一種從胡蘆巴種子中提取4－羥基－異亮氨酸及胡蘆巴膠等多種副產品的方法

專利名稱：一種從胡蘆巴種子中提取4－羥基－異亮氨酸及胡蘆巴膠等多種副產品的方法
技術領域：
本發明涉及一種植物提取方法，特別是涉及一種從胡蘆巴種子中提取4-羥基-異亮氨酸及胡蘆巴膠等多種副產品的方法。
胡蘆巴種子中化學組成分主要有脂肪類、聚多糖類、三萜類、甾類、黃酮類、生物堿類、蛋白質和游離氨基酸。這些化合物因其結構特征不同而呈現出不同的生物活性和藥理功效。
近年來發現并公認了胡蘆巴種子粉有較好的降血糖效果，引起國際上醫藥界許多專家的興趣和關注，但對其降糖活性組分的報導較為混亂，其中有胡蘆巴肽酯(Fenugreekine)、水溶性食用纖維(即胡蘆巴膠)、胡蘆巴皂苷、煙酸、香豆素(在地上部分)等等。1992年Yres Sauvaire等報導了從胡蘆巴種子中提取、分離出來特有天然的4-羥基-異亮氨酸，經動物實驗證明其具有明顯的刺激胰腺分泌胰島素的功能，因此，呈現出顯著的降低血糖水平和提高耐葡萄糖量的效果。國內對胡蘆巴種子的應用，除了藥用之外，已報道了從胡蘆巴種子中分離出胚乳并用以生產工業級或食品級增稠劑和從胡蘆巴種子(或脫除胚乳后種子粉)中提取薯蕷皂甙的二種綜合利用產物。至今，在國內尚未見到從胡蘆巴種子中提取天然游離氨基酸及其特有的4-羥基-異亮氨酸的研究報道。同時，無論在國內或國外，均未見到從胡蘆巴種子中提取天然的4-羥基-異亮氨酸工業化生產的報道，也未見到在一條生產線上同時提取、制造以4-羥基-異亮氨酸為主的胡蘆巴籽游離氨基酸、胡蘆巴膠、胡蘆巴籽毛油、胡蘆巴黃酮及皂素五種產品的綜合利用技術與工藝的報導。
胡蘆巴膠(Fenugreek Gum)，又稱胡蘆巴可溶性食用纖維、香豆膠，即胡蘆巴種子的胚乳部分，其中60％為半乳甘露聚糖(Galactomannan)，總糖含量占80％以上，蛋白質占6％左右，其余為水、粗脂肪、粗纖維、灰份等等。曾有人推猜它是降血糖的主要組分，Ali L.在1995年報導了他的研究結果，證明了這種可溶性食用纖維對正常大鼠和非胰島素依賴型糖尿病大鼠無降糖活性，但同時喂飼葡萄糖時血糖明顯降低，僅能說明它具有提高耐葡萄糖量的效果。胡蘆巴膠水溶液可抑制旋渦的生成與發展，顯示出減阻作用，這些特性決定了它的用途。
當前胡蘆巴膠的主要產品與用途有以下二種工業級胡蘆巴膠，可用于石油開采、日用化工、印染漿紗、配制炸藥等用途；食品藥用級胡蘆巴膠可制得食品、醫藥級胡蘆巴膠增稠劑、賦形劑。
胡蘆巴毛油(Oil of Common Fenugreek seed)，胡蘆巴種子含油量僅為7％左右，屬于低油種子，若作為油料作物處理，沒有經濟效益，但通過綜合利用途徑提取胡蘆巴籽油，可大幅度降低成本，增加經濟效益。有關文獻報導胡蘆巴毛油有含催乳成分，但無任何性激素樣作用。毛油及其非皂苷成分具有抗菌作用，其中含有羽扇豆醇具有顯著的降血糖功能。毛油經精制，可從油腳、皂腳中分離、提取出磷酯、VE、β-谷甾醇等高附加值的營養保健品。精制的胡蘆巴油富含不飽和脂肪酸(高于80％)，其中亞油酸和亞麻酸總量達50％以上。不飽和脂肪酸具有降血脂、抑制血小板聚集、防止動脈硬化、抗炎、抗癌、增強免疫功能等生理作用，故可作為保健油。
以天然4-羥基-異亮氨酸(4-hydroxyisoleucine)為主的天然游離氨基酸，4-羥基-異亮氨酸是一種非蛋白組分，極性非電荷(即中性)的新型氨基酸，學名是2-氨基-3-甲基-4-羥基-戊酸，在哺乳動物細胞中沒有發現，僅存在于某些(胡蘆巴種屬)植物中。1973年L Fowdent等首先從胡蘆巴種子中分離并鑒定出4-羥基-異亮氨酸，并提出它有三個手性碳原子，有4種異構體(2S，3R，4R)-，(2R，3R，4R)-，及它們所形成的二種內酯鹽酸鹽，這種開鏈和內酯構型可以互相轉化。4-羥基-異亮氨酸占干燥種子的游離氨基酸總量的30-50％。而在1984年Y.Sauvaire等的研究，也證明了這個4-羥基-異亮氨酸分子中有三個手性中心，存在于胡蘆巴種子中這種氨基酸有二個非對映的異構體形式，主要的一種以(2S，3R，4S)-構型占這種氨基酸含量的90％左右。