專利名稱：識別血小板膜糖蛋白的單克隆抗體及其在抗血栓治療中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫學免疫領域。更具體地說，本發明涉及可識別血小板表面抗原的單克隆抗體，產生該單克隆抗體的雜交瘤，含有該單克隆抗體的抗血小板藥物及其在抗血栓治療中的應用。
背景技術：
1.血栓栓塞所引起或并發的病變，約為癌瘤的3倍之多，而且是最常見的死亡病因之一，是當前嚴重危害人類健康的疾病。因此防止血栓形成，是當代醫學研究的一個重點和熱點。作為血栓的主要組成成份，血小板在血栓的形成中起著關鍵作用。血小板在正常循環血液中處于靜息狀態。當血管破損暴露出血管內皮下膠原等結構，血小板就會通過其表面膜糖蛋白直接與血漿蛋白如von Willebrand因子(vWF)結合而粘附于血管破損處內皮下組織。粘附的血小板或當血小板受到在凝血過程或組織損傷過程中產生的血小板活化劑作用時發生變形，伸出偽足，進而釋放細胞內顆粒內容物。同時血小板膜糖蛋白(GP)IIb-IIIa復合物被激活形成粘附分子受體，該受體與纖維蛋白原(纖原)的結合便能促使血小板之間相互粘附、聚集成團，最終導致在血管破損處形成血小板血栓(Plow EF，Ginsberg MH.Cellular adhesionGPIIb/IIIa as a prototypic adhesion receptor.Progress in Haemostasis and Thrombosis.1989；9117-124)。血小板血栓的形成在動脈血栓栓塞性疾病，包括急性心肌梗死等冠狀動脈血栓形成的發病過程中起重要作用，因此一類抗血小板藥物已成為包括冠心病在內的動脈血栓栓塞性疾病的重要治療手段(Becker RC.Thrombinantagonists and antiplatelet agents.Am J Cardiol 1992；6939E；阮長耿。單克隆抗體與血栓性疾病的診斷與治療。中國科學技術前沿(中國工程院版)2001；第四卷131-145頁.)。目前臨床上常用的抗血小板藥物有阿斯匹林、雙嘧達莫、噻氯匹啶等，但是這些藥物只能作用于血小板活化的某一環節，它們的療效都不如血小板受體GPIIb-IIIa拮抗劑。血小板受體GPIIb-IIIa拮抗劑直接抑制血小板聚集的最終共同途徑，阻斷纖原與血小板GPIIb-IIIa的結合就能抑制血小板聚集，使血小板血栓不能形成，從而成為臨床上強力、高效和特異的抗血小板藥物，顯示出良好的應用前景。血小板受體GPIIb-IIIa拮抗劑有三類單克隆抗體，如c7E3，人工合成肽，如Eptifibatide及非肽類小分子物質，如Tirofiban(阮長耿.單克隆抗體與血栓性疾病的診斷與治療。中國科學技術前沿(中國工程院版)2001；第四卷131-145頁；Verstraete M.Synthetic inhibitors ofplatelet GPIIb/IIIa in clinical development.Circulation.2000；101(6)76-80)。
單克隆抗體(McAb，單抗)技術始創于1975年，在醫學和生物學的基礎研究以及疾病的診斷和治療中發揮了很大作用。但隨著單抗在臨床上的廣泛應用，人們發現鼠源性單抗藥物存在一些問題鼠源性抗體用于人體后產生的人抗鼠抗體(HAMA)反應；抗體分子量較大，抗體分子到達靶部位的量不足；抗體本身效應功能不強等，使抗體治療效果不理想。針對這些問題，人們對抗體進行人源化改造，如常見的人鼠嵌合抗體，制備單鏈抗體等小分子量抗體片段以及制備雙功能抗體等研究。7E3是1983年美國研究人員制備的一株鼠源性抗膜糖蛋白IIb-IIIa單克隆抗體(Coller BS，Peerschke EI，Scudder LE etal.A murine monoclonal antibody thatcompletely blocks the binging of fibrinogen to platelet producesa thrombas thenic-like state in normal platelet and bind toglycoprotein IIb/IIIa.Journal of Clinical Investigation.1983；72(1)325-328)。