專利名稱：控制擬南芥葉綠素合成相關的突變致死基因的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物基因工程技術領域，具體涉及一種控制擬南芥葉綠素合成相關的突變致死基因。
細胞死亡依據其是否由生物體內的遺傳機制所控制分為生理性死亡和非生理性死亡。非生理性死亡是生物在生長發育過程中由于意外的外界因素，或者由于生物體內的缺陷如產生ATP酶突變，或者突變后的基因產物對細胞具有毒害作用等原因引起的細胞死亡(Vaux and Korsmeyer，1999)。我們所獲得的AT4g14220基因突變引起的致死效應，是由葉綠素的合成失敗，無法進行光合作用，致使細胞缺乏代謝所需的能量而死。AT4g14220基因可能是一個轉錄因子，它所含的典型RING-H2鋅指結構在擬南芥基因組其他一些蛋白質基因中也存在，RING-H2鋅指蛋白多為DNA結合蛋白，N端富含脂肪族氨基酸，多具有跨膜結構域，C端有鋅指結構(Jensen RB et al.，FEBS Lett 1998 Oct 2)。
葉綠素生物合成代謝研究已取得了很大進展，除了葉綠素b的合成尚有異議外，對于葉綠素合成的前體的合成途徑和一些重要的中間代謝過程都得到了深入研究，許多與此過程相關的基因都已得到克隆(陳文俊等，2001年8月，植物生理學通報)。但是對于葉綠素合成啟動的核基因調控的研究仍處于開始階段，缺乏深入的研究。在水稻的斑馬葉溫敏突變體中，性狀表達期的葉綠素、蛋白質含量明顯減少，過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性降低，過氧化物酶活性上升(何瑞鋒、丁毅等，2000年2月)。因此，葉綠素的合成與植物本身的發育時期和生理代謝水平都有很大的關系，它是發育過程中基因表達和調控與環境相互作用的結果。研究這類基因，了解其作用機理，對提高光合效率和作物產量具有重要意義。
本發明的技術方案如下利用農桿菌介導的轉化來實現T-DNA在野生型擬南芥基因中隨機插入誘變，獲得大量含有T-DNA插入的擬南芥轉化體，經過TAIL-PCR(ThermalAsymmetric Interlaced PCR，Yaoguang Liu et al，1998，Plant MolecularBiology Reporter 16175-181，熱不對稱交錯多聚酶鏈式反應)技術擴增并測定標簽插入位點的兩端序列，用Blast2.0軟件將測定序列和擬南芥的全基因組序列比較，找出突變位點，種植突變體，觀察分析其表型。在所獲得的因葉綠素合成終止而致死的突變體中，T-DNA插入位點被定位在擬南芥基因組第四染色體第7161592堿基處，正好插入基因AT4g14220(GenBank Number)的第五外顯子中，該基因編碼一個含有鋅指結構的蛋白。其純合體表型為新生子葉呈淡紫色半透明，2-3天后子葉變白色，在土壤中不能繼續生長而死亡。這表明基因AT4g14220與擬南芥葉綠素合成有關。將該基因在轉基因植物中過量表達，可以增加植物的葉綠素的含量，從而提高植物的光合效率和經濟產量，由此，我們得到控制植物的葉綠素合成及光合作用的方法，即將AT4g14220基因在轉基因植物中過量表達。
AT4g14220基因序列AT4g14220基因位于第四染色體第93452-95594堿基對，全長2143bp，共有7個外顯子(1..180，489..535，645..707，808..919，998..1287，1626..1733，1813..2143)，6個內含子。涉及27種限制性內切酶位點，其中單一位點18酶種，為AccIII，BsamI，CfoI，ClaI，DraI，EcoRI，EcoRV，FokI，HaeIII，HhaI，HindIII，NdeI，NsiI，PvuII，SphI，VspI，XbaI，XhoI.，兩位點酶3種，BamHI，HpaII，PstI，還有6種多位點酶，AlwI，RsaI，TaqI，MboI，Sau3A，AluI。AT4g14220基因序列見序列表1(SEQ ID No.1)；基因AT4g14220去除內含子的全長cDNA序列為1278bp，序列見序列表2(SEQ ID No.2)；基因AT4g14220編碼的蛋白質序列為376Aa，序列見序列表3(SEQ ID No.3)。