而次要的一種是以(2R，3R，4S)-構型，占10％左右，這個結果被Hasan(1986)，Alcock等(1989)所確證，其它的4-羥基-異亮氨酸立體構型在天然植物中似乎是難以得到的。1992年Y.Sauvaore等研究發現了從胡蘆巴種子中提取，分離出的天然4-羥基-異亮氨酸有明顯的刺激胰腺分泌胰島素的功能，呈現出顯著的降血糖和提高耐糖量的效果。Masiell等(1998)、C.Broca等(1999，2000)都驗證了這個結果，并提出了在4-羥基-異亮氨酸的三個異構體中(2S，3R，4S)-構型刺激胰腺分泌胰島素效果顯著，而(2R，3R，4S)-構型及其內脂亦有明顯的效果。但分泌量低于前者。因此，可以認為4-羥基-異亮氨酸是一種具有潛在的，有益于II型糖尿病患者的抗糖尿病新制劑(藥劑)。
由于在某種環境條件作用下，(2S，3R，4S)-構型會轉化為(2R，3R，4S)-構型或內酯構型，導致相應地削弱了該產品的降血糖和提高耐糖量的功效，在產品的制備過程避免和減少上述轉化的發生是關鍵。
胡蘆巴總黃酮(Total Flavones of Fenugreek seed)，有文獻報導胡蘆巴總皂苷、黃酮苷能促進核酸及蛋白質合成及膽固醇酯質代謝，抗動脈硬化，降低膽固醇等功效，；胡蘆巴中黃酮類化合物成分母核多為4’，5，7-三羥基黃酮，如牡荊素，牡荊素-7-葡萄糖苷，異牡荊素，葒草素，異葒草素，葒草素苷，異葒草素苷，芹菜素-6-木糖苷-8-葡萄糖苷，芹菜素-6，8-二碳-葡萄糖苷，牡荊素-2”-O-對羥基苯基本柚皮素，木樨草素，小麥黃素，小麥黃素-7-O-葡萄糖苷，6，8-二碳-β-D-呋喃葡萄糖苷，金合歡素等十五種黃酮，及二種黃酮醇槲皮素，莰非醇。上述17種黃酮類化合物中十三種是黃酮苷類化合物，其中碳-苷十二種，氧-苷一種，這是胡蘆巴黃酮的特點，但至今尚未見到胡蘆巴總黃酮、黃酮苷的提取和應用的報導。
胡蘆巴皂苷(Fenugreek Saponin，Trigosaponin)，從胡蘆巴種子中已提取鑒定出34種皂苷，其中屬于甾體皂苷有30種，分別為薯芋皂苷元(Diosgenin)、雅莫皂苷元(Yamogenin)、支脫皂苷元(Gitogenin)、新支脫皂苷元(Neogiogenin)、替告皂苷元(Tigogenin)、新替告皂苷元(Neotigogenin)、絲蘭皂苷元(Yuccagenin)等的不同糖苷化合物，三萜皂苷有4種，分別為胡蘆巴皂苷I(Trigosaponin I)、大豆皂苷I(SayasaponinI)、大豆皂苷I甲酯(Methylsayasaponin I)、β-谷甾醇吡喃葡萄糖苷。其中具有薯芋皂苷元母體結構的皂苷，除薯芋皂苷外，胡蘆巴皂苷(Gzaecunin)H、I、J、K、L、M、N和胡蘆巴素B(Fenugrin B)其苷元都是薯芋皂苷元。這類皂苷是胡蘆巴皂苷中主要組分。已有文獻報導胡蘆巴皂苷有降血糖、降血脂、降低膽固醇、利尿、抗炎等活性，其中薯芋皂苷、雅莫皂苷元有抗真菌、殺蟲作用，薯芋皂苷元有雌激素作用和降膽固醇作用，大豆皂苷有抗氧化、抗癌、抗肝損傷、抗血栓及增強免疫力作用，但大多皂苷化合物都有溶血性缺陷。由于胡蘆巴皂苷水解成苷元后，其中主要是薯芋皂苷元，可以作為甾體激素，醫藥工業的原料，目前還沒有全合成的原料能與其競爭或代用。國際市場上甾體藥物總銷售額以每年6-10％的速度遞增，進入九十年代以來年產值已突破100億美元，年皂苷元用量(不包括中國)已超過2000噸，市場呈現原料緊張，求過于供的現狀。原來薯芋皂苷元生產的主要原料是盾葉薯芋、穿龍薯芋，而薯芋生長周期要4-7年才挖掘，造成資源短缺，而我國年需薯芋皂苷元(包括出口)1500噸左右，現有50余家工廠生產總量不足1000噸，缺口甚大，因此從胡蘆巴籽中提取皂苷，經水解精制，制造薯芋皂苷元，可以彌補市場供應不足之問題。