1992年改造為人鼠嵌合抗體片段c7E3(Knight DM，Wagner C，Jordan R，etal.The immunogenicity of the 7E3 murine Fabmonoclonal-antibody fragment variable region in dramaticallyreduced in humans by substitution of human for murine constantregions.M0lecular Immunology.1995；32(16)1271-1281)。大規模臨床觀察表明它具有良好的抗栓功能，已通過FDA批準，在國外廣泛用于缺血性心臟病的治療，顯示了這類藥物良好的應用前景。
然而，單克隆抗體c7E3的不足在于它僅作用于血小板表面的一個抗原決定簇，它僅從一個角度去封閉受體，因而它難以達到完全抑制血小板聚集的作用。因此，臨床上，人們一直在尋找新的、能夠更有效的抑制血小板聚集的單克隆抗體。
發明簡述本發明的第一個方面是提供了新的、抗血小板表面糖蛋白特定抗原決定簇的單克隆抗體。
本發明的第二個方面是提供了新的、能夠產生抗血小板表面糖蛋白特定抗原決定簇的單克隆抗體的雜交瘤細胞。
本發明的第三個方面是提供了新的、抗血小板表面糖蛋白特定抗原決定簇的單克隆抗體的制備方法。
本發明的第四個方面是提供了新的、抗血小板表面糖蛋白特定抗原決定簇的單克隆抗體片段。
本發明的第五個方面是提供了新的、能夠有效抑制血小板聚集的藥物組合物。
圖1顯示研制產生單抗R813和Y262的雜交瘤細胞的流程圖。
圖2顯示純化單抗R813和Y262 IgG的電泳分析。
圖3顯示Western印跡轉移電泳圖譜，(R813和Y262結果)。
圖4顯示單抗R813和Y262親和層析產物電泳分析，其中A為蛋白質標記物，B為R813非還原性產物，C為蛋白質Marker，D為Y262非還原性產物。
圖5顯示單克隆抗體R813和Y262與血小板結合活性，1為陰性對照，2為陽性對照SZ-22，3為單克隆抗體R813，4為單抗Y262。
圖6顯示125I標記單克隆抗體R813和Y262的放射免疫競爭抑制試驗結果。
圖7顯示制備單克隆抗體R813和Y262 F(ab′)2的電泳分析。
發明詳述按照本發明的第一個方面，提供了新的、抗血小板表面糖蛋白特定抗原決定簇的單克隆抗體。
我們運用人血小板免疫Balb/c小鼠，研制成功了一批抗血小板GPIIIa或抗血小板GPIIb-IIIa的單克隆抗體(約20個克隆)，經過反復篩選、檢測，證明Y262，Y321，Y474和R813能良好地抑制血小板聚集的功能。運用125I標記單克隆抗體的放射免疫競爭抑制試驗和流式細胞術平均熒光強度疊加法發現本發明單抗所識別血小板表面糖蛋白的不同抗原決定簇，其中第一組單克隆抗體選自R813、Y88、Y128、Y474，它們特異性地識別血小板GPIIIa，而第二組單抗選自Y8、Y262、Y291、Y295、Y321、Y342、Y458、Y585、Y700，它們特異性地識別血小板受體GPIIb-IIIa復合物。優選的本發明第一組單抗是單抗R813，優選的本發明第二組單抗是單抗Y262。
按照本發明的第二個方面，提供了新的、能夠產生抗血小板表面糖蛋白特定抗原決定簇的單克隆抗體的雜交瘤細胞系。具體地說，本發明提供了分別能夠產生上述第一組單抗和第二組單抗的雜交瘤細胞系，它選自產生識別血小板GPIIIa單克隆抗體的雜交瘤細胞R813、Y88、Y128、Y474和產生識別血小板GPIIb-IIIa復合物單克隆抗體的雜交瘤細胞Y8、Y262、Y291、Y295、Y321、Y342、Y458、Y585、Y700。其中優選的是雜交瘤R813和Y262，這兩株雜交瘤細胞已按照布達佩斯條約的規定，于2002年4月30日保藏于國際保藏單位—中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，其保藏編號分別為CGMCC No.0740和CGMCC No.0741。
