赭曲霉11α-羥化酶和氧化還原酶的制作方法

專利名稱：赭曲霉11α-羥化酶和氧化還原酶的制作方法
技術領域：
本發明涉及新型細胞色素P450樣酶(赭曲霉(Aspergillusochraceus)11α-羥化酶)和氧化還原酶(赭曲霉氧化還原酶)，所述兩種酶分離自從赭曲霉孢子mRNA產生的cDNA文庫。當編碼所述11α-羥化酶的cDNA與編碼作為電子供體的人氧化還原酶的cDNA在秋粘蟲(Spodoptera frugiperda)(Sf-9)昆蟲細胞中共表達時，根據HPLC分析測定，它成功催化類固醇底物4-雄甾烯-3，17-二酮(AD)轉化成11α-羥基-AD。本發明還涉及與這些cDNA分子有關的核酸分子或由這些cDNA分子衍生得到的核酸分子，其中包括它們的互補物、同源物和片段，本發明還涉及使用這些核酸分子產生例如它們的多肽和片段的方法。本發明還涉及產生識別所述赭曲霉11α-羥化酶和氧化還原酶的抗體，以及使用這些抗體分別在未改變的宿主細胞和轉化的宿主細胞內檢測這些天然和重組多肽存在的方法。本發明還提供下面方法在異源宿主細胞中只表達所述曲霉11α-羥化酶基因、或在異源宿主細胞內共同表達所述曲霉11α-羥化酶基因以及人或曲霉氧化還原酶，以便將類固醇底物生物轉化為它們對應的11α-羥化物。
背景技術：
長久以來，人們已經使用微生物轉化或生物轉化來化學合成各種藥用產物。與產生不需要的副產物的對應化學方法相比，在溫和酶促條件下進行的立體特異性反應常常更好。微生物也具有對底物分子進行同時的獨立反應或順序反應的能力，這最小化在合成中不同步驟數量，并降低所需中間體或終產物的總成本。
已經綜述用作生物催化劑轉化有機化合物的微生物系統的一般特征(見，如，Goodhue，Charles T.，Microb.Transform.Bioact.Compd.，19-44，1982)。例如，可以在連續培養物或分批培養物中進行生物轉化。從所述微生物分泌的酶與底物反應，然后可以從培養基中回收產物。如果底物能夠通過主動或被動擴散過程進入細胞，那么細胞內的酶也可以與所述底物反應。在微生物轉化中也已經使用固定化、干燥、透化處理和靜息細胞和孢子。應用溶液形式的細胞提取物和純化的酶、或應用固定化在載體上的細胞提取物和純化的酶與傳統發酵方法相比，可能最終提供顯著的成本或控制優勢。
在類固醇領域已經廣泛使用生物轉化反應(Kieslich，K.；Sebek，O.K.Annu.Rep.Ferment.Processes 3275-304，1979；Kieslich，Klaus.Econ.Microbiol.，5(Microb.Enzymes Bioconvers.)369-465，1980)。已經表征多種反應，包括羥化作用、環氧化作用、氧化作用、脫氫作用、環和側鏈降解作用、還原作用、水解作用和異構化反應。也已經使用多種類型微生物，其中包括多種物種，例如，枝頂孢屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、根霉屬(Rhizopus)、鐮孢霉屬(Fusarium)、青霉屬(Penicillium)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、放線菌屬(Actinomyces)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、節桿菌屬(Arthrobacter)和芽孢桿菌屬(Bacillus)。
已經使用多種方法，以便利于羥化在合成重要商業化類固醇化合物時使用的中間體。例如，美國專利4,588,683描述制備11β，17α，20，21四羥基類固醇的方法在包含能夠產生11β羥基化作用的彎孢霉屬(Curvularia)的真菌培養物的培養基中，溫育底物化合物。也已經使用赭曲霉和菌絲體制備物將孕酮和其它類固醇轉化成它們對應的11α-羥基化形式(Tan，L.和Falardeau，P.，1970；Tan L.和FalardeauP.，J.Steroid Biochem.1221-227，1970；Samanta，T.B.等，Biochem.J.176，593-594，1978；Jayanthi，C.R.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.1061262-1268，1982)。
使用類固醇治療多種疾病的新型和擴展臨床應用的出現已經需要以工業化規模生產類固醇化合物和它們的中間體的改良方法。例如，美國專利4,559,332描述制備20-spiroxane系列類固醇化合物的多種方法，包括制備依普利酮甲基氫9，11α-環氧-17α-羥基-3-氧代孕-4-烯-7α，21-二羧酸酯，γ-內酯(也稱為依普利酮或表氧孕甲酯丙酸酮(epoxymexrenone))和相關化合物的多種方法。WO 98/25948和美國申請09/319,673描述制備9，11-環氧類固醇化合物的新方法，尤其是制備20-spiroxane系列和它們的類似物的新方法，并且描述在制備類固醇化合物中使用的新型中間體，以及制備所述新型中間體的方法。美國專利6,046,023公開通過微生物轉化坎利酮或雌-4-烯-3，17-二酮成為其11α-羥基化類似物的改良方法，該方法使用曲霉屬、根霉屬和Pestelotia屬的微生物，并且使用濃度超過10g/L的純度低于97％、高于90％的類固醇底物。
優化特定類固醇中間體生物轉化所需的許多現代和系統化的方法常常由于對涉及所述合成和降解的酶的生物化學知識不足而受到限制。真核細胞的細胞色素P450看起來與內質網(ER)或線粒體膜有關。結合ER的細胞色素P450酶的電子供體常常是依賴于FAD/FMN的NADPH細胞色素P450氧化還原酶。線粒體細胞色素P450中的電子傳遞通常由NADPH-鐵氧還蛋白氧化酶和鐵氧還蛋白介導。已知涉及哺乳動物類固醇發生作用的特定電子供體也分別稱為腎上腺皮質鐵氧還蛋白還原酶和腎上腺皮質鐵氧還蛋白。
雖然已知細胞色素P450酶介導真菌的生物轉化，但非常難純化這些酶的酶促活性形式(van den Brink等，Fungal Genetics and Biologiy23，1-17，1998)。許多真菌的P450酶看起來與內質網結合(van denBrink等，Fungal Genetics and Biologiy 23，1-17，1998)。酵母有一種腎上腺皮質鐵氧還蛋白還原酶類似物，該類似物在體外與哺乳動物11β羥化酶偶聯(Laeour等，Journal of Biological Chemistry 273，23984-23992，1998)。與此不同，與赭曲霉11α羥化酶偶聯的電子供體預期是NADPH-細胞色素P450氧化還原酶(Samanta和Ghosh，J SteroidBiochem 28，327-32，1987)。Rhizopus nigricans內的類固醇11α羥化作用復合物看起來也需要NADPH-細胞色素p450氧化還原酶(Makovec和Breskvar，Arch Biochem Biophys.357，310-6，1998)。在孕酮誘導的真菌菌絲體制備物中增強細胞色素R.nigricans P450和NADPH-細胞色素P450還原酶活性可能有利于表征所述兩種酶的生物化學特征(Makovec和Breskvar，Pflugers Arch-Eur J.Physiol 439(增刊)R111-R112，2000)。
已經顯示赭曲霉的孢子催化類固醇底物如孕酮的11α羥化作用(Dutta TK，Datta J，Samanta TB，Biochem.Biophys.Res.Commun.192119-123，1993)。也已知煙曲霉(A.fumigatus)表現類固醇11α羥化酶活性(Smith等，J Steroid Biochem Mol Biol 4993-100，1994)。所述煙曲霉的酶與所述赭曲霉酶不同，因為所述煙曲霉的酶看起來是對11α和15β羥化作用具有雙位點特異性的細胞色素P450，并且與所述赭曲霉酶不同，所述煙曲霉的酶看起來是非誘導性的。
盡管測序技術最近快速發展，但關于從核苷酸序列數據收集的真菌細胞色素P450的結構關系的詳細知識仍是初級的。Breskvar等(Biochem.Biophys.Res.Commun 1991；178，1078-1083，1991)已經描述從Rhizopus nigricans獲得的編碼推定的P-450的基因組DNA序列，所述DNA序列編碼孕酮11α-羥化酶。然而，該序列可能不是完整的，因為預測的氨基酸序列缺少規范的血紅素結合基序FxxGxxxCxG，該基序在幾乎所有已知細胞色素P-450酶中是常見的(Nelson等，Pharmacogenetics 61-42，1996)。
已經描述對黑曲霉(Aspergillus niger)的NADPH細胞色素P450氧化還原酶(cprA)基因的克隆和表征化(van den Brink，J.等，Genebank登記號Z26938，CAA81550，1993，未出版)。已經從啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NADPH-細胞色素P450還原酶的克隆基因的核苷酸序列推導出該酶的一級結構(Yabusaki等，J.Biochem.103(6)1004-1010，1998)。
已經使用幾種其它方法來克隆和分析類固醇酶。例如，美國專利5,422,262、美國專利5,679,521和歐洲專利EP 0 528 906 B1描述表達克隆2型類固醇5α還原酶。例如，美國專利5,869,283描述包含異源DNA的表達盒，所述異源DNA編碼兩種或多種酶，每種酶催化涉及轉化膽固醇成為皮質甾醇的一個氧化步驟，包括轉化膽固醇成為孕烯醇酮、轉化孕烯醇酮成為孕酮、轉化孕酮成為17α-羥基孕酮、轉化17α-羥基孕酮成為11-脫氧皮甾醇和轉化11-脫氧皮甾醇成為皮質甾醇。
還未曾報道赭曲霉11α羥化酶和赭曲霉氧化還原酶的序列。關于它們序列的知識能夠極大地促進發展表達載體和重組宿主菌株，在工業化規模上更有效地生物轉化類固醇中間體和合成終產物，而不帶來與部分鑒定的宿主菌株或對涉及類固醇發生作用的酶的不完全了解有關的問題。本發明通過鑒定能夠進行類固醇11α羥化的酶，克服許多上文討論的限制。本方法不僅極大促進11α羥化作用的應用，而且允許發展從其它真菌鑒定相似酶的新策略、從赭曲霉和其它微生物克隆涉及類固醇產生的其它酶、以及發展在生物轉化中應用游離細胞或固定化細胞或酶的改良宿主菌株或方法。也可以發展相似方法，幫助構建表達載體和重組宿主菌株，所述表達載體和重組宿主菌株比目前在大規模生物反應器中普遍用于生物轉化的野生型微生物更易增殖和控制。
發明簡述在本發明最大范圍內，提供克隆涉及類固醇代謝的酶的方法以及使用這些酶生產新型類固醇中間體和終產物的應用。本發明的一方面提供新型11α羥化酶和氧化還原酶以及它們的核酸、蛋白、肽、片段和類似物。本發明還涉及鑒定和克隆涉及類固醇代謝的其它酶的方法。本發明還包括新型載體和宿主細胞、使用上述載體制造異源蛋白的新方法、以及鑒定所克隆的酶的底物特異性的方法。
本發明提供確定所克隆的11α羥化酶、其等位基因變異體、突變蛋白和融合蛋白的底物特異性的方法，該方法允許評估廣泛的類固醇底物，包括3酮δ4，5類固醇(3酮δ4類固醇)、3酮δ4，5δ6，7類固醇(3酮δ4δ6類固醇)、3酮δ6，7類固醇(3酮δ6類固醇)或3酮δ1，2δ4，5類固醇(3酮δ1δ4類固醇)。用于測試的優選底物包括(a)坎利酮、(b)雄甾烯二酮、(c)aldona、(4)ADD(1，4雄二烯二酮)(e)孕甲酯丙酸酮(mexrenone)、(f)6β孕甲酯丙酸酮、(g)9α孕甲酯丙酸酮、(h)12β孕甲酯丙酸酮、(i)δ12孕甲酯丙酸酮、(j)睪酮、(k)孕酮、(l)孕甲酯丙酸酮6，7-二-內酯、和(m)孕甲酯丙酸酮7，9-二內酯。優選所克隆的11α羥化酶、其等位基因變異體、突變蛋白和融合蛋白不催化選自以下的第二種羥化反應對底物3酮δ4，5類固醇、3酮δ4，5δ6，7類固醇或3酮δ6，7類固醇的15α或β羥化、6α或β羥化、7α或β羥化、9α或β羥化、12α或β羥化和17α或β羥化。最優選所克隆的11α羥化酶、其等位基因變異體、突變蛋白和融合蛋白不催化底物3酮δ4，5類固醇、3酮δ4，5δ6，7類固醇或3酮δ6，7類固醇的15β羥化。
本發明提供編碼赭曲霉11α羥化酶的分離純化核酸。本發明還提供編碼赭曲霉11α羥化酶的基因的分離的DNA、cDNA、基因和等位基因。最好所述分離純化的核酸如SEQ ID NO01所述。最好所述基因的分離的DNA、cDNA、基因和等位基因如SEQ ID NO01所述。
本發明提供具有赭曲霉11α羥化酶的氨基酸序列的分離蛋白。本發明還提供赭曲霉11α羥化酶的分離變異體、包含所述羥化酶的融合蛋白。最好所述蛋白如SEQ D NO2所述。本發明還提供SEQ IDNO2所述蛋白的變異體；包含SEQ ID NO2并具有至少一個保守氨基酸取代的多肽；具有與SEQ ID NO2至少99％、95％、90％、75％和50％相同的氨基酸序列的多肽。
本發明提供編碼赭曲霉11α氧化還原酶的分離純化核酸。本發明還提供編碼赭曲霉氧化還原酶的基因的分離DNA、cDNA、基因和等位基因。最好所述分離純化核酸的核酸序列如SEQ ID NO5所述。本發明還提供SEQ ID NO5基因的分離DNA、cDNA、基因和等位基因。
本發明提供具有赭曲霉氧化還原酶氨基酸序列的分離蛋白。本發明還提供具有赭曲霉氧化還原酶氨基酸序列的蛋白的分離變異體、包含赭曲霉氧化還原酶氨基酸序列的融合蛋白。所述分離蛋白的優選具有SEQ ID NO6氨基酸序列。本發明還提供SEQ ID NO6所述蛋白的分離變異體；純化的多肽，所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO6并具有至少一個保守氨基酸取代；具有與SEQ ID NO6至少99％、95％、90％、75％和50％相同的氨基酸序列的多肽。
本發明提供編碼酶的分離純化核酸，所述酶催化3酮δ4，5類固醇(3酮δ4類固醇)、3酮δ4，5δ6，7類固醇(3酮δ4δ6類固醇)、3酮δ6，7類固醇(3酮δ6類固醇)或3酮δ1，2δ4，5類固醇(3酮δ1δ4類固醇)的11α羥化。優選所述酶不催化3酮δ4，5類固醇、3酮δ4，5δ6，7類固醇或3酮δ6，7類固醇的15β羥化。更優選所述羥化反應選自以下(a)從坎利酮到11α羥基坎利酮；(b)從雄甾烯二酮到11α羥基雄甾烯二酮；(c)從aldona到11α羥基aldona；(d)從ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羥基ADD；(e)從孕甲酯丙酸酮到11α羥基孕甲酯丙酸酮；(f)從6β孕甲酯丙酸酮到11α羥基6β孕甲酯丙酸酮；(g)從9α孕甲酯丙酸酮到11α羥基9α孕甲酯丙酸酮；(h)12β孕甲酯丙酸酮到11α羥基12β孕甲酯丙酸酮；(i)從δ12孕甲酯丙酸酮到11α羥基δ12孕甲酯丙酸酮；(j)從睪酮到11α羥基睪酮；(k)從孕酮到11α羥基孕酮；(l)從孕甲酯丙酸酮6，7-二內酯到11α羥基孕甲酯丙酸酮6，7-二內酯和(m)從孕甲酯丙酸酮7，9-二內酯到11α羥基孕甲酯丙酸酮7，9-二內酯。更優選所述羥化反應選自以下(a)從坎利酮到11α羥基坎利酮；(b)從雄甾烯二酮到11α羥基雄甾烯二酮；(c)從aldona到11α羥基aldona；(d)從ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羥基ADD。最優選所述羥化反應是從坎利酮到11α羥基坎利酮。
本發明還提供表達蛋白的方法，所述蛋白能夠催化3酮δ4，5類固醇、3酮δ4，5δ6，7類固醇、3酮δ6，7類固醇或3酮δ1，2δ4，5類固醇的11α羥化，所述方法包括(a)用表達盒轉化或轉染宿主細胞，所述表達盒包含編碼所述蛋白的核酸以及與所述核酸有效連接的啟動子，然后(b)在所述宿主細胞中表達所述蛋白。本發明還提供生產所述蛋白的方法，所述方法還包括回收所述蛋白的步驟。所述蛋白優選是赭曲霉11α羥化酶。更優選所述方法還包括表達電子供體蛋白，其中所述電子供體蛋白能夠為催化3酮δ4，5類固醇、3酮δ4，5δ6，7類固醇、3酮δ6，7類固醇或3酮δ1，2δ4，5類固醇的11α羥化的所述蛋白提供電子。優選所述電子供體蛋白選自以下人氧化還原酶和赭曲霉氧化還原酶。更優選所述電子供體蛋白是赭曲霉氧化還原酶。更優選編碼所述類固醇11α羥化酶和所述電子供體蛋白的核酸在不同表達盒內。更優選編碼所述類固醇11α羥化酶和所述電子供體蛋白的核酸在同一表達盒內。甚至更優選所述類固醇11α羥化酶是赭曲霉11α羥化酶，所述電子供體蛋白是人氧化還原酶。甚至更優選所述類固醇11α羥化酶是赭曲霉11α羥化酶，所述電子供體蛋白是赭曲霉氧化還原酶。優選所述表達盒在表達載體上。更優選所述表達載體是桿狀病毒。甚至更優選所述桿狀病毒是選自以下的核型多角體病毒苜蓿銀紋夜蛾(Autograapha californica)核型多角體病毒和家蛋(Bombyx mori)核型多角體病毒。最優選所述核型多角體病毒是苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒。優選所述宿主細胞是昆蟲細胞。更優選所述昆蟲細胞選自以下秋粘蟲、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)、苜蓿銀紋夜蛾和煙草天蛾(Manduca sexta)細胞。最優選所述昆蟲細胞是秋粘蟲細胞。本發明還提供表達蛋白的方法，其中所述赭曲霉11α羥化酶是SEQ ID NO2；所述人氧化還原酶是SEQ ID NO4；所述赭曲霉氧化還原酶是SEQ ID NO6。