本發明目的是通過如下技術方案實現的1、胡蘆巴種子中五種提取物的提取制備胡蘆巴籽毛油取經粉碎機粉碎后的胡蘆巴種子粉，60-80℃恒溫恒壓下石油醚提取1-3小時，抽濾上述提取物，濾渣分別用石油醚再提取二次，合并三次提取液，濾渣A另行處理；提取液濃縮回收溶劑，得到胡蘆巴籽毛油；制備胡蘆巴粗黃酮濾渣A在60-80℃恒溫恒壓下用10-90％乙醇提取2-3次，每次1-3小時，合并提取液，濾渣B另行處理；提取液通過超濾去除大分子蛋白，收集透過2萬分子量膜的濾液；回收乙醇，濃縮，濃縮液加無離子水稀釋，即殘液A；殘液A用液-液萃取法分別用乙酸乙酯萃取三次，水層經減壓蒸餾至無乙酸乙酯殘留止，作為殘留液B；合并乙酸乙酯層，濃縮，回收乙酸乙酯，釜殘加純水至溶解，濃縮，干燥，得到黃色粉末即為胡蘆巴粗黃酮；制備胡蘆巴粗皂苷用液-液萃取法，用正丁醇作為提取劑從殘液B中提取三次，水層作為殘留液c備用，合并醇層，減壓濃縮至干，回收正丁醇得到褐色粗皂苷固體粉末；制備4-羥基-異亮氨酸殘液c調節PH為1～6，上陽離子交換樹脂柱，進行離子交換，并用無離子水洗滌，樹脂柱用0.05N～2N氨水解吸，脫氨，濃縮至干后，真空干燥4-8hr，得到黃色或黃褐色固體，產物中4-羥基-異亮氨酸的含量為10-60％；制備胡蘆巴膠取濾渣B，加10-18倍水，加熱，攪拌提取1-3h，抽濾，濾渣棄去，濾液濃縮至1/3體積后，加80-95％乙醇沉淀、洗滌、脫水、干燥得到淡黃至白色的藥用或食用胡蘆巴膠粉末。
本發明上述方法中石油醚可以用正己烷、環己烷或溶劑汽油代替。
本發明上述方法胡蘆巴黃酮制備中濾渣A恒溫恒壓下乙醇提取可用甲醇提取代替。
本發明上述方法乙醇提取液用超濾方法除去蛋白質還可用礦物酸(如硫酸、鹽酸)、有機酸〔如鞣酸、三氯醋酸、乳酸〕或氯仿、聚乙二醇等其他有機物沉降蛋白質來代替。
本發明上述方法胡蘆巴黃酮制備中殘液A，可用聚酰胺樹脂吸附，無離子水洗滌，合并流出液、洗滌液為殘液B，另行處理；樹脂柱用10～90％乙醇解吸，收集解析液，濃縮回收乙醇，濃縮至干，真空干燥得到黃褐色粗黃酮；本發明上述方法胡蘆巴粗皂苷制備還可以是殘留液B用大孔徑樹脂吸附，無離子水洗滌，樹脂柱用10～90％乙醇解吸，收集解吸液濃縮至干，得到黃褐色粗皂苷固體粉末。
本發明上述方法胡蘆巴粗皂苷制備還可以是殘液B加硫酸或鹽酸直接加熱回流5～8hr水解糖苷，使水不溶性的皂苷元呈晶態析出，過濾，濾餅烘干后，加適量活性碳混勻，用石油醚連續回流提取8～10hr，提取液經濃縮回收溶劑，濃縮至適當的濃度后，室溫放置使結晶完全析出后，過濾，濾液回收使用，濾餅抽干后呈黃色晶體，經乙醇或丙酮溶液重結晶，呈白色皂苷元晶狀物；本發明上述方法工業胡蘆巴膠的制備也可以是胡蘆巴種子經浸水軟化后，破碎、篩分出來的胚乳，經去雜、磨粉、過篩可制得工業胡蘆巴膠；本發明上述方法原料可以是篩分出胚乳后的胡蘆巴種子粉。
2、本發明4-羥基-異亮氨酸的提取方法，該方法為取經粉碎機粉碎后的胡蘆巴種子粉，60-80℃恒溫恒壓下石油醚提取1-3小時，抽濾上述提取物，濾渣分別用石油醚再提取二次，合并三次提取液，濾渣A在60-80℃恒溫恒壓下用10-90％乙醇提取2-3次，每次1-3小時，合并提取液，濾渣B另行處理；提取液通過超濾，收集透過2萬分子量膜的濾液；回收乙醇，濃縮，濃縮液加無離子水稀釋，即殘液A；殘液A調節PH為1～6，上陽離子交換樹脂柱，進行離子交換，并用無離子水洗滌，流出液和洗滌液合并為殘液B另行處理。樹脂柱用0.05N～2N氨水解吸，脫氨，濃縮至干后，真空干燥4-8hr，得到黃色或黃褐色固體，產物中4-羥基-異亮氨酸的含量為10-60％；本發明上述方法還可以是殘液A調節PH為1～6，上陽離子交換樹脂柱，進行離子交換，并用無離子水洗滌后，以0.05～2N氨水解吸，用茚三酮試劑檢測解吸液，當出現氨基酸呈色反應時，即開始收集解吸液至流出解吸液呈微黃色止，合并解析液，蒸發濃縮，脫氨，濃縮至干后，真空干燥4-8hr，得到黃色或黃褐色固體，產物中4-羥基-異亮氨酸的含量為10-60％。
