專利名稱：利用生物合成和化學修飾技術生產胸腺素al單體的方法
技術領域：
本發明屬于生物合成和化學修飾技術領域，特別涉及用于提高人免疫能力和應用于多種疾病治療的胸腺素α1的生產方法。
目前胸腺素α1純品為一化學藥物，在國內外都已經上市。由于胸腺素α1是由28個氨基酸組成的小分子多肽，結構與作用非常明確，因此可以采用化學合成方法制備。但是化學方法制備胸腺素α1成本高，大規模實現難度大，采用有毒試劑比較多。
本發明提出的利用生物合成和化學修飾技術生產胸腺素α1單體的方法，主要包括以下步驟(1)利用人工基因合成技術，獲得胸腺素α1基因的全序列；(2)利用人工基因合成技術對該全序列構建“多胸腺素α1”融合蛋白重組基因質粒，并導入宿主細胞中合成多胸腺素α1；(3)利用基因工程技術對該多胸腺素α1發酵獲得“多胸腺素α1”重組融合蛋白表達產物；(4)通過對該表達產物進行純化獲得“多胸腺素α1”；(5)利用化學裂解技術將“多胸腺素α1”裂解為胸腺素α1單體；(6)利用化學修飾技術或酶促合成方法將該胸腺素α1單體修飾成為天然結構；(7)通過純化方法獲得純度達96％以上的天然結構胸腺素α1單體。
本發明上述方法步驟(1)中，所說的胸腺素α1基因來自GeneBank公用數據庫公布的人28肽胸腺素α1基因序列。
上述第(2)步方法中，所說的構建“多胸腺素α1”融合蛋白基因的方式為
a.雙分子連接，即胸腺素α1---胸腺素α1，或b.三分子連接，即胸腺素α1---胸腺素α1---胸腺素α1；上述的分子間的連接方式可以是直接分子連接或借助其它蛋白連接肽。
上述步驟(3)中，多胸腺素α1重組融合蛋白的表達方式，可以是直接表達，或者再與其它任意蛋白質融合表達(如各種融合表達標簽、各種蛋白純化標簽)在各種原核系統，酵母系統，真菌系統和其它真核系統表達。
上述步驟(5)中，所說的裂解方法包括各種化學裂解，如溴化氰裂解、羥胺裂解、酸裂解以及各種酶裂解等方法。
上述步驟(6)中，所說的化學修飾方法包括各種化學修飾如乙酸酐化學修飾方法；各種酶修飾如N-乙酰轉移酶修飾方法。
本發明還可利用上述方法，獲得幾種胸腺素α1的衍生物，如N端非乙酰化胸腺素α1、C端高絲氨酸化胸腺素α1、以及N-乙酰-C-高絲氨酸胸腺素α1。
本發明的特點及效果本發明利用生物工程技術，將多個胸腺素基因進行重組，在大腸桿菌中表達該重組基因而獲得高表達的多個胸腺素融合體；利用化學技術將該融合體裂解和修飾，最終形成胸腺素α1單體。
本發明克服了小分子多肽很難在生物體內合成的問題，通過將胸腺素α1的基因導入宿主細胞(例如常用大腸桿菌DH5α)，在宿主細胞中合成多胸腺素α1，經過化學修飾、分離純化，從而獲得與目前上市的化學合成胸腺素α1結構完全一致的產品，而且胸腺素α1單體的純度可以達到96％以上。且工藝簡單，生產成本低，便于大規模生產。
本實施例方法包括以下步驟1.利用人工基因合成技術，獲得胸腺素α1基因的全序列；具體包括1)設計胸腺素α1基因序列片段，利用DNA全自動合成儀進行合成，其合成的片段如下片斷1AAT ATG TCT GAT GCT GCT GTT GAT ACT TCT TCT GAG ATT ACT ACTAAA GAT CTT AAG GAG AAG AAG GAA GTT GTC GAA GAG GCT GAG(87mer)片斷2CAT ATT CTC AGC CTC TTC GAC AAC TTC CTT CTT CTC CTT AAG ATCTTT AGT AGT AAT CTC AGA AGA AGT ATC AAC AGC AGC ATC AGA(87mer)片斷3AGT AGT AAT CTC AGA AGA AGT ATC AAC AGC AGC ATC AGA(39mer)片斷4ATT GGT ACC CTT GGC AAA GCA TGC GTT CTC AGC CTC TTC GAC AACTTC CTT CTT CTC CTT AAG ATC TTT 3′(69mer)2)上述4個片斷可以通過核酸片段退火、連接形成任意個胸腺素α1的連接體，包括單分子體、雙分子體、三分子體、四分子體等；3)通過瓊脂糖凝膠電泳技術，分離胸腺素α1雙分子體或三分子體基因。
2.利用基因工程技術將上述雙分子體或三分子體基因插入原核表達質粒中，獲得基因工程重組質粒。將質粒轉化大腸桿菌DH5α，獲得雙分子體或三分子體基因工程重組表達菌株。
3.利用基因工程技術，誘導上述基因工程表達菌株，使大腸桿菌表達胸腺素α1雙分子體或三分子體融合蛋白。
4.利用離子交換層析、反向層析、凝膠過濾等分離純化方法，獲得純化胸腺素α1雙分子體或三分子體融合蛋白。
