專利名稱：聚乙二醇人生長激素綴合物及其制備方法及其藥物用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質與聚乙二醇PEG綴合物，以及其制備方法和藥物用途。
背景技術：
Ross Clark等于1996年，The Journal of Biological Chemistry 27121969-21977，1996，首次公開了用PEG偶聯人生長激素的方法和藥理活性的研究結果，他們應用的PEG的分子量為5kDa，PEG-GH綴合物的半衰期明顯延長，可以每5天注射一次，使患者使用更方便。但此綴合產物的每個GH分子上偶聯了1-7個PEG分子，綴合物產物是一種混合物，偶聯位點不確定，每種成分無法定量，也無法完全分離，使得批與批之間綴合物的產品成分差異性較大，無法應用于臨床。
各種天然的和重組的蛋白質都具有醫藥用途。一旦將它們純化、分離并配成藥品，可以將它們經非腸道途徑進行給藥，而用于不同的醫療適應癥，然而，非腸道途徑給予的蛋白質可以是免疫原性的、可以是相對不溶于水的且可以具有較短的藥理半衰期。因此，難以使所述的蛋白質在患者體內達到有治療作用的血藥濃度。
通過將所述的蛋白質與聚合物如PEG偶聯后可以克服這些難題。Davis等在美國專利4179337中公開了將PEG與蛋白質如酶和胰島素偶聯以獲得具有低于原始蛋白質的免疫原性作用并仍可保持其基本比例的藥理活性的綴合物的技術方案。Katre等在美國專利4766106和4917888中還公開了通過聚合物偶聯使蛋白質增溶的技術方案。同樣，可以將PEG和其它聚合物與蛋白質偶聯以便降低免疫原性并延長半衰期。
隨著生物醫學及基因工程技術的發展和深入，大量的藥用PEG化蛋白質被制備、生產并應用于臨床。現在已應用于臨床的藥用PEG化蛋白質有PEG-干擾素、PEG-粒細胞集落刺激因子等。
人生長激素是人腦垂體分泌的一種蛋白類激素，能促進人體充分利用各方面的能量和原料合成蛋白質，促進營養中的鈣沉積在骨骼，增加身體細胞的大小和數量，使骨骼和內臟器官成比例增長。1958年國外科學家就從人腦垂體中提取出生長激素用以治療侏儒癥，人類垂體重約0.5g，含GH量極微，每個垂體僅含GH5-10mg。由于垂體來源的限制，臨床應用和研究進展極其緩慢。1979年，DNA生物技術使得人類GH的DNA順序密碼在大腸桿菌中的表達成為可能，從而生產了用DNA重組技術人工合成的重組人生長激素rhGH。隨著生產技術的不斷提高，rhGH產品的質量及產量均有很大提高。1985年，用基因工程技術人工合成的重組人生長激素開始應用于臨床，給患者帶來福音。由于rhGH在體內的半衰期短，患者必須每天注射一次，使用非常不方便。
發明內容
根據hGH的N端暴露的特點，選擇性的將PEG分子偶聯到hGH的N端，而不與hGH蛋白上的其它自由氨基反應，此方法生產的PEG-hGH為每個hGH分子與單一PEG分子偶聯，最終產物成分單一，易于分離純化，收率高。PEG-hGH的半衰期可達5-7天，減少用藥頻率，每5-7天注射一次，方便患者使用。
本發明是一種被連接到一種聚乙二醇上的人生長激素，該PEG的分子量為15kDa到50kDa，其中每個hGH分子與單一PEG分子偶聯；本發明不限于特定分子量的PEG分子，但它們都具有一個單一的具有反應活性的醛基。在一個實施方案中，所述的聚乙二醇是PEG40000。在一個優選的實施方案中，用尿烷鍵使所述的hGH與所述的PEG40000分子連接。