本發明上述方法還可以是殘液A分別用乙酸乙酯萃取三次，水層分別用正丁醇提取三次，在正丁醇提取后的水層B，用鹽酸調PH＝5，上陽離子樹脂柱上進行離子交換，加3-4倍柱體積的無離子水洗滌，棄去流出液及洗滌液，用1N氨水解吸，用茚三酮試劑檢測，解吸液呈黃褐色后開始收集，至解吸液呈淡黃色止，合并解吸液，蒸發濃縮、脫氨，濃縮至干后干燥4-8h，得到黃色粉末狀物質，其中4-羥基-異亮氨酸的含量為14.47％。
本發明所述陽離子交換樹脂還可以是強酸性、中酸性或弱酸性陽離子樹脂；干燥可用噴霧干燥、真空干燥、冷凍干燥。
3、本發明還提供了一種胡蘆巴種子中四種提取物的提取方法，該方法為制備胡蘆巴毛油取經粉碎脫胚乳后的胡蘆巴粉在60～80℃恒溫恒壓下，用10～90％乙醇提取三次，每次1-3hr，合并濾液；濾液經濃縮回收乙醇，濃縮液用無離子水稀釋，用用正己烷進行液-液萃取，萃取三次，合并油層，水層另行處理；油層經濃縮回收溶劑，得到胡蘆巴毛油；制備4-羥基-異亮氨酸水層用稀醋酸調PH4-6，使蛋白變性析出，經沉降過濾，濾液用陽離子交換樹脂吸附氨基酸，并用無離子水洗滌，合并流出液、洗滌液為殘液d，另行處理；陽離子制樹脂柱用0.05～2N氨水解吸，解析液經減壓濃縮、脫氨、蒸干，并在80℃下真空干燥4-8hr，得到黃色固體粉末產品，產物中4-羥基-異亮氨酸含量為10-60％；制備胡蘆巴黃酮殘液d通過聚酰胺樹脂吸附，并用無離子水洗滌，合并流出液和洗滌液為殘液e，另行處理，聚酰胺柱用10-90％乙醇解吸，收集解析液，經濃縮回收乙醇，蒸干，在80℃真空干燥4-8hr，得到黃色固體粉末胡蘆巴黃酮；制備胡蘆巴皂苷殘液e通過大孔徑樹脂柱吸附，并用無離子水洗滌，流出液、洗滌液排入污水處理池，大孔徑樹脂柱用10-90％乙醇解吸，收集解析液，經濃縮，回收乙醇，蒸干，在80℃真空干燥4-8hr，得到黃褐色固體粉末胡蘆巴皂苷。
本發明上述方法中制備胡蘆巴毛油還可以是取經粉碎脫胚乳后的胡蘆巴粉以乙醇為提取劑用20KHz超聲波提取2-3次，每次30-50min，合并濾液；濾液經濃縮回收乙醇，濃縮液用無離子水稀釋，用正己烷進行液-液萃取，萃取三次，合并油層，水層另行處理；油層經濃縮回收溶劑，得到胡蘆巴毛油。
本發明上述方法中為制備胡蘆巴毛油還可以是其中乙醇提取液的濃縮液加無離子水稀釋后，還可用礦物酸(如硫酸、鹽酸)、有機酸〔如鞣酸、三氯醋酸、乳酸〕或氯仿、聚乙二醇等其他有機物沉降蛋白質，過濾，濾液再用非極性溶劑(石油醚，正己烷，環己烷，溶劑汽油等)萃取胡蘆巴籽油。
本發明上述方法中制備胡蘆巴黃酮還可以是殘液d用乙酸乙酯萃取，合并酯層，經濃縮，干燥，得到黃色固體粉末——胡蘆巴黃酮。
本發明所述方法中，陽離子交換樹脂為強酸性、中酸性、弱酸性陽離子樹脂均可；本發明所述方法中干燥方法，可用噴霧干燥、真空干燥、冷凍干燥等方法；本發明所指的4-羥基-異亮氨酸包括以下幾個異構體(2S，3R，4S)-4-Hydroxylisoleucine，(2R，3R，4S)-4-Hydroxylisoleucine，(2S，3R，4S)-4-Hydroxylisoleucine lactone Hcl，(2R，3R，4S)-4-Hydroxylisoleucine lactone Hcl。
本發明所指的4-羥基-異亮氨酸可加入常規輔料是碳酸氫鈣、硫酸鈉、甘露糖、聚半乳糖、微粉硅膠、淀粉及其衍生物、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素等物質。
本發明方法優點在于在一條生產線上可同時獲得天然4-羥基-異亮氨酸、胡蘆巴膠、胡蘆巴毛油、粗黃酮、粗皂苷等五類產品，這一綜合利用生物化工技術填補了國內空白，具有很好的應用前景。目前胡蘆巴籽主要利用以提取胡蘆巴膠和薯蕷皂苷元為主的胡蘆巴皂苷元。以100kg胡蘆巴籽進行綜合利用為例，可提取約20kg工業胡蘆巴膠(20元/公斤)，約1kg皂苷元(500元/公斤)，6kg胡蘆巴種子油(5元/公斤)，合計930元產值，按本專利工藝進行綜合利用，可制得約3kg含10％4-羥基-異亮氨酸為主的天然混合氨基酸產品，以300元/公斤計，3kg產值為900元，及制得1.5kg胡蘆巴黃酮，為胡蘆巴黃酮的藥效研究和利用提供一定的基礎。從上可知本專利技術可增加附加值約一倍左右，其經濟效益十分顯著。
