專利名稱：光學分割d1－反式－4－苯基－5－鄰氯芐基吡咯烷酮－2的方法
技術領域：
本發明屬于有機化學合成領域，具體地屬于利用酶促反應拆分dl-反式-4-苯基-5-鄰氯芐基吡咯烷酮-2為左旋和右旋單體的方法。
背景技術：
吡咯烷酮-2類化合物被認為是唯一沒有爭議的一類具有促智活性的化合物，如成藥上市的、主要用于改善腦功能，特別是用于治療老年性癡呆、腦血管后遺癥的行為和精神障礙的藥物腦復康和阿尼西坦。申請人已設計、合成并篩選出了一個對神經細胞具有高選擇性鈣拮抗活性的化合物dl-反式-4-苯基-5-鄰氯芐基吡咯烷酮-2(KMBZ-009)，并對其合成方法、路線、結構以及應用等相關內容已申請發明專利三項且均已獲得證書(專利號ZL 94 1 04879.9、ZL 97 123417.5和ZL 97 1 23419.1)。為進一步開展該目標化合物的藥理、藥效及臨床研究，將dl-反式-4-苯基-5-鄰氯芐基吡咯烷酮-2拆分左旋和右旋單體是必須的。到目前為止，利用酶促反應來對吡咯烷酮-2類化合物進行光學分割是最有效的方法[Bruno Jouglet and GerardRousseau，Tetrahedron Letters，34(14)，2307-2310，1993]，但是，按照現有技術的方法和路線，未得到預期的結果。
發明內容
本發明的目的在于提供一種將dl-反式-4-苯基-5-鄰氯芐基吡咯烷酮-2拆分為左旋和右旋單體化合物的，與現有技術不同的途徑、不同的催化酶以及不同的脫除輔助基的方法。
為實現上述目的，本發明提供如下技術方案光學分割dl-反式-4-苯基-5-鄰氯芐基吡咯烷酮-2化合物(簡稱KMBZ-009)的方法，對映體dl-反式-4-苯基-5-鄰氯芐基吡咯烷酮-2(KMBZ-009)在甲醛水溶液中，碳酸鉀的作用下，室溫攪拌反應，生成氮甲醛化物1；在醋酐/吡啶的作用下，氮甲醛化物1轉化為乙酰化物2；中間體乙酰化物2經酶的催化作用后，形成具有光學活性的乙酰化物3和去乙酰基產物4，再經脫除輔助基處理后就得到相應的左旋和右旋單體化合物 根據所述方法，甲醛化用反式dl-4-苯基-5-鄰氯芐基吡咯烷酮-2(KMBZ-009)在1.5倍量碳酸鉀(K2CO3)的作用下，與30-40％甲醛水溶液(20倍-40倍量)，室溫條件下攪拌反應4小時，得氮甲醛化物(式1)。 根據所述方法，乙酰化采用氮甲醛化合物1在室溫下、干燥吡啶溶劑與三當量的醋酐反應生成乙酰化產物(式2)。
根據所述方法，酶促反應是在10-25℃，少量甲醇或乙醇或正丁醇存在下，1∶1的異丙醚∶正己烷/叔丁基甲醚溶劑中，酶試劑Triacylglylcerol lipase(EC 3.1.1.3 from porcine pancreas，type II Crude)催化乙酰化產物發生水解反應，乙酰化產物與酶試劑重量比為1∶6，生成具有光學活性的化合物3和4(式3和式4)。 根據所述方法，酶促反應時間為3-5天；反應進程由硅膠薄層層析(TLC)來檢測，展開系統為3∶1石油醚/乙酸乙酯；反應產物3和4經硅膠與樣品的重量比為50∶1，洗脫系統是5∶1和1∶1石油醚/乙酸乙酯梯度洗脫的硅膠柱層析分離。
根據所述方法通過酶促反應生成的化合物4可再經混合溶劑石油醚-乙酸乙酯重結晶達到100％ee值；化合物3可再經三次酶解后得到純度足以滿足經下一步操作后得100％ee最終產物的大于70％ee的光學活性體3。
根據所述方法得到的大于70％ee的化合物3可進一步溶解于無水甲醇中，在0-5℃條件下，與3當量的KOH或NaOH反應，生成右旋光學活性體(+)-KMBZ-009，再經石油醚-乙酸乙酯重結晶處理后得100％ee(+)-KMBZ-009(右旋體)；100％ee化合物4可進一步經Ac2O/Pyr.乙酰化后，在0-5℃條件下，與3當量的KOH或NaOH反應，生成右旋光學活性體(+)-KMBZ-009，再經石油醚-乙酸乙酯重結晶處理后得100％ee的左旋單體化合物(-)-KMBZ-009(左旋體)。