一、突變體的獲得1.材料擬南芥(Arabidopsis thaliana)的野生型Columbia；農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101；大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α；T-DNA載體pSKI015。
2.突變體制備和篩選用含Ti質粒的農桿菌侵染野生型擬南芥，利用T-DNA上的篩選標記篩選轉化植株，擴增篩選標記基因獲得分子生物學的實驗依據確定轉化體。
實驗方法(1)擬南芥種植擬南芥種子經過滅菌洗滌，均勻地點到滅菌的培養基上，在4℃冰箱同步化處理3天，經過春化作用，再放入溫室生長。種子萌發出苗后，轉移到小花盆中，繼續在溫室中生長。溫室的溫度一般控制在19～24℃，濕度控制在50～60％，以一定的光強照射15小時，并有8小時的暗期，如此周期循環。
(2)浸染用T-DNA區含bar基因的Ti質粒pSKI015轉化農桿菌，篩選并培養轉化子，制備對數生長期的菌液。剪去擬南芥的頂芽，促進側芽生長，在側芽長到10-20cm高，未開花的花蕾最多時準備侵染。將擬南芥植株倒置，于菌液中浸泡15min，取出植株，避光過夜，繼續培養至種子成熟。
(3)篩選bar基因產物有PPT抗性，用含有PPT的培養基培育轉化植株的種子進行初篩，條件為在4℃冰箱同步化處理3天后，再放入溫室生長。種子萌發出苗后，轉移到小花盆中，繼續在溫室中生長。當擬南芥生長到10-20cm時，剪取約1-1.5g的葉片，用CTAB法提取總DNA。以總DNA為模板，根據bar基因的序列設計引物進行PCR擴增。凡有大小約為700bp的DNA擴增片段，均為轉化成功的轉化體。
二、插入位點的確定以及DNA序列分析采用TAIL-PCR技術擴增T-DNA插入位點的側翼序列。TAIL-PCR是利用三條嵌套式巢式特異性引物和一隨機任意簡并性引物，用溫度循環控制特異性產物和非特異性產物的相對擴增效率。通過兩個高嚴謹度循環和一個低嚴謹度循環的交替進行，目的序列特異性地以幾何級數擴增，數量大大超過非特異性產物，從而獲得目的產物。Sanger雙脫氧法在ABI PRISM 377測序儀上測序，并用Blast2.0軟件將所測定的序列和擬南芥的全基因組序列比較，確定插入位點。
實驗方法1.引物設計利用T-DNA左邊界附近一段序列設計三條巢式特異引物，為DL15’-GACAACATGTCGAGGCTCAGCAGGA-3’，DL25’-TGGACGTGAATGTAGACACGTCGA-3’，DL35’-GCTTTCGCCTATAAATACGACGG-3’；并設計序列較短的非特異引物，為AD25’-NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA-3’。
2.TAIL-PCR以擬南芥總DNA為模板，進行三輪TAIL-PCR，每輪反應分別用DL1、DL2和DL3加AD2進行。每一輪反應使用的特異引物比前一輪更靠近T-DNA左邊界。第一輪反應先進行5個高嚴謹性循環使特異引物結合擴增產生模板，降低退火溫度使隨機引物結合，然后交替進行高嚴謹性循環和低嚴謹性循環，使目的序列得以擴增。第二輪反應用高嚴謹性循環和低嚴謹性循環交替進行，一端結合特異引物而另一端結合隨機引物的目的序列得到選擇性的幾何級數擴增。第三輪反應用DL3進一步擴增目的序列，進行20個左右的常規循環。每一輪反應后將產物稀釋以降低非目的序列的干擾。
(1)測序第三輪反應產物直接或經過回收用于測序反應。
(2)序列分析并與數據庫比對通過NCBI網站用Blast2.0軟件在GenBank國際基因數據庫中進行序列分析，確定插入位點，并進行同源性分析。
三、表型分析純合突變體中突變基因的表型種植突變體，同時種植野生型擬南芥為對照。純合型突變體表型為純合型突變體種子可以萌發，子葉呈紫色半透明，萌發后2-3天白化死亡。如附