5利用化學裂解技術將胸腺素α1雙分子或三分子體裂解為胸腺素α1單體；具體包括以下步驟；1)溴化氰化學裂解方法在分子間連接的蛋氨酸處裂解，將胸腺素α1雙分子體或三分子融合蛋白體裂解為胸腺素α1單體和C-端高絲氨酸化胸腺素α1單體；2)酶裂解方法改變分子間的連接方式，可以使用相應的特異性蛋白酶將其進行裂解，如活化的凝血酶、腸激酶等；3)將裂解產物進行純化，可以直接獲得純度達96％以上的胸腺素α1，和C-高絲氨酸化胸腺素α1。
6利用化學或酶修飾技術將胸腺素α1單體或C-端高絲氨酸化胸腺素α1單體修飾為N-乙酰化胸腺素α1(天然結構胸腺素α1)或N-乙酰-C-高絲氨酸化胸腺素α1；具體包括以下步驟1)酶修飾方法利用N-乙酰轉移酶和乙酰輔酶A在適當條件下對胸腺素α1進行乙酰化；2)化學修飾方法利用乙酸酐在適當條件下對胸腺素α1進行乙酰化。
7通過反向色譜和分子篩技術，獲得純度達96％以上的天然結構胸腺素α1，和N-乙酰-C-高絲氨酸化胸腺素α1。
用上述方法制備的天然結構胸腺素α1進行活性測定，具有與化學合成胸腺素α1相同的活性。
本發明的效果實驗本工藝生產的胸腺素α1對淋巴細胞的增殖效應從人全血分離得到淋巴細胞，PBS洗后，懸于含10％FCS的1640培養液中，向96孔培養板中加入4×105/孔的脾細胞和12.5ug/孔的ConA，每樣設5個重復。CO2孵箱中37℃培養6h，再加入不同濃度的胸腺素α1，繼續培養72h，每孔加入3H-TdR18.5×103GBq繼續培養6h，收獲于玻璃纖維濾紙上，晾干后測定cpm值，按下列公式計算出增殖率。 對照組cpm結果加入不同濃度的最終胸腺素α1，能明顯增加淋巴細胞的增殖。
權利要求
1.一種利用生物合成和化學修飾技術生產胸腺素α1單體的方法，主要包括以下步驟(1)利用人工基因合成技術，獲得胸腺素α1基因的全序列；(2)利用人工基因合成技術對該全序列構建“多胸腺素α1”融合蛋白重組基因質粒，并導入宿主細胞中合成多胸腺素α1；(3)利用基因工程技術對該多胸腺素α1發酵獲得“多胸腺素α1”重組融合蛋白表達產物；(4)通過對該表達產物進行純化獲得“多胸腺素α1”；(5)利用化學裂解技術將“多胸腺素α1”裂解為胸腺素α1單體；(6)利用化學修飾技術或酶促合成方法將該胸腺素α1單體修飾成為天然結構；(7)通過純化方法獲得純度達96％以上的天然結構胸腺素α1單體。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，上述步驟(1)中，所說的胸腺素α1基因來自GeneBank公用數據庫公布的人28肽胸腺素α1基因序列。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，上述第(2)步驟中，所說的構建“多胸腺素α1”融合蛋白基因的方式為a.雙分子連接，即胸腺素α1---胸腺素α1，或b.三分子連接，即胸腺素α1---胸腺素α1---胸腺素α1；所說的分子間的連接方式為直接分子連接或借助其它蛋白連接肽。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，上述步驟(3)中，所說的多胸腺素α1重組融合蛋白的表達方式為直接表達，或者再與其它任意蛋白質融合表達，在各種原核系統，酵母系統，真菌系統和其它真核系統表達。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，上述步驟(5)中，所說的裂解方法包括各種化學裂解，以及各種酶裂解方法。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，上述步驟(6)中，所說的化學修飾方法包括各種化學修飾；各種酶修飾。
7.一種利用如權利要求1所述的方法獲得胸腺素α1的衍生物。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所說的胸腺素α1的衍生物包括N端非乙酰化胸腺素α1、C端高絲氨酸化胸腺素α1、以及N-乙酰-C-高絲氨酸胸腺素α1。
全文摘要
本發明屬于生物合成和化學修飾技術領域,涉及利用生物合成方法和化學修飾方法生產胸腺素α1單體的方法。本發明利用生物工程技術,將多個胸腺素基因進行重組,在宿主細胞中表達該重組基因而獲得高表達的多個胸腺素融合體;利用化學技術將該融合體裂解和修飾,最終形成胸腺素α1單體。利用該生產工藝可以生產出與化學合成完全一致的胸腺素α1,且具有工藝簡單,生產成本低,便于大規模生產的優點。本發明同時也提供其它幾種胸腺素α1衍生物的生產方法。
文檔編號C07K14/435GK1388133SQ0212526
公開日2003年1月1日 申請日期2002年7月22日 優先權日2002年7月22日
發明者吳建中 申請人:吳建中