1992年Y.Sauvaore等研究發現了從胡蘆巴種子中提取，分離出的天然4-羥基-異亮氨酸有明顯的刺激胰腺分泌胰島素的功能，呈現出顯著的降血糖和提高耐糖量的效果。Masiell等(1998)、C.Broca等(1999，2000)都驗證了這個結果。因此，4-羥基-異亮氨酸是一種具有潛在的有益于II型糖尿病患者的抗糖尿的新的輔助藥品和預防II型糖尿病患者的發生與擴大的良好保健食品，其社會效益是明顯的。
實施例1取200g經粉碎機粉碎后的胡蘆巴種子粉，溫度在75±2℃，800ml石油醚溶媒提取2小時后，抽濾上述提取物及物料，抽畢，將固體物料在75±2℃分別用600ml石油醚再提取二次，合并三次提取液，濾渣A另行處理；提取液進行蒸發濃縮回收溶劑，最后減壓濃縮脫除殘留溶劑，得到12.53g胡蘆巴籽毛油，得率為6.265％；制備胡蘆巴粗黃酮將濾渣A在75±2℃下，用800ml、600ml、600ml 80％乙醇提取三次，每次2h，濾渣B另行處理，合并提取液，通過微濾、10萬分子量膜、5萬分子量膜、2萬分子量膜，收集透過2萬分子量膜的濾液，濃縮，回收乙醇，濃縮液加400ml無離子水稀釋，即殘液A；殘液A分別用300ml乙酸乙酯萃取三次，水層經減壓蒸餾至無乙酸乙酯殘留止，作為殘留液B；合并乙酸乙酯層，進行蒸餾濃縮，回收乙酸乙酯，釜殘加適量純水溶解，濃縮，脫除殘留乙酸乙酯，而后蒸干，80℃下干燥，得到3.02g黃色粉末，得率1.51％；該物質即為胡蘆巴黃酮；制備胡蘆巴粗皂苷殘液B分別用300ml正丁醇提取三次，水層作為殘留液c備用；合并正丁醇層，濃縮回收正丁醇溶劑，釜殘即為黃褐色粗皂苷，重量10.26g，得率為5.13％；
制備4-羥基-異亮氨酸殘留液c用鹽酸調PH＝5，然后用裝有300ml已再生處理好并交換成H+型的陽離子樹脂柱上進行離子交換，而后加3-4倍柱體積的無離子水進行洗滌，流出液及洗滌液棄之，洗滌后用1N氨水進行解吸，用茚三酮試劑檢測，當解吸液呈黃褐色后開始收集，至解吸液呈淡黃色止，合并解吸液，蒸發濃縮、脫氨，濃縮至干后，在80℃下干燥6h，得到黃色粉末狀物質4.32g，得率為2.16％，其中4-羥基-異亮氨酸的含量為14.47％；制備胡蘆巴膠取濾渣B，加15倍的水，加熱，攪拌提取3h，抽濾，濾渣棄去，濾液濃縮至1/3體積后，加95％乙醇進行沉淀、過濾、洗滌、風干后，80℃下干燥6h，得到胡蘆巴膠淡黃色粉末27.64g，得率為13.32％。實施例2取200g經粉碎篩分去胚乳的胡蘆巴種子粉，在75±2℃恒溫恒壓下，用800ml，600ml，600ml的80％乙醇提取三次，每次2hr，合并提取液另行處理，提取液進行濃縮，回收至濃縮液無醇味止，濃縮液加無離子水600ml稀釋，稀釋液各用200ml正己烷提取三次，水層另行處理，合并油層進行濃縮，回收正己烷，最后用減壓蒸餾脫除殘留正己烷，得12.02g粗胡蘆巴毛油，得率為6.01％；制備4-羥基-異亮氨酸水層用稀醋酸調PH＝5，則有大量蛋白質沉淀析出，沉降，過濾，濾液用300gH+型陽離子交換樹脂柱進行離子交換，并用600ml無離子水洗滌，合并流出液，洗滌液為殘液d另行處理；陽離子樹脂柱用0.6N氨水解吸，解吸液經減壓濃縮，脫氨，蒸干，并在80℃下真空干燥6hr，得到黃色固體粉末5.44g，得率為1.61％，產品中4-羥基-異亮氨酸含量為30.4％；制備胡蘆巴黃酮殘液d用450g聚酰胺樹脂吸附，用600ml無離子水洗滌，合并流出液、洗滌液為殘液e，另行處理，聚酰胺樹脂柱用80％乙醇進行解吸至流出液為淡黃色為止，合并解析液，經濃縮至干，回收乙醇，釜殘為黃色固體，80℃真空干燥4hr，經研磨，得2.92g黃色的粗黃酮粉末，得率為1.46％；