本發明制備聚乙二醇人生長激素綴合物的方法(a)烷基化反應向pH為3-9的4℃溶液中加入hGH和已活化的PEG醛，hGH與PEG醛摩爾比為1∶0.1到1∶1，PEG醛的平均分子量為15kDa到50kDa；(b)反應產物的分離和純化在該反應過程中，蛋白質改性的程度用分子篩凝膠色譜進行監測，用含有0.1M氯化鈉、pH為6.5的50mM磷酸鈉在0.4毫升/分鐘的流速下進行洗脫；5小時后，經分子篩凝膠色譜法的分析表明所有的hGH已經基本上轉化成為N-末端聚乙二醇化的衍生物的形式；隨后用無菌水將該反應混合物總共稀釋五倍，并且將其加到一個離子交換柱上，再用pH為7.0的50mM磷酸鈉緩沖溶液飽和該柱；在1毫升/分鐘的流速下向該柱中裝填反應混合物，并且用三倍柱體積的同樣的緩沖溶液洗脫未反應的PEG的醛；采用線性梯度洗脫N-末端聚乙二醇化的hGH，該線性梯度采用從0％至100％的50mM磷酸鈉，其pH為7.5、含0.2M氯化鈉，進行100分鐘，含有該hGH綴合物的部分被合并、濃縮并且無菌過濾。
通過烷基化的聚乙二醇化作用通常涉及在有一種還原劑存在下將PEG的一種醛的衍生物與hGH反應，通常生成的是多個PEG與hGH上的多個氨基酸偶聯的綴合物。但人們可以通過控制該反應條件，從而基本上只使hGH的N-末端α-氨基上發生該聚乙二醇化反應，即一個單聚乙二醇化的物質，從而達到單一PEG分子連接到單一hGH分子上的效果。
通過還原性烷基化作用生產一種單聚乙二醇化產物的衍生化作用，利用了不同類型伯胺基的賴氨酸與hGH的N-末端不同的反應性能，該伯胺基是在hGH的衍生化作用中可以利用的基團。上述反應是在pH值3-9下進行的，而該PH值可以讓人們利用賴氨酸殘基的ε-氨基與hGH的N-末端殘基α-氨基間pKa值的差異。通過這種選擇性的衍生化作用，向一種多肽上連接含有一個活性基團的PEG是可以控制的。hGH與該PEG的結合作用主要地發生在hGH的N-末端上，而其它具反應活性的基團如賴氨酸側鏈氨基，不發生明顯的改性作用。在一個重要的方面，本發明提供了一種基本上均一的單PEG/hGH的結合物的分子制劑，而這表明hGH僅在一個單一的位置上被連接到一個聚合物分子上。更具體地講，如果使用聚乙二醇的話，本發明也提供聚乙二醇化的hGH，其可能缺少抗原連接基因并且含有被直接偶聯到該hGH多肽上的聚乙二醇分子。
另外一個重要的考慮為聚合物與hGH的分子比。一般說來，該聚合物與hGH的分子比越低，可以連接到hGH上的聚合物分子的數目也越少。一般說來，對于此處所計劃的聚乙二醇化反應而言，該聚合物優選的平均分子量為從15kDa至50kDa。特別優選40kDa。hGH與聚乙二醇的比值通常在1∶0.1至1∶1的范圍內，優選1∶0.15至1∶0.6。
pH值也影響待用的聚合物與hGH之間的比值。一般說來，如果pH值較低，則需要聚合物hGH的比值量較大，即N-末端α-氨基的反應活性較差，則需要更多的聚合物來實現最佳反應條件。如果該pH值較高，則PEG∶hGH的比值不需要如此之大，即有較多的反應活性基團可以利用，于是需要較少的聚合物分子。對于本發明的目的而言，該pH值通常落在3-9的范圍內，優選4.5-7。
通過采用如上所示的條件，按照本發明的還原性烷基化作用提供了一種連接方法，其中該連接為將PEG選擇性地連接到任意一種在氨基末端處具有一個α-氨基的hGH的多肽蛋白質上，并且提供了制備一種基本上為均一的單PEG-hGH綴合物。該PEG-hGH綴合物含有一個在N-末端定位的PEG分子，而在hGH分子其它賴氨酸的側鏈基團都不反應。上述制劑優選為生產出大于60％的PEG-hGH綴合物，并且更優選生產出大于70％的PEG-hGH綴合物，同時還伴有未反應的PEG及未反應的hGH分子。下面的實施例提供了一種至少有大約70％的PEG-hGH綴合和與大約70％的未反應的hGH的制劑。該PEG-hGH綴合物是具有生物學活性的。
對于本還原性烷基化作用而言，還原劑在液體狀態下應當是穩定的，并且優選該還原劑能夠僅還原在還原性烷基化作用的初期步驟中所形成的席夫堿Schiff’s base。優先的還原劑可以選自氫化鈉、氰基硼氫鈉，二甲胺甲硼烷三甲胺甲硼烷與吡啶甲硼烷所組成，特別優選的還原劑為氰基硼氫鈉。