本發明還提供分離純化的多肽，所述多肽催化3酮δ4，5類固醇(3酮δ4類固醇)、3酮δ4，5δ6，7類固醇(3酮δ4δ6類固醇)、3酮δ6，7類固醇(3酮δ6類固醇)或3酮δ1，2δ4，5類固醇(3酮δ1δ4類固醇)的11α羥化。優選所述多肽不催化3酮δ4，5類固醇、3酮δ4，5δ6，7類固醇或3酮δ6，7類固醇的15β羥化。更優選所述羥化反應選自以下(a)從坎利酮到11α羥基坎利酮；(b)從雄甾烯二酮到11α羥基雄甾烯二酮；(c)從aldona到11α羥基aldona；(d)從ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羥基ADD；(e)從孕甲酯丙酸酮到11α羥基孕甲酯丙酸酮；(f)從6β孕甲酯丙酸酮到11α羥基6β孕甲酯丙酸酮；(g)從9α孕甲酯丙酸酮到11α羥基9α孕甲酯丙酸酮；(h)12β孕甲酯丙酸酮到11α羥基12β孕甲酯丙酸酮；(i)從δ12孕甲酯丙酸酮到11α羥基δ12孕甲酯丙酸酮；(j)從睪酮到11α羥基睪酮；(k)從孕酮到11α羥基孕酮；(l)從孕甲酯丙酸酮6，7-二內酯到11α羥基孕甲酯丙酸酮6，7-二內酯和(m)從孕甲酯丙酸酮7，9-二內酯到11α羥基孕甲酯丙酸酮7，9-二內酯。更優選所述羥化反應選自以下(a)從坎利酮到11α羥基坎利酮；(b)從雄甾烯二酮到11α羥基雄甾烯二酮；(c)從aldona到11α羥基aldona；(d)從ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羥基ADD。最優選所述羥化反應是從坎利酮到11α羥基坎利酮。
本發明還提供表達盒，所述表達盒包含有效連接分離純化核酸的啟動子，所述核酸編碼能夠催化3酮δ4，5類固醇(3酮δ4類固醇)、3酮δ4，5δ6，7類固醇(3酮δ4δ6類固醇)、3酮δ6，7類固醇(3酮δ6類固醇)或3酮δ1，2δ4，5類固醇(3酮δ1δ4類固醇)的11α羥化的多肽。更優選所述羥化反應選自以下(a)從坎利酮到11α羥基坎利酮；(b)從雄甾烯二酮到11α羥基雄甾烯二酮；(c)從aldona到11α羥基aldona；(d)從ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羥基ADD；(e)從孕甲酯丙酸酮到11α羥基孕甲酯丙酸酮；(f)從6β孕甲酯丙酸酮到11α羥基6β孕甲酯丙酸酮；(g)從9α孕甲酯丙酸酮到11α羥基9α孕甲酯丙酸酮；(h)12β孕甲酯丙酸酮到11α羥基12β孕甲酯丙酸酮；(i)從δ12孕甲酯丙酸酮到11α羥基δ12孕甲酯丙酸酮；(j)從睪酮到11α羥基睪酮；(k)從孕酮到11α羥基孕酮；(l)從孕甲酯丙酸酮6，7-二內酯到11α羥基孕甲酯丙酸酮6，7-二內酯和(m)從孕甲酯丙酸酮7，9-二內酯到11α羥基孕甲酯丙酸酮7，9-二內酯。更優選所述羥化反應選自以下(a)從坎利酮到11α羥基坎利酮；(b)從雄甾烯二酮到11α羥基雄甾烯二酮；(c)從aldona到11α羥基aldona；(d)從ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羥基ADD。最優選所述羥化反應是從坎利酮到11α羥基坎利酮。
本發明還提供表達盒，所述表達盒包含有效連接分離純化核酸的啟動子，所述核酸編碼赭曲霉氧化還原酶。優選所述核酸是SEQ IDNO6。
本發明還提供包含異源DNA的表達盒，所述異源DNA編碼從谷甾醇合成依普利酮的代謝途徑中的酶，其中所述酶催化選自以下的至少一種轉化(a)從坎利酮到11α羥基坎利酮；(b)從雄甾烯二酮到11α羥基雄甾烯二酮；(c)從aldona到11α羥基aldona；(d)從ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羥基ADD；(e)從孕甲酯丙酸酮到11α羥基孕甲酯丙酸酮；(f)從6β孕甲酯丙酸酮到11α羥基6β孕甲酯丙酸酮；(g)從9α孕甲酯丙酸酮到11α羥基9α孕甲酯丙酸酮；(h)12β孕甲酯丙酸酮到11α羥基12β孕甲酯丙酸酮；(i)從δ12孕甲酯丙酸酮到11α羥基δ12孕甲酯丙酸酮；(j)從睪酮到11α羥基睪酮；(k)從孕酮到11α羥基孕酮；(l)從孕甲酯丙酸酮6，7-二內酯到11α羥基孕甲酯丙酸酮6，7-二內酯和(m)從孕甲酯丙酸酮7，9-二內酯到11α羥基孕甲酯丙酸酮7，9-二內酯，并且其中所述異源DNA有效連接在重組宿主內表達所編碼的酶所需的控制序列。優選所述表達盒中的所述異源DNA編碼序列選自以下屬和物種赭曲霉、赭曲霉、黑曲霉、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)、米根霉(Rhizopus oryzae)、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)、弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、克羅斯韋假單胞菌(Pseudomonas cruciviae)、粉紅單端孢(Trichothecium roseum)、尖鐮孢(Fusarium oxysporum)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、藍色梨頭霉(Absidia coerula)、灰綠梨頭霉(Absidiaglauca)、雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)、黃柄曲霉(Aspergillusflavipes)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、白僵菌(Beauveria bassiana)、Botryosphaeria obtusa、Calonectria decora、螺卷毛殼(Chaetomiumcochliodes)、山扁豆生棒孢(Corynespora cassiicola)、短刺小克銀汗霉(Cunninghamella blakesleeana)、刺孢小克銀汗霉(Cunninghamellaechinulata)、雅致小克銀汗霉(Cunninghamella elegans)、Curvulariaclavata、彎孢(Curvularia lunata)、Cylindrocarpon radicicala、Epicoccumhumicala、卵形孢球托霉(Gongronella butleri)、金孢菌寄生(Hypomyceschrysospermus)、Monosporium olivaceum、深黃被孢霉(Mortierellaisabellina)、大毛霉(Mucor mucedo)、灰藍毛霉(Mucor griseocyanus)、疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)、Nocardia corallina、Paecilomycescarneus、展青霉(Penicillum patulum)、Pithomyces atroolivaceus、Pithomyces cynodontis、Pycnosporium sp.、紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythrae)、黃瘤孢(Sepedonium chrysospermum)、Stachylidium bicolor、吸水鏈霉菌(Streptomyces hyqroscopicus)、淺絳紅鏈霉菌(Streptomyces purpurascens)、總狀共頭霉(Syncephalastrumracemosum)、Thamnostylum piriforme、Thielavia terricola和可可輪枝孢(Verticillium theobromae)、Cephalosporium aphidicola、Cochlioboluslunatas、Tieghemella orchidis、Tieghemella hyalospora、Monosporiumolivaceum、焦曲霉(Aspergillus ustus)、禾本科鐮孢(Fusariumgraminearum)、灰綠輪枝孢(Verticillium glaucum)和Rhizopusnigricans。更優選所述屬和物種選自以下赭曲霉、赭曲霉、黑曲霉、構巢曲霉、米根霉、匍枝根霉、弗氏鏈霉菌、巨大芽孢桿菌、克羅斯韋假單胞菌(Pseudomonas cruciviae)、粉紅單端孢、尖鐮孢、少根根霉和Monosporium olivaceum。最優選所述屬和物種是赭曲霉。
優選所述重組宿主細胞和其后代包含至少一個表達盒。更優選所述宿主是微生物。最優選所述宿主是細菌。本發明還提供制造來自轉化谷甾醇成為依普利酮的代謝途徑中一種或多種酶的方法，所述方法包括在表達和積累由所述異源DNA編碼的一種或多種酶的條件下，在營養培養基中培養所述重組宿主細胞。更優選所述方法包括下列步驟(a)在羥化所述需要氧化的化合物并且積累所述羥化產物的條件下，在所述重組細胞存在下溫育所述化合物，然后(b)回收所述羥化產物。最優選所述方法包括下列步驟(a)在羥化所述需要氧化的化合物并且積累所述羥化產物的條件下，在所產生的酶存在下溫育所述化合物，然后(b)回收所述羥化產物。本發明還提供帶有表達盒的宿主細胞。更優選所述表達盒整合入所述宿主細胞的染色體。更優選所述表達盒整合進表達載體。
本發明還提供確定克隆的11α羥化酶的比活的方法，所述方法包括下面步驟(a)用包含編碼所述11α羥化酶的核酸的表達載體轉化宿主細胞，(b)在所述宿主細胞中表達所述11α羥化酶；(c)從所述細胞制備亞細胞膜部分，(d)用類固醇底物溫育所述亞細胞膜部分，然后(e)監測所述類固醇底物轉化成其11α羥基類固醇對應物。優選所述方法還包括下面步驟用包含編碼氧化還原酶的核酸的表達載體轉化宿主細胞，然后在所述宿主細胞中表達所述氧化還原酶。更優選所述氧化還原酶是人氧化還原酶或赭曲霉氧化還原酶。最優選所述氧化還原酶是人氧化還原酶。最優選所述氧化還原酶是赭曲霉氧化還原酶。
本發明還提供具有SEQ ID NO2的蛋白，或者與SEQ ID NO2至少95％相同并且催化3酮δ4，5類固醇、3酮δ4，5δ6，7類固醇、3酮δ6，7類固醇或3酮δ1，2δ4，5類固醇的11α羥化的變異體，其中所述羥化反應選自以下(a)從坎利酮到11α羥基坎利酮；(b)從雄甾烯二酮到11α羥基雄甾烯二酮；(c)從aldona到11α羥基aldona；(d)從ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羥基ADD；(e)從孕甲酯丙酸酮到11α羥基孕甲酯丙酸酮；(f)從6β孕甲酯丙酸酮到11α羥基6β孕甲酯丙酸酮；(g)從9α孕甲酯丙酸酮到11α羥基9α孕甲酯丙酸酮；(h)12β孕甲酯丙酸酮到11α羥基12β孕甲酯丙酸酮；(i)從δ12孕甲酯丙酸酮到11α羥基δ12孕甲酯丙酸酮；(j)從睪酮到11α羥基睪酮；(k)從孕酮到11α羥基孕酮。所述酶最好不催化3酮δ4，5類固醇、3酮δ4，5δ6，7類固醇或3酮δ6，7類固醇的15β羥化。
本發明提供分離純化的核酸，所述核酸編碼催化3酮δ4，5類固醇(3酮δ4類固醇)、3酮δ4，5δ6，7類固醇(3酮δ4δ6類固醇)、3酮δ6，7類固醇(3酮δ6類固醇)或3酮δ1，2δ4，5類固醇(3酮δ1δ4類固醇)的11α羥化的酶，其中所述羥化反應選自以下(a)從坎利酮到11α羥基坎利酮；(b)從雄甾烯二酮到11α羥基雄甾烯二酮；(c)從aldona到11α羥基aldona；(d)從ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羥基ADD；(e)從孕甲酯丙酸酮到11α羥基孕甲酯丙酸酮；(f)從6β孕甲酯丙酸酮到11α羥基6β孕甲酯丙酸酮；(g)從9α孕甲酯丙酸酮到11α羥基9α孕甲酯丙酸酮；(h)12β孕甲酯丙酸酮到11α羥基12β孕甲酯丙酸酮；(i)從δ12孕甲酯丙酸酮到11α羥基δ12孕甲酯丙酸酮；(j)從睪酮到11α羥基睪酮；(k)從孕酮到11α羥基孕酮。所述酶最好不催化3酮δ4，5類固醇、3酮δ4，5δ6，7類固醇或3酮δ6，7類固醇的15β羥化。
本發明還提供純化的多肽，所述多肽的氨基酸序列選自SEQ IDNO23、SEQ ID NO24、SEQ ID NO25。
本發明提供純化的免疫原性多肽，所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO2的至少十個連續殘基。
本發明提供分離純化的抗體，所述抗體對具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的11α羥化酶具有結合特異性。最好所述抗體結合選自以下的蛋白區(a)SEQ ID NO2的N末端氨基酸1-10；(b)SEQ ID NO2的最后10個C末端氨基酸；(c)氨基酸SEQ ID NO23；(d)氨基酸SEQID NO24；和(e)氨基酸SEQ ID NO25。最好所述抗體在肽柱上純化，其中所述肽選自以下(a)SEQ ID NO2的N末端氨基酸1-10；(b)SEQID NO2的最后10個C末端氨基酸；(c)氨基酸SEQ ID NO23；(d)氨基酸SEQ ID NO24；和(e)氨基酸SEQ ID NO25。
本發明還提供純化的多肽，所述多肽的氨基酸序列選自SEQ IDNO26。
本發明還提供純化的免疫原性多肽，所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO6的至少十個連續殘基。
本發明還提供分離純化的抗體，所述抗體對具有SEQ ID NO6的氨基酸序列的11α羥化酶具有結合特異性。優選所述抗體結合選自以下的蛋白區(a)SEQ ID NO6的N末端氨基酸1-10；(b)SEQ ID NO6的最后10個C末端氨基酸；(c)氨基酸SEQ ID NO26。更優選所述抗體在肽柱上純化，其中所述肽選自以下(a)SEQ ID NO6的N末端氨基酸1-10；(b)SEQ ID NO6的最后10個C末端氨基酸；(c)氨基酸SEQ ID NO26。
本發明還提供組合物，所述組合物包含在有效載體、媒介物或輔助劑中的上文所述抗體。本發明還提供包含所述抗體和溶液的組合物。所述抗體可以是多克隆抗體。所述抗體也可以是單克隆抗體。所述抗體可以偶聯免疫親和基質。本發明還提供使用免疫親和基質從生物液體或細胞裂解物中純化多肽的方法。優選所述免疫親和基質是SEPHAROSE 4B。更優選所述使用免疫基質從生物液體或細胞裂解物純化多肽的方法使用SEPHAROSE 4B作為免疫基質。更優選所述使用免疫基質從生物液體或細胞裂解物純化多肽的方法使用SEPHAROSE 4B作為免疫基質。
本發明還提供使用肽柱純化抗體的方法，其中所述肽選自以下(a)SEQ ID NO2的N末端氨基酸1-10；(b)SEQ ID NO2的最后10個C末端氨基酸；(c)氨基酸SEQ ID NO23；(d)氨基酸SEQ ID NO24；和(e)氨基酸SEQ ID NO25。
本發明還提供使用肽柱純化抗體的方法，其中所述肽選自以下(a)SEQ ID NO6的N末端氨基酸1-10；(b)SEQ ID NO6的最后10個C末端氨基酸；(c)氨基酸SEQ ID NO26。
本發明還提供檢測生物體液中第一種多肽的方法，其中所述第一種多肽選自11α羥化酶和氧化還原酶，所述方法包括以下步驟(a)使所述液體與第二種多肽接觸，所述第二種多肽具有對所述第一種多肽的結合特異性，然后(b)測定所述第二種多肽的存在以確定所述第一種多肽的水平。優選所述第二種多肽是抗體。更優選所述第二種多肽受到放射標記。
本發明還提供生產分離核酸的方法，所述方法包括在6XSSC中和65℃下使SEQ ID NO1與基因組DNA雜交，然后分離SEQ ID NO1所檢測到的核酸。本發明還提供依照所述方法制備的分離DNA核酸。
本發明還提供在高度嚴格條件下與SEQ ID NO1序列的互補物特異性雜交的分離核酸。
本發明還提供生產分離核酸的方法，所述方法包括在6XSSC中和65℃下使SEQ ID NO5與基因組DNA雜交，然后分離SEQ ID NO5所檢測到的核酸。本發明還提供依照所述方法制備的分離DNA核酸。
本發明還提供在高度嚴格條件下與SEQ ID NO5所述序列的互補物特異性雜交的分離核酸。
本發明還提供DNA構建物，當將所述DNA構建物插入細胞的染色體DNA時，所述DNA構建物改變在所述細胞中通常不表達的11α羥化酶基因的表達，所述DNA構建物包含(a)靶序列；(b)調節序列；和(c)編碼類固醇11α羥化酶的結構基因。本發明還提供攜帶所述DNA構建物的宿主細胞。
本發明還提供DNA構建物，當將所述DNA構建物插入細胞的染色體DNA時，所述DNA構建物改變在所述細胞中通常不表達的11α羥化酶基因的表達，所述DNA構建物包含(a)靶序列；(b)調節序列；和(c)編碼類固醇氧化還原酶的結構基因。本發明還提供攜帶所述DNA構建物的宿主細胞。
本發明還提供使用攜帶克隆的11α羥化酶的宿主細胞生產藥物的應用，所述藥物用于治療心臟病、炎癥、關節炎或癌癥。
本發明還提供組合物，所述組合物包含從約0.5到約500g/L糖蜜，0.5-50g/L玉米漿，0.5-50g/L KH2PO4，2.5-250g/L NaCl，2.5-250g/L葡萄糖和0.04-4g/L孕酮，pH3.5-7。優選所述組合物包含從約10到約250g/L糖蜜，1-25g/L玉米漿，1-25g/L KH2PO4，5-125g/L NaCl，5-125g/L葡萄糖和0.08-2g/L孕酮，pH4.5-6.5。更優選所述組合物包含約25-100g/L糖蜜，2.5-10g/L玉米漿，2.5-10g/L KH2PO4，12.5-50g/L NaCl，12.5-50g/L葡萄糖和0.2-0.8g/L孕酮，pH5.5-6.0。最優選所述組合物包含約50g/L糖蜜，5g/玉米漿，5g/L KH2PO4，25g/LNaCl，25g/L葡萄糖，20g/L瓊脂和0.4g/L孕酮，pH5.8。
本發明還提供上文所述任何一種組合物的半固體制劑，所述制劑還包含從約4-100g/L瓊脂。優選所述瓊脂濃度從約10-40g/L瓊脂。更優選所述瓊脂是約20g/L瓊脂。
本發明還提供使用上文所述任何一種組合物的應用，所述組合物用于生產選自以下的微生物的孢子赭曲霉、黑曲霉、構巢曲霉、米根霉、匍枝根霉和粉紅單端孢、尖鐮孢、少根根霉、Monosporiumolivaceum、產黃青霉(Penicillum chrysogenum)和藍色梨頭霉。所述組合物最好用于生產赭曲霉的孢子。
定義下面列表是本文中可互換使用的縮寫和對應意義11α羥基坎利酮＝11α羥基-4-雄烯-3，17-二酮(C22H28O4，MW356.46)AcNPV＝苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒，昆蟲病毒中桿狀病毒科家族成員AD＝雄甾烯二酮或4-雄烯-3，17-二酮(C22H28O3，MW 340.46)烯睪丙酸＝坎利酮Amp＝氨芐青霉素attTn7＝Tn7的附著位點(Tn7插入細菌染色體的優選位點)bacmid＝從大腸桿菌(E.coli)分離的重組桿狀病毒穿梭載體Bluo-gal＝鹵化吲哚基-β-D-半乳糖苷bp＝堿基對Cam＝氯霉素cDNA＝互補DNADMF＝N，N-二甲基甲酰胺ds＝雙鏈依普利酮或環氧孕甲酯丙酸酮＝甲基氫9，11α-環氧-17α-羥基-3-氧代孕-4-烯-7α，21-二羧酸酯，γ-內酯(MW 414.5)g＝克Gen＝慶大霉素hoxr＝人氧化還原酶HPLC＝高效液相色譜羥基坎利酮＝11α-或11β-羥基坎利酮IPTG＝異丙基-β-D-硫代半乳糖苷Kan＝卡那霉素kb＝千堿基，1000bp(s)mb＝兆堿基Me＝甲基mg＝毫克ml或mL＝毫升