根據所述方法得到的化合物3和4以及(+)-KMBZ-009和(-)-KMBZ-009的％ee值的檢測方法是用手性柱型(Daicel Chiralcel AD)，洗脫劑10％異丙醇/正己烷，流速1ml/min.，檢測波長230nm，內標為它們對應的消旋體的HPLC來檢測它們的光學純度。
與現有技術相比，本發明的有益效果在于1.采用了新的利用酶促反應拆分對映體為光學活性體的途徑，即氮甲醛化物的乙酰化物為底物，在水解酶的作用下，達到拆分的目的，而不是現有文獻[Bruno Jouglet and Gerard Rousseau，TetrahedronLetters，34(14)，2307-2310，1993]中報道的以氮甲醛化物為底物進行的光學分割。
2.使用的酶試劑Triacylglylcerol lipase(EC 3.1.1.3 fromporcine pancreas，type II Crude)是文獻[Bruno Jouglet and GerardRousseau，Tetrahedron Letters，34(14)，2307-2310，1993]中沒有采用的，且比文獻中報道的酶試劑更有效于拆分dl-反式-4-苯基-5-鄰氯芐基吡咯烷酮-2為左旋和右旋單體化合物。
3.采用了新的脫除氮原子上輔助基的方法，即在強堿(KOH或NaOH)-甲醇作用于氮甲醛化物的乙酰化物可一步轉換成為吡咯烷酮-2化合物，比現有技術更方便、更有效。
圖1為本發明的光學分割dl-反式-4-苯基-5-鄰氯芐基吡咯烷酮-2的方法流程圖。
具體實施例方式下面用本發明的實施例來進一步闡明本發明的技術方案，但本發明的內容并不局限于此。
實施例1氮甲醛化物1的制備0.84g dl-KMBZ-009(其制備方法見發明專利專利號ZL 97 123419.1，國際專利主分類號C07D207/26)室溫下與K2CO3(1.5當量)及40當量甲醛水溶液反應4小時，過濾，水洗即可得消旋體化合物(2)0.88g(95％)。
無色柱狀結晶(AcOEt)，1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm6.90-7.35(m，9H)，4.99(d，J＝11.0Hz，1H)，4.73(d，J＝11.0Hz，1H)，4.16(m，1H)，3.71(w，1H)，3.38(dd，J＝5.0，13.8Hz，1H)，2.83-2.97(m，2H)，3.24(m，1H)，2.42(dd，J＝4.2，17.6Hz，1H).13C-NMR(400MHz，CDCl3)δppm175.3(s)，143.5(s)，134.8(s)，134.4(s)，131.4(d)，129.8(d)，128.82(d)，128.4(d)，127.0(d)，126.8(d)，126.4×2(d)，66.0(t)，65.2(d)，41.9(d)，38.4(t)，37.9(t).
dl-反式-4-苯基-5-鄰氯芐基吡咯烷酮-2的核磁共振波譜數據為1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm7.17-7.35(m，9H)，6.08(w，1H)，4.01(m，1H)，3.28(m，1H)，3.13(dd，J＝4，14Hz，1H)，2.83(dd，J＝9，14Hz，1H).2.76(dd，J＝9，17Hz，1H)，2.49(dd，J＝9，17Hz，1H).13C-NMR(400MHz，CDCl3)δppm176.0(s)，141.4(s)，135.1(s)，134.1(s)，131.1-127.1(7×d)，61.2(d)，46.8(d)，39.2(t)，38.9(t).