制備胡蘆巴皂苷殘液e用500gD-X型大孔徑樹脂柱吸附，并用800ml無離子水洗滌，大孔徑樹脂柱用85％乙醇進行解吸，至流出液為淡黃色為止，合并解析液，經濃縮至干，回收乙醇，釜殘為褐色固體，80℃真空干燥4hr，經研磨得11.72g粗皂苷，得率為5.68％
權利要求
1.一種胡蘆巴種子中五種提取物的提取方法，其特征在于該方法為制備胡蘆巴籽毛油取經粉碎機粉碎后的胡蘆巴種子粉，60-80℃恒溫恒壓下石油醚提取1-3小時，抽濾上述提取物，濾渣分別用石油醚再提取二次，合并三次提取液，濾渣A另行處理；提取液濃縮回收溶劑，得到胡蘆巴籽毛油；制備胡蘆巴粗黃酮濾渣A在60-80℃恒溫恒壓下用10-90％乙醇提取2-3次，每次1-3小時，合并提取液，濾渣B另行處理；提取液通過超濾去除大分子蛋白，收集透過2萬分子量膜的濾液；回收乙醇，濃縮，濃縮液加無離子水稀釋，即殘液A；殘液A用液-液萃取法分別用乙酸乙酯萃取三次，水層經減壓蒸餾至無乙酸乙酯殘留止，作為殘留液B；合并乙酸乙酯層，濃縮，回收乙酸乙酯，釜殘加純水至溶解，濃縮，干燥，得到黃色粉末即為胡蘆巴粗黃酮；制備胡蘆巴粗皂苷用液-液萃取法，用正丁醇作為提取劑從殘液B中提取三次，水層作為殘留液c備用，合并醇層，減壓濃縮至干，回收正丁醇得到褐色粗皂苷固體粉末；制備4-羥基-異亮氨酸殘液C調節PH為1～6，上陽離子交換樹脂柱，進行離子交換，并用無離子水洗滌，樹脂柱用0.05N～2N氨水解吸，脫氨，濃縮至干后，真空干燥4-8hr，得到黃色或黃褐色固體，產物中4-羥基-異亮氨酸的含量為10-60％；制備胡蘆巴膠取濾渣B，加10-18倍水，加熱，攪拌提取1-3h，抽濾，濾渣棄去，濾液濃縮至1/3體積后，加80-95％乙醇沉淀、洗滌、脫水、干燥得到淡黃至白色的藥用或食用胡蘆巴膠粉末。
2.如權利要求1所述的提取方法，其特征在于該方法為制備胡蘆巴籽毛油取200g經粉碎機粉碎后的胡蘆巴種子粉，溫度在75±2℃，800ml石油醚溶媒提取2小時后，抽濾上述提取物及物料，抽畢，將固體物料在75±2℃分別用600ml石油醚再提取二次，合并三次提取液，濾渣A另行處理；提取液進行蒸發濃縮回收溶劑，最后減壓濃縮脫除殘留溶劑，得到12.53g胡蘆巴籽毛油，得率為6.265％；制備胡蘆巴粗黃酮將濾渣A在75±2℃下，用800ml、600ml、600ml 80％乙醇提取三次，每次2h，濾渣B另行處理，合并提取液，通過微濾、10萬分子量膜、5萬分子量膜、2萬分子量膜，收集透過2萬分子量膜的濾液，濃縮，回收乙醇，濃縮液加400ml無離子水稀釋，即殘液A；殘液A分別用300ml乙酸乙酯萃取三次，水層經減壓蒸餾至無乙酸乙酯殘留止，作為殘留液B；合并乙酸乙酯層，進行蒸餾濃縮，回收乙酸乙酯，釜殘加適量純水溶解，濃縮，脫除殘留乙酸乙酯，而后蒸干，80℃下干燥，得到3.02g黃色粉末，得率1.51％；該物質即為胡蘆巴黃酮；制備胡蘆巴粗皂苷殘液B分別用300ml正丁醇提取三次，水層作為殘留液c備用；合并正丁醇層，濃縮回收正丁醇溶劑，釜殘即為黃褐色粗皂苷，重量10.26g，得率為5.13％；制備4-羥基-異亮氨酸殘留液c用鹽酸調PH＝5，然后用裝有300ml已再生處理好并交換成H+型的陽離子樹脂柱上進行離子交換，而后加3-4倍柱體積的無離子水進行洗滌，流出液及洗滌液棄之，洗滌后用1N氨水進行解吸，用茚三酮試劑檢測，當解吸液呈黃褐色后開始收集，至解吸液呈淡黃色止，合并解吸液，蒸發濃縮、脫氨，濃縮至干后，在80℃下干燥6h，得到黃色粉末狀物質4.32g，得率為2.16％，其中4-羥基-異亮氨酸的含量為14.47％；制備胡蘆巴膠取濾渣B，加15倍的水，加熱，攪拌提取3h，抽濾，濾渣棄去，濾液濃縮至1/3體積后，加95％乙醇進行沉淀、過濾、洗滌、風干后，80℃下干燥6h，得到胡蘆巴膠淡黃色粉末27.64g，得率為13.32％。
3.如權利要求1或2的提取方法，其特征在于該方法中石油醚可以用正己烷、環己烷或溶劑汽油代替。
4.如權利要求1或2的提取方法，其特征在于該方法胡蘆巴黃酮制備中濾渣A恒溫恒壓下乙醇提取可用甲醇提取代替。