按照本發明的第三個方面，提供了新的、抗血小板表面糖蛋白特定抗原決定簇的單克隆抗體的制備方法。該方法包括利用人血小板作免疫原免疫Balb/c小鼠，取脾細胞與SP2/0-Ag14骨髓瘤細胞融合，研制產生識別血小板GPIIIa或IIb-IIIa復合物單克隆抗體的雜交瘤細胞，運用ELISA，FCM，Western印跡，親和層析等方法鑒定單克隆抗體的抗原決定簇和觀察單抗與血小板結合活性，并制備腹水與純化單克隆抗體。
按照本發明的第四個方面，提供了新的、抗血小板表面糖蛋白特定抗原決定簇的單克隆抗體片段。運用木瓜酶消化法制備單克隆抗體R81 3和Y262 F(ab′)2片段并經過SDS-PAGE鑒定，觀察單抗R813和Y262 F(ab′)2片段及其“雞尾酒”的血小板聚集功能抑制活性。
按照本發明的第五個方面，提供了新的、能夠有效抑制血小板聚集的藥物組合物，該藥物組合物含有一種或多種本發明的單克隆抗體，并根據需要含有藥學上可接受的載體或輔助劑。
在本發明的一優選實施方案中，運用125I標記單克隆抗體放射免疫競爭抑制法和流式細胞術平均熒光強光疊加法篩選出針對不同抗原決定簇的抗體R813和Y262。將Y262和R813聯合作用于血小板發現此二個單抗聯合作用能完全抑制ADP誘導的血小板聚集反應，且抗體用量少(總量6～7μg/ml)。試驗結果表明，單抗R813和Y262作用于血小板受體GPIIb-IIIa的不同位點，二者組成的單克隆抗體“雞尾酒”完全阻斷了纖原與血小板受體GPIIb-IIIa的結合，徹底抑制血小板聚集活性。且其F(ab′)2片段仍能達完全抑制血小板聚集活性，生物活性超過c7E3(商品名為Reopro)。使用兩株單抗組成單抗的“雞尾酒”，100％封閉了血小板膜糖蛋白IIb-IIIa的受體功能，這在國際上尚屬首創，其生物活性超過了Reopro(c7E3)。Reopro只是作用在血小板受體GPIIb-IIIa的一個位點，從一個角度去封閉受體，達到50％血小板聚集抑制率所需抗體量為5.5ug/ml。我們研制成功的“雞尾酒”作用于血小板受體GPIIb-IIIa上兩個不同位點，在空間構型上全面封閉纖維蛋白原和受體的結合，達到50％抑制率所需的抗體量僅為3.3ug/ml，不僅明顯降低了單克隆抗體用量，而且血小板聚集功能抑制作用也大大增強，超過了Reopro(c7E3)。為降低單抗作用時的HAMA反應，同時減小分子量，增加靶部位抗體濃度，我們將單抗R813和Y262用酶解法改造為F(ab’)2片段(有研究表明單純鼠源性抗體F(ab’)2片段的HAMA反應并不比嵌合抗體大，且其親和力高，可直接用于治療)。體外試驗表明此二株抗體的F(ab’)2片段聯合作用仍能完全阻斷血小板受體GPIIb-IIIa功能，完全抑制血小板聚集。
本發明的優點在于本發明研制了作用于血小板受體GPIIb-IIIa不同位點的單抗R813和Y262，它們均能良好抑制血小板聚集功能，將這二株抗體聯合在一起組成“雞尾酒”可以完全阻斷血小板受體GPIIb-IIIa的功能，徹底抑制血小板聚集功能。我們發明的單抗“雞尾酒”生物活性超過了國際著名的抗血小板藥物Reopro且用量少。將抗體用酶解法制備成F(ab’)2片段，保存生物活性的同時也降低了抗體分子量，使到達作用靶部位的抗體量增加。去除Fc端還降低了HAMA反應和減少了因與網狀內皮系統結合而導致的血小板破壞。此外，酶解法操作簡單，成本低廉。因此，強力高效的生物活性，低廉的成本，簡單的操作使得本發明具有巨大的抗栓治療潛力和市場前景。
以下借助非限制性實施例舉例詳細描述本發明。
