專利名稱：新型抗腫瘤植物提取物、其提取方法及其類似物的制作方法
技術領域：
本發明屬醫藥技術領域，具體涉及從植物中提取得到的化合物、其提取方法、用途及其類似物。
核磁共振碳譜(100MHz，DMSO-d6，δin ppm and TMS as intemalstandard)123.8(d，C-1)，115.2(d，C-2)，157.8(s，C-3)，105.3(d，C-4)，130.2(s，C-4a)，123.8(s，C-4b)，104.6(d，C-5)，149.0(s，C-6)，149.8(s，C-7)，104.2(d，C-8)，124.5(s，C-8a)，122.6(s，C-8b)，52.4(t，C-9)，53.5(t，C-11)，22.0(t，C-12)，23.0(t，C-13)，30.6(t，C-14)，57.8(d，C-14a)，3 1.2(t，C-15)，120.1(s，C-15a)，122.5(s，C-15b)，55.6(q，C-3-OMe)，55.8(q，C-6-OMe)and 55.5(q，C-7-OMe).
特別地，當R1＝R3＝OMe，R2＝OH時，該化合物為3，7-二甲氧基-6-羥基-11，12，13，14，14a，15-六氫-9H-菲[9，10-b]并喹喏里西定(化合物2)，其特征在于顏色和形狀白色粉末熔點248-250℃比旋光[α]D20-63.7°(c0.2，CH3OH)紅外光譜主要的特征譜帶位于3410，2934，1613，1514，1467，1419，1357，1310，1265，1240，1195，1137，1037 and 819cm-1紫外光譜(λmaxMeOHlogε)282nm(4.96)質譜(ESI(+))364(M+H)+(ESI(-))362(M-H)-(HREIMS(+))363.1830([M]+，calcd.363.1834)核磁共振氫譜(400MHz，DMSO-d6，δin ppm and TMS as internalstandard)8.12(1H，s，H-5)，7.92(1H，d，J＝2.4Hz，H-4)，7.80(1H，d，J＝9.2Hz，H-1)，7.33(1H，s，H-8)，7.26(1H，dd，J＝9.2，2.4Hz，H-2)，4.97 and 4.51(each 1H，d，J＝16Hz，H-9)，4.00(3H，s，H-3-OMe)，3.98(3H，s，H-7-OMe)，3.74 and 3.16(each 1H，d，J＝10.4Hz，H-11)，3.55 and 3.10(each 1H，d，J＝15.2Hz，H-15)，3.51(1H，m，H-14a)，2.25 and 1.89(each 1H，d，J＝14.4Hz，H-14)，1.93(2H，m，H-12)，1.60 and 1.77(each 1H，m，H-13).
核磁共振碳譜(100MHz，DMSO-d6，δin ppm and TMS as internalstandard)124.8(d，C-1)，116.2(d，C-2)，157.8(s，C-3)，108.3(d，C-4)，131.5(s，C-4a)，123.2(s，C-4b)，104.8(d，C-5)，147.1(s，C-6)，150.6(s，C-7)，104.3(d，C-8)，124.0(s，C-8a)，122.1(s，C-8b)，52.4(t，C-9)，54.1(t，C-11)，22.0(t，C-12)，23.0(t，C-13)，30.4(t，C-14)，57.6(d，C-14a)，31.2(t，C-15)，120.0(s，C-15a)，122.1(s，C-15b)，55.9(q，C-3-OMe)and 55.5(q，C-7-OMe)。
要得到化合物1和化合物2，可以借助合適的溶劑浸提蓼科植物束序苧麻粗粉得到總浸膏，總浸膏用水分散后用適宜的有機溶劑萃取而得到萃取物，萃取物經分離得到。本發明以整個植物形式存在的束序苧麻通常被干燥粉碎后用合適的溶劑進行浸提得到總浸膏，總浸膏分散在適量水中，用適宜的有機溶劑進行萃取，濃縮萃取液得到萃取物。從萃取物中經分離得到上述的化合物，此類化合物是具有抗腫瘤活性并能誘導腫瘤細胞向正常細胞分化的菲并喹喏里西啶型生物堿。