mm＝毫米mM＝毫摩爾NMR＝核磁共振oxr＝氧化還原酶PCR＝聚合酶鏈反應r＝抵抗的或抗性RP-HPLC＝反相高效液相色譜RT＝室溫RT-PCR＝反轉錄酶聚合酶鏈反應s＝敏感SDS-PAGE＝十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳Spc/Str＝壯觀霉素/鏈霉素Tet＝四環素Tn＝轉座子ts＝對溫度敏感U＝單位ug或μg＝微克ul或μl＝微升X-gal＝5-溴-3-氯-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷X-gluc＝5-溴-3-氯-吲哚基-β-D-吡喃葡萄糖苷下面列表是本文使用的各種術語的定義物種“赭曲霉NRRL 405”指絲狀真菌赭曲霉NRRL 405，保藏號18500，從美國典型培養物保藏中心(ATCC)獲得。赭曲霉NRRL405和赭曲霉ATCC 18500是同一菌株，目錄號不同。
術語“氨基酸”指所有天然L-氨基酸，包括正亮氨酸、正纈氨酸、高半胱氨酸和鳥氨酸。
術語“簡并”指兩種核酸分子編碼同樣氨基酸序列，但包含不同核苷酸序列。
術語“片段”指這樣的核酸分子所述核酸分子的序列比靶核酸分子或已鑒定的核酸分子短，并且所述核酸分子具有靶核酸分子或已鑒定的核酸分子的至少10個連續核苷酸相同、或其實質性互補物或實質性同源物。
術語“融合蛋白”指蛋白或其片段，所述蛋白包含不來自所述蛋白的一種或多種其它肽區。
術語“探針”指用于確定分子、細胞、組織或生物的性質或特征(如存在或不存在、位置、相關性等)的試劑。
術語“啟動子”廣義指控制mRNA生產的調節序列。所述序列包括RNA聚合酶結合位點、增強子等。
術語“蛋白片段”指肽分子或多肽分子，其氨基酸序列包含所述蛋白氨基酸序列的一部分。
術語“重組”指直接來源于或間接來源于對核酸分子的人工操作的任何試劑(如DNA、肽等)。
術語“可選擇或可篩選的標記基因”指其表達可以通過用探針鑒定或篩選轉化細胞的方式檢測的基因。
術語“特異性結合”指抗體或肽的結合不受到不相關分子的競爭性抑制。
術語“特異性雜交”指能夠形成反平行、雙鏈核酸結構的兩個核酸分子。
術語“實質性互補物”指與互補物共有至少80％序列同一性的核酸序列。
術語“實質性片段”指包含至少100個核苷酸的核酸片段。
術語“實質性同源物”指相互之間共有至少80％序列同一性的核酸分子。
術語“實質雜交”指在一定條件(如鹽和溫度)下可以形成反平行雙鏈核酸結構的兩個核酸分子，所述條件允許相互之間表現90％或更高序列同一性并且在所述核酸分子的至少約50個連續核苷酸上表現所述同一性的序列進行雜交。
術語“基本純化”指在包含靶分子的天然制備物中存在或可能存在的一種或多種分子已經被除去或降低濃度。
下面是類固醇、對應術語和它們的結構的列表，在本文中它們之間可以互換使用#名稱CA索引名別名化學式 結構1依普利酮孕-4-烯-7，21- 螺[9，11-環氧-9H- C24H30O6二羧酸，9，11- 環戊二烯并[a]菲-環氧-17-羥基- 17(2H)，2′(3′H)-呋3-氧代-，γ-內 喃]，孕-4-烯-7，21-酯，甲 二羧酸衍生物；酯，(7α，11α，17 CGP 30083；依普α)-(9CI) 利酮；SC 66110 2烯睪丙酸； 孕-4，6-二烯- 17α-孕-4，6-二烯- C22H28O3坎利酮 21-羧酸，17-羥 21-羧酸，17-羥基-3-基-3-氧代-，γ- 氧代-，γ-內內酯，(17α)- 酯，(6CI，7CI，8CI)；(9CI) 螺[17H-環戊二烯并[a]菲-17，2′(5′H)-呋喃]，孕-4，6-二烯-21-羧酸衍生物；11614R.P.；17β-羥基-3-氧代孕-4，6-二烯-21-羧酸；20-Spiroxa-4，6-二烯-3，21-二酮；烯睪丙酸；坎利酮；Phanurane；SC9376；螺甾內酯SC14266 311α-羥基 孕-4，6-二烯- 11α-羥基坎利酮 C22H28O4坎利酮 21-羧酸，11，17-二羥基-3-氧代，γ-內酯，(11α，17α)-(9CI)
5Aldona乙孕-4，6-二烯- 螺[17H-環戊二烯 C24H34O3烯醇醚 21-羧酸，3-乙 并[a]菲-17，2′(5′H)-氧基-17-羥 呋喃]，孕-4，6-二烯-基，γ-內酯21-羧酸衍生物；(9CI) Aldona乙烯醇醚 6雄甾烯二雄-4-烯-3，17- Δ4-雄烯-3，17-二 C19H26O2酮 二酮(8CI，9CI) 酮；17-酮睪酮；3，17-二氧代雄-4-烯；雄甾烯二酮；Fecundin；SKF2170 711α-羥基 雄-4-烯-3，17- 雄-4-烯-3，17-二 C19H26O3雄甾烯二二酮，11-羥基- 酮，11α-羥基酮 (11α)-(9CI) (8CI)；11α-羥基雄甾烯二酮；11α-羥基雄甾烯二酮 8孕甲酯丙孕-4-烯-7，21- 螺[17H-環戊二烯 C24H32O5酸酮二羧酸，17-羥 并[α]菲-17，2′(5′H)-基-3-氧代-，γ-呋喃]，孕-4-烯-內酯，甲 7，21-二羧酸衍生酯，(7α，17α)- 物；孕甲酯丙酸酮；(9CI) SC 25152；ZK32055 911β-羥基 孕-4-烯-7，21- 11β-羥基孕甲酯丙 C24H32O6孕甲酯丙二羧酸，11，17-酸酮酸酮二羥基-3-氧代-，γ-內酯，甲酯，(7α，11β，17α)-(9CI)
10 12β-羥基 孕-4-烯-7，21- 12β-羥基孕甲酯丙 C24H32O6孕甲酯丙二羧酸，12，17- 酸酮酸酮二羥基-3-氧代-，γ-內酯，甲酯，(7α，12β，17α)-(9CI) 11 9α-羥基孕 孕-4-烯-7，21- 9α-羥基孕甲酯丙 C24H32O6甲酯丙酸二羧酸，9，17- 酸酮酮 二羥基-3-氧代-，21，17-內酯，7-甲酯，(7α，17α)-(9CI) 12 6β-羥基孕 孕-4-烯-7，21- 螺[17H-環戊二烯 C24H32O6甲酯丙酸二羧酸，6，17- 并[a]菲-17，2′(3′H)-酮 二羥基-3-氧 呋喃]，孕-4-烯-代-，γ-內酯，甲7，21-二羧酸衍生酯，(6β，7α，17α 物；6β-羥基孕甲酯)-(9CI) 丙酸酮 13 孕酮孕-4-烯-3，20- 孕酮(8CI)；Δ4-孕 C21H30O2二酮(9CI) 烯-3，20-二酮；和多于70種別名 14 雌-4-烯-雌-4-烯-3，17- (+)-19-降雄-4-烯- C18H24O23，17-二酮 二酮3，17-二酮；Δ4-雌烯(6CI，8CI，9CI) -3，17-二酮；19-降雄-4-烯-3，17-二酮
15 δ1，4-雄二雄-1，4-二烯-Δ1，4-雄二烯-3，17- C19H24O2烯-3，17-二3，17-二酮 二酮；1-脫氫雄甾酮(ADD)(7CI，8CI，9CI) 烯二酮；雄二烯二酮；雄烷-1，4-二烯-3，17-二酮 16 11α-羥基 雄-1，4-二烯-雄-1，4-二烯-3，17- C19H24O3雄-1，4-二3，17-二酮，11- 二酮，11α-羥基-烯-3，17-二 羥基-，(11α)- (6CI，7CI，8CI)；酮(11α羥 (9CI)11α-羥基雄-1，4-二基ADD) 烯-3，17-二酮；Kurchinin 17 aldona 化合物5(Aldona乙烯醇醚，在位置用O＝取代EtO-)18 孕甲酯丙 在位置6和7的碳之間形成環二酸酮6，7- 內酯環(-O-C＝O-)的化合物12(見二內酯 美國專利5,981,744關于類似內酯環的論述)19 11α羥基孕 化合物18的11α羥基形式甲酯丙酸酮6，7-二內酯20 孕甲酯丙 在位置7和9的碳之間形成環二酸酮7，9- 內酯環(-O-C＝O-)的化合物12(見二內酯 美國專利5,981,744關于類似內酯環的論述)21 11α羥基孕 化合物20的11α羥基形式甲酯丙酸酮7，9-二內酯

圖1-赭曲霉11α羥化酶的核苷酸序列和蛋白序列展示赭曲霉11α羥化酶的核苷酸序列和蛋白質序列(分別是SEQID NO1和SEQ ID NO2)。
圖2-人氧化還原酶的核苷酸序列和蛋白質序列展示人氧化還原酶的核苷酸序列和蛋白質序列(分別是SEQ IDNO3和SEQ ID NO4)。本說明書公開的從cDNA文庫獨立克隆的人氧化還原酶的預測氨基酸序列與三個不同實驗室以前所報道的序列相符合，所述cDNA文庫使用來自人HepG2細胞的RNA作為模板通過RT-PCR制備。這些基因座的GenBank登記號包括A60557(NADPH-高鐵血紅素蛋白還原酶(EC 1.6.2.4)-人)、AAG09798(NADPH-細胞色素P450還原酶[智人(Homo sapiens)]和P16435(NADPH-細胞色素P450還原酶(CPR)(P450R))。
AAB21814(細胞色素P450還原酶{EC 1.6.2.4}[人，胎盤，肽部分，676aa])與人氧化還原酶A60557和P16435在4個殘基上不同在500是A→V，在518是F→L，在537是V→W，在538是A→H。AAB21814還缺失起始的甲硫氨酸。編碼AAB21814的相關核酸(S90469細胞色素P450還原酶[人，胎盤，mRNA部分，2403nt])缺失編碼起始甲硫氨酸的ATG密碼子、在1496包括C→T的變化、在1551包括C→A的變化，并且在1605由于缺失G而出現移碼，但該移碼可以通過在1616加入T解決。
這些基因座的參考文獻如下A60557(Yamano，S.，Aoyama T.，McBride，O.W.，Hardwick，J.P.，Gelboin，H.V.和Gonzalez，F.J.人NADPH-P450氧化還原酶互補DNA克隆、序列和痘苗病毒介導的表達以及將CYPOR定位到7號染色體Mol.Pharmacol.36(1)，83-88(1989)]、AAG09798[Czerwinski，M.，SAHNI，M.，Madan，A.和Parkinson，A.人CYPOR的多態性新等位基因的表達.待發表，直接遞交]和P16435[Haniu，M.，McManus，M.E.，Birkett，D.J.，Lee，T.D.和Shively，J.E.對來自人肝的NADPH細胞色素P-450還原酶的結構和功能分析人類酶和NADPH結合位點的完整序列Biochemistry 28(21)，8639-8645(1989)]、AAB21814[Shephard，E.A.，Palmer，C.N.，Segall，H.J.和Philips，I.R.定量人組織內的細胞色素P450還原酶基因表達.Arch.Biochem.Biophys.294(1)，168-172(1992)]、S90469[Shephard，E.A.，Palmer，C.N.，Segall，H.J.和Philips，I.R.定量人組織內的細胞色素P450還原酶基因表達.Arch.Biochem.Biophys.294(1)，168-172(1992)]。
圖3-赭曲霉氧化還原酶的核苷酸序列和蛋白質序列展示赭曲霉11氧化還原酶的核苷酸序列和蛋白質序列(分別是SEQ ID NO5和SEQ ID NO6)。
圖4-赭曲霉11α羥化酶與GenBank頭10位BLAST搜索結果的氨基酸同一性排列對比將克隆進質粒pMON45624(SEQ ID NO01)的赭曲霉類固醇11α羥化酶(SEQ ID NO02)與用BLASTP程序在GenBank中發現的相關酶進行排列對比，其中BLASTP程序應用探試匹配算法(Altschul等，JMol Biol Oct 5；215(3)403-10，1990)。頭10位匹配的GenBank登記號(其可能的功能，[屬和種])如下CAA75565(細胞色素P450單加氧酶[藤倉赤霉(Gibberella fujikuroi)]、CAB91316(可能的細胞色素P450單加氧酶(lovA)[粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)]、CAB56503(細胞色素P450[Catharanthus roseus])、AAB94588(CYP71D10P[Glycinemax])、CAA75566(細胞色素P450單加氧酶[藤倉赤霉])、AAD34552(細胞色素P450單加氧酶[土曲霉(Aspergillus Terreus)]、CAA75567(細胞色素P450單加氧酶[藤倉赤霉])、CAA76703(細胞色素P450[藤倉赤霉])、CAA57874(未命名的蛋白產物[尖鐮孢])、CAA91268(類似于細胞色素P450-cDNA EST yk423b11.3，來自該基因[Caenorhabditiselegans])。
這些基因座的參考文獻如下CAA75565[Tudzynski，B.和Holter，K.藤倉赤霉內的赤霉素生物合成途徑基因簇的證據.Fungal Genet.Biol.25(3)，157-170(1998)]、CAB913 16[Schulte，U.，Aign，V.，Hoheisel，J.，Brandt，P.，Fartmann，B.，Holland，R.，Nyakatura，G.，Mewes，H.W.和Mannhaupt，G.，未發表]、CAB56503[Schroeder，G.，Unterbusch，E.，Kaltenbach，M.，Schmidt，J.，Strack，D.和Schroeder，J.吲哚生物堿生物合成中的依賴于光誘導細胞色素P450的酶水甘草堿16羥化酶FEBSLett.458，97-102(1999)]、AAB94588[Siminszky，B.，Corbin，F.T.，Ward，E.R.，Fleischmann，T.J.和DEWEY，R.E.在酵母和煙草中表達大豆細胞色素P450單加氧酶cDNA增強苯基脲類除草劑的代謝.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(4)，1750-1755(1999)]、CAA75566[Tudzynski，B.和Holter，K.藤倉赤霉內的赤霉素生物合成途徑基因簇的證據.Fungal Genet.Biol.25(3)，157-170(1998)]、AAD34552[Kennedy，J.，Auclair，K.，Kendrew，S.G.，Park，C.，Vederas，J.C.和Hutchinson，C.R.Lovastatin生物合成期間輔助蛋白調節多聚乙酰合酶活性.Science(1999)In press]、CAA75567[Tudzynski，B.和Holter，K.藤倉赤霉內的赤霉素生物合成途徑基因簇的證據.Fungal Genet.Biol.25(3)，157-170(1998)]、CAA76703[Tudzynski，B.和Hoelter，K.表征來自藤倉赤霉的P450單加氧酶.未發表]、CAA57874[Mouyna，I.和Brygoo，Y.通過重復序列破壞Fusarium oxysporum f.sp.elaeidis細胞色素P450基因.未發表]和CAA91268[無作者.線蟲C.Elegans的基因組研究生物學的平臺.C.Elegans測序論壇.Science 282(5396)，2012-2018(1998)[堪誤表發表于Science 1999年1月1日；283(5398)35和1999年5月26日；283(5410)2103和1999年9月3日；285(5433)1493]]]。
圖5-系統樹顯示赭曲霉11α羥化酶與GenBank頭10位BLAST搜索結果的相似性將展示克隆進質粒pMON45624的赭曲霉類固醇11α羥化酶的遺傳相關性的系統樹與在GenBank中發現的相關酶進行排列對比。使用BLAST尋找GenBank內相關的酶，使用ClustalW產生多序列排列對比和本圖描述的系統樹。在本圖中作為用作標志的GenBank登記號的描述與圖4的圖例相同。
圖6-赭曲霉11α羥化酶與GenBank頭10位BLAST搜索結果之間的同一性百分率使用CLUSTAL計算赭曲霉11α羥化酶與使用BLAST在GenBank中發現的頭10位BLAST搜索結果之間的同一性百分率(Thompson等，Comput.Appl.Biosci.1019-29，1994)。圖7-赭曲霉和人氧化還原酶與黑曲霉、小鼠和啤酒酵母NADPH細胞色素P450還原酶的氨基酸同源性排列對比將克隆進質粒pMON45632(SEQ ID NO05)的赭曲霉類固醇氧化還原酶的氨基酸序列(SEQ ID NO06)以及克隆進質粒pMON45605(SEQ ID NO04)的人氧化還原酶的氨基酸序列(SEQ ID NO03)與來自黑曲霉、小鼠和啤酒酵母的相關酶如上所述進行排列對比。GenBank登記號(可能的功能，[屬和種])如下BAA02936(NADPH-細胞色素P450還原酶前體[啤酒酵母])、CAA81550 NADPH-細胞色素P450還原酶[黑曲霉])、P16435(NADPH-細胞色素P450還原酶(CPR)(P450R)[人])、BAA04496(NADPH-細胞色素P450還原酶[小家鼠(Mus musculus)])。
這些基因座的參考文獻如下BAA02936[Yabusaki，Y.，Murakami，H.和Ohkawa，H.根據啤酒酵母NADPH細胞色素P450還原酶克隆基因的核苷酸序列推導的該酶的一級結構.J.Biochem.103(6)，1004-1010(1988)]、CAA81550[van den Brink，J.，van Zeijl，C.，van denHondel，C.和van Gorcom，R.克隆和表征黑曲霉的NADPH細胞色素P450氧化還原酶(cprA)基因.未發表]、P16435[Haniu，M.，McManus，M.E.，Birkett，D.J.，Lee，T.D.和Shively，J.E.對來自人肝的NADPH細胞色素P-450還原酶的結構和功能分析人類酶和NADPH結合位點的完整序列Biochemistry 28(21)，8639-8645(1989)]、BAA04496[Ohgiya，S.，Shinriki，N.，Kamataki，T.和Ishizaki，K.小鼠NADPH細胞色素P-450氧化還原酶在酵母中的分子克隆和功能表達.Biochim.Biophys.Acta 1186(1-2)，137-141(1994)]。