實施例1產生單抗R813和Y262雜交瘤細胞的制備1.1材料Balb/c小鼠購自Charles River Laboratories Inc.Canada，SP2/0-Ag14小鼠骨髓瘤細胞，慢性骨髓瘤性白血病細胞(K562)，急性淋巴母細胞白血病細胞(MOLF-4)，人急性T細胞白血病細胞(Jurkat E6-1)均購自美國ATCC公司，D-MEM/F12，RPMI1640，L-G lutamine，MEMnon-Es sential，HT Supplement，HAT Suplement，Antibiotic-Antimycotic均為GIBCO公司產品，8-Azaguanie為Sigma公司產品，50％PEG1500Solution為ROCH產品，鼠抗體亞類分型試劑盒為Biorad公司產品，其余試劑為國產分析純。
1.2方法正常成人抗凝全血分離出血小板，TEN洗滌3次，PBS懸浮并調血小板數為1×108細胞/毫升，取0.2ml注入8周齡雌性Balb/C小鼠腹腔，4周后重復，再過4周0.2ml血小板懸液注入小鼠尾靜脈，3日后處死小鼠，取出脾臟制成脾細胞懸液。將108脾細胞與1×107處于對數生長期的SP2/0-Ag14細胞用常規方法融合，依次用HAT培養基，HT培養基各培養2周，接著換用普通完全培養基。其間對出現細胞克隆者用血小板包被的酶標板做ELISA檢測，結果發現有20多個雜交瘤細胞克隆與血小板有顯著的結合反應。對與血小板反應陽性的并經過篩選的雜交瘤細胞克隆用有限稀釋法進行3次亞克隆，爾后逐步轉入24孔板、培養瓶培養，并制備腹水(見圖1)。由此獲得12株能穩定分泌抗血小板單抗的細胞株，它們是R813、Y8、Y88、Y128、Y262、Y291、Y295、Y321、Y458、Y474、Y585和Y700。采用流式細胞術觀察這些抗體與人紅細胞，白細胞，慢性骨髓瘤白血病細胞(K562)，急性淋巴母細胞白血病細胞(MOLF-4)和人急性T細胞白血病細胞(Jurkat E6-1)反應，結果顯示這12株抗體與這些細胞均無交叉反應。同時對產生這些抗體的細胞進行核型分析表明它們確為雜交瘤細胞。應用單抗亞類分型試劑盒(Biorad)進行分析，結果顯示單抗R813、Y128、Y321、Y458、Y474、Y585和Y700為IgG1，Kappa；單抗Y8和Y295為IgG2a，Kappa；單抗Y88、Y262和Y291為IgG2b，Kappa。連續幾年對其中兩個優選單抗R813和Y262的雜交瘤細胞株動態觀察，證明這兩株雜交瘤細胞株能長期穩定分泌高效價的單抗。現兩株細胞已建成生產細胞庫。
實施例2抗體R813和Y262 IgG的制備和純化2.1材料Pristane為Sigma公司產品，Balb/C小鼠購自上海實驗動物中心，Protein G 1ml預裝柱為Pharmacia公司產品，其余試劑均為國產分析純。
2.2方法以1ml Pristane注入雄性10周齡Balb/c小鼠腹腔致敏，一周至二周后分別將R813和Y262雜交瘤細胞1～10×106注入致敏后的小鼠腹腔，一周左右開始觀察并收集腹水。小鼠腹水以0.02M PB(pH7.0)4℃透析過夜，隨后4℃離心10000轉/分×15分去除沉淀，0.2μm濾器過濾。濾過液1ml/次加入Protein G柱，0.02M PB(pH7.0)平衡及洗去雜蛋白，0.1MGly-HCl(pH2.7)洗脫IgG并收集之。收集產物經PBS透析后濃縮定量，并經10％SDS-PAGE鑒定。結果表明腹水中抗體含量約8mg/ml，純化后抗體純度在90％以上(見圖2)。
實施例3抗體R813和Y262的血小板結合活性研究3.1材料
血小板來自正常成年志愿者全血，GAM-FITC為上海華美公司產品，GAM-HRP為Sigma公司產品，CNBr-Sepharose 4B為Pharmacia產品，蛋白質標記物為上海生化所西巴斯公司產品，蛋白質組成為43KD、66KD、97KD、130KD和200KD，其余試劑均為國產分析純試劑。