本發明中化合物的提取可以通過以下方式得以實現束序苧麻全植株粉碎后用70％-98％的乙醇、甲醇等浸提，浸提液經減壓濃縮得總浸膏，總浸膏溶解在水中后可以分別用合適的有機溶劑萃取，比如乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚、苯等，萃取液經減壓濃縮得萃取物，萃取物經分離提純得到化合物1和化合物2。
特別地，當R1＝R2＝R3＝OMe時，該化合物為3，6，7-三甲氧基-11，12，13，14，14a，15-六氫-9H-菲[9，10-b]并喹喏里西定(化合物1)白色細針晶，在薄層板上與Dragendorff試劑反應顯橘紅色。該化合物的質譜中的準分子離子峰(APIMS(+)378(M+H)+，ESI(+)755(2M+H)+，378(M+H)+)提示該化合物可能為含氮化合物。此化合物位于δ8.15(1H，d，J＝2.4Hz，H-4)，7.83(1H，d，J＝9.2Hz，H-1)，7.30(1H，dd，J＝9.2，2.4Hz，H-2)和8.13(1H，s，H-5)，7.34(1H，s，H-8)的1H NMR信號及紅外光譜中的1609和1466cm-1說明兩個取代苯環的存在。1H NMR信號δ4.05(3H，s，H-6-OMe)，4.01(3H，s，H-3-OMe)，3.97(3H，s，H-7-OMe)確認為3個甲氧基的1H NMR信號。13C NMR(DEPT)中除上述基團的信號外，還有位于δ122.6(s，C-8b)，52.4(t，C-9)，53.5(t，C-11)，22.0(t，C-12)，23.0(t，C-13)，30.6(t，C-14)，57.8(d，C-14a)，31.2(t，C-15)和120.1(s，C-15a)處的9個信號。綜合上述信息，該化合物可能是菲并喹喏里西定型生物堿。根據此化合物的1H-1H COSY，HMQC和HMBC(見下圖)推斷該化合物為3，6，7-三甲氧基-11，12，13，14，14a，15-六氫-9H-菲[9，10-b]并喹喏里西定，其分子式C24H27NO3(計算值377.1991)與高分辨質譜所提供實測值(377.1994)吻合。此化合物的IR光譜中位于2850cm-1處的吸收說明D環與E環是反式稠和的。由此該化合物的結構如下所示。 特別地，當R1＝R3＝OMe，R2＝OH時，該化合物為3，7-二甲氧基-6-羥基-11，12，13，14，14a，15-六氫-9H-菲[9，10-b]并喹喏里西定(化合物2)白色粉末，在薄層板上與Dragendorff試劑反應顯橘紅色。此化合物的質譜中的準分子離子峰(ESI(+)364(M+H)+，ESI(-)362(M-H)-)提示該化合物可能為含氮化合物。化合物2與化合物1的1H NMR和13C NMR譜圖非常相似，差別在于化合物l中的一個甲氧基被一個羥基取代。根據NOSY實驗結果(見右圖)確定化合物2中的6-位應為羥基取代。因此化合物2即為3，7-二甲氧基-6-羥基-11，12，13，14，14a，15-六氫-9H-菲[9，10-b]并喹喏里西定，其分子式C23H25NO3(計算值363.1834)與高分辨質譜所提供實測值(363.1830)吻合。
本發明中，化合物2可在一定條件下轉化為化合物1化合物2溶解于無水丙酮中，向此溶液中加入硫酸二甲酯，再加入無水碳酸鉀，攪拌并回流，反應液冷卻后過濾，濾液與化合物1作薄層對照，證明化合物2的甲基化產物就是化合物1。
本發明中從蓼科植物束序苧麻中提取分離得到的化合物1和2是新發現的具有顯著抗腫瘤活性并能誘導腫瘤細胞向正常細胞分化的菲并喹喏里西定型生物堿，抗腫瘤實驗表明化合物1和2對7種腫瘤細胞具有明顯的抑制作用，其作用機理是誘導腫瘤細胞向正常細胞分化。
