專利名稱：重組人骨形態發生蛋白-2微量免疫法的建立及抗體的制備的制作方法
技術領域：
本發明涉及免疫學技術領域，尤其是涉及到一種重組人骨形態發生蛋白-2微量免疫法的建立及抗體的制備
2.建立免疫方案并免疫動物首先對實驗家兔進行四次單一免疫，每次都是將rhBMP2-BSA與弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，注入兔的四足掌、背部皮下6點及大腿。從1到4次每只家兔獲得rhBMP2依次為0.223mg----0.198mg。每次免疫持續時間21天。
然后再對實驗家兔進行兩次分組對比免疫第1組，將rhBMP2-BSA與弗氏不完全佐劑混合制成乳化劑，注入1號家兔的頸部部背部皮下共8點及大腿。家兔均獲得rhBMP2為0.198mg。每次免疫持續時間21天。
第2組，將rhBMP2-BSA與生理鹽水混合制成水劑，注入2號家兔的頸部背部皮下共8點及大腿。家兔均獲得rhBMP2為0.198mg。每次免疫持續時間7天。
3.抗血清效價的測定自初次免疫后第9周起，每周測定抗血清效價，直至處死動物測最后的效價。方法則采用間接ELISA法。
4.rhBMP2抗體的制備首先用免疫吸收法沉淀載體BSA抗體，每毫升血清加入BSA 5mg，混均后放4℃過夜。次日離心，可見有少量白色沉淀，棄去。將抗血清用50％的飽和硫酸鹽析沉淀IgG，放4℃過夜，離心棄上清，用pH7.2，0.01M的PBS溶解。再用33％的飽和硫酸鹽析沉淀IgG，放4℃60分鐘，離心棄上清，用pH7.2，0.01M的PBS溶解，重復3次。離心棄上清，對pH7.2，0.01M的PBS透析過夜。離心棄沉淀，上清即為rhBMP2抗體。
本發明的微量免疫法是針對常規免疫法而言的，對小分子抗原，常規的免疫方法是注射一次卡介苗進行基礎免疫，10天后注射一次弗氏完全佐劑、28天后注射一次弗氏不完全佐劑，之后再用5-9次水劑，免疫時間12--17周(取血時間依抗體效價上升情況而定)。一般抗血清效價效價在1∶1-2.5萬左右。純抗原用量為15mg/只兔。本發明給兩組兔分別注射一次弗氏完全佐劑、五次弗氏不完全佐劑和注射一次弗氏完全佐劑、三次弗氏不完全佐劑，延長了每次免疫的間隔時間，免疫時間為14周。抗血清效價可高達1∶6萬；純抗原用量為1.213mg/只兔。本微量免疫法不但獲得了高效價、特異的的抗體并且比常規免疫方案節省抗原12.37倍。微量免疫法的設建立及rhBMP2特異抗體的制備對于骨科的基礎及臨床研究有廣泛的應用價值。臨床及科研機構可應用此抗體作為基礎試劑，進一步研制各類標記抗體，開發ELISA及免疫組化試劑盒。還可以應用此抗體對骨科、口腔科的各類相關疾病進行基礎研究。
3.制備酶標羊抗兔1gG，采用常規改良過碘酸鈉法。二.免疫用家兔1.青紫蘭純系灰兔，雄性2只，體重兩公斤以下。三.實施步驟1.rhBMP2-BSA復合物的制備(采用戊二醛法)將高純度的rhBMP2與載體蛋白BSA(牛血清白蛋白)通過雙功能試劑(戊二醛)交聯，連接成rhBMP2-BSA復合物。方法稱rhBMP25mg，BSA 8.5mg，用6M的鹽酸胍將rhBMP2溶解，再加入pH7.2，0.01M的PBS至6ml，將BSA加入上述抗原液中，攪拌狀態下緩慢加入0.2％的戊二醛1.5ml，冰浴60分鐘， 再緩慢加入1.9ml 1M的甘氨酸冰浴60分鐘，放入pH7.2，0.01M PBS透析過夜，得到rhBMP2-BSA復合物。