圖8-赭曲霉氧化還原酶與黑曲霉、小鼠和啤酒酵母NADPH細胞色素P450還原酶的氨基酸同源性排列對比將克隆進質粒pMON45632(SEQ ID NO05)的赭曲霉類固醇氧化還原酶的氨基酸序列(SEQ ID NO06)與來自黑曲霉、小鼠和啤酒酵母的相關酶如上所述進行排列對比。在本圖中作為用作標志的GenBank登記號的描述與上面圖7的圖例的描述相同。
圖9-系統樹顯示赭曲霉和人氧化還原酶與來自黑曲霉、酵母和小鼠的還原酶的相關性將展示克隆進質粒pMON45632(SEQ ID NO05)的赭曲霉氧化還原酶(SEQ ID NO06)的遺傳相關性的系統樹與在GenBank中發現的相關酶進行排列對比。使用BLAST尋找GenBank內相關的酶，使用ClustalW產生多序列排列對比和本圖描述的系統樹。在本圖中作為用作標志的GenBank登記號的描述與上面圖7的圖例的描述相同。
圖10-赭曲霉氧化還原酶與來自黑曲霉、酵母和小鼠的還原酶的同一性百分率使用Clustal W和Boxshade計算赭曲霉氧化還原酶與來自黑曲霉、小鼠和啤酒酵母的氧化還原酶之間的同一性百分率。
圖11-人氧化還原酶與SwissProt頭4位搜索結果的排列對比將克隆進質粒pMON45605(SEQ ID NO03)的人類固醇氧化還原酶的氨基酸序列(SEQ ID NO04)與SWISSPORT蛋白質數據庫的頭4位搜索結果如上文所述進行排列對比，所述人的類固醇氧化還原酶的氨基酸序列對應于下面關于P16435所報道的校正序列的氨基酸序列。SWISSPORT登記號{基因座}[俗名]種物種](可能的功能)如下P16435{NCPR_HUMAN}[人]NADPH-細胞色素P450還原酶、P00389{NCPR_RABIT}[兔]NADPH-細胞色素P450還原酶、P00388{NCPR_RAT}[大鼠]NADPH-細胞色素P450還原酶、P37040{NCPR_MOUSE}[小鼠]NADPH-細胞色素P450還原酶、P04175{NCPR_PIG}[豬]NADPH-細胞色素P450還原酶。
這些基因座的參考文獻如下P16435[Haniu，M.，McManus，M.E.，Birkett，D.J.，Lee，T.D.和Shively，J.E.對來自人肝的NADPH細胞色素P-450還原酶的結構和功能分析人類酶和NADPH結合位點的完整序列Biochemistry 28(21)，8639-8645(1989)]、P00389[Katagiri，M.，Murakami，H.，Yabusaki，Y.，Sugiyama，T.，Okamoto，M.，Yamano，T.和Ohkawa，H.兔肝NADPH細胞色素P-450還原酶mRNA的全長cDNA的分子克隆和序列分析J.Biochem.100(4)，945-954( 986)]、P00388[Porter，T.D.和Kasper，C.B.大鼠NADPH細胞色素P-450氧化還原酶cDNA的編碼核苷酸序列以及鑒定黃素結合結構域.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82(4)，973-977(1985)]、P37040[Ohgiya，S.，Shinriki，N.，Kamataki，T.和Ishizaki，K.小鼠NADPH細胞色素P-450氧化還原酶在酵母中的分子克隆和功能表達.Biochim.Biophys.Acta 1186(1-2)，137-141(1994)]、P04175[Haniu，M.，Iyanagi，T.，Miller，P.，Lee，T.D.和Shively，J.E.來自豬肝微粒體的NADPH細胞色素P-450還原酶的完整氨基酸序列.Biochemistry 25(24)，7906-7911(1986)]。
圖12-系統樹顯示人氧化還原酶與SwissPort頭4位搜索結果的相關性將展示克隆進質粒pMON45604(SEQ ID NO03)的人氧化還原酶(SEQ ID NO04)的遺傳相關性的系統樹與在SWISSPORT中發現的相關酶進行排列對比。使用BLAST尋找SWISSPORT內相關的酶，使用ClustalW產生多序列排列對比和本圖描述的系統樹。在本圖中作為用作標志的SWISSPORT登記號的描述與上面圖11的圖例的描述相同。
圖13-人氧化還原酶與SwissPort頭4位搜索結果之間的同一性百分率使用Clustal W和Boxshade計算人氧化還原酶與SWISSPORT中發現的頭4位搜索結果的同一性百分率。
圖14在轉染的Sf9昆蟲細胞中表達赭曲霉11α羥化酶用桿狀病毒感染昆蟲細胞，感染后25小時和48小時收獲表達赭曲霉11α羥化酶的感染細胞，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳制備和分離微粒體膜部分。將凝膠中的蛋白通過電泳轉移到0.2um硝酸纖維素膜(Schleicher & Schuell Grimsehlstrasse 23 37574 EinbeckGermany)，用從肽11aOH肽2 CRQILTPYIHKRKSLKGTTD(SEQ IDNO24)制備的抗體GN-1187和GN-1188進行探測。
圖15在轉染的Sf9昆蟲細胞中表達赭曲霉P450氧化還原酶用桿狀病毒感染昆蟲細胞，感染后25小時和48小時收獲表達赭曲霉11氧化還原酶的感染細胞，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳制備和分離微粒體膜部分。將凝膠中的蛋白通過電泳轉移到0.2um硝酸纖維素膜(Schleicher & Schuell Grimsehlstrasse 23 37574 EinbeckGermany)，用從oxr肽1 CTYWAVAKDPYASAGPAMNG(SEQ IDNO26)制備的抗體GN-2023和GN-12024進行探測。
圖16-通過HPLC監測從雄甾烯二酮到11α羥基雄甾烯二酮的轉化從用重組桿狀病毒共感染的昆蟲細胞制備微粒體和線粒體亞細胞部分，所述重組桿狀病毒表達重組赭曲霉11α羥化酶和從HepG2細胞RNA克隆的人氧化還原酶。在NADPH生產系統的存在下用250μM雄甾烯二酮(AD)溫育所述亞細胞部分120分鐘，所得產物用HPLC分離，在247nm處進行紫外檢測。羥化酶活性如預料中的一樣出現在微粒體部分，但該活性也出現在線粒體部分。這些結果提示所述11α羥化酶可能有附著到破碎細胞的膜的趨勢，或者該試驗中亞細胞部分的分離不足夠。圖A展示用從線粒體部分制備的酶進行的反應。圖A中在AD后洗脫出的峰看起來是睪酮。當使用微粒體部分時，幾乎同樣數量的AD轉化為11α羥基AD，但同時產生相對更多的睪酮。圖B展示在無酶來源的情況下進行120分鐘的同樣反應。圖C展示在溫育緩沖液中加入11α-羥基雄甾烯二酮標準后的HPLC描圖。
發明詳述本發明包括促進類固醇分子生物合成的酶，具體是具有細胞色素P450或氧化還原酶活性的酶。本發明部分涉及分離編碼赭曲霉11α羥化酶的核酸，所述羥化酶與對應于細胞色素P450酶的高度保守殘基顯示序列同源性。本發明還涉及分離編碼人和赭曲霉氧化還原酶的核酸。本發明所克隆的羥化酶和氧化還原酶的生物活性可以通過多種測定方法測量，包括在從重組桿狀病毒感染的昆蟲細胞制備的微粒體存在下，溫育類固醇底物，然后通過高效液相色譜(HPLC)監測所述底物到它們的11α羥化物的轉化。本發明包括新型11α羥化酶和氧化還原酶核酸、蛋白質、肽、同源物以及任何一者的片段，提供轉化類固醇中間體到它們的11α羥化物的新型有效方法。
本發明還包括編碼11α羥化酶和氧化還原酶的DNA序列、基本類似或行使基本相同功能的DNA序列、以及僅僅由于密碼子簡并性而與編碼本發明羥化酶和氧化還原酶的DNA不同的DNA序列。本發明還包括用于構建這些DNA的突變形式的寡核苷酸中間體和所述寡核苷酸和突變DNA編碼的多肽。
本發明還包括特異性結合赭曲霉11α羥化酶或赭曲霉氧化還原酶的抗體(包括抗肽抗體)、使用這些抗肽抗體純化這些和其它相關多肽的方法、使用所述純化多肽產生針對全長多肽的多克隆抗體或單克隆抗體的方法、以及使用針對所述全長多肽的抗體評價重組和非重組宿主細胞中所述多肽存在的方法。對于具有與這些多肽相關生物活性的多種宿主生物，可以使用所述抗體鑒定任何一種所述宿主生物中相關多肽的存在。
可以在該羥化步驟中使用的優選生物有赭曲霉NRRL 405、赭曲霉ATCC 18500、黑曲霉ATCC 16888和ATCC 26693、構巢曲霉ATCC 11267、米根霉ATCC 11145、匍枝根霉ATCC 6227b、弗氏鏈霉菌ATCC 10745、巨大芽孢桿菌ATCC 14945、克羅斯韋假單胞菌ATCC 13262和粉紅單端孢ATCC 12543。其它優選生物包括Fusarium oxysporum f sp.cepae ATCC 11171和少根根霉ATCC11145。
對該反應表現活性的其它生物包括藍色梨頭霉ATCC 6647、灰綠梨頭霉ATCC 22752、雅致放射毛霉ATCC 6476、黃柄曲霉ATCC1030、煙曲霉ATCC 26934、白僵菌ATCC 7159和ATCC 13144、Botryosphaeria obtusa IMI 038560、Calonectria decora ATCC 14767、螺卷毛殼ATCC 10195、山扁豆生棒孢ATCC 16718、短刺小克銀汗霉ATCC 8688a、刺孢小克銀汗霉ATCC 3655、雅致小克銀汗霉ATCC9245、Curvularia clavata ATCC 22921、彎孢ACTT 12071、Cylindrocarpon radicicola ATCC 1011、Epicoccum humicola ATCC12722、卵形孢球托霉ATCC 22822、金孢菌寄生、深黃被孢霉ATCC42613、大毛霉ATCC 46Q5、灰藍毛霉ATCC 1207A、疣孢漆斑菌ATCC9095、Nocardia corallina、Paecilomyces carneus ATCC 46579、展青霉ATCC 24550、Pithomyces atroolivaceus IFO 6651、Pithomycescynodontis ATCC 26150、Pycnosporium sp.ATCC 12231、紅色糖多孢菌ATCC 11635、黃瘤孢ATCC 13378、Stachylidium bicolor ATCC12672、吸水鏈霉菌ATCC 27438、淺絳紅鏈霉菌ATCC 25489、總狀共頭霉ATCC 18192、Thamnostylum piriforme ATCC 8992、Thielaviaterricola ATCC 13807和可可輪枝孢ATCC 12474。
預期顯示11α羥化活性的其它生物包括Cephalosporiumaphidicola(Phytochemistry(1996)，42(2)，411-415)、Cochlioboluslunatas(J.Biotechnol.(1995)，42(2)，145-150)、Tieghemella orchidis(Khim.-Farm.Zh.(1986)，20(7)，871-876)、Tieghemella hyalospora(Khim.-Farm.Zh.(1986)，20(7)，871-876)、Monosporium olivaceum(Acta Microbiol.Pol.，Ser.B.(1973)，5(2)，103-110)、焦曲霉(ActaMicrobiol.Pol.，Ser.B.(1973)，5(2)，103-110)、禾本科鐮孢(ActaMicrobiol.Pol.，Ser.B.(1973)，5(2)，103-110)、灰綠輪枝孢(ActaMicrobiol.Pol.，Ser.B.(1973)，5(2)，103-110)和Rhizopus nigricans(J.Steroid Biochem.(1987)，28(2)，197-201)。
圖1圖示赭曲霉11α羥化酶的核苷酸序列和蛋白質序列(分別是SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)。圖2圖示人氧化還原酶的核苷酸序列和蛋白質序列(分別是SEQ ID NO3和SEQ ID NO4)。圖3圖示赭曲霉氧化還原酶的核苷酸序列和蛋白質序列(分別是SEQ ID NO5和SEQ ID NO6)。
圖4圖示克隆在pMON45624中并與用BLAST在GenBank中發現的相關酶進行排列對比的赭曲霉11α羥化酶的氨基酸同一性排列對比。圖5是圖解顯示該關系的系統樹。圖6顯示赭曲霉類固醇11α羥化酶和使用BLAST在GenBank中發現的頭10種酶之間用ClustalW和Boxshade計算得到的同一性百分率。
圖7圖示赭曲霉和人氧化還原酶與來自黑曲霉、小鼠和啤酒酵母(酵母)的NADPH細胞色素P450還原酶之間的氨基酸同一性。圖8圖示赭曲霉、黑曲霉和啤酒酵母氧化還原酶之間的氨基酸排列對比。圖9是顯示赭曲霉和人氧化還原酶與黑曲霉、酵母和小鼠的還原酶之間相關性的系統樹。圖10顯示赭曲霉類固醇11α羥化酶與來自黑曲霉、酵母和小鼠的氧化還原酶之間用ClustalW和Boxshade計算得到的同一性百分率。
圖11-人氧化還原酶與SwissPort頭4位搜索結果的排列對比。圖12圖示展示人氧化還原酶與這些搜索結果的遺傳相關性的系統樹。圖13顯示人氧化還原酶與SwissPort頭4位搜索結果之間的同一性百分率。
圖14圖示赭曲霉P450 11α羥化酶在桿狀病毒感染的昆蟲細胞中表達的免疫印跡，所述桿狀病毒感染的昆蟲細胞在感染后25小時和48小時收獲。用綴合合成肽11aOH肽2(SEQ ID NO 24)免疫兩只兔，然后用從所述兩只兔制備的1∶1抗體混合物探測所述硝酸纖維素膜。
圖15圖示赭曲霉P450氧化還原酶在桿狀病毒感染的昆蟲細胞中表達的免疫印跡，所述桿狀病毒感染的昆蟲細胞在感染后25小時和48小時收獲。用綴合合成肽oxr肽1(SEQ ID NO 26)免疫兩只兔，然后用從所述兩只兔制備的1∶1抗體混合物探測所述硝酸纖維素膜。
圖16圖示HPLC描圖，該描圖說明用從表達赭曲霉11α羥化酶和人氧化還原酶的桿狀病毒感染的昆蟲細胞制備的亞細胞部分溫育雄甾烯二酮(AD)后，從AD到其11α羥化物的轉化。
克隆技術可以使用本領域內目前標準的遺傳工程技術(美國專利4,935,233和Sambrook等，“Molecular Cloning A Laboratory Manual”，Cold SpringHarbor Laboratory，1989)構建本發明的DNA序列。一種所述方法是盒式誘變(Wells等，Gene 34315-323，1985)，其中用合成寡核苷酸取代質粒內的部分編碼序列，所述合成寡核苷酸編碼兩個限制位點間基因部分內的所需氨基酸取代。
可以制造編碼所需基因的成對互補合成寡核苷酸，并使它們相互退火。所述寡核苷酸的DNA序列編碼所需基因的氨基酸序，除那些在所述序列中受到取代和/或缺失的氨基酸外。
可以用選定限制性內切核酸酶處理質粒DNA，然后連接到所述退火的寡核苷酸。可以使用所述連接的混合物轉化感受態大腸桿菌細胞，這將賦予合適的抗生素抗性。可以挑出單克隆，通過限制分析或DNA測序檢查質粒DNA，鑒定具有所需基因的質粒。
可以通過使用中間載體完成編碼新型蛋白和融合蛋白的DNA序列的克隆。可以使用接頭和連接物連接DNA序列以及取代缺失的序列，其中限制位點在目標區之內。將編碼單個多肽或融合蛋白(包括第一種多肽、肽接頭和第二種多肽)的DNA插入合適的表達載體，然后將所述表達載體轉化或轉染進合適的細菌、真菌、昆蟲或哺乳動物宿主細胞。培養轉化的生物或宿主細胞，然后通過標準技術分離重組蛋白。重組融合蛋白具有全長或部分第一種蛋白，所述第一種蛋白通過接頭區連接全長或部分第二種蛋白。
雜交編碼11α羥化酶或氧化還原酶的核酸分子和片段核酸分子可以與其它核酸分子特異性雜交。假如兩種核酸分子能夠形成反平行雙鏈核酸結構，則稱這兩種核酸分子能夠特異性相互雜交。假如一種核酸分子與另一種核酸分子顯示完全的互補性，則稱一種核酸分子是另一種核酸分子的“互補物”。當其中一種分子的每一個核苷酸與另一種分子的核苷酸相同，則這些分子表現“完全互補性”。假如兩種分子能夠以允許它們在至少常規“低嚴格性”條件下保持相互退火的足夠穩定性相互雜交，則這兩種分子“最小互補”。相似地，假如所述分子能夠以允許它們在常規“高嚴格性”條件下保持相互退火的足夠穩定性相互雜交，則所述分子“互補”。常規嚴格條件的描述見Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)和Haymes等，Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approach，IRLPress，Washington，DC，(1985)。因此，只要從完全互補性的偏離不完全防止所述分子形成雙鏈結構的能力，則所述偏離是允許的。
促進DNA雜交的合適嚴格條件是本領域內技術人員眾所周知的，或者可見Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，N.Y.，6.3.1-6.3.6，(1989)。基本條件包括，例如，在約45℃的6X檸檬酸鈉鹽溶液(SSC)，然后在50℃用2X SSC洗滌。嚴格性可以如下改變例如，將洗滌步驟中的鹽濃度從50℃約2X SSC(中低嚴格性)變為在50℃約0.2X SSC(高嚴格性)。也可以通過改變洗滌步驟中的溫度而改變嚴格性，從室溫約22℃(低嚴格性條件)改為約65℃(高嚴格性條件)。可以改變溫度和鹽，或者保持溫度或鹽濃度穩定，改變另一個變量。
表達載體本發明的另一方面包括用于表達這些新型羥化酶和氧化還原酶的質粒DNA載體。這些載體包含上文所述編碼本發明新型多肽的新型DNA序列。轉化能夠表達羥化酶和氧化還原酶的微生物或細胞系的合適載體包括表達載體，所述表達載體包含編碼羥化酶和氧化還原酶的核苷酸序列，并且該核苷酸序列連接根據所用宿主細胞選定的轉錄和翻譯調節序列。
本發明包括如上文所述加入修飾序列的載體，所述載體用于生產羥化酶和氧化還原酶。在所述方法中使用的載體也包含有效連接本發明DNA編碼序列的選定調節序列，所述調節序列能夠指導所述DNA編碼序列在選定宿主細胞中的復制和表達。