以上數據顯示原料dl-反式-4-苯基-5-鄰氯芐基吡咯烷酮-2中的“NH”(6.08ppm)信號峰消失，產物分子結構中氮原子甲醛取代的“N-CH2-OH”基團(4.99和4.73ppm)和3.71ppm信號峰出現；產物的13CNMR比原料多出一個CH2基團的碳峰(66.0ppm)。由此推斷，產物應為氮甲醛化物。
乙酰化物2的制備在室溫下，化合物2(0.80g)與3當量Ac2O(0.7mL)和5當量吡啶(1mL)混合攪拌反應過夜，常法處理后，柱層析分離得0.90g乙酰化物2(100％)純品。
無色油狀物，1H-NMR(400MHz，CDCl3)δppm7.26-6.86(m，9H)，5.49(d，J＝10.4Hz，1H)，5.27(d，J＝10.4Hz，1H)，4.07(m，1H)，3.28(m，2H)，2.95(m，2H)，2.51(d，J＝4.0，17.6Hz，1H)，2.01(s，3H).13C-NMR(400MHz，CDCl3)δppm175.3(s)，170.6(s)，143.1(s)，134.3×2(s)，131.3(d)，129.8(d)，128.7×2(d)，128.5(d)，127.0(d)，126.9(d)，126.32(d)，65.3(t)，65.1(d)，41.6(d)，37.6(t)，37.4(t)，20.7(q).
以上的氫質子NMR顯示產物比中間體原料甲醛化物1在2.01ppm處多出一個單峰(CH3CO-)；在產物的碳NMR中，170.6ppm(單峰)和20.7ppm(四重峰)處也證明產物分子中的乙酰基存在。由此推斷產物為乙酰化物。
酶催化反應0.88g乙酰化物2在固定化酶5.28g(Lipase，EC 3.1.1.3，Type II，Crude，from Porcine)(酶與樣品質量比＝6∶1)作用下，isopropylether(100mL)/Hexane(100mL)/Methanol(100μl)中，室溫下反應3～5天，濾去固定化酶后，回收溶劑，所得浸膏經柱層析分離后得化合物4(0.27g，75％ee)，化合物3(0.65g，22％ee) (AD column，10％isopropyl ether/Hexane，1ml/min.).化合物4重結晶(AcOEt/petroleum ether)后，可得100％ee的單體化合物4(150mg)，其1H-NMR和13C-NMR與甲醛化物1相同。化合物3再酶解兩次后，可得0.33g油狀化合物3(73％ee)，其1H-NMR和13C-NMR與乙酰化物2相同。
脫除輔助基反應0.33g酶解物3(73％ee)經三當量KOH/MeOH水解、經石油醚-乙酸乙酯混合溶劑重結晶后可得200mg(+)-KMBZ-009(100％ee)，其1H-NMR和13C-NMR與dl-KMBZ-009相同；HPLC的保留時間是13.4min.(HPLC條件手性AD柱，1ml/min，10％iso-propanol/Hexane)； ＝+45.0(c＝1.0 in CHCl3)。酶解物4(79mg，100％ee)乙酰化后，經同樣的操作，得64mg(-)-KMBZ-009(100％ee)，其1H-NMR和13C-NMR與dl-KMBZ-009相同；HPLC的保留時間是12.9min.(HPLC條件手性AD柱，1ml/min，10％iso-propanol/Hexane)； ＝-44.0(c＝1.0 inCHCl3)。
左旋KMBZ-009晶體結構分析實驗采用MAC DIP2030K面探測儀、Moka輻射、石墨單色器分別收集樣品Samp4004(左旋KMBZ-009)的衍射數據。用直接法(SHELX86)分別解析并獲得它們的晶體結構。在分子結構中，含有1個氯離子，由于氯離子對于Mo靶有反常散射效應，即Δf’＝0.1，Δf”＝0.2，故可以利用氯離子的反常散射效應，通過比較正反型的Rf值判斷它們的絕對構型。對采用直接法解析得到的晶體結構，考慮反常散射對原子散射的影響，計算并修正p(r)和p(-r)值，最終分別得到它們正、反型 Rf值，如表1所示。從表1可知，Samp4004(左旋KMBZ-009)的Rf(+)大于Rf(-)，其差值為0.0001，初步可以判斷它的絕對構型為提供構型的反型，即4、5位碳原子的絕對構型最可能均為R構型。可能的絕對構型如下 表1左旋KMBZ-009晶體結構分析結果