2.免疫方案的設計并免疫動物初次免疫將rhBMP2-BSA與弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，注入家兔的四足掌、背部皮下6點及大腿。每只家兔獲得rhBMP20.223mg。免疫持續時間28天。第二次免疫將rhBMP2-BSA與弗氏不完全佐劑混合制成乳化劑，分別注入兩只家兔的四足掌、背部皮下6點及大腿。每只家兔獲得rhBMP20.199mg。免疫持續時間21天。第三次免疫將rhBMP2-BSA與弗氏不完全佐劑混合制成乳化劑，分別注入兩只家兔的四足掌、背部皮下6點及大腿。每只家兔獲得rhBMP20.198mg。免疫持續時間21天。第四次免疫將rhBMP2-BSA與弗氏不完全佐劑混合制成乳化劑，分別注入兩只家兔的頸部背部皮下共8點及大腿。每只家兔獲得rhBMP20.198mg。免疫持續時間21天。
第5次免疫分為兩種方案，進行對比研究①將rhBMP2-BSA與弗氏不完全佐劑混合制成乳化劑，注入1號家兔的頸部背部皮下共8點及大腿。家兔獲得rhBMP20.198mg。免疫持續時間21天。
②將rhBMP2-BSA與生理鹽水混合制成水劑，注入2號家兔的頸部背部皮下共8點及大腿。家兔獲得rhBMP20.198mg。免疫持續時間7天第6次免疫分為兩種方案，進行對比研究③將rhBMP2-BSA與弗氏不完全佐劑混合制成乳化劑，注入1號家兔的頸部背部皮下共8點及大腿。家兔獲得rhBMP20.198mg。免疫持續時間19天。
④將rhBMP2-BSA與生理鹽水混合制成水劑，注入號家兔的頸部背部皮下共8點及大腿。家兔獲得rhBMP20.198mg。免疫持續時間7天。
頸動脈取血處死動物，無菌分離抗血清，分裝后放-20℃保存待用。
3.抗血清效價的測定自初次免疫后第9周起，每周測定抗血清效價，至處死動物測最后效價。1號兔共測定效價10次；2號兔共測定效價6次。方法采用間接ELISA法詳見附
圖1。
4.rhBMP2抗體的制備首先用免疫吸收法沉淀載體BSA抗體，每毫升血清加入BSA 5mg，混均后放4℃過夜。次日離心，可見有少量白色沉淀，棄去。將抗血清用50％的飽和硫酸鹽析沉淀IgG，放4℃過夜，離心棄上清，用pH7.2，0.01M的PBS溶解。再用33％的飽和硫酸鹽析沉淀IgG，放4℃60分鐘，離心棄上清，用pH7.2，0.01M的PBS溶解，重復3次。離心棄上清，對pH7.2，0.01M的PBS透析過夜。離心棄沉淀，上清即為rhBMP2抗體。經免疫活性測定、純度測定，符合抗體質量標準。
圖2清楚的說明了本發明效價測定結果。而表1是兩種微量免疫法與常規免疫效果的比較.數據。
由于本發明給1號兔注射一次弗氏完全佐劑、五次弗氏不完全佐劑，延長了每次免疫的間隔時間，從效價測定結果看(圖1)，抗血清效價從14周起明顯上升達4萬，16周達最高點4.5萬，之后至18周降至2萬。本發明給2號兔注射一次弗氏完全佐劑、三次弗氏不完全佐劑，自13周再用2次水劑增強，抗血清效價可高達6萬；免疫時間為14周。這兩種方案均比常規免疫方案節省抗原12.37倍(用量為1.213mg/只兔)、獲得的抗血清效價高(4萬以上)。對本研究設計的兩種方案比較發現2號兔的方案優于1號兔，特點為經水劑及時刺激后抗體效價上升快、免疫時間短。表1.半抗原不同免疫方案效果的比較(rhBMP2)基礎免疫 弗氏完全 弗氏不完水劑 免疫時間 抗血清 半抗原量(次) 佐劑(次) 全佐劑(次) (次) (周) 最高效價(mg/只兔)1號兔方案 0 1 5 0 181∶4.5萬1.212號兔方案 0 1 2 2 141∶6萬 1.21常規免疫1 1 1 5-9 12-17 1∶1-2.5萬 10-15表1為本發明的兩種微量免疫法與常規免疫方案效果的比較，從表格中可見2號兔的免疫方案為最佳。
