專利名稱：制備用于硫代磷酸酯殺蟲劑免疫分析的半抗原的方法
背景技術：
發明領域本發明涉及一種制備用于硫代磷酸酯殺蟲劑免疫分析的半抗原的方法，更具體地，涉及一種通過用酚類化合物與O-甲基(乙基)二氯硫代磷酸酯反應來獲得O-甲基(乙基)O-芳基氯硫代磷酸酯，并將由此獲得的O-甲基(乙基)O-芳基氯硫代磷酸酯與氨基羧酸反應，來制備用于有機磷硫代磷酸酯殺蟲劑免疫分析的半抗原的方法。
現有技術的描述自從20世紀30年代Schrader發現了一種具有殺蟲活性的有機磷化合物以來，在本領域中已經發展了大量具有高度生物學活性的有機磷殺蟲劑，以符合阻止使用有機氯化物殺蟲劑的運動。現在，有機磷殺蟲劑在當前的殺蟲劑中占大多數。此外，值得注意的是其中大約100,000種已被鑒定具有殺蟲活性，且它們中的超過100種可以市售獲得。
有機磷殺蟲劑被依據其磷原子周圍的化學結構分為磷酸酯，硫代磷酸酯，硫醇磷酸酯，二硫代磷酸酯，膦酸酯，硫代膦酸酯，二硫代膦酸酯，phosphorothiolothinate，以及焦磷酰胺(參見表1)。在它們之中，硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯被認為是農業中最重要的殺蟲劑且已經成為分析殘留殺蟲劑的主要對象。
殘留殺蟲劑的分析主要借助于GC或HPLC來進行，其中兩者都具有固有的缺點即預處理步驟費時，機器和工具昂貴，以及需要專門的技術且對GC而言，不可能來分析熱不穩定的材料以及對HPLC而言，很難用于分析沒有發色團的殺蟲劑。為解決這些問題，人們從20世紀70年代開始進行了許多嘗試來利用免疫分析方法分析殘留殺蟲劑其主要地被用來分析生物組分或臨床診斷。殘留殺蟲劑免疫分析的下述各方面比傳統的方法更為有利高靈敏度；不需要進行預處理樣品；且由于其允許同時迅速分析多重樣品所以成本較低。
免疫分析基于抗體和抗原之間的具有高度親合力的特異性結合。因此，應制備合適的抗原來產生用于分析材料的抗體。然而，低分子量材料，諸如殺蟲劑，不能用作它們自己的抗原且因此，抗體不能被產生。在這種情況下，對應該合成半抗原來制備殺蟲劑-特異性抗原的需求已經增加，其中所述的半抗原具有與殺蟲劑相似的結構且能與蛋白質形成共價鍵的原子基團。同樣，需要合成半抗原來用于制備用于競爭性-免疫分析方法的酶示蹤劑和固定抗原、競爭劑。
表1有機磷殺蟲劑的分類 通常，用于硫代磷酸酯殺蟲劑免疫分析的半抗原具有如下的化學結構
其中，R1是甲基或乙基；R2是芳基；R3是氫或烷基；和，R4是亞烷基。
上述半抗原中，具有其中R3是氫且R4是兩個或五個亞甲基結構的半抗原通過如下步驟的方法合成(i)3-氨丙酸(1)與芐基氯甲酸酯反應來獲得3-(芐氧基羰基氨基)丙酸(2)；(ii)由此獲得的3-(芐氧基羰基氨基)丙酸與叔-丁醇在二環己基碳二亞胺(DCC)存在下反應來獲得叔-丁基3-(芐氧基羰基氨基)丙酸酯(3)；(iii)通過利用催化劑氫化去除由此獲得的叔-丁基3-(芐氧基羰基氨基)丙酸酯(3)的氨基保護基來獲得叔-丁基3-氨基丙酸酯(4)；(iv)由此獲得的叔-丁基3-氨基丙酸酯(4)與O-烷基-二氯硫代磷酸酯(5)反應來獲得叔-丁基3-[氯代(甲氧基)-phosphorthioyl-氨基]-丙酸酯(6)；(v)由此獲得的叔-丁基3-[氯代(甲氧基)-phosphorthioyl-氨基]-丙醇酯與苯酚(7)的鈉鹽反應來獲得O-烷基O-芳基N-[[2-[叔-丁基氧]羰基]乙基]氨基硫代磷酸酯(8)；以及，(vi)用三氟乙酸(TFA)除去O-烷基O-芳基N-[[2-[叔-丁基氧]羰基]乙基]氨基硫代磷酸酯(8)的叔-丁基保護基來獲得O-烷基O-芳基N-(2-羧基乙基)氨基硫代磷酸酯(9)。
已知通過上述方法合成的O-烷基O-芳基N-(2-羧乙基)氨基硫代磷酸酯是一種高度優選用于產生硫代磷酸酯殺蟲劑抗體的半抗原。然而，所述方法暴露了缺點非常復雜，耗時-和浪費成本以及低產率。
在此情況下，人們強烈的需要發展一種以更有效的方式制備用于硫代磷酸酯殺蟲劑免疫分析的半抗原的方法。