另外，本發明以抗腫瘤化合物1和2的結構為模型，設計并合成了系列類似物，其結構式如右所示，其中R1 R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9可以為下述之一種氫原子(H)、羥基(hydroxyl)、烴基(alkyl)、芳基(aryl)、酰基(acyl)、烷氧基(alkoxy)、醛基(aldellyde)、鹵素(halogen)、氨基(amjno)、烴氨基(alkylamino)、芳氨基(arylamino)和酰氨基(acylamino)，且R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9不全為氫原子(H)。上述的類似物可以作為抗腫瘤藥物應用。
本發明具有以下的優點1、本發明分離得到的菲并喹喏里西定型生物堿具有顯著抗腫瘤活性并能誘導腫瘤細胞向正常細胞分化；2、本發明的提取、萃取分離的工藝簡單；3、本發明為新型抗癌藥物的研制奠定了基礎。
具體實施例方式實施例1束序苧麻全植株30Kg(干重)，粉碎后用95％乙醇浸提(50L×3)，減壓濃縮得總浸膏1176g。總浸膏溶解在3.0L溫熱水(約50℃)中，冷卻后用乙酸乙酯萃取(1.0L×10)，減壓濃縮得乙酸乙酯部分455g。乙酸乙酯部分經硅膠柱層析梯度洗脫(CHCl3，CHCl3∶CH3OH＝50∶1，20∶1，10∶1，5∶1，2∶1，CH3OH)分成9個部分(TLC作檢測，相同部分合并在一起)；Fr.4經硅膠柱層析(CH2Cl2∶CH3OH＝20∶1)分離得到1(132mg)和2(26mg)。
實施例2化合物2轉化為化合物1化合物2(3mg)溶解于5ml的無水丙酮中，向此溶液中加入1.4mg硫酸二甲酯，再加入無水碳酸鉀1.3mg。攪拌并回流30分鐘。反應液冷卻后過濾，濾液與化合物1作薄層對照，證明化合物2的甲基化產物就是化合物1。
實施例3本發明抑制人體惡性腫瘤細胞體外生長活性將腫瘤細胞培養在含10％小牛血清的RPMI 1640培養基中，內含適量青、鏈霉素和谷氨酰胺，在5％CO2，37℃條件下培養。試驗前將細胞按一定密度接種于96孔培養板中，24小時后換用含不同濃度本發明(用PBS配置成1mg/ml工作液，使用時按所需濃度用培養基稀釋并加入細胞)的新鮮培養基，繼續培養48小時。終止培養，每孔加入50ul預冷50％三氯乙酸(TCA，終濃度為10％)，靜置5分鐘后移放4℃1小時。蒸餾水洗滌5次，空氣干燥，加入100ul SRB染液(用1％醋酸配制成0.4％溶液)，染色處理細胞10分鐘，用1％醋酸溶液洗滌細胞4次，除去未結合染料，空氣干燥。最后加入150ul 10mmol/L非緩沖Tris溶液溶解結合染料，充分混勻后，經酶標儀在490nm波長下測定并計算GI50(50％細胞生長抑制所需要的濃度)。
表1本發明對七種腫瘤中38個細胞系的生長抑制(GI50，μg/ml)作用
如表1所示，本發明對七種腫瘤、38個細胞系的生長抑制作用，表明了本發明的廣譜抗腫瘤作用。
實施例4本發明誘導乳腺癌脂肪細胞分化應用本發明處理乳腺癌細胞，發現除可引起顯著的細胞增殖抑制外，而且伴有顯著的胞漿脂質堆積。因此應用油紅染色法檢測本發明作用乳腺癌細胞后的脂肪細胞分化。將常規培養的MDA-MB-231乳腺癌細胞接種于24孔板內，貼瓶后加入不同濃度的本發明，繼續培養3-7天。棄培養上清，加入10％甲醛固定細胞1h，蒸餾水洗細胞，用油紅O染色5-10分鐘，直至脂滴著紅色時終止染色。在劑量為0.038ug/ml作用3天后，MDA-MB-231細胞形態學發生明顯改變，主要特征為胞漿脂質堆積，并隨藥物作用時間延長(藥物作用7d)，脂質堆積量增加，而未經本發明處理的細胞，沒有觀察到這種脂滴堆積的形態學改變。正常人靜止期乳腺組織內含有豐富的脂肪細胞，癌組織的發生通常與細胞凋亡受阻、細胞分化障礙有關。誘導分化已成為腫瘤治療的一種新途徑，至今，已發現許多具有誘導癌細胞分化作用的藥物，最典型的藥物是維甲酸類化合物。通過誘導分化探索乳腺癌的治療不僅能為腫瘤治療提供新的途徑，而且這種誘導分化作用也許可能解釋乳腺癌發生的某些機制。
權利要求
