感染性病毒進行檢測。
上述已有芯片技術，首先在探針構成上，前者采用高密度陣列可對靶基因進行序列分析，但使芯片成本過高，不適于日常的臨床診斷；后者只采用一種特征基因片段，不能進行艾滋病毒的分型檢測。
其次，芯片檢測是利用熒光素等標記靶基因的熒光標記法，用高分辨熒光掃描儀獲得結合于芯片上靶基因的熒光信號進行分析測試。熒光標記法存在一些嚴重的不足，如檢測需前標記靶基因，需在雜交反應完成并洗脫未結合標記物后才能進行檢測，檢測設備復雜且成本高，對檢測條件有極其嚴格的要求，操作冗繁，難以實現自動化、小型化等等。
再次，只能進行是否存在艾滋病毒的定性檢測，而不能進行艾滋病毒的定量分析。
現有艾滋病毒芯片技術存在的上述問題，嚴重限制了其推廣應用。
艾滋病毒原位核酸芯片包括基片、固定在基片上的微型電極陣列，各微型電極分別由電極引線與檢測電路連接，在微型電極陣列中，以每兩個微型電極構成一個傳感器，兩個微型電極之間的空間距離為10μm-10mm，傳感器之間的空間距離至少要10μm以上，微型電極陣列所構成的各傳感器產生信號的區域內分別對應地固化有不同的艾滋病毒核酸片段作為探針，組成艾滋病毒探針陣列。
本發明采用在基片上制作結構相同的微型傳感器陣列，在每一個傳感器上固化一種艾滋病毒的特征核酸片段作為探針，構成在使用時能通過傳感器的響應原位獲取探針與靶核酸反應信息的艾滋病毒原位核酸芯片來實現其目的。
上述的基片是硅、或石英、或玻璃、或塑料等半導體或絕緣材料。
上述的微電極是金、或銀、或銅、或鋁等金屬導電材料。
上述的艾滋病毒核酸探針是艾滋病毒的特征基因片段，一種探針對應一種艾滋病毒，包括各種亞型的艾滋病毒。一探針固化在一傳感器的一個或兩個電極的(2)表面上、或固化在傳感器兩電極間的基片(5)上、或固化在一個傳感器的兩微型電極及其之間的區域上。
上述的各種艾滋病毒特征基因片段選自各種HIV病毒的保守區，各種HIV病毒保守區靶基因為已有公開技術，共設計了34種探針，其序列如表1所示表1艾滋病毒核酸探針序列
適用于本發明的艾滋病毒原位核酸芯片的檢測對象即靶物質，可以是各種艾滋病毒的DNA(脫氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)，探針可以是按照艾滋病毒的特征核酸片段的序列合成的寡核苷酸。由于一個傳感器上對應有一種探針，而由多個傳感器構成的陣列芯片上對應有由多種探針構成的探針組，因此可對包括所有已知的各種艾滋病毒進行檢測。
當將含有靶物質的樣品溶液與本原位芯片接觸時，靶物質被相應的探針捕獲，探針—靶的相互作用將導致傳感器響應(電參數)的變化，由此，通過電參數測量可對原位芯片內每一傳感器上特定的靶物質—探針結合進行動態實時監測，從而實現對靶物質的測定。
本發明的艾滋病毒原位核酸芯片的制備方法如下1)制作基片(1)，2)在基片上用微電子技術制作微型電極陣列，(1)將金屬電極材料在基片(1)上蒸發鍍膜，(2)采用光刻法制出電極圖形，再采用反應離子腐蝕法，按電極圖形腐蝕去除多余的金屬層制出微電極(2)陣列及其引線(3)，3)在各微電極(2)上，或微電極間的基片上，采用化學鍵合法、或自組裝法，分別固化各種艾滋病毒核酸探針(4)，構成艾滋病毒核酸探針陣列，制成本艾滋病毒原位核酸芯片。
上述的光刻法、反應離子腐蝕法、化學鍵合法、自組裝法均為已有公開技術。
本發明與已有生物芯片及其制備方法相比較，具有如下的明顯優點和顯著效果。
本發明一是采用微電子技術制作芯片，可大批量生產，二是采用各種HIV病毒的特征基因段構建艾滋病毒的核酸探針陣列，可全面準確地檢測各種亞型的艾滋病毒，而無須高密度的探針陣列，因此大大降低了芯片成本。
本發明采用微型傳感器，通過測量探針—靶結合所致的一種電信號的變化，原位、實時直接檢測探針—靶的相互作用，一是HIV靶核酸無須偶聯熒光素等標記物，使用簡便，二是所需電子測量設備簡單，易于實現小型化、自動化，對使用環境的要求也不高。高效快速、準確靈敏、檢測方便，可同時檢測多種艾滋病病毒核酸的多個片段，實現對艾滋病的診斷、病情及療效的動態跟蹤等。
本發明的艾滋病毒原位核酸芯片使用時，一是不存在對未結合標記物的清洗，二是無須標記而減少了樣本制備時間，三是只要有足夠的結合量使電信號有明顯變化而無須等待反應完成，因此可大大縮短檢測時間。
本發明與利用傳感器信號變化量與傳感器上靶病毒核酸的結合量有關，可用于對HIV病毒進行定量分析。
圖1中，1為基片，2為微電極，3為電極引線，4為傳感器兩電極間基片區域，探針在圖中未示出。