本發明也涉及聚乙二醇人生長激素綴合物在制備、治療兒童或成人生長激素缺乏癥的藥物中的應用。
如上述所提及的，與本發明相應的PEG-hGH綴合物能夠用于所有已知的天然hGH相同的用途，但注射頻率由每天一次改為每5-7天一次。已有的臨床應用已經表明hGH的臨床效果，例如能促進人體充分利用各方面的能量和原料合成蛋白質，促進營養中的鈣沉積在骨骼，增加身體細胞的大小和數量，使骨骼和內臟器官成比例增長，從而促進兒童身高的線性增長。
對于治療用途而言，本發明的PEG-hGH綴合物可以配制于并且可以溶在任意一種無菌的生物相容的藥用載體包括鹽水，緩沖鹽水及水中進行使用。在治療疾病中發揮效用的hGH聚合物的用量依賴于上述疾病或狀況的實質，并且該用量可以通過臨床試驗進行測定。當有可能時，人們首先在有用的動物體模型內測定本發明的PEG-hGH綴合物的療效。注射的方法包括皮下，肌內給藥。
使用劑量為6mgPEG-hGH/kg體重/次，每5-7天注射一次。
PEG-hGH綴合物進行實際應用時，要保證它們在一段時間期限內的穩定性，并且還要便于患者使用，這就要加一些保護劑和穩定劑來保護PEG-hGH并制成特定的制劑。對PEG-hGH我們研究了液體劑型和凍干劑型兩種劑型。
液體劑型的中各物質含量為每毫升含30mg PEG-hGH，10mM檸檬酸鈉，4mg吐溫20，17.4mg氯化鈉，苯酚5mg，pH6.0。
凍干劑型先配成各物質含量為每毫升含30mg PEG-hGH，甘氨酸120mg，甘露醇12mg，乳酸12mg，碳酸氫鈉100mg的溶液，之后用冷凍干燥法制成凍干劑型，患者使用前加注射用水溶解。
在一個藥效試驗的實驗例中，該方法包括將再溶解PEG-hGH的溶液引入生長激素缺乏動物體內的步驟。在該實驗例中，所述的動物是大鼠，生長激素缺乏的大鼠是去垂體大鼠。
附圖名稱是各組實驗動物累計增重與時間關系曲線。 陰性對照組 hGH組 40KGH組 60KGH-30組 60KGH-70組
具體實施例方式根據本發明的具體的hGH的制備及其生理學與生物學特性顯示在下文中。所給出的這些實施例更為詳盡地描述了本發明，但是并不打算用于限制本發明。在這些實施例中，hGH均來源于基因重組技術。
實施例1連接位點在N-末端α-氨基處的PEG40kDa-hGH綴合物的制備向溶于50mM磷酸鈉，該溶液pH為5.5且含有20mMNaCNBH3，的2.5毫克/毫升hGH的一個冷卻4℃并攪拌的溶液中加入0.3倍摩爾的活化聚乙二醇的醛，該醛的平均分子量為40000道爾頓，即40kDa。hGH來自大腸桿菌表達技術生產。
在該反應過程中，蛋白質改性的程度用分子篩凝膠色譜進行監測，該色譜使用一個Superose 6HR 10/30柱，Pharmacia，用含有0.1M氯化鈉、pH為6.5的50mM磷酸鈉在0.4毫升/分鐘的流速下進行洗脫。5小時后。經分子篩凝膠色譜法的分析表明所有的hGH已經基本上轉化成為N-末端聚乙二醇化的衍生物的形式。
隨后用無菌水將該反應混合物總共稀釋五倍，并且將其加到一個HiLoad 16/10S Sepharose HP離子交換柱上，Pharmacia，再用pH為7.0的50mM磷酸鈉緩沖溶液飽和該柱。在1毫升/分鐘的流速下向該柱中裝填反應混合物，并且用三倍柱體積的同樣的緩沖溶液洗脫未反應的PEG的醛。采用線性梯度洗脫N-末端聚乙二醇化的hGH，該線性梯度采用從0％至100％的50mM磷酸鈉，其pH為7.5、含0.2M氯化鈉，進行了100分鐘，含有該hGH衍生物的部分被合并、濃縮并且無菌過濾。
實施例2連接位點在N-末端α-氨基處的PEG20kDa-hGH結合物的制備向溶于50mM磷酸鈉，該溶液pH為4.5且含有20mM NaCNBH3的2.5毫克/毫升hGH的一個冷卻4℃并攪拌的溶液中加入0.6倍摩爾的活化聚乙二醇的醛，該醛的平均分子量為20000道爾頓，即20kDa。hGH來自哺乳動物表達技術生產。其余步驟重復實施例1的步驟。