本發明的另一方面是生產羥化酶和氧化還原酶的方法。本發明的方法涉及培養合適的細胞或系統系，所述細胞或細胞系已經用包含編碼新型羥化酶和氧化還原酶的DNA序列的載體轉化。合適的細胞或細胞系可以是細菌細胞。例如，大腸桿菌的各種株是生物工程領域內眾所周知的宿主細胞。所述株的例子包括大腸桿菌DH5α、DH10B和MON105株(Obukowicz等，Applied EnvironmentalMicrobiology 581511-1523，1992)。本發明還包括利用基于Mu噬菌粒的針對大腸桿菌的染色體表達載體表達羥化酶和氧化還原酶(Weinberg等，Gene，12625-33，1993)。在本方法中也可以使用細菌的各種其它株，包括腸細菌(如沙門氏菌(Salmonella sp.))和枯草芽孢桿菌(B.subtillis)。
當在大腸桿菌胞質內表達編碼本發明蛋白的基因時，也可以構建所述基因以便在所述基因的5′末端加入密碼子，在所述蛋白的N-末端編碼Met-2-Ala-1、Met-2-Ser-1、Met-2-Cys-1或Met-1。在大腸桿菌胞質內制造的所述蛋白的N末端受到甲硫氨酸氨肽酶翻譯后加工的影響(Ben Bassat等，J.Bacteriol.169751-757，1987)，并且有可能受到其它肽酶翻譯后加工的影響，這樣表達后切除N末端的甲硫氨酸。本發明的蛋白可以包括在N末端具有Met-1、Ala-1、Ser-1、Cys-1、Met-2-Ala-1、Met-2-Ser-1或Met-2-Cys-1的多肽。也可以通過在這些突變蛋白的N末端融合分泌信號肽，使這些突變蛋白在大腸桿菌中表達。作為分泌過程的一部分，從所述多肽切除所述信號肽。
酵母也可利用本領域內技術人員已知的多種酵母細胞株作為宿主細胞，表達本發明的多肽。在另一實施方案中，在酵母細胞，最好是啤酒酵母中表達本發明的蛋白或其片段。可以將本發明的蛋白或其片段融合到URA3、CYCl或ARG3基因的N末端，在啤酒酵母中表達(Guarente和Ptashne，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)782199-2203(1981)；Rose等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)782460-2464(1981)；和Crabeel等，EMBO J.2205-212(1983))，或者本發明的蛋白或其片段可以融合進PGK基因或TRP1基因(Tuite等，EMBO J.1603-608(1982)；和Dobson等，Nucleic Acids.Res.112287-2302(1983))。更優選本發明的蛋白或其片段作為成熟蛋白表達(Hitzeman等，Nature 293717-722(1981)；Valenzuela等，Nature 298347-350(1982)；和Derynck等，Nucleic Acids Res.111819-1837(1983))。
Romanos等，Yeast 8423-488(1992)已經綜述適于在本發明中使用的天然和工程化酵母啟動子。更優選本發明的蛋白或其片段由酵母細胞分泌(Blobel和Dobberstein，J.Cell Biol.67835-851(1975)；Kurjan和Herskowitz，Cell 30933-943(1982)；Bostian等，Cell 36741-751(1984)；Rothman和Orci，Nature 355409-415(1992)；Julius等，Cell32839-852(1983)；和Julius等，Cell 36309-318(1984))。
哺乳動物細胞在哺乳動物細胞中表達外源基因的通用方法已經有綜述(Kaufman，R.J.，1987，“Genetic Engineering，Principles and Methods”，第9卷，J.K.Setlow，編輯，Plenum Press，New York；Colosimo等，Biotechniques 29314-331，2000)。假如存在信號肽，那么重組蛋白一般將靶向它們在宿主細胞內的天然位置(如胞質、核或各種膜區室)，或者分泌出細胞。構建表達載體，其中能夠在哺乳動物細胞中發揮功能的強啟動子驅動真核細胞分泌信號肽編碼序列的轉錄，所述信號肽在翻譯后連接到所需蛋白的編碼區。例如，可以使用質粒如pcDNA I/Neo、pRc/RSV和pRc/CMV(從Invitrogen Corp.，San Diego，California獲得)。所述真核細胞分泌信號肽編碼序列可以來自所述基因本身或來自另一分泌性哺乳動物蛋白(Bayne，M.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 842638-2642，1987)。在構建包含所述基因的載體后，將所述載體DNA轉染進哺乳動物細胞如COS7、HeLa、BHK、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或小鼠L系。可以在例如DMEM培養基(JRHScientific)中培養所述細胞。轉染細胞后，或選擇抗生素抗性并隨后建立穩定細胞系后，細胞瞬時表達24-72小時，然后通過標準生物化學方法回收分泌進培養基中的多肽。合適哺乳動物宿主細胞的選擇和轉化、培養、擴增、篩選和產物生產和純化的方法是本領域內已知的。見，如，Gething和Sambrook，Nature，293620-625，1981，或者Kaufman等，Mol.Cell.Biol.，5(7)1750-1759，1985)或Howley等和美國專利第4,419,446號。其它合適的哺乳動物細胞系是猴COS-1細胞系和CV-1細胞系。
也可以使用哺乳動物細胞表達本發明的核酸分子。也可以將本發明的核酸分子克隆進合適的反轉錄病毒載體(見，例如，Dunbar等Blood 853048-3057(1995)；Baum等，J.Hematother.5323-329(1996)；Bregni等，Blood 801418-1422(1992)；Boris-Lawrie和Temin，Curr.Opin.Genet.Dev.3102-109(1993)；Boris-Lawrie和Temin，Annal.NewYork Acad.Sci.71659-71(1994)；Miller，Current Top.Microbiol.Immunol.1581-24(1992))、腺病毒載體(Berkner，BioTechniques 6616-629(1988)；Berkner，Current Top.Microbiol.Immunol.15839-66(1992)；Brody和Crystal，Annal.New York Acad.Sci.71690-103(1994)；Baldwin等，Gene Ther.41142-1149(1997))、RSV、MuSV、SSV、MuLV(Baum等，J.Hematother.5323-329(1996))、AAV(Chen等，Gene Ther.550-58(1998)；Hallek等Cytokines Mol.Ther.269-79(1996))、AEV、AMV或CMV(Griffiths等，Biochem.J.241313-324(1987)。
轉化和轉染在另一方面，本發明提供具有如下核酸分子的轉化細胞所述核酸分子包含在細胞中起作用導致產生mRNA分子的外源啟動子區，所述啟動子區連接結構核酸分子，其中所述結構核酸分子編碼11α羥化酶或氧化還原酶基因或它們的片段。該核酸分子連接3′非翻譯序列，所述3′非翻譯序列在細胞中起作用，導致在mRNA分子的3′末端終止轉錄和添加聚腺苷酸化核糖核苷酸。
用于轉化真核細胞、細菌和其它微生物的方法和組合物是本領域內已知的(見，例如，Sambrook等，Molecular CloningA LaboratoryManual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，(1989)；Colosimo等，Biotechniques 29314-331，2000)。
將DNA引入細胞的技術是本領域內技術人員眾所周知的。已經描述四種傳遞基因進入細胞的通用方法(1)化學方法(Graham和vander Eb，Virology 54536-539(1973))；(2)物理方法如顯微注射(Capecchi，Cell 22479-488(1980))、電穿孔(Wong和Neumann，Biochem.Biophys.Res.Commun.107584-587(1982)；Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)825824-5828(1985)；美國專利第5,384,253號)、和基因槍(Johnston和Tang，Methods Cell Biol.43353-365(1994)；(3)病毒載體(Clapp，Clin.Perinatol.20155-168(1993)；Lu等，J.Exp.Med.1782089-2096(1993)；Eglitis和Anderson，Biotechniques，6608-614(1988))；和(4)受體介導的機制(Curiel等，Hum.Gen.Ther.3147-154(1992)，Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)896099-6103(1992))。也可以使用其它本領域內眾所周知的方法。
可以使用基于磷酸鈣沉淀、聚乙二醇處理、電穿孔以及組合這些處理的方法完成轉化(見，例如，Potrykus等，Mol.Gen.Genet.205193-200(1986)；Lorz等，Mol.Gen.Genet.199178(1985)；Fromm等，Nature 319791(1986)；Uchimiya等，Mol.Gen.Genet.204204(1986)；Marcotte等，Nature 335454-457(1988))。
已經發展出基于克隆核酸構建物的瞬時表達的基因表達測定通過聚乙二醇處理、電穿孔或粒子轟擊將核酸分子引入細胞(Marcotte等，Nature 335454-457(1988)；McCarty等，Cell 66895-905(1991)；Hattori等，Genes Dev.6609-618(1992)；Goff等，EMBO J.92517-2522(1990))。可以使用瞬時表達系統在功能上仔細分析包含有效連接的遺傳元件的表達盒的調節和結構特征。
昆蟲細胞表達可以使用昆蟲細胞作為宿主細胞，表達本發明的重組蛋白(見，例如，Luckow，V.A.，Protein Eng.J.L.Cleland.，Wiley-Liss，New York，NY183-218，1996和該文中引用的參考文獻)。已經描述使用桿狀病毒載體在昆蟲細胞中表達外源基因的通用方法(O’Reilly，D.R.，L.K.Miller等Baculovirus Expression VectorsA Laboratory Manual.NewYork，W.H.Freeman and Company，1992；和King，L.A.和R.D.Possee，The Baculovirus Expression SystemA Laboratory Guide，London，Chapman & Hall)。
將能夠通過同源重組整合入桿狀病毒基因組的所需基因(如11α羥化酶或氧化還原酶)插入桿狀病毒轉移載體，構建桿狀病毒表達載體。許多轉移載體使用強桿狀病毒啟動子(如多角體蛋白啟動子)驅動所需基因的轉錄。通過將真核細胞分泌信號肽編碼區與所需基因的編碼區融合，一些載體允許表達融合蛋白或指導蛋白從細胞的分泌。例如，可以使用質粒pVL1393(從Invitrogen Corp.，San Diego，California獲得)指導非融合外源基因在桿狀病毒感染的昆蟲細胞中的轉錄。將包含所需基因的桿狀病毒轉移載體與環狀或線性化基因組桿狀病毒DNA一起轉染進秋粘蟲(Sf9)昆蟲細胞，并在一次或多次噬菌斑測定后純化和擴增重組桿狀病毒。
也可以使用桿狀病毒穿梭載體系統產生重組桿狀病毒(Luckow，V.A.等，J.Virol.67(8)4566-4579，1993；美國專利第5,348,886號)，所述桿狀病毒穿梭載體系統目前市場上有Bac-To-BacTM表達系統(Life Technologies，Inc.，Rockville，MD)。將所需基因插入mini-Tn7表達盒內多角體蛋白啟動子的下游，所述mini-Tn7表達盒體內轉座進入桿狀病毒穿梭載體基因組，該基因組在大腸桿菌內增殖。從大腸桿菌分離復合病毒DNA，將所述DNA轉染進Sf9細胞，然后快速制備重組桿狀病毒的貯液，而不必采用依賴于同源重組的方法所普遍應用的多輪繁重的噬菌體純化。
也可以使用Gateway重組克隆系統(Life Technologies)產生重組桿狀病毒，所述重組克隆系統使用修飾遺傳元件(附著位點)和涉及λ噬菌體位點特異性整合和切割的修飾蛋白(如int、IHF、xis)將基因在載體之間傳送。
使用攜帶所述11α羥化酶或氧化還原酶基因的純重組桿狀病毒感染細胞，所述細胞在例如Excell 401無血清培養基(JRH Biosciences，Lenexa，Kansas)或Sf900-II(Life Technologies)中培養。可以使用標準方法制備定位到膜的羥化酶或氧化還原酶，所述標準方法分級分離并濃縮在線粒體或微粒體部分內的酶(Engel和White，Dev Biol.140196-208，1990)。也可以通過標準生物化學方法回收分泌或滲漏入培養基的羥化酶和氧化還原酶。
可以通過兩種通用方法在桿狀病毒感染的昆蟲細胞中同時表達兩種或多種重組蛋白。最簡單的方法是用重組桿狀病毒的已滴定貯液共感染昆蟲細胞，所述重組桿狀病毒攜帶在強桿狀病毒啟動子如多角體蛋白啟動子或p10啟動子控制下的單個異源基因。在感染晚期，當大多數宿主細胞蛋白合成已經中斷時，這些啟動子高度轉錄。也可以使用早期桿狀病毒啟動子或其它昆蟲或真核細胞啟動子指導其它時間的合成，這通常導致更低的表達水平。通過改變在共感染中使用的兩種或多種重組病毒的比例或選擇使用不同啟動子驅動所述重組蛋白表達的病毒，將允許本領域內技術人員選擇適于優化表達所需重組蛋白的條件。
構建雙表達載體或多表達載體也將允許在桿狀病毒感染的昆蟲細胞中表達兩種或多種重組蛋白。通常這些載體允許將兩個或多個基因盒引入桿狀病毒基因組內的單一基因座。已經描述多種雙表達載體的結構(O’Reilly，D.R.，L.K.Miller等Baculovirus ExpressionVectorsA Laboratory Manual.New York，W.H.Freeman and Company，1992；和King，L.A.和R.D.Possee，The Baculovirus Expression SystemA Laboratory Guide，London，Chapman & Hall)。
材料和方法通用方法克隆、表達和表征蛋白的通用方法可見T.Maniatis等，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1982以及該文引用的參考文獻，所述文獻通過引用結合到本文中；和J.Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory，1989以及該文引用的參考文獻，所述文獻通過引用結合到本文中。已經公開多種克隆和表達載體的一般特征和圖譜(Gacesa，P.和Ramji，D.P.，VectorsEssential Data，John Wiley &Sons，1994)。在哺乳動物細胞中克隆和表達基因的通用方法也可見Colosimo等，Biotechniques 29314-331，2000。構建、操作和分離多克隆和單克隆抗體的通用和具體條件和方法是本領域內眾所周知的(見，例如，Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York，1988)。
除專門指出外，從Sigma(St.Louis，MO)獲得所有專用化學品。從Life Technologies(Rockville，MD)、New England Biolabs(Beverly，MA)、Roche Molecular Biochemicals(Indianapolis，IN)或Promega(Madison，WI)獲得限制性內切核酸酶和T4 DNA連接酶。除特別指出外，所有組份采用重量單位，溫度以攝氏溫度(℃)表示。
菌株、質粒和序列表在這些研究中使用的細菌菌株列于表1。本研究中使用或構建的質粒列于表2。相關寡核苷酸、基因或蛋白序列的簡要描述列于表3。
表1菌株命名描述或基因型 參考文獻/來源DH5αTMF-，phi80 dlacZdeltaM15，Life Technologies，delta(lacZYA-argF)U169，deoR，Rockville，MarylandrecA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，lambda-，thi-1，gyrA96，relA1DH10BTMF-，mcrA D(mrr-hsdRMS-mcrBC) Life Technologies，phi80 Rockville，MarylanddlacZDM15DlacX74endA1recA1 deoR D(ara，leu)7697araD139 galU galK nupG rspLDH10BacTM攜帶桿狀病毒穿梭載體 Life Technologies，bMON14272(KanR)和輔助質粒Rockville，Maryland；pMON7124(TetR)的DH10B另見Luckow等，J.
Virol.674566-4579(1993)
表2質粒質粒 SEQ ID 標記描述 來源NO.
pFastBac1AmpR桿狀病毒供體質粒，包含在 LifeGentRmini-Tn7轉座因子內AcNPV Technologies多角體蛋白啟動子下游的多 Inc.(Rockville，克隆位點，該轉座因子能夠 MD)；另見轉座到桿狀病毒穿梭載體 Luckow等，J.