2)在基片上用微電子技術制作微型電極陣列(1)在基片1上蒸鍍或濺射電極金屬材料，如金、或銀、或鉑、或鎳鉻合金，制出厚100nm-5000nm的金屬薄膜。
(2)采用光刻法制出電極圖形，再采用反應離子腐蝕法，按電極圖形腐蝕制出微電極2的陣列及其引線。在基片上平行對齊地裝了兩排，每排由6個傳感器組成的陣列，每一微電極長0.2-2mm、寬0.2-2mm，每一傳感器的兩個微型電極的空間距離為0.2-2mm，引線寬0.1-1mm，在12個傳感器的兩微型電極間的基片上分別固化有12種不同的艾滋病毒核酸探針。
3)在傳感器表面固定探針本發明的艾滋病毒核酸探針根據HIV特征基因片段設計，共設計了34種，如前表1所示。可全部選用，也可根據需要選用其中的幾種，如在圖1所示的芯片上可選用表1中1-12號探針。
探針固定在傳感器的一對電極上，也可固定在傳感器電極間基片區域上。當探針固定在金、氧化鈮、氧化銥、鉑、鈦、鉭、鎢及其它金屬表面時，這些金屬表面能通過與探針上的有機巰基連接形成穩定的偶合物。如一5’或3’端標記上巰基的合成DNA探針可與金等金屬形成穩定的偶合物。當探針固定在用作基片的玻璃表面時，可通過與環氧硅烷反應使其環氧基功能化，在玻璃上的環氧基與5’-氨基-衍生寡核苷酸探針反應，形成一仲胺共價聯接，而將探針聯接到玻璃的表面。如5’醛或羧酸、氨基和磷酸的衍生物可分別與酰肼、重氮化活化以及氮基修飾的聚苯乙烯結合。
探針的固定可在合成各種探針后，采用微量移液管或微噴頭或針頭將各種探針逐點分布在基片表面各相應的位點上。
使用本發明的艾滋病毒核酸原位芯片，對艾滋病毒核酸進行檢測的傳感檢測可用成熟的各種電學或電磁學方法，以下對其中的交流電導法作一介紹交流電導GAC＝εA/d，式中，A為電極的有效面積、d為電極間的有效距離，兩者之比對所用芯片而言為一常數；而ε為介電常數，取決于電極表面以及其間介質的性質和狀態。在檢測過程中，GAC將隨著傳感器上是否存在核酸雜交、核酸雜交的量的變化而變化。因此可通過測量芯片上傳感器的交流電導，對探針與靶核酸的反應進行原位實時檢測，從而判斷是否存在某種艾滋病毒，并可測定出該艾滋病毒核酸的量。
權利要求
1.一種艾滋病毒原位核酸芯片，包括基片、固定在基片上的微型電極陣列，各微型電極分別由電極引線與檢測電路連接；其特征在于每兩個微型電極構成一個傳感器，兩個微型電極之間的空間距離為10μm-10mm，傳感器之間的空間距離至少要10μm以上，微型電極陣列所構成的各傳感器產生信號的區域內分別對應地固化有不同的艾滋病毒核酸片段作為探針，組成艾滋病毒探針陣列。
2.根據權利要求1所述的艾滋病毒原位核酸芯片，其特征在于該芯片的基片長20mm，寬13mm，在基片上平行對齊地裝了兩排，每排由6個傳感器組成的陣列，每一微型電極長為0.2-2mm，寬為0.2-2mm，厚為100nm-5000nm的金屬薄膜，每一傳感器的兩個微型電極的空間距離為0.2-2mm，電極引線寬0.1-1mm，在12個傳感器的兩微型電極間的基片上分別固化有12種不同的艾滋病毒核酸探針。
3.根據權利要求1所述的艾滋病毒原位核酸芯片，其特征在于每一艾滋病毒核酸探針固化在一個傳感器的一個或兩個微型電極的表面上。
4.根據權利要求1所述的艾滋病毒原位核酸芯片，其特征在于每一艾滋病毒核酸探針固化在一個傳感器兩微型電極間的基片上。
5.根據權利要求1所述的艾滋病毒原位核酸芯片，其特征在于每一艾滋病毒核酸探針固化在一個傳感器的兩微型電極及其之間的區域上。
全文摘要
一種艾滋病毒原位核酸芯片及其制備方法，涉及艾滋病的診斷、篩查裝置及制備方法。該芯片包括芯片、固定在基片上的微型電極陣列和與各微型電極固定連接的電極引線。微型電極陣列中每兩個微型電極構成一個傳感器，在微型電極所構成的各傳感器產生信號的區域內分別對應地固化有不同的艾滋病毒核酸片段作為探針，組成艾滋病毒探針陣列。其制備方法包括制作基片、在基片上制作微型電極陣列、分別固化各種艾滋病毒核酸探針。本發明可同時高效快速、無須標記、自動簡便地檢測多種艾滋病毒核酸的多個片段，實現對艾滋病的診斷及其原位跟蹤，大大降低了芯片成本，準確靈敏，檢測時間縮短，可用于對艾滋病毒進行定量分析。
文檔編號C07H21/04GK1429917SQ0213389
公開日2003年7月16日 申請日期2002年10月11日 優先權日2002年10月11日
發明者薛永新, 莫志宏, 靳萍, 田學隆, 郭鋼 申請人:薛永新, 莫志宏, 靳萍, 田學隆, 郭鋼