實施例3連接位點在N-末端α-氨基處的PEG15kDa-hGH結合物的制備向溶于50mM磷酸鈉，該溶液pH為7.0且含有20mM NaCNBH3的2.5毫克/毫升hGH的一個4℃并攪拌的溶液中加入0.15倍摩爾的活化聚乙二醇的醛，該醛的平均分子量為15000道爾頓，15kDa。hGH來自哺乳動物表達技術生產。其余步驟重復實施例1的步驟。
實施例4連接位點在N-末端α-氨基處的PEG50kDa-hGH結合物的制備向溶于50mM磷酸鈉，該溶液pH為6且含有20mM NaCNBH3的2.5毫克/毫升hGH的一個4℃并攪拌的溶液中加入0.2倍摩爾的活化聚乙二醇的醛，該醛的平均分子量為50000道爾頓，即50kDa。hGH來自大腸桿菌表達技術生產。其余步驟重復實施例1的步驟。
實施例5連接位點在N-末端α-氨基處的PEG(30kDa)-hGH結合物的制備向溶于50mM磷酸鈉，該溶液pH為5.0且含有20mMNaCNBH3的2.5毫克/毫升hGH的一個4℃并攪拌的溶液中加入0.4倍摩爾的活化聚乙二醇的醛，該醛的平均分子量為30000道爾頓，即30kDa。hGH來自大腸桿菌表達技術生產。其余步驟重復實施例1的步驟。
實施例6液體劑型的制備將實施例1方法制備的PEG-hGH 1000mg溶解于330ml液體劑型母液中，其中含10mM檸檬酸鈉，4mg吐溫20，17.4mg氯化鈉，苯酚5mg，pH6.0，無菌過濾后分裝至330個2ml安瓶中，每瓶1ml。
實施例7凍干劑型將實施例2方法制備的PEG-hGH 1000mg溶解于330ml凍干劑型母液中，每ml母液中含有甘氨酸120mg，甘露醇12mg，乳酸12mg，碳酸氫鈉100mg的溶液，無菌過濾之后，分裝至330個2ml安瓶中，用冷凍干燥法制成凍干劑型，注射前加注射用水溶解。
實驗例利用摘除腦垂體的大鼠對PEG-hGH綴合物體內活性的評價測定人生長激素產品活性的最經典方法之一是未成年去垂體大鼠的體重增加法(Body Weight Gain，BWG)，已載入歐洲藥典。
實驗方法實驗用藥hGH原始樣品每瓶含0.5克重組人生長激素，3.0克賦形劑。用Sephadex G25脫鹽柱緩沖體系變更為磷酸緩沖液(50mM，pH7.0)。首次給藥前用載體稀釋至10mg/ml。
60KGH60KGH為PEG40000-hGH，原始濃度0.088毫克/毫升。首次給藥前用載體稀釋到70毫克/毫升。
40KGH40KGH為PEG20000-hGH，原始濃度0.16毫克/毫升。首次給藥前用載體稀釋至70微克/毫升。
純度hGH符合《中華人民共和國藥典2000版》要求。
60KGHPEG40000-hGH綴合物占95％。
40KGHPEG20000-hGH綴合物占95％。
實驗動物Wister品系大鼠(白求恩醫科大學動物實驗部)，雄性，六周齡時將其腦垂體摘除。在腦垂體摘除后二周時，篩除體重增加速率超過標準差一倍的大鼠，共53只去垂體大鼠用于本研究，按照以下數量進行抽簽分組。
陰性對照組大鼠10只；陽性對照組大鼠10只；60KGH(70微克)給藥組大鼠11只；60KGH(30微克)給藥組大鼠11只；40KGH(70微克)給藥組大鼠11只。
年齡腦垂體摘除時為6周齡，開始給藥時為8周齡。
接收時體重范圍為85.5克至111.6克。
編號方法每籠2只大鼠，用苦味酸飽合溶液在其中一只大鼠背部做標記，有標記者為1號碼，無標記者為0號碼，附加在籠號后面。示例第3籠的大鼠編號為30(無標記)和31號(有標記)，第10籠大鼠編號為100(無標記)和101(有標記)。
給藥劑量和給藥程序載體每次給予1毫升/大鼠，每天給予一次，連續給予14天。