5.如權利要求1或2的提取方法，其特征在于該方法胡蘆巴黃酮制備中提取液還可用礦物酸、有機酸、氯仿、聚乙二醇沉降蛋白質。
6.如權利要求1或2的提取方法，其特征在于該方法胡蘆巴黃酮制備中殘液A，可用聚酰胺樹脂吸附，無離子水洗滌，合并流出液、洗滌液為殘液B，另行處理；樹脂柱用10～90％乙醇解吸，收集解析液，濃縮回收乙醇，濃縮至干，真空干燥得到黃褐色粗黃酮。
7.如權利要求1或2的提取方法，其特征在于該方法胡蘆巴粗皂苷制備還可以是殘留液B用大孔徑樹脂吸附，無離子水洗滌，樹脂柱用10～90％乙醇解吸，收集解吸液濃縮至干，得到黃褐色粗皂苷固體粉末。
8.如權利要求1或2的提取方法，其特征在于該方法胡蘆巴粗皂苷制備還可以是殘液B加硫酸或鹽酸直接加熱回流5～8hr水解糖苷，使水不溶性的皂苷元呈晶態析出，過濾，濾餅烘干后，加適量活性碳混勻，用石油醚連續回流提取8～10hr，提取液經濃縮回收溶劑，濃縮至適當的濃度后，室溫放置使結晶完全析出后，過濾，濾液回收使用，濾餅抽干后呈黃色晶體，經乙醇或丙酮溶液重結晶，呈白色晶狀物。
9.如權利要求1或2的提取方法，其特征在于該方法工業胡蘆巴膠的制備也可以是胡蘆巴種子經浸水軟化后，破碎、篩分出來的胚乳，經去雜、磨粉、過篩可制得工業胡蘆巴膠。
10.如權利要求1或2的提取方法，其特征在于該方法原料可以是篩分出胚乳后的胡蘆巴種子。
11.一種4-羥基-異亮氨酸的提取方法，其特征在于該方法為取經粉碎機粉碎后的胡蘆巴種子粉，60-80℃恒溫恒壓下石油醚提取1-3小時，抽濾上述提取物，濾渣分別用石油醚再提取二次，合并三次提取液，濾渣A在60-80℃恒溫恒壓下用10-90％乙醇提取2-3次，每次1-3小時，合并提取液，濾渣B另行處理；提取液通過超濾，收集透過2萬分子量膜的濾液；，回收乙醇，濃縮，濃縮液加無離子水稀釋，即殘液A；殘液A調節PH為1～6，上陽離子交換樹脂柱，進行離子交換，并用無離子水洗滌，流出液和洗滌液合并為殘液B另行處理；樹脂柱用0.05N～2N氨水解吸，脫氨，濃縮至干后，真空干燥4-8hr，得到黃色或黃褐色固體，產物中4-羥基-異亮氨酸的含量為10-60％。
12.一種如權利要求1、2或11所述的提取方法，其特征在于該方法還可以是殘液A調節PH為1～6，上陽離子交換樹脂柱進行離子交換吸附，用無離子水洗滌后，用0.05～2N解吸用茚三酮試劑檢測解吸液，當出現氨基酸呈色反應時，即開始收集解吸液至流出解吸液呈微黃色止，合并解析液，蒸發濃縮，脫氨，濃縮至干后，真空干燥4-8hr，得到黃色或黃褐色固體，產物中4-羥基-異亮氨酸的含量為10-60％。
13.一種如權利要求1、2或11所述的4-羥基-異亮氨酸的提取方法，其特征在于該方法還可以是殘液A分別用乙酸乙酯萃取三次，水層分別用正丁醇提取三次，在正丁醇提取后的水層B，用鹽酸調PH＝5，上陽離子樹脂柱上進行離子交換，加3-4倍柱體積的無離子水洗滌，棄去流出液及洗滌液，用1N氨水解吸，用茚三酮試劑檢測，解吸液呈黃褐色后開始收集，至解吸液呈淡黃色止，合并解吸液，蒸發濃縮、脫氨，濃縮至干后干燥4-8h，得到黃色粉末狀物質，其中4-羥基-異亮氨酸的含量為14.47％。
14.如權利要求1、2、11所述的提取方法，其特征在于該方法中陽離子交換樹脂還可以是強酸性、中酸性或弱酸性陽離子樹脂；干燥可用噴霧干燥、真空干燥、冷凍干燥。
15.一種胡蘆巴種子中四種提取物的提取方法，其特征在于該方法為制備胡蘆巴毛油取經粉碎脫胚乳后的胡蘆巴粉在60～80℃恒溫恒壓下，用10～90％乙醇提取三次，每次1-3hr，合并濾液；濾液經濃縮回收乙醇，濃縮液用無離子水稀釋，用用正己烷進行液-液萃取，萃取三次，合并油層，水層另行處理；油層經濃縮回收溶劑，得到胡蘆巴毛油；制備4-羥基-異亮氨酸水層用稀醋酸調PH4-6，使蛋白變性析出，經沉降過濾，濾液用陽離子交換樹脂吸附氨基酸，并用無離子水洗滌，合并流出液、洗滌液為殘液d，另行處理；陽離子制樹脂柱用0.05～2N氨水解吸，解析液經減壓濃縮、