圖1所示，圖1為擬南芥突變體植株和野生擬南芥在苗期形態對比照片，圖中左側兩個植株為突變體植株在苗期的形態，右側兩個植株為野生擬南芥在苗期的形態。由圖中可以看出，突變體植株在苗期，表現出明顯的白化并沉積花青素。證明該基因是控制擬南芥葉綠素合成相關的突變致死基因。
受基因AT4g14220的功能啟示，我們得到一種控制植株莖粗的方法，包括將AT4g14220基因在轉基因植物中過量表達。
本發明利用T-DNA插入突變獲得擬南芥基因突變體庫，采用TAIL-PCR擴增并測定插入標簽側翼序列，通過序列分析以及與擬南芥全基因組序列比對確定插入位點。由此獲得AT4g14220基因的插入突變體，對突變體表型的觀察分析表明，AT4g14220基因對葉綠素的合成有重要的調控作用，該敲除基因的純合突變體有致死效應。在國際基因序列數據庫GenBank中進行基因同源性分析發現，該基因編碼的蛋白質產物為RING-H2 finger protein鋅指蛋白RHF1a，可能是一個轉錄因子。含鋅指結構的轉錄因子在真核生物中廣泛存在。對該基因的進一步研究表明該基因對葉綠素的合成具有關鍵作用。這對于探索核基因和葉綠體基因的作用模式，探究植物葉綠素合成的啟動和調控有重要意義。
序列表1(SEQ ID No.1)1 ATGTCTAATT TCACTTATAC ATCTGCTTTC AACTTATCCG ACAACTCCCC TTTTAATCCC61 GCCATTGGTT CTTCGTCTTC TTCTTCCTCC GCGCTCGTCG TAGCTTCCGA TGATGATAAT121 AATACCGATG ATGCTTGTAG CATCTGTCTC GAGCCTTTCA CCCTCCAGGA TCCTTCCACT181 GTCAGATTCT TTTAATCCTC TCTCTTTTTG TTTTTGTCTA TAAGCTCTTC GGGGTTTAAC241 GATCTCCTTC TCGCTTTTAT TTCGCTTTTA CTTGAAATCT GGGATAATCG GATTTTGTGC301 CTTGCGATAT TTTGACTCAG ATTAATAACG AGATCGTTTG ATTAACTCGA TCACTTGTTC361 TTGAACCATC GTTGAACATG TTTGATTGAT CCTCTCGCTT TCTCATTTTG GTCCTATTGG421 ATCTAACATA AACATCTTCT ATTGTTGTTT CTTCTCCGAT ATCTAAAGCT TTCCGATGGT481 TTTCTCAGGT CACCAGCTGC AAACATGAAT ATCACCTTCA GTGCATCATT GAATGGTACT541 TGCAAACATG AATCTGTGAT CTTTTTTATC TTTCTTTGGA CTTGAATCTT CTCTTCATAT601 CTCTATCACT GATTGATTTG TCATTGGGGT TTATTATTAC ACAGGTCACA GAGAAGCAAA661 GAGTGTCCTA TTTGCTGGCA ATTGTTTGTT TTGAGAGACC CTGCTAGGTA CTCTCATCCA721 TCTTTAAGGA GAAAGAAAGA TTTTGTTCTC ATGATACTTT GCTCATAGTT AGGTCTTGAT781 AGTATTATTG GTTCCTTTGT TTTGTAGCCA AGAGCTTTTA GCTGCTGTGG AAAAGGAAAG841 ACTTTTGAAA ACCAGGAATA TATCTTCATC CTCTCCAATC TCTATTCATC ACTCTCATGA901 CGATTTTCAC TCTGAGGAGG TTCGACAAAG TCTCCAGTGT GATTTATTAA AATTTAGGAG961 TTTTAAGTTA TAGTAGTTGA CTTGATAATG TTTCCAGGAG GAATCACAGT TTAGCAGCTT1021 TGATGAACAA TTCTTGAGGC ATCTTACTGA AGCTGCACAT AGACGTTGTT TGCTTCGCAG1081 AAGGGATGGT CAAATATCCT CTAGTCTTGT TTCGTCCAGC GATCCCACTA