發明概述本發明人努力發展了一種有效制備用于硫代磷酸酯殺蟲劑免疫分析的半抗原的方法；并發現具有O-甲基(乙基)O-芳基N-(羧基烷基)phophoramidothioate或O-甲基(乙基)O-芳基N-烷基N-(羧基烷基)硫代氨基磷酸酯結構的半抗原可通過包括下述步驟的方法來制備用酚類化合物與O-甲基(乙基)氯硫代磷酸酯反應來獲得O-甲基(乙基)O-芳基氯硫代磷酸酯；以及，將獲得的O-甲基(乙基)O-芳基氯硫代磷酸酯與羧基不被保護的氨基羧酸反應。
因此，本發明的主要目的是提供一種制備用于有機磷硫代磷酸酯殺蟲劑免疫分析的半抗原的方法。
發明詳述一種制備用于有機磷硫代磷酸酯殺蟲劑的免疫分析的半抗原的方法，包括步驟(i)4℃下用化合物(10)與酚類化合物(11)以及K2CO3在乙腈中反應30到90分鐘來獲得化合物(12)；以及，(ii)4℃下將化合物(12)與化合物(13)以及KOH在甲醇中反應3至5分鐘來獲得化合物(14)。所述硫代磷酸酯殺蟲劑包含penthion，penitrothion，對硫磷，甲基對硫磷，bromofos-甲基，bromofos-乙基，chloropyrifos，chloropyrifos-甲基，chloropyrifos-乙基，二嗪農，pyridapenthion，triazofos，isofenfos以及pyrimifos。
其中，R1是甲基或乙基；R2是芳基；R3是氫或烷基；和，R4是亞烷基。
本發明在下文實施例中進行進一步的說明，其不應被理解為對本實施例1用于硫代磷酸酯殺蟲劑免疫分析的半抗原的制備通過O-甲基(乙基)二氯硫代磷酸酯與酚反應獲得的O-甲基(乙基)O-芳基氯硫代磷酸酯與氨基羧酸反應來產生用于硫代磷酸酯殺蟲劑免疫分析的半抗原46.28mmol的O-甲基(乙基)二氯硫代磷酸酯(10)溶于30ml的乙腈中，加入45g的重質K2CO3和溶解在30mL乙腈中的42.07mmol的酚(11)并在室溫下攪拌1小時。然后，反應混合物用cellite過濾，從濾液中蒸發溶劑，且殘余物用于通過苯/己烷(1∶1，v/v)或己烷/丁酸(10∶1，v/v)平衡的硅膠柱層析，來獲得O-甲基(乙基)O-芳基氯代硫酸酯(12)的油狀化合物。
2.1mmol由此獲得的O-甲基(乙基)O-芳基氯代硫酸酯(12)溶于甲醇，加入4℃冰水，并攪拌3到5分鐘徐徐加入溶解在1.7mL甲醇中的5.2mmol(292mg)的KOH和2.6mmol的氨基羧酸(13)。為制備含有甲醇的溶液，在為氨基羧酸為氫氯化物的情況下，KOH加入量差不多是氨基羧酸的3倍。反應溶液被灌注到分液漏斗中并通過加入1N HCl和氯仿獲得提取物，通過MgSO4脫水，蒸發殘余的溶劑，且殘余物被用于通過氯仿∶乙酸乙酯∶乙酸(65∶35∶1，v/v/v)平衡的硅膠柱層析，來獲得用于硫代磷酸酯殺蟲劑免疫分析的化合物(14)。在下面的化學反應式中，R1是甲基或乙基，R2是芳基，R3是氫或烷基，以及R4是亞烷基。
實施例2用于硫代磷酸酯殺蟲劑免疫分析的半抗原的合成通過利用實施例1的方法，合成帶有不同的R1，R2，R3和R4取代基的半抗原來用于硫代磷酸酯殺蟲劑諸如甲基對硫磷，chloropyrifos和isofenfos的免疫分析。用于硫代磷酸酯殺蟲劑免疫分析的半抗原的不同結構顯示在下述表2中，其中Ph和Pyr分別表示苯環和吡啶基。
表2用于硫代磷酸酯殺蟲劑免疫分析的半抗原的不同結構
1H NMR分析顯示合成的半抗原具有與表2中顯示的半抗原結構相同的光譜。在1H NMR光譜中，化學位移的值用ppm標記作為來自四甲基硅烷的位移并且耦合常數的值(J)用Hz和s，d，t，q，qn，sext，sp表示，且和m分別表示單重峰，雙重峰，三重峰，四重峰，五重峰，六重峰，七重峰，和多重峰。
實施例2-1半抗原A的合成通過利用實施例1的方法，合成了半抗原A(R1＝甲基，R2＝芳基，R3＝氫且R4＝-(CH3)CH2-3.00g的(21.6mmol)O-甲基二氯硫代磷酸酯溶于20mL的乙腈中，加入溶解于15mL乙腈中的20g重質K2CO3和3.00g(21.6mmol)4-硝基酚并在室溫下攪拌1小時。然后，反應混合物用cellite過濾，蒸發濾液中的溶劑，且殘留物用于通過苯/己烷(1∶1，v/v)平衡的硅膠柱層析，來獲得O-甲基O-(4-硝基苯基)phorochloridothioate的油狀化合物。