權利要求
1.光學分割dl-反式-4-苯基-5-鄰氯芐基吡咯烷酮-2化合物(簡稱KMBZ-009)的方法，其特征在于KMBZ-009在甲醛水溶液中，碳酸鉀的作用下，室溫攪拌反應，生成氮甲醛化物1；在醋酐/吡啶的作用下，氮甲醛化物1轉化為乙酰化物2；中間體乙酰化物2經酶的催化作用后，形成具有光學活性的乙酰化物3和去乙酰基產物4，再經脫除輔助基處理后就得到相應的左旋和右旋單體化合物
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于甲醛化用反式dl-4-苯基-5-鄰氯芐基吡咯烷酮-2(KMBZ-009)在1.5倍量碳酸鉀(K2CO3)的作用下，與30-40％甲醛水溶液(20倍-40倍量)，室溫條件下攪拌反應4 小時，得氮甲醛化物(式1)。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于乙酰化采用氮甲醛化合物1在室溫下、干燥吡啶溶劑與三當量的醋酐反應生成乙酰化產物(式2)。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于酶促反應是在10-25℃，少量甲醇或乙醇或正丁醇存在下，1∶1的異丙醚∶正己烷/叔丁基甲醚溶劑中，酶試劑Triacylglylcerol lipase(EC 3.1.1.3 from porcine pancreas，typ II Crude)催化乙酰化產物發生水解反應，乙酰化產物與酶試劑重量比為1∶6，生成具有光學活性的化合物3和4(式3和式4)。
5.根據權利要求1或4所述的方法，其特征在于酶促反應時間為3-5天；反應進程由硅膠薄層層析(TLC)來檢測，展開系統為3∶1石油醚/乙酸乙酯；反應產物3和4經硅膠與樣品的重量比為50∶1，洗脫系統是5∶1和1∶1石油醚/乙酸乙酯梯度洗脫的硅膠柱層析分離。
6.根據權利要求1或4所述的方法，其特征在于通過酶促反應生成的化合物4可再經混合溶劑石油醚-乙酸乙酯重結晶達到100％ee值；化合物3可再經三次酶解后得到純度足以滿足經下一步操作后得100％ee最終產物的大于70％ee的光學活性體3。
7.根據權利要求1或6所述的方法，其特征在于用權利要求6得到的大于70％ee的化合物3可進一步溶解于無水甲醇中，在0-5℃條件下，與3當量的KOH或NaOH反應，生成右旋光學活性體(+)-KMBZ-009，再經石油醚-乙酸乙酯重結晶處理后得100％ee(+)-KMBZ-009(右旋體)；100％ee化合物4可進一步經Ac2O/Pyr.乙酰化后，在0-5℃條件下，與3當量的KOH或NaOH反應，生成右旋光學活性體(+)-KMBZ-009，再經石油醚-乙酸乙酯重結晶處理后得100％ee的左旋單體化合物(-)-KMBZ-009(左旋體)。
8.根據權利要求1或6或7所述的方法，其特征在于化合物3和4以及(+)-KMBZ-009和(-)-KMBZ-009的％ee值的檢測方法是用手性柱型(Daicel Chiralcel AD)，洗脫劑10％異丙醇/正己烷，流速1ml/min.，檢測波長230nm，內標為它們對應的消旋體的HPLC來檢測它們的光學純度。
全文摘要
提供一種利用酶促反應光學分割具改善記憶功能障礙、腦血管后遺癥,增進學習記憶作用,用于治療老年性癡呆癥的化合物dl－反式－4－苯基－5－鄰氯芐基吡咯烷酮－2(KMBZ－009)的方法。KMBZ－009在甲醛水溶液中,碳酸鉀的作用下,室溫攪拌反應,生成氮甲醛化物1;在醋酐/吡啶的作用下,氦甲醛化物1轉化為乙酰化物2;中間體乙酰化物2經酶的催化作用后,形成具有光學活性的乙酰化物3和去乙酰基產物4,再經脫除輔助基處理后就得到相應的左旋和右旋單體化合物。
文檔編號C07D207/00GK1389459SQ02133429
公開日2003年1月8日 申請日期2002年7月4日 優先權日2002年7月4日
發明者汪冶, 楊小生, 郝小江 申請人:中國科學院昆明植物研究所