3.2方法(1)ELISA法測定抗體R813和Y262與血小板結合活性健康人抗凝全血，分離出富含血小板血漿(PRP)，TEN溶液洗3次，以5×105血小板/孔包板，4℃過夜，2％BSA-PBS 37℃封閉2小時，0.5％戊二醛固定，0.01％Tween20-PBS洗滌，GAM-HRP為二抗，OPD顯色，常規ELISA測定492nm處的戲光A492值。同時以鼠IgG為陰性對照，以SZ-22(抗血小板GPIIbα)為陽性對照。結果表明R813和Y262具有良好的血小板結合活性。
(2)流式細胞術測定抗體R813和Y262與血小板結合活性5ul PRP(血小板濃度為5×108/ml)加入50ul 1∶100稀釋的抗體R813和Y262小鼠腹水，室溫放置30分鐘，洗滌后加入GAM-FITC，流式細胞儀(CoulterEPICSR，XL)檢測。同時以鼠IgG為陰性對照，同樣稀釋度之SZ-22為陽性對照。結果表明R813和Y262具有血小板結合能力(見圖5)。
(3)Western印跡測定抗體R813和Y262與血小板膜蛋白結合位點EDTA抗凝全血分離PRP，TEN溶液洗3次，調整血小板數至2×108/ml，加入1mmol/L PMSF，1％Triton X-100裂解血小板后，離心取上清，按60ul/孔加樣，進行非還原5％-15％對數梯度SDS-PAGE，轉移至硝酸纖維薄膜，2％BSA-PBS封閉后，裁剪成不同條帶，加R813和Y262抗體37℃溫育2小時，GAM-HRP為二抗，最后加氯萘酚顯色。同時以鼠IgG為陰性對照，SZ-22抗體為陽性對照。結果表明，R813作用于血小板GPIIIa，而Y262未見反應(見圖3)。
(4)親和層析測定R813和Y262抗體與血小板膜蛋白作用位點將CNBr-Sepharose 4B凝膠用1mmol/L鹽酸溶脹4小時，偶聯緩沖液洗滌3次，將純化之R813，Y262經充分透析后加入凝膠，4℃振蕩16小時。在砂芯漏斗內經偶聯緩沖液洗滌，1mmol/L乙醇胺浸泡2次，每次1小時，依次用偶聯緩沖液，25mmol/L Tris-HCl，TBS抽濾，最后將偶聯后的凝膠裝柱。同方法(3)中制備血小板破碎液，將2×109血小板的破碎液循環上樣，然后用0.05mol/L二乙胺-5mmol/L EDTA緩沖液洗脫。洗脫物經PBS透析后濃縮用10％SDS-PAGE鑒定。結果表明R813作用抗原為GPIIIa，而Y262作用抗原為GPIIb-IIIa復合物(見圖4)。
實施例4抗體R813與Y262分別與血小板受體GPIIb-IIIa復合物的不同位點作用4.1材料125I購自中國原子能總公司，Sephadex G-25凝膠為phamacia公司產品，其余試劑均為國產分析純試劑。
4.2方法125I標記R813放射免疫競爭抑制試驗30ug R813(1mg/ml)加入10ul0.1mol/LPB pH 7.5；1mGi125I及5mg/ml ChT 10ul，室溫靜置1分鐘，后加入20mg/ml Na2S2O820ul室溫靜置1分鐘，之后加入100ul 0.5％BSA-PBS。該反應物加入0.5％BSA-PBS預平衡的Sephadex G-25凝膠柱，同樣溶液洗脫，每管收集10滴。γ計數儀(國營262廠，FJ2008)測定放射性計數，收集第一個放射性峰。同前血小板包板，以不同濃度鼠IgG，R813，Y262與固定濃度125I-R813混合后加入包被板，37℃溫育2小時后，洗滌3次，γ計數儀檢測放射性計數。結果表明隨R813濃度增加，包被每孔放射性計數下降，而放射性計數不隨Y262和鼠IgG濃度改變而變化，說明Y262與R813作用抗原位點不同(見圖6)。
實施例5抗體R813與Y262協同封閉血小板GPIIb-IIIa復合物，充分抑制血小板聚集功能5.1材料ADP為上海麗珠東風生物制品公司產品，GAM-FITC為上海華美公司產品，其余試劑均為國產分析純試劑。