hGH 每次給予10微克/大鼠，每天給予一次，連續給予14天。
40KGH每次給予70微克/大鼠，首日和第8日各給予一次。
60KGH每次給予70微克/大鼠，首日和第8日各給予一次。
60KGH每次給予30微克/大鼠，首日和第8日各給予一次。
給藥途徑皮下注射。
體重測量頻率給藥前每2-3天測量一次。從首次給藥起每天測量一次。
方法使用電子臺秤測量大鼠體重。
實驗結果與結論給藥前大鼠體重日平均增長速率為0.72g±0.36g各組大鼠的平均體重為載體109.76g±6.60ghGH 110.86g±5.00g40KGH 107.85g±8.87g60KGH(30μg)112.78±7.24g60KGH(70μg)108.10g±5.73g給藥后各組大鼠體重每日平均累積增重(n天體重-0天體重)顯示在圖1中。
實驗結果顯示(1)陰性對照組(Vehicle)給藥前后體重變化趨勢一致，陰性對照成立；
(2)陽性對照組(hGH)給藥前體重變化與陰性對照組和其他給藥組一致；給藥后日平均累積增重基本成直線上升，日體重增長速率均勻。因此陽性對照成立；(3)70μg PEG-hGH給藥組(40KGH和60KGH)的日平均
權利要求
1.一種聚乙二醇人生長激素綴合物，其特征是一種被連接到一種聚乙二醇(PEG)上的人生長激素(hGH)，該PEG的分子量為15kDa到50kDa，其中每個hGH分子與單一PEG分子偶聯。
2.根據權利要求1所述的聚乙二醇人生長激素綴合物，其特征在于聚乙二醇(PEG)有一個單一的具反應活性的醛基。
3.根據權利要求1所述的聚乙二醇人生長激素綴合物，其特征在于人生長激素(hGH)通過N端α氨基被連接到PEG上。
4.根據權利要求1中所述的聚乙二醇人生長激素綴合物，其特征在于PEG的分子量為20kDa到40kDa。
5.根據權利要求1中所述的聚乙二醇人生長激素綴合物，其特征在于人生長激素指基因工程表達的人生長激素分子。
6.一種制備聚乙二醇人生長激素綴合物的方法，其特征在于(a)烷基化反應向pH為3-9的4℃溶液中加入hGH和已活化的PEG醛，hGH與PEG醛摩爾比為1∶0.1到1∶1，PEG醛的平均分子量為15kDa到50kDa；(b)反應產物的分離和純化在該反應過程中，蛋白質改性的程度用分子篩凝膠色譜進行監測，用含有0.1M氯化鈉、pH為6.5的50mM磷酸鈉在0.4毫升/分鐘的流速下進行洗脫；5小時后，經分子篩凝膠色譜法的分析表明所有的hGH已經基本上轉化成為N-末端聚乙二醇化的衍生物的形式；隨后用無菌水將該反應混合物總共稀釋五倍，并且將其加到一個離子交換柱上，再用pH為7.0的50mM磷酸鈉緩沖溶液飽和該柱；在1毫升/分鐘的流速下向該柱中裝填反應混合物，并且用三倍柱體積的同樣的緩沖溶液洗脫未反應的PEG的醛；采用線性梯度洗脫N-末端聚乙二醇化的hGH，該線性梯度采用從0％至100％的50mM磷酸鈉，其pH為7.5、含0.2M氯化鈉，進行100分鐘，含有該hGH綴合物的部分被合并、濃縮并且無菌過濾。
7.根據權利要求6中所述的制備聚乙二醇人生長激素綴合物的方法，其特征在于在烷基化反應時，hGH∶PEG范圍摩爾比為1∶0.15到1∶0.6，pH范圍為4.5到7。
8.一種聚乙二醇人生長激素綴合物在制備治療兒童或成人生長激素缺乏癥的藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種聚乙二醇人生長激素綴合物及其制備方法及藥物用途，本發明為每個hGH分子與單一PEG分子偶聯的綴合物，防止hGH在體內的迅速降解，形成的聚合物比hGH具有更好的穩定性，及明顯延長體內的半衰期。
文檔編號C07K14/435GK1468863SQ0213261
公開日2004年1月21日 申請日期2002年7月15日 優先權日2002年7月15日
發明者王思勉 申請人:王思勉