Virol.674566-4579(1993)pBluescript II AmpR得自pUC19的多功能噬菌Stratagene，LaSK 粒克隆載體 Jolla，CApCRII-TOPO AmpR用于使用T突出端直接克隆 Invitrogen，KanR聚合酶鏈反應產物的多功能 Carlsbad，CA克隆載體pSport1 AmpR用于克隆和從任一條鏈使用 LifeSP6或T7啟動子體外轉錄Technologies，的多功能克隆載體 Rockville，MDpGEM-T AmpRpGEM-5Zf(+)的衍生物，在 Promega，插入位點有單5′T突出端以 Madison，WI改善PCR產物連接的效率PMON45624 #1 AmpRpFastBacl EcoRI/XbaI+編 本研究GentR碼赭曲霉11α羥化酶的PCR片段EcoRI/XbaIpMON45603AmpRpBluescriptII SK 本研究BamHI/HincII+人氧化還原酶的BamHI/HincII 5′區pMON45604AmpRpBluescriptII SK HincII/KpnI 本研究+人氧化還原酶的HincII/KpnI 3′區pMON45605 #3 AmpRpFastBacl BamHI/KpnI+人 本研究GentR氧化還原酶cDNA的BamHI/KpnI完整編碼區
pMON45630AmpRpCRII-TOPO SalI/BamHI+ 本研究KanR赭曲霉氧化還原酶cDNA的SalI/BamHI 5′區pMON45631AmpRpCRII-TOPO BamHI/XhoI+ 本研究KanR沒有內含子的赭曲霉氧化還原酶cDNA BamHI/XhoI 3′區pMON45632 #5 AmpRpFastBacl SalI/XhoI+包含本研究GentR赭曲霉氧化還原酶裝配編碼區表3序列表SEQ ID NO 描述 長度/序列類型(SEQ ID NO01) pMON45624的赭曲霉11αOH1776 DNA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO02) pMON45624的赭曲霉11αOH514蛋白質蛋白序列(SEQ ID NO03) pMON45605的人氧化還原酶2031 DNA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO04) pMON45605的人氧化還原酶677蛋白質蛋白序列(SEQ ID NO05) pMON45632的赭曲霉氧化還2322 DNA原酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO06) pMON45632的赭曲霉氧化還705蛋白質原酶蛋白序列(SEQ ID NO07) 引物人氧化還原酶1A GatcggatccaatATDNAGGGAGACTCCCACGTGGACAC(SEQ ID NO08) 引物人氧化還原酶1B CAGCTGGTTGADNACGAGAGCAGAG(SEQ ID NO09) 引物人氧化還原酶2A CTCTGCTCTCGDNATCAACCAGCTG(SEQ ID NO10) 引物人氧化還原酶2B gatcggtaccttaGCT DNA
CCACACGTCCAGGGAGTAG(SEQ ID NO11) 引物曲霉氧化還原酶-for1GACGGIGCIGG DNATACAATGGA(SEQ ID NO12) 引物曲霉氧化還原酶-rev1TTAIGACCAIACDNAATCITCCTGGTAGC(SEQ ID NO13) 引物pSport-for1CAAGCTCTAAT DNAACGACTCACTATAGGGA(SEQ ID NO14) 引物曲霉氧化還原酶-rev2VAGGAACCGA DNATCGACCTCGGAA(SEQ ID NO15) 引物曲霉氧化還原酶-rev3GTCACCCTCAC DNACAGCAGAGCCAATG(SEQ ID NO16) 引物曲霉氧化還原酶-rev4CCACATTGCGA DNAACCATAGCGTTGTAGTG(SEQ ID NO17) 引物pSport-for2GCCAAGCTCTAATACGACTCACTATAGGGAAAGC(SEQ ID NO18) 引物曲霉氧化還原酶-for2gtcgacATGGCGC DNAAACTCGATACTCTC(SEQ ID NO19) 引物曲霉氧化還原酶-rev5ctcgagttaGGACC DNAAGACATCGTCCTGGTAG(SEQ ID NO20) 引物曲霉氧化還原酶-for3GGATCCCTCGC DNAGACCTGTGATCAT(SEQ ID NO21) 引物曲霉氧化還原酶-for4CGAAGATTTCT DNATGTACAAGGATGAATGGAAGACTTTTC(SEQ ID NO22) 引物曲霉氧化還原酶-rev6CTGAAAAGTCT DNA
TCCATTCATCCTTGTACAAGAAATC(SEQ ID NO23) 11αOH肽1 AAAYWLATLQ 蛋白質PSDLPELN(SEQ ID NO24) 11αOH肽2 CRQILTPYIHKR蛋白質KSLKGTTDE(SEQ ID NO25) 11αOH肽3 HMGFGHGVHA 蛋白質CPGRFFASENI(SEQ ID NO26) oxr肽1 CTYWAVAKDP 蛋白質YASAGPAMNG(SEQ ID NO27) CAA75565；細胞色素P450單 蛋白質加氧酶[藤倉赤霉](SEQ ID NO28) CAB91316；可能的細胞色素 蛋白質P450單加氧酶(lovA)[粗糙脈孢菌](SEQ ID NO29) CAB56503；細胞色素P450 蛋白質[Catharanthus roseus](SEQ ID NO30) AAB94588；CYP71D10p蛋白質[Glycine max](SEQ ID NO31) CAA75566；細胞色素P450單 蛋白質加氧酶[藤倉赤霉](SEQ ID NO32) AAD34552；細胞色素P450單 蛋白質加氧酶[土曲霉](SEQ ID NO33) CAA75567；細胞色素P450單 蛋白質加氧酶[藤倉赤霉](SEQ ID NO34) CAA76703；細胞色素P450 蛋白質[藤倉赤霉](SEQ ID NO35) CAA57874；未命名的蛋白產 蛋白質物[尖鐮孢](SEQ ID NO36) CAA91268；類似于細胞色素 蛋白質P450-cDNA EST yk423b11.3，來自該基因；[Caenorhabditiselegans](SEQ ID NO37) BAA02936 NADPH細胞色素 蛋白質
P450還原酶前體[啤酒酵母](SEQ ID NO38)CAA81550 NADPH細胞色素 蛋白質P450氧化還原酶[黑曲霉](SEQ ID NO39)BAA04496 NADPH細胞色素 蛋白質P450氧化還原酶[小家鼠](SEQ ID NO40)通用噬菌體M13反向引物 CAG GAA ACA DNAGCT ATGAC(SEQ ID NO41)通用噬菌體T7啟動子引物 TAA TAC GAC DNATCA CTA TAGGG(SEQ ID NO42)赭曲霉引物11αOH-forgatcgaattcATGCC DNACTTCTTCACTGGGCT(SEQ ID NO43)赭曲霉引物11αOH-revgatctctagattacacag DNAttaaactcgccaTATCGAT(SEQ ID NO44)pFastBacl引物Bacfwd CTGTTTTCGTA DNAACAGTTTTG(SEQ ID NO45)pFastBacl引物PolyA CCTCTACAAAT DNAGTGGTATG(SEQ ID NO46)赭曲霉引物45624-for1GAGATCAAGA DNATTGCCTT(SEQ ID NO47)赭曲霉引物45624-for2CTTCGACGCTC DNATCAA(SEQ ID NO48)赭曲霉引物45624-rev1GCAATCTTGAT DNACTCGTT(SEQ ID NO49)S90469人細胞色素P450還原2403 DNA酶[胎盤，部分mRNA，2403nt](SEQ ID NO50)AAB21814人細胞色素P450 676 DNA還原酶，胎盤，部分(SEQ ID NO51)A60557人NADPH-高鐵血紅 677 DNA素蛋白還原酶(SEQ ID NO52)P16435人NADPH-細胞色素 677 DNAP450還原酶(SEQ ID NO53)p00389兔NADPH-細胞色素 679 蛋白質
P450還原酶(SEQ ID NO54)p00388大鼠NADPH-細胞色 678 蛋白質素P450還原酶(SEQ ID NO55)p37040小鼠NADPH-細胞色 678 蛋白質素P450還原酶(SEQ ID NO56)p04175豬NADPH-細胞色素 678 蛋白質P450還原酶(SEQ ID NO57)通用噬菌體SP6引物 gatttaggtgacactata DNAg(SEQ ID NO58)NotI-poly-dT連接物 5′- DNApGACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCC(T)15-3′(SEQ ID NO59)SalI連接物，上鏈5′- DNATCGACCCACGCGTCCG-3′(SEQ ID NO60)SalI連接物，下鏈5′- DNAGGGTGCGCAGGCp-3′(SEQ ID NO61)引物氧化還原酶1CGTGGACCACA DNAAGCTCGTACTG(SEQ ID NO62)引物氧化還原酶2CCATCGACCACC DNATGTGTGAGCTG(SEQ ID NO63)引物氧化還原酶2DGTACAGGTAGT DNACCTCATCCGAG(SEQ ID NO64)黑曲霉NADP CYP450氧化還 3710 DNA原酶Z26838(SEQ ID NO65)黑曲霉NADP CYP450氧化還 693 蛋白質原酶CAA81550具體方法轉化大腸桿菌株大腸桿菌菌株如DH5α和DH10B(Life Technologies，Rockville，MD)常規用于轉化連接反應產物，并且是制備用于轉染哺乳動物細胞的質粒DNA的宿主。大腸桿菌菌株如DH10B和MON105(Obukowicz等，Appl.and Envir.Micr.，581511-1523，1992)可以用于在胞質或壁膜間隙中表達本發明的蛋白。
購買感受態DH10B和DH5α亞克隆效率細胞，用生產商的方法使其準備接受轉化。使用CaCl2方法使其它大腸桿菌菌株處于能夠攝取DNA的感受態。通常在LB培養基(1％細菌用胰蛋白胨，0.5％細菌用酵母提取物，150mM NaCl)中培養20-50mL細胞，直到使用Baush& Lomb Spectronic分光光度計(Rochester，NY)在600納米(OD600)測得約1.0吸光度的密度。離心收集細胞，重懸浮于五分之一體積的CaCl2溶液[50mM CaCl2，10mM Tris-Cl(10mM 2-氨基-2-(羥甲基)1，3-丙二醇鹽酸鹽，pH7.4)]，然后在4℃保持30分鐘。再次離心收集細胞，重懸浮于十分之一體積的CaCl2溶液。在0.1ml這些細胞中加入連接的DNA，所述樣品在4℃保持30-60分鐘。所述樣品轉移到42℃45秒鐘，加入1.0ml LB，然后在37℃振蕩所述樣品一小時。將來自這些樣品的細胞鋪展在含抗生素的平板(LB培養基加1.5％細菌用瓊脂)，所述抗生素在選擇氨芐青霉素抗性轉化子時使用氨芐青霉素(100微克/mL，ug/ml)，在選擇壯觀霉素抗性轉化子時使用壯觀霉素(75ug/ml)。所述平板在37℃溫育過夜。挑取集落并接種到添加合適抗生素(100ug/ml氨芐青霉素或75ug/ml壯觀霉素)的LB，37℃下振蕩培養。
DNA分離和表征可以使用多種不同和使用本領域內技術人員已知的商業化試劑盒分離質粒DNA。使用Promega WizardTMMiniprep試劑盒(Madison，WI)、Qiagen QIAwell質粒分離試劑盒(Chatsworth，CA)或QiagenPlasmid Midi或Mini試劑盒分離質粒DNA。這些試劑和使用分離質粒DNA的相同通用方法。簡要地說，離心(5000xg)沉淀細胞，通過順序NaOH/酸處理釋放質粒DNA，然后離心(10000xg)除去細胞碎片。上清液加載到含DNA結合樹脂的柱子，洗柱，并洗脫質粒DNA。用目標質粒篩選集落后，將所述大腸桿菌細胞接種進添加合適抗生素的50-100ml LB，在空氣培養箱中37℃下振蕩培養過夜。所純化的質粒DNA用于DNA測序、其它限制酶消化、其它DNA片段的亞克隆以及轉染進大腸桿菌、哺乳動物細胞或其它細胞類型。
DNA測序方法將純化的質粒DNA重懸浮于dH2O，用Baush and Lomb Spectronic601UV分光光度計在260/280nm測量吸光度，確定其濃度。使用ABIPRISMTMDyeDeoxyTM終止測序化學(Applied Biosystems Division ofPerkin Elmer Corporation，Lincoln City，CA)試劑盒(部件號碼401388或402078)，根據廠家建議的方法對DNA樣品進行測序。有時在重復試驗中在所述混合物中加入5％DMSO，以便利困難模板的測序。
使用DNA熱循環儀(Perkin Elmer Corporation，Norwalk，CT)，根據推薦的擴增條件進行測序反應。在薄壁0.2mL PCR管中制備DNA樣品加入500ng模板DNA和100ng選定引物，用Millipore mili-Q(mQ)水調到12uL。在每管中加入2uL 2mM Mg++。管在Perkin-ElmerSystem 9700熱循環儀中96℃下變性5分鐘。變性后，通過熱循環儀將所述管冰凍到4℃。在每管中加入6ul ABI Prism Big Dye TerminatorCycle Sequencing Ready Reaction Kit。將所述樣品返回熱循環儀，使用下面程序循環測序(1)96℃30秒鐘；(2)50℃5秒鐘；(3)60℃4分鐘，隨后重復步驟(1)24個循環，然后在4℃保持。約2.5小時后完成循環測序。
樣品用CentriSepTM離心柱(Princeton Separations，Adelphia，NJ)純化除去多余的染料終止物，或者通過已經充滿25uL Sephadex G-50超精細樹脂和300uL mQ水的Millipore MAHV N45 50 Multiscreen-HV過濾板進行純化。過濾板在750xg離心2分鐘，除去多余水份，然后將樣品加載到該板上。將所述樣品加載到樹脂上，然后再次在750xg離心該板4分鐘。將所述樣品收集到96孔板，該板離心時直接放到所述填充Sephadex的板下。使用Speed Vac在室溫下干燥所述96孔板內的液體。45-60分鐘后，DNA干燥并沉淀在板底部。樣品重懸浮于3uL甲酰胺/藍色Dextran加樣染料，加熱2分鐘(見Perkin-ElmerBig Dye說明書第33頁關于加樣緩沖液的配方)。將樣品加載到48cmwell-to-read長度4.5％丙烯酰胺凝膠上，使用ABI自動化DNA測序儀測序7小時(一般運行模式為Seq Run 48E-1200和染料設置DT，Program BD，Set Any-Primer)。
使用Sequencher DNA Analysis軟件(Gene Codes Corporation，AnnArbor，MI)或Perkin-Elmer Data Collection and Sequence Analysis程序分析重疊的DNA序列，裝配成母DNA重疊群，以便將堿基分配到所收集的數據。
BLAST、ClustalW和Boxshade同源性排列對比工具可以使用多種程序在核苷酸序列或肽序列之間進行排列對比以及便利在大序列數據庫內的同源性搜索。BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool)應用Karlin和Altschul的統計學配對理論(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877，1993)，是廣泛應用的快速鑒定匹配給定查詢序列的無缺口核苷酸亞序列或肽亞序列的程序(可以從National Center forBiotechnology Information，http//www.ncbi.nlm.nih.gov獲得)。BLAST使用查找局部排列對比而不是全體排列對比的探試性算法，因此能夠檢測僅共有分離區域相似性的序列之間的關系(Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410，1990)。
可以改變影響BLAST搜索結果的靈敏度和數量的兩個參數。參數B(默認值10)調節結果中報道的高分區段對(排列對比)的數目。參數V(默認值10)是提供一行描述的數據庫序列(搜索結果)的最大數目。配對基于高分區段對(HSP)。假如HSP被缺口分開，那么兩個序列可能共有超過一個HSP。BLAST算法對序列中的雙關性(ambiguity)敏感，并不適于包含許多缺口的序列。
程序blastp比較氨基酸查詢序列以及蛋白質序列數據庫。blastn比較核苷酸查詢序列以及核苷酸序列數據庫。blastx比較翻譯出所有可讀框的核苷酸查詢序列以及蛋白質序列數據庫。可以使用該選項查找未知核苷酸序列的可能翻譯產物。tblastn比較蛋白質查詢序列以及動態翻譯所有可讀框的核苷酸序列數據庫。tblastx比較核苷酸查詢序列的六框翻譯物以及核苷酸序列數據庫的六框翻譯物(見http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/，可以獲得關于BLAST、相關程序和模式匹配算法的更多信息)。
使用BLAST，分數＝98-557，字長514字進行核苷酸搜索，獲取與本發明核酸分子同源的核苷酸序列。使用BLASTP，分數＝50，字長3進行蛋白質搜索，獲取與參考多肽(如SEQ ID NO2)同源的氨基酸序列。
Clustal W版本1.74應用不同算法進行多種DNA或蛋白質序列的排列對比，該程序也用于進行排列對比和分配不同序列之間的同一性百分率。該程序通過賦予序列權重、位置特異性缺口罰分和加權矩陣選擇而改善漸進的多序列排列對比的靈敏度(Thompson等，Nucleic Acids Research，22(22)4673-4680，1994)。使用版本1.74默認的參數以便利排列對比和獲得兩個序列之間的同一性百分率。輸入是FASTA格式的序列，輸出是以圖顯示的排列對比。對于核酸序列，使用iub DNA加權矩陣。對于氨基酸序列，使用blosum蛋白質加權矩陣(見http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/，獲得關于BLAST、相關程序和模式匹配算法的更多信息)。
Boxshade v 3.31是從多個排列的蛋白質或DNA序列產生精密格式打印輸出的公共領域程序。Boxshade本身并不產生排列對比，但對以前通過其它序列排列對比程序產生的文件進行陰影和著色(coloring)。Boxshade的輸入是通過ClustalW產生的排列對比以及需要著色或陰影的殘基的域值。除具體指出外，在大多數情況下，使用50％的同一性值。使用該設置，假如在一個位置上有半數序列或超過半數序列共有相同殘基，則在該位置增加暗度。可以從KayHofmann(khofmann@isrecsunl-unil.ch)或Micheal D.Baron(micheal.baron@bbsrc.ac.uk)通過ftp到ftp或通過電子郵件獲得Boxshade。