化合物的產率為70％且其NMR數據如下1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.28(2H，d，J＝6.1，ar)，7.42(2H，d，J＝7.2，ar)，4.03(3H，d，J＝16.5，CH3OP)由此獲得的500mg(1.87mmol)O-甲基O-(4-硝基苯基)phorochloridothioate溶于3ml的甲醇，傾入4℃冰水，并攪拌3到5分鐘徐徐加入通過在1.7mL甲醇中溶解274mg(4.88mmol)KOH和229mg(2.2mmol)氨基丁酸獲得的含有甲醇的溶液。反應溶液被灌注到分液漏斗中并通過加入1N HCl和氯仿獲得提取物，通過MgSO4脫水，蒸發殘余的溶劑，且殘余物被用于通過氯仿∶乙酸乙酯∶乙酸(65∶35∶1，v/v/v)平衡的硅膠柱層析，來獲得表2中的半抗原A。半抗原A產量為81％且其NMR數據如下1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.24(2H，d，J＝8.9，ar)，7.38(2H，d，J＝8.3，ar)，3.81(3H，d，J＝14.1，CH3OP)，3.47(1H，qn，J＝7.4，NH)，3.17(2H，sext，J＝6.8，NCH2)，2.46(2H，t，J＝7.0，CH2CO2)，1.88(2H，qn，J＝7.0，CH2CH2CH2)實施例2-2半抗原B的合成通過利用實施例1的方法，合成了半抗原B(R1＝甲基，R2＝芳基，R3＝氫且R4＝-(CH2)6-)由此獲得的500mg(1.87mmol)O-甲基O-(4-硝基苯基)phorochloridothioate溶于3ml的甲醇，傾入4℃冰水，并攪拌3到5分鐘徐徐加入通過在1.7mL甲醇中溶解274mg(4.88mmol)KOH和291mg(2.2mmol)的6-氨基己酸獲得的含甲醇溶液。然后，以類似于實施例2-1的方式合成半抗原B，其產率為88％且NMR數據如下1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.24(2H，d，J＝8.9，ar)，7.37(2H，d，J＝9.2，ar)，3.81(3H，d，J＝14.2 CH3OP)，3.34(1H，qn，J＝7.3，NH)，3.09(2H，sext，J＝6.9，NCH2)，2.37(2H，t，J＝7.3，CH2CO)，1.68(2H，qn，J＝7.6，NHCH2CH2)，1.56(2H，m，CH2CH2CO)，1.40(2H，m，CH2CH2CH2)。
實施例2-3半抗原C的合成通過利用實施例1的方法，合成半抗原C(R1＝甲基，R2＝芳基，R3＝氫且R4＝-(CH2)3-)由此獲得的202mg(0.76mmol)O-甲基O-(4-硝基苯基)phorochloridothioate溶于1.5ml的甲醇，加入4℃冰水，并攪拌5分鐘徐徐加入通過在1.5mL甲醇中溶解207mg(3.7mmol)KOH和154mg(1.0mmol)的4-(甲基氨基)丁酸獲得的含甲醇溶液。然后，以類似于實施例2-1的方式合成半抗原C，其產率為70％且NMR數據如下1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.23(2H，d，J＝9.0，ar)，7.31(2H，d，J＝9.0，ar)，3.76(3H，d，J＝14.1，CH3OP)，3.36(2H，m，NCH2)，2.86(3H，d，J＝11.0，CH3N)，2.40(2H，t，J＝7.5，CH2CO2)，1.89(2H，qn，J＝7.0，CH2CH2CH2)。
實施例2-4半抗原D的合成通過利用實施例1的方法，合成了半抗原D(R1＝乙基，R2＝芳基，R3＝氫且R4＝-(CH2)3-)3.52g的(20mmol)的O-乙基二氯硫代磷酸酯溶于20mL的乙腈中，加入溶解于5mL乙腈中的10g重質K2CO3和3.00g(15mmol)3，5，6-三氯-2-吡啶酚并在室溫下攪拌1小時。然后，反應混合物用cellite過濾，蒸發濾液中的溶劑，且殘留物用于通過苯/己烷(1∶1，v/v)平衡的硅膠柱層析，來獲得O-乙基O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)phorochloridothioate的油狀化合物。所述化合物的產率為65％且其NMR數據如下1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.91(1H，d，J＝1.3，ar)，4.52(2H，qxd，J＝11.0 & 7.1，CH2CH3)，1.51(3H，txd，J＝7.1&1.1，CH2CH3)。