1.從蓼科苧麻屬植物束序苧麻中提取分離得到的化合物及在其基礎上設計并合成的類似物，其特征在于具有如下的化學結構 其中，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9可以為下述之一種氫原子(H)、羥基(hydroxyl)、烴基(alkyl)、芳基(aryl)、酰基(acyl)、烷氧基(alkoxy)、醛基(aldehyde)、鹵素(halogen)、氨基(amino)、烴氨基(alkylamino)、芳氨基(arylamino)和酰氨基(acylamino)，且R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9不全為氫原子(H)。
2.根據權利要求1所述的從蓼科苧麻屬植物束序苧麻中提取分離得到的化合物及在其基礎上設計并合成的類似物，其特征是當R1＝R2＝R3＝OMe，R4＝R5＝R6＝R7＝R8＝R9＝H時，該化合物為3，6，7-三甲氧基-11，12，13，14，14a，15-六氫-9H-菲[9，10-b]并喹喏里西定。
3.根據權利要求1所述的從蓼科苧麻屬植物束序苧麻中提取分離得到的化合物及在其基礎上設計并合成的類似物，其特征是當R1＝R3＝OMe，R2＝OH，R1＝R5＝R6＝R7＝R8＝R9＝H時，該化合物為3，7-二甲氧基-6-羥基-11，12，13，14，14a，15-六氫-9H-菲[9，10-b]并喹喏里西定。
4.根據權利要求2或3所述的從蓼科苧麻屬植物束序苧麻中提取分離得到的化合物及在其基礎上設計并合成的類似物，其特征是該化合物可以借助合適的溶劑浸提蓼科植物束序苧麻粗粉得到總浸膏，總浸膏用水分散后用適宜的有機溶劑萃取而得到萃取物，萃取物經分離得到。
5.根據權利要求4所述的從蓼科苧麻屬植物束序苧麻中提取分離得到的化合物及在其基礎上設計并合成的類似物，其特征是浸提可采用70％-98％的乙醇、甲醇，萃取的有機溶劑可采用乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚、苯中的任一種。
6.根據權利要求1或2或3或5所述的從蓼科苧麻屬植物束序苧麻中提取分離得到的化合物及在其基礎上設計并合成的類似物，其特征是3，7-二甲氧基-6-羥基-11，12，13，14，14a，15-六氫-9H-菲[9，10-b]并喹喏里西定通過甲基化可轉化為3，6，7-三甲氧基-11，12，13，14，14a，15-六氫-9H-菲[9，10-b]并喹喏里西定。
7.根據權利要求1或2或3所述的從蓼科苧麻屬植物束序苧麻中提取分離得到的化合物及在其基礎上設計并合成的類似物，其特征是以3，7-二甲氧基-6-羥基-11，12，13，14，14a，15-六氫-9H-菲[9，10-b]并喹喏里西定和3，6，7-三甲氧基-11，12，13，14，14a，15-六氫-9H-菲[9，10-b]并喹喏里西定結構為模型，可以設計并合成系列類似物。
8.根據權利要求1或2或3所述的從蓼科苧麻屬植物束序苧麻中提取分離得到的化合物及在其基礎上設計并合成的類似物的用途，其特征是具有顯著抗腫瘤活性并能誘導腫瘤細胞向正常細胞分化。
全文摘要
本發明屬醫藥技術領域，公開了一類新型抗腫瘤植物提取物、其提取方法及其類似物。以蓼科植物束序苧麻(Boehmeria siamensis Craib，Urticaceae)為原料，經溶劑提取和多種層析方法分離并鑒定了兩個新的菲并喹喏里西定型生物堿3，6，7－三甲氧基－11，12，13，14，14a，15－六氫－9H－菲[9，10－b]并喹喏里西定和3，7－二甲氧基－6－羥基－11，12，13，14，14a，15－六氫－9H－菲[9，10－b]并喹喏里西定，體外抗腫瘤活性實驗表明，其具有對多種惡性腫瘤有明顯的抑制作用并可使部分腫瘤細胞轉化為正常脂肪細胞。本發明還設計并合成了上述化合物的系列類似物，可應用于臨床作為預防和治療癌癥的新藥物。本發明對研究與開發新的抗腫瘤藥物提供了先導化合物，為開發利用天然植物資源提供了科學依據。
文檔編號C07D471/00GK1463973SQ0213330
公開日2003年12月31日 申請日期2002年6月18日 優先權日2002年6月18日
發明者羅應剛, 高小平, 劉燕, 田雅娟, 顧健, 周敏, 李伯剛, 張國林 申請人:中國科學院成都生物研究所