蛋白純化和表征可以使用多種色譜方法中的任何一種完成蛋白純化，所述色譜方法如離子交換、凝膠過濾或疏水層析或反相HPLC。在一些情況下，可以使用親和試劑親和純化正確折疊的蛋白，所述親和試劑例如附著到合適基質上的單克隆抗體或受體亞單位。這些蛋白純化方法和其它方法在下面文獻中詳細描述Methods in Enzymology，第182卷“Guide to Protein Purification”Murray Deutscher編輯，AcademicPress，San Diego，California，1990。
可以通過RP-HPLC、電噴射質譜和SDS-PAGE分析純化的蛋白。通過氨基酸組成、RP-HPLC和/或Bradford蛋白染料結合測定進行蛋白定量。在一些情況下，聯合進行胰蛋白酶肽作圖和電噴射質譜，確認蛋白的身份。
實施例下面實施例將更詳細地舉例說明本發明，但應當理解本發明不限于這些具體的實施例。閱讀本公開內容后，不偏離本發明精神和范圍的各種其它實施例對于本領域內技術人員是明顯的。所有這樣的其它實施例將包括在所附權利要求的范圍內。
實施例1-制備赭曲霉孢子用于提取RNA在含孢子形成培養基的平板上培養赭曲霉ATCC 18500貯液培養物(50ul)3-4天，所述孢子形成培養基含50g/L糖蜜，5g/L玉米漿，5g/L KH2PO4，25g/L NaCl，25g/L葡萄糖，20g/L瓊脂和0.4g/L孕酮，pH5.8。在培養基中包括孕酮以誘導類固醇11α羥化酶。從平板刮下孢子，加入5到7ml鹽水，在鹽水中洗滌，離心收集，然后重懸浮于含15％甘油的鹽水。所述孢子在干冰上冰凍，保存于-80℃。將約0.8g孢子在30℃下接種到盛有400ml 1％葡萄糖，50mM KH2PO4和0.1g坎利酮，pH7.0的瓶中。在破碎孢子前的該處理有三個好處(1)通過與坎利酮溫育，誘導類固醇11α羥化酶；(2)確定所述孢子是否催化坎利酮的11α羥化；(3)軟化孢子壁。在30℃下振蕩溫育約26小時以提供更好通氣，然后離心收集孢子。使用顯微鏡的目視檢查顯示非常少的孢子開始萌發。所述孢子沉淀在液氮中瞬間凍結，保存于-80℃。通過HPLC分析培養基中11α羥基坎利酮的存在，確定用于構建文庫的孢子是否顯示所需活性。
實施例2-赭曲霉孢子催化坎利酮的11α羥化用70ml乙酸乙酯萃取從孢子誘導獲得的約160ml培養基三次，收集類固醇底物和產物。有機相在無水硫酸鎂上干燥、過濾、然后蒸發到干。將殘余物溶解于8ml甲醇，這樣坎利酮的終濃度是約15mM(假設定量回收)。所述培養基提取物在50％甲醇中稀釋10到15倍，進行HPLC分析。在甲醇中制備坎利酮和11α-羥基坎利酮的貯液。用50％甲醇將這些貯液稀釋到終濃度750uM，制備用于HPLC分析的標準。在C-4反相HPLC柱上色譜分離培養基提取物和標準品。根據在254nm處的監測(數據未顯示)，培養基包含一種保留時間與11α羥基坎利酮標準品的保留時間相同的成份。
實施例3-培養赭曲霉菌絲體用于提取RNA28℃下，在體積為160ml的培養基中培養赭曲霉菌絲體的液體培養物72小時，所述培養基含10g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物和10g/L葡萄糖，20g/L坎利酮。過濾10ml細胞樣品，用冷水洗滌，冰凍，然后保存在-80℃。
實施例4-從誘導的孢子提取總RNA使用3110型Mini-BeadbeaterTM(Biospec Products，Bartlesville，OK)在40ml Trizol試劑(Life Technologies，Rockville，MD)中破碎約0.4g孢子。簡要地說，在低速度四次30秒脈沖處理孢子-Trizol混合物。在脈沖之間，在冰上冰凍含孢子的管。使用顯微鏡進行的目測檢查顯示該處理破碎大多數孢子。低速離心，沉淀碎片，使用Trizol根據廠家建議的方法提取上清液中的總RNA。簡要地說，在11ml聚丙烯離心管中，每10ml Trizol加入2ml氯仿。萃取蛋白3分鐘后，通過離心分離相，將包含RNA的水相轉移到干凈的管中，用等體積異丙醇沉淀。通過離心回收沉淀的RNA，然后用70％乙醇洗滌。所述RNA重懸浮于10ml水，用氯仿再萃取，然后用乙醇在-20℃沉淀過夜。通過離心回收總RNA(3mg)，在2ml水中再水化，然后加入等體積冷的4M氯化鋰，在冰上沉淀。使用該沉淀步驟除去DNA、糖類、血紅素和從胍方法帶來的其它雜質。通過25分鐘離心回收RNA。
實施例5-從誘導的菌絲體提取總RNA用在干冰中預冷的研缽和研杵，在液氮內磨碎約0.5g濕重細胞成為精細的粉末。將所述粉末加入10ml Trizol試劑(LifeTechnologies)，用Kinematica polytron(Kinematica AG，Lucerne，Switzerland)按設置#4均質化。離心除去細胞碎片，然后用氯仿萃取。用異丙醇在室溫下沉淀含核酸的水相10分鐘。離心收集沉淀物，用70％乙醇洗滌。在水中再水化RNA，用氯仿再萃取以除去任何殘余蛋白。在-20℃下用1/10體積3M乙酸鈉和2.5倍體積無水乙醇沉淀水相。最終產量是424ug。在1.2％瓊脂糖凝膠上通過電泳分離約4ug和16ug總RNA，然后通過在溴化乙錠中染色而可視化。存在微量染色體DNA污染。
實施例6-從HepG2細胞提取總RNA肝細胞人肝癌細胞(HepG2)ATCC HB-8065保持在補充Penstrep、谷氨酸和10％胎牛血清(Life Technologies，Rockville，MD)的DMEM高葡萄糖培養基中。用0.05％乙醇誘導細胞過夜，通過胰蛋白酶化收獲用于提取RNA。簡要地說，將細胞沉淀重懸浮于＞10X體積的4M異硫氰酸胍，50mM Tris-HCl，pH7.5，25mM EDTA(溶液D，Life Technologies)，然后攪拌。加入水和乙酸鈉，pH4.1，乙酸鈉最終濃度為0.1M。用一半體積氯仿萃取所述RNA溶液，然后置于冰上15分鐘。用氯仿再次萃取水相，然后用異丙醇沉淀過夜。將總RNA重懸浮于溶液D，用異丙醇再沉淀，然后在含0.3M乙酸鈉pH5.5的水中和2.5倍體積乙醇中兩次沉淀。如下進行PolyA+選擇兩次。
實施例7-mRNA的PolyA+選擇用Eppendorf 5Prime，Inc.試劑盒(Boulder CO)從總RNA中選擇PolyA+RNA。簡要地說，每1mg總RNA在含寡聚dT纖維素的柱上選擇兩次。溫和離心，裝填柱漿，然后用0.5M NaCl平衡。在室溫下使RNA結合dT纖維素15分鐘。柱子用0.5M NaCl洗一次，用0.1M NaCl洗兩次。在0.5ml 10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.5中洗脫PolyA+RNA。用寡聚dT纖維素的選擇進行兩次。用0.3M乙酸鈉的50％乙醇溶液在-20℃下沉淀mRNA，其中加入糖元作為載體。
實施例8-cDNA合成和文庫構建使用cDNA合成的SuperscriptTM質粒系統和質粒克隆試劑盒(LifeTechnologies)進行cDNA合成和文庫構建。42℃下Superscript II反轉錄酶在20ul反應物中催化cDNA第一條鏈的合成。最終組合物是50mM Tris-HCl，pH8.3，75mM KCl，3mM MgCl2，10mM DTT，50uM每種dATP、dCTP、dGTP和dTTP，50ug/ml在它們的5′末端磷酸化的寡聚-dT-NotI引物-連接物(Life Technologies)和50,000單位/mlSuperscript II反轉錄酶。
寡聚-dT-NotI引物-連接物5′ - pGACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCC(T)23-3′(SEQ ID NO58)SpeI XbeINruI NotI未加入放射性標記的示蹤物([α-32P]dCTP)。在150ul反應體積內合成cDNA的第二條鏈。所述混合物的最終組合物包括第一條鏈反應物，以及25mM Tris-HCl，pH7.5，100mM KCl，5mM(NH4)2SO4，0.15mM B-NAD+，250uM每種dATP、dCTP、dGTP和dTTP，1.2mMDTT，65單位/ml大腸桿菌DNA連接酶，250單位/ml大腸桿菌DNA聚合酶I和13單位/ml大腸桿菌Rnase H。在16℃溫育2小時后，加入10單位T4 DNA聚合酶，在16℃溫育5分鐘。用10ul 0.5M EDTA終止反應，用GENECLEAN II(BIO 101 Inc.La Jolla，CA)將所述cDNA與小于300堿基對的cDNA、引物連接物和脫氧核苷酸分離開。將在5′平端磷酸化的退火SalI連接物(Life Technologies)在16℃下連接到所述cDNA過夜。
SalI連接物5′-TCGACCCACGCGTCCG -3′(SEQ ID NO59)3′-GGGTGCGCAGGCp-5′(SEQ ID NO60)使用GENECLEAN II去除所述連接物。然后用NotI消化所述cDNA。使用QIAquick柱(QIAGEN，Valencia，CA)從乙醇沉淀的cDNA中去除小DNA片段。
實施例9-cDNA的大小分級分離使用TAE緩沖液中的0.8％Sea-Plaque瓊脂糖(FMC BioProducts，Rockland ME)通過凝膠電泳富集約1.5kb和更大的cDNA。制備型凝膠有一道DNA大小標記，電泳后將該標記從凝膠上切下，用溴化乙錠染色，在紫外光下對照直尺目視檢查，以便能夠可以從所述凝膠回收所述cDNA的合適區。使用GENECLEAN II提取cDNA，然后在20ul水中洗脫。
實施例10-在載體pSport1中構建文庫并電穿孔進大腸桿菌在20ul反應物中，將等分量根據大小選擇的cDNA與用NotI和SalI預消化的pSport1(Life Technologies，Inc.，Rockville，MD)在4℃下連接過夜，在20ul反應物中包含50mM Tris-HCl，pH7.6，10mMMgCl2，1mM ATP，5％(w/v)PEG 8000，1mM DTT，2.5ug/ml pSport1，約0.5ug/ml cDNA和50單位/ml T4 DNA連接酶。加入12.5ul 7.5M乙酸銨、5ul酵母tRNA載體和70ul無水乙醇，沉淀所述連接反應混合物。室溫下離心20分鐘，回收連接的cDNA，然后在5ul無菌水中再水化。通過電穿孔將1ul所述連接的cDNA引入ElectroMAXDH10B大腸桿菌(Life Technologies)。使細胞在1ml SOC培養基(LifeTechnologies)上37℃下恢復1小時，然后等分量接種在含100ug/ml氨芐青霉素的LB上。通過用SOC制備細胞懸浮液的順序稀釋物，確定所述赭曲霉孢子文庫(命名為LIB3025)的滴度。接種1ul、0.1ul和0.01μl的細胞懸浮液樣品，經計算，獲得的滴度是1.75×106/ml集落形成單位。
實施例11-通過DNA序列分析鑒定編碼細胞色素P450酶的集落，構建編碼赭曲霉11α羥化酶的質粒pMON45624從赭曲霉克隆11α羥化酶在含100ug/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上選擇約2,000個集落，制備小量制備的質粒DNA樣品用于測序。從已表達序列標記(EST)的3′末端進行單向測序，所述已表達序列標記開始于NotI位點，包括用于合成cDNA的部分寡聚dT引物。使用兩種通用引物便利所述測序M13反向 CAG GAA ACA GCT ATC AC(SEQ ID NO40)T7啟動子TAA TAC GAC TCS CTA TAG GG(SEQ ID NO41)
眾所周知的細胞色素p450包含一個保守血紅素結合區，該區約50個氨基酸殘基(150個核苷酸)，在終止密碼子上游(Nelson等，Pharmacogenetics 61-42，1996)。使用BLASTX，目視檢查根據規范的血紅素結合基序評為羥化酶的序列，篩選2,000個EST中在合適區編碼規范血紅素結合基序(FXXGXXXCXG，其中“X”是任何氨基酸)的序列。只有十五個EST有血紅素結合基序。一個EST是獨特的，其它十四個看起來是重疊序列。然后對從編碼推定的細胞色素p450酶的七個集落得到的cDNA插入片段進行完全測序。所有七個集落編碼同樣的酶。
基因擴增赭曲霉11α羥化酶使用從赭曲霉cDNA孢子文庫(LIB3025)獲得的獨特集落作為模板，通過PCR擴增11α羥化酶的編碼區。所述引物包括EcoRI(正向)和XbaI(反向)的識別位點，這兩個識別位點用于定向克隆進pFastbacl。使用PCR核心試劑盒(Roche)和50pmol每種引物擴增32個循環。一個循環包括在94℃的變性步驟45秒鐘、在60℃的退火步驟45秒鐘和在72℃的延伸步驟60秒鐘。
引物11αOH-forgatcgaattcATGCCCTTCTTCACTGGGCT (SEQ ID NO42)引物11αOH-revgatctctagaTTACACAGTTAAACTCGCCATATCGAT(SEQ ID NO43)構建pMON45624通過QIAquick柱(Qiagen，Valencia CA)純化上述擴增的片段，用EcoRI和XbaI消化，然后連接進用EcoRI和XbaI切割的pFastbacl。獲得的質粒命名為pMON45624，使用基于載體序列的引物和基于11α羥化酶序列的內部引物(見下文)確認DNA序列。
引物BacfwdCTGTTTTCGTAACAGTTTTG (SEQ ID NO44)引物PolyACCTCTACAAATGTGGTATG (SEQ ID NO45)引物45624-for1GAGATCAAGATTGCCTT (SEQ ID NO46)引物45624-for2CTTCGACGCTCTCAA(SEQ ID NO47)引物45624-rev1GCAATCTTGATCTCGTT (SEQ ID NO48)
所克隆11α羥化酶的核苷酸序列和預測的氨基酸序列顯示于圖1，分別是SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。
圖4描述克隆在pMON45624內的赭曲霉11α羥化酶與使用BLAST在GenBank中發現的相關酶排列對比的氨基酸同源性排列對比。圖5是圖解顯示這種關系的系統樹。圖6顯示赭曲霉類固醇11α羥化酶與使用BLAST根據ClustalW和Boxshade計算在GenBank中發現的頭10個酶之間的同源性百分率。
實施例12-擴增編碼人NADPH細胞色素P450還原酶的cDNA并克隆進質粒pMON45603、pMON45604和pMON45605基因擴增人氧化還原酶在11ul反應物中，將從HepG2細胞得到的約1ug polyA+mRNA與100ng隨機六聚物(Invitrogen，Carlsbad，CA)一起加熱到65℃10分鐘。所述混合物在冰上冰凍，然后在下面20ul反應物中42℃溫育75分鐘1ul Rnase抑制劑(Promega，Madison，WI)，0.01M DTT，5mMdNTP，50mM Tris-HCl，pH8.3，75mM KCl，3mM MgCl2和1ulSuperScriptII酶(Life Technologies)。在95℃加熱2分鐘，失活反轉錄酶。第一條cDNA鏈保存于-20℃。正向引物和反向引物基于登記號S90469(編碼細胞色素P450還原酶(SEQ ID NO49)的人胎盤部分mRNA)的核苷酸序列。對應蛋白序列的登記號是AAB21814(SEQ IDNO50)。分兩段克隆人氧化還原酶，這兩段通過在內部HincII位點連接而在pFastBacl(Life Technologies)中裝配。所述引物包括用于定向亞克隆進pFastBacl的限制位點。
引物人氧化還原酶1AgatcggatccaatATGGGAGACTCCCACGTGGACAC (SEQ ID NO07)引物人氧化還原酶1BCAGCTGGTTGACGAGAGCAGAG(SEQ ID NO08)引物人氧化還原酶2ACTCTGCTCTCTCGTCAACCAGCTG (SEQ ID NO09)引物人氧化還原酶2BgatcggtaccttaGCTCCACACGTCCAGGGAGTAG (SEQ ID NO10)在每150ul反應物中，使用400uM dNTP和167nM每個引物組合成第二條鏈。使用Deep Vent聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)進行擴增。區段2(氧化還原酶cDNA的3′端二分之一)的反應物調整到5％DMSO。擴增反應包括一個初始循環在94℃變性90秒鐘，然后在62℃退火2分鐘，隨后在72℃延伸2分鐘。此后是30個循環，包括45秒鐘的變性步驟、45秒鐘的退火步驟和60秒鐘的延伸步驟。最后一個循環延伸步驟延長到5分鐘。
構建pMON45603、pMON45604、pMon45605用BamHI和HincII消化編碼氧化還原酶cDNA 5′端二分之一的PCR片段。用HincII和KpnI消化編碼氧化還原酶cDNA 3′端二分之一的PCR片段，然后連接進pBluescript II(Stratagene，La Jolla，CA)進行測序。得到的質粒命名為pMON45603(5′區段)和pMON45604(3′區段)。將來自pMON45603的BamHI/HincII片段和來自pMON45604的HincII/KpnI片段連接進用BamHI和KpnI切割的pFastbacl，產生pMON45605。
測序引物基于GenBank登記號S90469(SEQ ID NO49)的序列，GenBank登記號S90469是一種編碼細胞色素P450還原酶的cDNA[人，胎盤，mRNA部分，2403nt]。關連蛋白序列是AAB21814(SEQID NO 50)細胞色素P450還原酶{EC 1.6.2.4}[人，胎盤，肽部分，676aa][智人]。使用引物氧化還原酶1C測序pMON45603的cDNA插入片段，使用引物氧化還原酶2C和2D測序pMON45604的cDNA插入片段。也使用通用T7(SEQ ID NO41)和M13反向(SEQ ID NO40)引物進行測序，所述兩個引物退火結合在所述cDNA插入片段側翼的載體序列。
引物氧化還原酶1CGTGGACCACAAGCTCGTACTG (SEQ ID NO61)引物氧化還原酶2CCATCGACCACCTGTGTGAGCTG (SEQ ID NO62)引物氧化還原酶2DGTACAGGTAGTCCTCATCCGAG (SEQ ID NO63)所克隆人氧化還原酶的核苷酸序列和預測的氨基酸序列顯示于圖2，分別是SEQ ID NO3和SEQ ID NO4。圖11描述人氧化還原酶與SwissProt頭4個搜索結果的排列對比。圖12描述顯示人氧化還原酶與這些搜索結果的遺傳相關性的系統樹。圖13顯示人氧化還原酶與SwissProt頭4個搜索結果之間的同一性百分率。
實施例13-從赭曲霉擴增編碼NADPH細胞色素P450還原酶的cDNA并克隆進質粒pMON45630、pMON45631和pMON45632基因擴增赭曲霉氧化還原酶目視檢查來自黑曲霉cprA基因登記號Z26938(SEQ ID NO65)的序列與來自煙曲霉(PathoSeq Database，Incyte Pharmaceuticals)的部分cDNA克隆804561639F1之間的排列對比，選擇高同源性區以設計PCR引物。選擇一個引物組，該引物組跨越cprA基因產物氨基酸203到693的編碼區。