脫氨、蒸干，并在80℃下真空干燥4-8hr，得到黃色固體粉末產品，產物中4-羥基-異亮氨酸含量為10-60％；制備胡蘆巴黃酮殘液d通過聚酰胺樹脂吸附，并用無離子水洗滌，合并流出液和洗滌液為殘液e，另行處理，聚酰胺柱用10-90％乙醇解吸，收集解析液，經濃縮回收乙醇，蒸干，在80℃真空干燥4-8hr，得到黃色固體粉末胡蘆巴黃酮；制備胡蘆巴皂苷殘液e通過大孔徑樹脂柱吸附，并用無離子水洗滌，流出液、洗滌液排入污水處理池，大孔徑樹脂柱用10-90％乙醇解吸，收集解析液，經濃縮，回收乙醇，蒸干，在80℃真空干燥4-8hr，得到黃褐色固體粉末胡蘆巴皂苷。
16.如權利要求15所述的提取方法，其特征在于該方法為制備胡蘆巴毛油取200g經粉碎篩分去胚乳后的胡蘆巴種子粉，在75±2℃恒溫恒壓下，用800ml，600ml，600ml的80％乙醇提取三次，每次2hr，合并提取液另行處理，提取液進行濃縮，回收至濃縮液無醇味止，濃縮液加無離子水600ml稀釋，稀釋液各用200ml正己烷提取三次，水層另行處理，合并油層進行濃縮，回收正己烷，最后用減壓蒸餾脫除殘留正己烷，得12.02g粗胡蘆巴毛油，得率為6.01％；制備4-羥基-異亮氨酸水層用稀醋酸調PH＝5，則有大量蛋白質沉淀析出，沉降，過濾，濾液用300gH+型陽離子交換樹脂柱進行離子交換，并用600ml無離子水洗滌，合并流出液，洗滌液為殘液d另行處理；陽離子樹脂柱用0.6N氨水解吸，解吸液經減壓濃縮，脫氨，蒸干，并在80℃下真空干燥6hr，得到黃色固體粉末5.44g，得率為1.61％，產品中4-羥基-異亮氨酸含量為30.4％；制備胡蘆巴黃酮殘液d用450g聚酰胺樹脂吸附，用600ml無離子水洗滌，合并流出液、洗滌液為殘液e，另行處理，聚酰胺樹脂柱用80％乙醇進行解吸至流出液為淡黃色為止，合并解析液，經濃縮至干，回收乙醇，釜殘為黃色固體，經研磨，得到2.92g黃色的粗黃酮固體粉末，得率為1.46％。制備胡蘆巴皂苷殘液e用500gD-X型大孔徑樹脂柱吸附，并用800ml無離子水洗滌，大孔徑樹脂柱用85％乙醇進行解吸，至流出液為淡黃色為止，合并解析液，經濃縮至干，回收乙醇，釜殘為褐色固體，經研磨得11.72g粗皂苷，得率為5.68％。
17.如權利要求15所述的提取方法，其特征在于該方法中為制備胡蘆巴毛油還可以是取經粉碎脫胚乳后的胡蘆巴粉以乙醇作提取劑用20KHz超聲波提取2-3次，每次30-50min，合并濾液；濾液經濃縮回收乙醇，濃縮液用無離子水稀釋，用正己烷進行液-液萃取，萃取三次，合并油層，水層另行處理；油層經濃縮回收溶劑，得到胡蘆巴毛油。
18.如權利要求15或17所述的提取方法，其特征在于該方法中制備胡蘆巴毛油還可以是其中乙醇提取液的濃縮液加無離子水稀釋后，還可用礦物酸、有機酸、氯仿、聚乙二醇沉降蛋白質，過濾，濾液再用非極性溶劑萃取2-3次，即得胡蘆巴籽油。
19.如權利要求15或17所述的提取方法，其特征在于該方法中為制備胡蘆巴黃酮還可以是殘液d用乙酸乙酯萃取2-3次，合并酯層，經濃縮，干燥，得到黃色固體粉末——胡蘆巴黃酮。
20.如權利要求15或17所述的提取方法，其特征在于該方法中為制備胡蘆巴皂苷還可以是殘液E用正丁醇萃取2-3次，合并醇層，經濃縮、干燥，得到褐色固體粉末的粗皂苷。
21.如權利要求11所述的提取方法制備的4-羥基-異亮氨酸可加入常規輔料制成膠囊、片劑、顆粒劑或口服液。
全文摘要
本發明公開了一種以胡蘆巴種子為原料，制備富含非蛋白成分的天然4－羥基－異亮氨酸及其副產品胡蘆巴毛油、黃酮、皂苷、胡蘆巴膠等五種產品的方法。本發明富含4－羥基－異亮氨酸產品具有良好的降血糖活性。本發明可使胡蘆巴籽得到充分的綜合利用，具有明顯的經濟效益和社會效益。
文檔編號C07C227/40GK1397545SQ0212882
公開日2003年2月19日 申請日期2002年8月14日 優先權日2002年8月14日
發明者張可欽, 李勝和, 李長城, 段建新, 劉彥 申請人:鷹翰國際貿易(上海)有限公司