CGATTCATCC1141 TACTGATTTG GTCAATCTTT ATCGTCTCTC TGCTATTTCC CATGTTGAAC ATCAAAACTC1201 AAACCCTTGT CCAAGTCCTG GCTCAATGAC TCCATCTCCC GTCTCTGGTC ATTCTTCCAT1261 TCCTGCAGAT AGCAATAACG GATCCAGGTA TTGACATACA CATAATCAAG TCTGGTTTAT1321 TGATAACGAG CTTTCATGAT TTATTCGCTT TCCATTTGCT TGTGCTGTCT CTATAACCAG1381 CTTTCATGAT TTGTATGGTT TCCATTTGCT TGAGCTGCAC AATGCAGATG CTCTTATACT1441 TCCTGTTTCG CTTAGTTACT GGGATTATCG TCTACTGATA AATAATTTAG ATGGCTCTGG1501 AATTCTAGAC CATGTCTCTT TATTATGCAG CTACTTCTTG GAGAATTGGT CAAGCCTTTA1561 AATTGTTTAG AACTTACCTA AACCATATGT AATATATCTT CATCTTTTCT TGTATCTGTC1621 ATCAGAATCT CTCCTGGCCC TTCTCCATCT CGTTCATCTC AAAGTCCAAA ATCACCTGAA1681 GCATCCTCGC TTCCGGAAGC CATTAAATCG AAACTAGCTG CTGCTTCTGC AAAGTATGGC1741 TATCTCAATT CCTCTTCATT TGTTCAGAAA TTGGTTATAA AAACTGACTG GGACATACAT1801 GCATGCCTCC AGGTACAAGG AATCGATCTC TAAAAGTAAA CAAGGTCTTA AAGAGAAGCT1861 ACTTGCTCGC AATAACTCAG TGAAAGAATT GAGCAAAGGA GTGCAACGTG AGATGAATGC1921 AGGAATAGCT GGTGTTGCAC GAATGATCGA ACGCATGGAT TTTTCTTCAA AACGTTTTGG1981 AGGGTCTGCT CATGTATCAA CCTCCACTGC TACTGCTTCT GGATTCAATT TCTCATTCAA2041 AGGGAAACGT GTAGAAGCCA ATTCTAAGTC TAACAACAAT GGAGACAAAA CCGAACCCCA2101 AAAGCTGCAG GTTTCAGACT TCTCCCGGTT TCTTGTCTTC TAA//序列表2(SEQ ID No.2)1 CGATGATGCT TGTAGCATCT GTCTCGAGCC TTTCACCCTC CAGGATCCTT CCACTGTCAC61 CAGCTGCAAA CATGAATATC ACCTTCAGTG CATCATTGAA TGGTCACAGA GAAGCAAAGA121 GTGTCCTATT TGCTGGCAAT TGTTTGTTTT GAGAGACCCT GCTAGCCAAG AGCTTTTAGC181 TGCTGTGGAA AAGGAAAGAC TTTTGAAAAC CAGGAATATA TCTTCATCCT CTCCAATCTC241 TATTCATCAC TCTCATGACG ATTTTCACTC TGAGGAGGAG GAATCACAGT TTAGCAGCTT301 TGATGAACAA TTCTTGAGGC ATCTTACTGA AGCTGCACAT AGACGTTGTT TGCTTCGCAG361 AAGGGATGGT CAAATATCCT CTAGTCTTGT TTCGTCCAGC GATCCCACTA CGATTCATCC421 TACTGATTTG GTCAATCTTT ATCGTCTCTC TGCTATTTCC CATGTTGAAC ATCAAAACTC481 AAACCCTTGT CCAAGTCCTG GCTCAATGAC