5.2方法(1)流式細胞術平均熒光強度疊加實驗5ul PRP分別與抗體R813，Y262及二者混合物作用室溫30分鐘，洗滌后加入GAM-FITC，流式細胞儀檢測。鼠IgG作為陰性對照。結果表明R813與Y262共同作用對陽性細胞平均熒光強度是兩個抗體單獨作用時之和，說明R813和Y262可以分別作用于血小板GPIIb-IIIa復合物上各自抗原決定簇，從而能對復合物分子產生協同封閉作用(見表1)。
表1單抗R813和Y262流式細胞術平均熒光強度疊加法實驗結果抗體 陽性細胞百分率(％) 平均熒光強度PBS3.222.61鼠-IgG 6.483.26SZ-22 90.283.1R813 87.7185.7Y262 73.6130.9R813+鼠-IgG86.4174.8R813+SZ-22 92.3255.4R813+R813 87.6180.1R813+Y262 88.1338.5(2)R813，Y262及二者協同抑制ADP誘導血小板聚集實驗枸橡酸抗凝健康成人全血，分離PRP，加入不同濃度的抗體R813，Y262及二者混合物，37℃溫育5分鐘，然后加入ADP(終濃度5umol/L)，檢測聚集結果。鼠IgG為陰性對照，Reopro為陽性對照。結果表明R813與Y262均可良好抑制血小板聚集功能，二者聯合作用時相同抗體濃度下對血小板聚集抑制作用增強，可完全阻斷血小板聚集功能，其抗栓活性超過Reopro。通過計算還可知50％抑制率用量低于Reopro(見表2、3、4)。
表2.不同濃度單抗對血小板聚集的影響第一次試驗試驗次數對照 單抗PBS R813 Y262 7E3濃度(ug/ml) 0 2.5 5.02.55.0 2.5 5.0血小板聚集百分率(％)1 82％63％74％69％75％69％37％2 86％75％46％81％65％53％22％平均值 84％69％60％75％70％61％29.5％第二次試驗試驗次數對照 單抗PBSR813 Y262 7E3濃度(ug/ml) 0 5.010.0 5.010.0 5.0 10.0血小板聚集百分率(％)平均值 59％53％ 22％ 64％ 28％ 47％ 43％
第三次試驗試驗次數對照 單抗PBSR813 Y262濃度(ug/m l) 0 5.0 10.05.0 10.0血小板聚集百分率(％)1 61％ 60％23％67％54％2 72％ 68％40％58％52％平均值 66.5％ 64％31.5％ 62.5％ 53.5％表3.單抗R813、Y262及其“雞尾酒”(DiMab)對血小板聚集的影響第一次試驗試驗次數 對照 單抗PBS Dimab R813 Y262濃度(ug/m l) 0 10 10 10血小板聚集百分率(％)1 73％0％42％ 62％2 77％0％51％ 54％平均值75％0％46.5％ 58％
第二次試驗試驗次數 對照單抗PBS Dimab濃度(ug/ml) 0 0.625 1.25 2.505.0 10.0血小板聚集百分率(％)1 62％ 67％55％ 61％30％4％2 74％ 70％63％ 61％17％5％3 67％ 88％66％ 58％25％7％平均值67.7％75％61.3％60％24％5.3％第三次試驗試驗次數 對照 單抗PBS Dimab 7E3濃度(ug/ml) 0 1.25 2.505.0 10.0 1.252.50 5.0 10.0血小板聚集百分率(％)1 44％30％ 19％14％0％54％35％ 23％5％2 49％38％ 38％8％ 0％53％31％ 28％6％平均值 46.5％ 34％ 28.5％ 11％0％5 3.5％ 33％2 5.5％ 5.5％
表4.單抗“雞尾酒”(DiMab)與7E3的50％血小板聚集抑制率用量DiMab 7E3ug/ml3.135.26實施例6抗體R813與Y262 F(ab′)2片段制備與鑒定6.1材料木瓜酶為上海麗珠東風生物公司產品，DEAE-52凝膠購自中科院上海生化所西巴斯公司，DTT為Fluka公司產品，其余試劑均為國產分析純試劑。