由此獲得的0.50g(1.47mol)O-乙基O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)phorochloridothioate溶于3ml的甲醇，加入4℃冰水，并攪拌3到5分鐘徐徐加入通過在1.7mL甲醇中溶解0.205g(3.23mmol)KOH和0.166g(1.6mmol)氨基丁酸獲得的含有甲醇的溶液。反應溶液灌注到分液漏斗中并通過加入1N HCl和氯仿獲得提取物，通過MgSO4脫水，蒸發殘余的溶劑，且殘余物用于通過氯仿∶乙酸乙酯∶乙酸(65∶35∶1，v/v/v)平衡的硅膠柱層析，來獲得表2中的半抗原D。半抗原D的產量為54％，且NMR數據如下1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.85(1H，d，J＝0.9，ar)，4.34(2H，qxd，J＝9.5&7.1，CH2CH3)，3.54(1H，m，NH)，3.25(2H，m，NHCH2)，2.51(2H，t，J＝7.2，CH2CO2)，1.93(2H，qn，J＝6.9，CH2CH2CH2)，1.41(3H，t，J＝7.1，CH2CH2)。
實施例2-5半抗原E的合成通過利用實施例1的方法，合成半抗原E(R1＝乙基，R2＝芳基，R3＝氫且R4＝-(CH2)6-)由此獲得的0.50g(1.47mol)O-乙基O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)phorochloridothioate溶于3ml的甲醇，加入4℃冰水，并攪拌5分鐘徐徐加入通過在1.7mL甲醇中溶解0.205g(3.23mmol)KOH和0.210g(1.6mmol)氨基己酸獲得的含有甲醇的溶液。然后，以類似于實施例2-4的方式合成半抗原E，其產率為53％且NMR數據如下1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.87(1H，d，J＝1.0，ar)，4.36(2H，qxd，J＝9.6&7.1，CH2CH3)，3.47(1H，m，NH)，3.19(2H，m，NHCH2)，2.40(2H，t，J＝7.3，CH2CO2)，1.50(6H，m，CH2(CH2)3CH2)，1.43(3H，t，J＝7.1，CH2CH3)。
實施例2-6半抗原F的合成通過利用實施例1的方法，合成半抗原F(R1＝乙基，R2＝芳基，R3＝氫且R4＝-(CH2)3-)0.50g(1.47mol))由此獲得的O-乙基O-(3，5，6-三氯-2-嘧啶基)phorochloridothioate溶于3ml的甲醇，加入4℃冰水，并攪拌5分鐘徐徐加入通過在1.7mL甲醇中溶解0.205g(3.23mmol)KOH和0.166g(1.61mmol)的4-氨基丁酸獲得的含有甲醇的溶液。然后，以類似于實施例2-4的方式合成半抗原F，其產率為54％且NMR數據如下1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.82(1H，s，ar)，4.36(2H，qxd，J＝8.7&7.1，CH2CH3)，3.33(2H，m，NCH2)，2.87(3H，d，J＝12.3，CH3N)，2.46(2H，t，CH2CO2)，1.93(2H，qn，CH2CH2CH2)，1.43(3H，t，J＝7.1，CH2CH3)。