權利要求
1.一種重組人骨形態發生蛋白-2微量免疫法的建立及抗體的制備，其特征在于建立兩種微量免疫方法免疫家兔，進行rhBMP2抗原不同免疫方式(弗氏不完全佐劑及水劑的給藥次數不同)的抗原劑量與抗血清效價間的比較研究，獲得高效價的抗體，再采用鹽析、離子交換劑及去載體蛋白等步驟將rhBMP2抗血清制備成rhBMP2IgG抗體。包括以下步驟；(1)rhBMP2-BSA復合物的制備(采用戊二醛法)將高純度的rhBMP2與載體蛋白BSA(牛血清白蛋白)通過雙功能試劑(戊二醛)交聯，連接成rhBMP2-BSA復合物。方法稱rhBMP25mg，BSA 8.5mg，用6M的鹽酸胍將rhBMP2溶解，再加入pH7.2，0.01M的PBS至6ml，將BSA加入上述抗原液中，攪拌狀態下緩慢加入0.2％的戊二醛1.5ml，冰浴60分鐘，再緩慢加入1.9ml 1M的甘氨酸冰浴60分鐘，放入pH7.2，0.01M PBS透析過夜，得到rhBMP2-BSA復合物。(2)建立免疫方案并免疫動物首先對實驗家兔進行四次單一免疫，每次都是將rhBMP2-BSA與弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，注入兔的四足掌、背部皮下6點及大腿。從1到4次每只家兔獲得rhBMP2依次為0.223mg----0.198mg。每次免疫持續時間21天。然后再對實驗家兔進行兩次分組對比免疫第1組，將rhBMP2-BSA與弗氏不完全佐劑混合制成乳化劑，注入1號家兔的頸部背部皮下共8點及大腿。家兔均獲得rhBMP2為0.198mg。每次免疫持續時間21天。第2組，將rhBMP2-BSA與生理鹽水混合制成水劑，注入2號家兔的頸部背部皮下共8點及大腿。家兔均獲得rhBMP2為0.198mg。每次免疫持續時間7天。(3)抗血清效價的測定自初次免疫后第9周起，每周測定抗血清效價，直至處死動物測最后的效價。方法則采用間接ELISA法。(4)rhBMP2抗體的制備首先用免疫吸收法沉淀載體BSA抗體，每毫升血清加入BSA 5mg，混均后放4℃過夜。次日離心，可見有少量白色沉淀，棄去。將抗血清用50％的飽和硫酸鹽析沉淀IgG，放4℃過夜，離心棄上清(rhBMP2抗體)，用pH7.2，0.01M的PBS溶解。再用33％的飽和硫酸鹽析沉淀IgG，放4℃ 60分鐘，離心棄上清，用pH7.2，0.01M的PBS溶解，重復3次。離心棄上清，對pH7.2，0.01M的PBS透析過夜。離心棄沉淀。
全文摘要
本發明公開了一種重組人骨形態發生蛋白－2微量免疫法的建立及抗體的制備，通過建立兩種微量免疫方法免疫家兔，進行rhBMP
文檔編號C07K16/18GK1465596SQ02120969
公開日2004年1月7日 申請日期2002年6月6日 優先權日2002年6月6日
發明者趙丹慧, 張艷, 李成文, 袁越 申請人:北京市創傷骨科研究所