6.2方法(1)R813和Y262F(ab′)2片段的制備和鑒定R813與木瓜酶質量比5∶1混勻4℃作用24h，碘乙酰胺(終濃度80mmol/L)終止反應，0.01mol/LTris-HCl pH 8.0透析后，上DEAE-52離子交換柱，0～0.3mol/L NaCl0.01mol/L Tris-HCl pH 8.0洗脫，收集第一峰。Y262與木瓜酶質量比為80∶1混勻4℃作用35分鐘，再加入木瓜酶與Y262質量比為1∶160，混勻4℃作用35分鐘，接下同R813終止反應并純化，不同的是收集第2個洗脫峰。將收集物作還原及非還原10％SDS-PAGE。結果表明，經木瓜酶消化后并純化得到兩種抗體之F(ab′)2片段。(見圖7)(2)R813和Y262 F(ab′)2片段抑制ADP誘導的血小板聚集試驗方法同前，結果表明R813和Y262 F(ab′)2片段仍可以協同作用，完全抑制血小板聚集功能。(見表5)
表5.抗體F(ab’)2片段對血小板聚集功能抑制作用1.252.505.0010.00 ug/ml血小板聚集抑制率(％)R813 16.211.876.582.4Y262 35.142.961.055.8DiMab 17.517.581.3100雖然上面結合實施例對本發明進行了具體描述，但是本領域熟練技術人員均了解，在不背離本發明的原則和精神的情況下，根據本說明書及所附權利要求書中公開的內容，可對本發明做出各種變動和改進。因此，所有這些變動和改進均應包括在所附權利要求書中所要求的保護范圍之內。
權利要求
1.一種抗血小板受體GP IIIa的單克隆抗體，它是由雜交瘤細胞系R813、Y88、Y128和Y474產生的。
2.一種抗血小板受體GPIIb-IIIa復合物的單克隆抗體，它是由雜交瘤細胞系Y8、Y262、Y291、Y295、Y321、Y458、Y585和Y700產生的。
3.根據權利要求1或2所述的單克隆抗體，它包括所述單克隆抗體的IgG片段Fab、F(ab’)2，單鏈抗體，嵌合抗體，人源化抗體或基因工程抗體。
4.產生特異性抗血小板受體單克隆抗體的雜交瘤細胞系，它選自Y262，Y321，Y474和R813。
5.權利要求4所述的雜交瘤細胞系，它是R813，CGMCC No.0740。
6.權利要求4所述的雜交瘤細胞系，它是Y262，CGMCC No.0741。
7.一種有效抑制抗血小板聚集的藥物組合物，其特征在于它含有以下兩組單克隆抗體中的一種或多種(1)抗血小板受體GP IIIa的單克隆抗體，和/或(2)抗血小板受體GPIIb-IIIa復合物的單克隆抗體。以及可作藥用的載體或賦形劑。
8.權利要求7所述的藥物組合物，其中抗血小板受體GP IIIa的單克隆抗體選自R813、Y88、Y128和Y474。
9.權利要求7所述的藥物組合物，其中抗血小板受體GPIIb-IIIa復合物的單克隆抗體選自Y8、Y262、Y291、Y295、Y321、Y458、Y585和Y700。
10.權利要求7所述的藥物組合物，其特征在于它含有單克隆抗體R813和Y262。
11.權利要求10所述的藥物組合物，其中單克隆抗體R813和Y262的比例為1∶1。
12.權利要求1至3中任一項所述的單克隆抗體的制備方法，它包括以下步驟(1)利用人血小板免疫Balb/c小鼠，制備產生抗血小板的抗體的雜交瘤細胞系；(2)培養獲得的雜交瘤細胞系以產生單克隆抗體；(3)純化獲得的單克隆抗體并鑒定其抗原決定簇，并任選地(4)用木瓜蛋白酶消化并純化，獲得該單克隆抗體的片段。
全文摘要
本發明涉及由分別作用于血小板GPIIb－IIIa不同位點的抗體組合而成的雙抗體。本發明的雙抗體能夠完全封閉GPIIb－IIIa的受體活性，完全抑制血小板的聚集活性，從而抑制血小板血栓的形成。因此，本發明的雙抗體作為一種新的血小板受體GPIIb－IIIa阻斷劑，具有常規抗血小板藥物不可比擬的優點和潛在應用價值。
文檔編號C07K16/18GK1495199SQ0212522
公開日2004年5月12日 申請日期2002年7月17日 優先權日2002年7月17日
發明者阮長耿, 葉慶煒 申請人:阮長耿, 葉慶煒