實施例2-7半抗原G的合成通過利用實施例1的方法，合成半抗原G(R1＝乙基，R2＝2-(異丙氧基羰基)苯基，R3＝氫且R4＝-CH2(CH3)CH2-)2.96g(17mmol)的O-乙基二氯硫代磷酸酯溶于10ml的乙腈，加入溶于20ml乙腈的5g重質K2CO3和1.96g(11mmol)水楊酸異丙酯并在室溫下攪拌40分鐘。然后，反應混合物用cellite過濾，蒸發濾液中的溶劑，且殘留物用于通過己烷/乙酸乙酯(10∶1，v/v)平衡的硅膠柱層析，來獲得O-乙基O[(2-異丙氧基羰基)苯基]phorochloridothioate的油狀化合物。所述化合物的產率為61％且其NMR數據如下1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.93(1H，dxd，J＝7.7&1.2，ar)，7.55(1H，dxd，J＝8.5&1.5，ar)，7.48(1H，txt，J＝8.4&1.6，ar)，7.32(1H，txt，J＝7.5&1.5，ar)，5.25(1H，sp，J＝6.3，(CH3)2CH)，4.48(2H，q，J＝7.1，CH2CH3)，1.47(3H，t，J＝7.1，CH2CH3)，1.38(6H，d，J＝6.3，CH(CH3)2)。
67mg(0.21mmol)由此獲得的O[(2-異丙氧基羰基)苯基]phorochloridothioate溶于0.2mL的甲醇，加入4℃冰水，并攪拌5分鐘徐徐加入通過在0.26ml甲醇中溶解31mg(0.55mmol)KOH和26mg(0.25mmol)DL-氨基丁酸的含甲醇溶液。反應溶液被灌注到分液漏斗中并通過加入1N HCl和氯仿獲得提取物，通過MgSO4脫水，蒸發殘余的溶劑，且殘余物被用于通過氯仿∶乙酸乙酯∶乙酸(29∶9∶1，v/v/v)平衡的硅膠柱層析，來獲得表2中的半抗原G。獲得的半抗原G的產率為66％且其NMR數據如下1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.81(1H，dxd，J＝8.9&1.2，ar)，7.60(1H，dxqn，J＝8.2&1.5，ar)，7.48(1H，txt，J＝7.9&1.8，ar)，7.21(1H，txt，J＝7.5&1.1，ar)，5.25(1H，sp，J＝6.2，(CH3)2CH)，4.29(1H，q，J＝9.5，NHCH)，4.20(2H，q，J＝7.1，CH2CH3)，3.97(1H，sp，J＝6.0，NHCH)，2.45(2H，t，J＝6.3，CH2CO2)，1.38(3H，t，J＝7.0，CH2CH3)，1.37(6H，d，J＝6.2，CH(CH3)2)，1.31(3H，CHCH3)。
權利要求
1.一種制備用于有機磷硫代磷酸酯殺蟲劑免疫分析的半抗原的方法，其包括如下步驟(i)將化合物(10)與酚類化合物(11)以及K2CO3在乙腈中4℃下反應30到90分鐘來獲得化合物(12)；和，(ii)將化合物(12)與化合物(13)以及KOH在甲醇中4℃下反應3到5分鐘來獲得化合物(14) 其中，R1是甲基或乙基；R2是芳基；R3是氫或烷基；以及，R4是亞烷基。
2.根據權利要求1所述的制備用于有機磷硫代磷酸酯殺蟲劑免疫分析的半抗原的方法，其中所述的硫代磷酸酯殺蟲劑選自penthion，penitrothion，對硫磷，甲基對硫磷，bromofos-甲基，bromofos-乙基，chloropyrifos，chloropyrifos-甲基，chloropyrifos-乙基，二嗪農，pyridapenthion，triazofos，isofenfos和pyrimifos。
全文摘要
本發明涉及一種制備用于硫代磷酸酯殺蟲劑免疫分析的半抗原的方法，其包括步驟將O－甲基(乙基)二氯硫代磷酸酯與酚類化合物反應來獲得O－甲基(乙基)O－芳基氯硫代磷酸酯，并將獲得的O－(甲基)乙基O－芳基氯硫代磷酸酯與氨基羧酸反應來產生目的半抗原。根據本發明，具有O－甲基(乙基)O－芳基－(羧基烷基)硫代氨基磷酸酯或O－甲基(乙基)O－芳基N－烷基－N－(羧基烷基)硫代氨基磷酸酯結構的半抗原可通過以有成本效益的方式利用兩步處理法來高產率簡單地進行制備。
文檔編號C07F9/24GK1582293SQ01823914
公開日2005年2月16日 申請日期2001年12月29日 優先權日2001年12月28日
發明者李庸泰, 李惠成, 金廷 申請人:李庸泰