TCCATCTCCC GTCTCTGGTC ATTCTTCCAT541 TCCTGCAGAT AGCAATAACG GATCCAGAAT CTCTCCTGGC CCTTCTCCAT CTCGTTCATC601 TCAAAGTCCA AAATCACCTG AAGCATCCTC GCTTCCGGAA GCCATTAAAT CGAAACTAGC661 TGCTGCTTCT GCAAAGTACA AGGAATCGAT CTCTAAAAGT AAACAAGGTC TTAAAGAGAA721 GCTACTTGCT CGCAATAACT CAGTGAAAGA ATTGAGCAAA GGAGTGCAAC GTGAGATGAA781 TGCAGGAATA GCTGGTGTTG CACGAATGAT CGAACGCATG GATTTTTCTT CAAAACGTTT841 TGGAGGGTCT GCTCATGTAT CAACCTCCAC TGCTACTGCT TCTGGATTCA ATTTCTCATT901 CAAAGGGAAA CGTGTAGAAG CCAATTCTAA GTCTAACAAC AATGGAGACA AAACCGAACC961 CCAAAAGCTG CAGGGAGGAG AAACGTGCTG AGGCAATCAG AAAAATGGAG AGAGGCCTTT1021 AATGCAAGCG ATGTACGTTT CCATTGAATC AACTTACCCG TTGGTCTTCG CATCCTGCAT1081 TGTTCAGAGC TCACGGTCTC GTCTCTCGTC TCTCTGTTAC CTTTGCGATG CGTACTTTTA1141 GATGGCTAAA ATAAGCAACT GAGTAATAAT TTTATTACTC GATTTTGACG GAGCCAAAAC1201 TATAATATTT ATTAATTTCA AAGGATAATG TTTTATGTTT TTTCACTAAA AAAAAAAAAA1261 AAAAAAAAAA AAAAAAAA//序列表3(SEQ ID No.3)MSNFTYTSAFNLSDNSPFNPAIGSSSSSSSALVVASDDDNNTDDACSICLEPFTLQDPSTVTSCKHEYHLQCIIEWSQRSKECPICWQLFVLRDPASQELLAAVEKERLLKTRNISSSSPISIHHSHDDFHSEEEESQFSSFDEQFLRHLTEAAHRRCLLRRRDGQISSSLVSSSDPTTIHPTDLVNLYRLSAISHVEHQNSNPCPSPGSMTPSPVSGHSSIPADSNNGSRISPGPSPSRSSQSPKSPEASSLPEAIKSKLAAASAKYKESISKSKQGLKEKLLARNNSVKELSKGVQREMNAGIAGVARMIERMDFSSKRFGGSAHVSTSTATASGFNFSFKGKRVEANSKSNNNGDKTEPQKLQVSDFSRFLVF
權利要求
1.一種多核苷酸，具有如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
2.一種蛋白質，具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。
3.如權利要求1所示的多核苷酸，其為控制擬南芥葉綠素合成相關的突變致死基因。
4.一種控制植物的葉綠素合成及光合作用的方法，包括將權利要求1所述的多核苷酸在轉基因植物中過量表達。
全文摘要
本發明提供了一種控制擬南芥葉綠素合成相關的突變致死基因AT4g14220基因的cDNA序列;AT4g14220基因編碼的蛋白質序列;以及控制植物的葉綠素合成及光合作用的方法,是將AT4g14220基因在轉基因植物中過量表達,可以增加植物的葉綠素的含量,從而提高植物的光合效率和經濟產量。
文檔編號C07H21/00GK1379039SQ02100158
公開日2002年11月13日 申請日期2002年1月16日 優先權日2002年1月16日
發明者瞿禮嘉, 康定明, 秦跟基, 董一宇, 申云平, 鄧興旺, 顧紅雅, 陳章良 申請人:北京大學