從重疊區的5′末端區選擇引物，其中二者之間的氨基酸序列相同，而核酸序列在第3個密碼子位置的2個位置不同。對于3′引物，所述核酸編碼終止密碼子、最后7個氨基酸殘基和2個附加堿基，所述2個附加堿基對應于從終止密碼子開始第8個氨基酸殘基位置密碼子的第二個位置和第三個位置，所述第8個氨基酸殘基位置密碼子在黑曲霉中編碼ARG，在煙曲霉中編碼SER(CGC與AGC)。當黑曲霉和煙曲霉序列之間有差異時，用肌苷取代密碼子中的第三個堿基。
引物曲霉氧化還原酶-for1GACGGIGCIGGTACAATGGA (SEQ ID NO11)引物曲霉氧化還原酶-rev1TTAIACCAIACATCITCCTGGTAGC (SEQ ID NO12)(其中I＝肌苷)使用從A.ochreaceus菌絲體提取的約5ug總RNA，擴增部分cDNA克隆。在合成第一條鏈前，在11ul反應混合物中將所述RNA與100ng隨機六聚物(Promega Madison WI)加熱到65℃10分鐘。所述混合物在冰上冰凍，然后在下面20ul反應物中42℃溫育75分鐘1ul RNase抑制劑(Promega)，0.01M DTT，5mM dNTP，50mMTris-HCl，pH8.3)，75mM KCl，3mM MgCl2和1ul SuperScriptII酶(LTI)。在95℃加熱2分鐘，失活反轉錄酶。第一條cDNA鏈保存于-20℃。使用5ul第一條鏈作為模板，合成第二條鏈。所述反應包括500nM引物，200uM每種dNTP，以及PCR核心試劑盒(Roche MolecularBiochemicals，Indianapolis，IN)提供的Taq聚合酶和緩沖液。擴增進行32個循環，每個循環在94℃變性步驟30秒鐘，在60℃退火步驟30秒鐘和在72℃延伸步驟60秒鐘。將擴增的DNA產物克隆進pGEM-T(Promega，Madison，WI)，使用通用T7(SEQ ID NO41)和SP6(SEQID NO57)引物測序。
引物SP6GATTTAGGTGACACTATAG (SEQ ID NO57)與黑曲霉cprA基因的序列排列對比揭示赭曲霉克隆在黑曲霉基因內含子的同樣位置有內含子。這指出赭曲霉PCR產物可能從總RNA的基因組DNA污染物擴增。設計基于赭曲霉序列的反向引物，用于擴增約600個缺失的bp，其中包括起始甲硫氨酸。然后使用赭曲霉cDNA文庫作為模板進行PCR。正向引物基于載體pSport1(LifeTechnologies)堿基299到326的反向互補物。另一引物曲霉氧化還原酶-rev2基于編碼殘基326-333的赭曲霉序列。
引物pSport-for1CAAGCTCTAATACGACTCACTATAGGGA(SEQ ID NO13)引物曲霉氧化還原酶-revCAGGAACCGATCGACCTCGGAA(SEQ ID NO14)然后使用從大小＞1.5kb的凝膠純化片段制備的赭曲霉孢子大小文庫作為模板，擴增編碼區的最后200堿基。從曲霉氧化還原酶序列設計兩個新的反向引物，并且使用基于pSport1(堿基295-328)的新的正向引物。
引物曲霉氧化還原-rev3GTCACCCTCACCAGCAGAGCCAATG (SEQ ID NO15)引物曲霉氧化還原酶-rev4CCACATTGCGAACCATAGCGTTGTAGTG(SEQ ID NO16)引物pSport-for2GCCAAGCTCTAATACGACTCACTATAGGGAAAGC (SEQ ID NO17)使用Elongase聚合酶試劑盒(Life Technologies，Rockville MD)擴增35個循環，每個循環包括在94℃變性步驟30秒鐘，在63℃退火步驟30秒鐘和在68℃延伸步驟5分鐘。將所述PCR產物直接克隆進pCRII TOPO(Invitrogen)。測序十二個克隆，所述復合序列延伸到起始甲硫氨酸上游232堿基，并且包括2個框內終止密碼子(數據未顯示)。
設計加入曲霉氧化還原酶完整編碼序列的引物，所述引物帶有5′SalI位點和3′XhoI位點，以便連接進表達載體pFastBacl。
引物曲霉氧化還原酶-for2gtcgachTGGCGCAACTCGATACTCTC (SEQ ID NO18)引物曲霉氧化還原酶-rev5ctcgagttaGGACCAGACATCGTCCTGGTAG (SEQ ID NO19)使用赭曲霉總RNA作為模板，應用這些引物和Elongase試劑盒進行PCR。擴增包括35個循環，每個循環在94℃變性步驟30秒鐘，在64℃退火步驟30秒鐘和在68℃延伸步驟5分鐘。所述反應物的等分量cDNA在電泳上表現為約2.1kb的一條帶。
構建pMON45630將所述PCR產物直接克隆進pCRII-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA)。所有克隆包含前文提到的內部內含子。一個克隆命名為pMON45630。
構建pMON45631和pMON45632使用基于兩步PCR的策略，從5′剪接位點上游約170bp的內部BamHI位點產生缺失內含子的克隆。
引物曲霉氧化還原酶-for3GGATCCCTCGCGACCTGTGATCAT(SEQ ID NO20)引物曲霉氧化還原酶-for4CGAAGATTTCTTGTACAAGGATGAATGGAAGACTTTTC (SEQ ID NO21)引物曲霉氧化還原酶-rev6CTGAAAAGTCTTCCATTCATCCTTGTACAAGAAATC(SEQ ID NO22)引物曲霉氧化還原酶-for4和rev6互補，在所述內含子側翼。第一個PCR反應使用在內部BamHI位點線性化的曲霉氧化還原酶克隆作為模板。聚合酶和緩沖液由PCR核心試劑盒(Roche MolecularBiochemicals，Indianapolis，IN)提供。引物和dNTP濃度分別是500nM和200uM。使用曲霉氧化還原酶-for3和曲霉氧化還原酶-rev6的組合以及曲霉氧化還原酶-for4和曲霉氧化還原酶-rev5的組合進行兩個反應。在2分鐘初始變性后，PCR擴增28個循環。一個循環包括在94℃變性步驟45秒鐘，在64℃變性步驟45秒鐘和在72℃延伸步驟45秒鐘。使用每個反應各1ul作為第二次PCR擴增的模板，并使用引物曲霉氧化還原酶-for3和曲霉氧化還原酶-rev5以及Elongase酶和緩沖液。擴增包括30個循環，每個循環在94℃變性步驟30秒鐘，在62℃退火步驟30秒鐘和在68℃延伸步驟5分鐘。所述PCR產物直接克隆進pCRII-TOPO。DNA測序證明已經除去所述內含子。該克隆命名為pMON45631。
使用三步連接構建質粒pMON45632連接來自pMON45630的SalI/BamHI片段和來自pMON45631的BamHI/XhoI片段以及載體pFastBacl，在此之前用SalI和XhoI切割所述載體pFastBacl并去磷酸化，以增加攜帶所需插入片段的載體的回收率。
所克隆的赭曲霉11氧化還原酶的核苷酸序列和氨基酸序列顯示于圖3，分別是SEQ ID NO5和SEQ ID NO6。圖7描述赭曲霉和人氧化還原酶與來自黑曲霉、小鼠和啤酒酵母的NADPH細胞色素P450還原酶之間的氨基酸同源性。圖8圖示赭曲霉、黑曲霉和啤酒酵母氧化還原酶之間的氨基酸排列對比。圖9是顯示赭曲霉和人氧化還原酶與來自黑曲霉、酵母和小鼠的還原酶關系的系統樹。圖10顯示赭曲霉類固醇11α羥化酶與來自黑曲霉、酵母和小鼠的氧化還原酶之間使用Clustal W和Boxshade計算得到的同源性百分率。
實施例15產生識別赭曲霉11α羥化酶和赭曲霉NADPH細胞色素p450還原酶的多克隆抗體產生抗11-α-羥化酶抗體在兔體內針對合成肽(由Sigma/Genosis，The Woodlands，TX制備)產生抗赭曲霉11α羥化酶和NADPH細胞色素p450還原酶的多克隆抗體，所述合成肽對應于下面預測的蛋白序列的幾個區11αOH肽1AAAYWLATLQPSDLPELN (SEQ ID NO23)11αOH肽2CRQILTPYIHKRKSLKGTTD (SEQ ID NO24)11αOH肽3HMGFGHGVHACPGRFFASNEI (SEQ ID NO25)oxr肽1CTYWAVAKDPYASAGPAMNG (SEQ ID NO26)所述11αOH肽2(SEQ ID NO24)對應于在Wang和Lu描述的11α羥化酶氨基酸序列與CYP3A4對應序列的排列對比中存在的G螺旋、G/H環和H螺旋區(Drug Metab.Dispos.25(6)，762-767，1997)。所述11αOH肽3(SEQ ID NO25)對應于血紅素結合域的肽片段。
使用反相高效液相色譜(HPLC)監測免疫級肽的純度。每種肽綴合到匙孔血藍蛋白(KLH)，并懸浮于完全弗氏佐劑。然后在多個位點將所述綴合的肽皮下注射入兔體內。每種綴合的肽注射入兩只兔。所有隨后的免疫都應用不完全弗氏佐劑。一般地說，初次免疫后以兩周間隔給予五次隨后的注射。使用Sepharose-蛋白A柱親和純化IgG組份。將每種肽注射的兩只兔的組份以1∶1比例混合。匯集的抗11α羥化酶(兔GN 1187/1188)是0.34mg/ml IgG。匯集的抗氧化還原酶(兔GN 2023/2024)是0.26mg/mlIgG。混合的IgG各自以1∶10、1∶100和1∶1,000稀釋進行預試驗，確定哪個稀釋度最適于探測蛋白質印跡。1∶10稀釋給出最佳結果，使用該稀釋度用于探測隨后的蛋白質印跡。
實施例16-昆蟲細胞感染和異源表達使用桿狀病毒穿梭載體在Sf9細胞中表達蛋白(Luckow等，J.Virol.674566-4579，1993)。所述桿狀病毒穿梭載體(桿粒)包含用于在細菌細胞中表達的小F復制子、用于選擇的卡那霉素抗性標記和lacZα序列內的attTn7(細菌Tn7轉座子的靶位點)。將這些元件的每一種都插入苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV，天然桿狀病毒)基因組的多角體蛋白基因座。使用供體質粒(pFastBacl，Life Technologies)傳遞需要表達的基因，將所述供體質粒通過細菌Tn7轉座因子插入桿粒。pFastBacl包含在多角體蛋白啟動子兩側的Tn7左末端和右末端、多接頭克隆序列、SV40 polyA轉錄終止序列以及用于選擇的慶大霉素抗性基因。將pFastBacl質粒轉化進包含所述桿粒和輔助質粒的DH10Bac大腸桿菌細胞(Life Technologies)后產生重組病毒，所述pFastBacl質粒包含一個11α羥化酶或氧化還原酶cDNA。
使用CellFectinTM試劑(Life Technologies)，按照廠家針對秋粘蟲(Sf9)細胞的方法進行轉染。將細胞以每孔9×105細胞接種到6孔組織培養板上的SF-900無血清培養基(Life Technologies)中，使其吸附至少一小時。在盛有200ul SF-900培養基的聚苯乙烯管內加入5ul小量制備的DNA和5μl Cellfectin，制得轉染混合物。使所述混合物在室溫下溫育15-30分鐘。轉染前，每管加入800ul SF-900培養基。用2ml SF-900培養基洗滌細胞一次，然后在細胞中加入所述DNA混合物。所述培養物在27℃溫育5小時。溫育5小時后，取出所述轉染混合物，每孔加入補充10％胎牛血清的IPL-41培養基(LifeTechnologies)，補充所述培養物。溫育三天后，收獲細胞，離心，取出包含重組病毒的上清(命名為第1代或P1貯液)，保存于4℃。用0.5ml所述P1培養基感染100ml密度為每ml 5×105細胞的新鮮Sf9細胞，制備更大體積的病毒貯液。隨后使用噬菌斑測定方法(O’Reilly等，1992)滴定所述更大體積的病毒貯液，所述病毒貯液用于分別或同時生產11α羥化酶或氧化還原酶。
圖14描述一個免疫印跡，該免疫印跡說明用桿狀病毒感染昆蟲細胞并在感染后25和48小時收獲時，赭曲霉P450 11α羥化酶在昆蟲細胞內的表達。由綴合合成肽11aOH肽2(SEQ ID NO 24)免疫的兩只兔制備抗體1∶1混合物，用所述抗體混合物探測硝酸纖維素膜。
圖15描述一個免疫印跡，該免疫印跡說明用桿狀病毒感染昆蟲細胞并在感染后25和48小時收獲時，赭曲霉P450氧化還原酶在昆蟲細胞內的表達。由綴合合成肽oxr肽1(SEQ ID NO 26)免疫的兩只兔制備抗體1∶1混合物，用所述抗體混合物探測硝酸纖維素膜。
實施例17-共感染表達赭曲霉11α羥化酶和人氧化還原酶的桿狀病毒用包含類固醇11α羥化酶cDNA的病毒顆粒和包含人NADPHP450-氧化還原酶的另一獨立病毒共感染Sf9細胞。以0.1∶0.01(11aOH對oxr)的感染復數(MOI)加入兩種病毒。感染一天后，在培養物中加入0.9μg/ml氯高鐵血紅素。感染三天后離心收獲細胞(除不同說明外)，冰凍經過洗滌的細胞沉淀，隨后加工獲得亞細胞組份。
實施例18共感染表達赭曲霉11α羥化酶和赭曲霉氧化還原酶的桿狀病毒用包含類固醇11α羥化酶cDNA的病毒顆粒和包含赭曲霉NADPH P450-氧化還原酶的另一獨立病毒共感染Sf9細胞。以0.1∶0.01(11aOH與oxr)的感染復數(MOI)加入兩種病毒。感染一天后，在培養物中加入0.9μg/ml氯高鐵血紅素。感染三天后離心收獲細胞(除不同說明外)，冰凍經過洗滌的細胞沉淀，以備用于隨后加工獲得亞細胞組份的試驗。
實施例19從桿狀病毒感染的昆蟲細胞制備亞細胞組份融化來自感染sf9細胞和未感染對照細胞的半克細胞糊，懸浮于40ml 0.25M蔗糖的10mM KHPO4溶液(調整到pH7.4)。用FisherSonic Dismembrator，300型探針超聲波儀(Fisher Scientific，St.Louis，MO)勻漿所述懸浮液。將所述樣品轉移到圓錐形離心管(Corning CostarCorporation，Cambridge，MA)，在5℃下500xg離心15分鐘。沉淀重懸浮于等體積新鮮緩沖液，鏡檢觀察以確認完全裂解。觀察到很少或沒有完整的細胞。然后上清液在5℃下10,000xg離心30分鐘，收集線粒體、高爾基體和其它亞細胞細胞器。沉淀重懸浮于新鮮緩沖液，在5℃下7,800xg離心30分鐘，收集線粒體。
如上所述，將所述線粒體沉淀重懸浮于緩沖液中，再次離心。將線粒體沉淀重懸浮于2ml緩沖蔗糖溶液，以100μl等分量保存于-80℃。
來自原始線粒體組份的上清液在5℃下200,000xg離心1小時。將線粒體沉淀重懸浮于2ml緩沖蔗糖溶液，以100μl等分量保存于-80℃。
溫育微粒體溫育混合物在100mM磷酸鉀緩沖液，pH7.4或150mM HEPES緩沖液，pH7.4內包含Sf9微粒體(最終濃度1mg蛋白/mL)、NADPH生產系統和250uM底物(AD)。所述NADPH生產系統包括所示最終濃度的下面成分MgCl2(7.5mM)，D-葡萄糖-6-磷酸(7.5mM)，NADP(0.80mM)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(1.0單位/mL)。在37℃水浴中進行溫育指定時間。溫育后，加入0.3ml甲醇終止反應。旋渦攪拌樣品三次，每次兩秒鐘，然后置于冰上，或保存于-70℃以備用于以后的分析。
實施例20使用HPLC分析測定測量類固醇底物到它們的羥化物的轉化情況高效液相色譜(HPLC)用于分離羥化類固醇化合物和類固醇底物(例如分離11α-羥化雄甾烯二酮和雄甾烯二酮)的HPLC方法是Sonderfan等，Arch.Biochem.Biophys.25527-41，1987所述睪酮羥化酶測定的改進形式。從Sigma獲得雄甾烯二酮和11-β-羥化雄甾烯二酮的標準。Searle MedicinalChemistry提供11α-羥化雄甾烯二酮(89.5％純度，主要雜質是雄甾烯二酮)。從Burdick & Jackson獲得HPLC級水和甲醇。
HPLC系統包括1050型泵、自動進樣器和可變波長檢測器(Hewlett-Packard，Naperville，IL)、TC-50型溫度控制器和CH-30型柱加熱器(均為Eppendorf，Madison，WI)。
用表達11-羥化酶和互補電子轉運蛋白的重組桿狀病毒轉染昆蟲細胞，在反應混合物內分析從所述昆蟲細胞獲得的細胞膜組份的11-羥化酶活性，所述反應混合物在200ul最終體積內含80mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4，8mM MgCl2和0.9mM NADP+。為保證還原當量的足夠來源，加入葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(1.5U/ml)和8mM葡萄糖-6-磷酸，提供NADPH生產系統。提供最終濃度為0.3mM的類固醇底物(如雄甾烯二酮)。反應混合物在37℃溫育30分鐘。加入200ul甲醇終止反應，然后置于冰上。離心收集樣品，除去沉淀的蛋白。
在一種情況下，在滲硅聚丙烯1.5ml微量離心管內，37℃下在0.5ml體積中進行溫育120分鐘。加入從微粒體組份或線粒體組份制備的酶，并加入底物達到濃度250μM(如AD的25mM甲醇貯液)。輔因子緩沖液是100mM磷酸鉀，pH7.4，7.5mM MgCl2，7.5mM葡萄糖-6-磷酸，0.80mM NADP和1.0單位/mL葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。如下制備HPLC樣品加入0.3ml甲醇終止所述0.5ml反應混合物，旋渦攪拌三次，每次2秒鐘，然后在冰上保存。所述管用微量離心機在約20,000xg離心5分鐘，將樣品轉移到自動進樣器的小管內并加蓋。
使用250mm×4mm Vydac分析型C-4柱，通過反相HPLC分離和分析在反應混合物和培養基提取物中的類固醇成分。如下發展色譜在十分鐘內使用從40％到100％甲醇的溶劑梯度，在100％甲醇保持5分鐘，然后再平衡到初始條件。在254和220nm監測柱洗脫液的UV吸光度。
使用裝備0.22微米柱前濾器的Nova-pak C-18柱，4微米，3.9×150mm(Waters Chromatography，Milford，MA)在40℃和1.0流動相/分鐘分離雄甾烯二酮、睪酮和單羥基化雄甾烯二酮代謝物。使用步進梯度，水是流動相溶劑A，甲醇是流動相溶劑B。溶劑B的起始濃度是42％6分鐘。B的百分率在4分鐘內線性增加到45％，然后保持3分鐘。然后B的百分率在10分鐘內線性增加到80％，在該點保持另外2分鐘，總共運行25分鐘。紫外檢測波長是247nm，注射體積是200ul。
“線粒體”樣品和“微粒體”樣品產生的峰都符合11α-羥化雄甾烯二酮標準的保留時間，而其它組份都不符合該保留時間。這些“線粒體”和“微粒體”峰分別占在247nm定量的總峰面積的3.2％和2.3％。將11α-羥化雄甾烯二酮標準也以5.0μg/mL的濃度加入空白微粒體溫育樣品。在根據標準純度(89.5％)進行校正后，“線粒體”和“微粒體”11α-羥化雄甾烯二酮峰的濃度是1.75μg/mL和1.31μg/mL。這些濃度說明在250μM底物濃度下，2.3％和1.7％的底物轉化為11α-羥化雄甾烯二酮。
圖16圖示一個HPLC描圖，該描圖說明用從表達赭曲霉11α羥化酶和人氧化還原酶的桿狀病毒感染的昆蟲細胞制備的亞細胞部分溫育雄甾烯二酮(AD)后，從AD到其11α羥化物的轉化。
實施例21通過使用針對合成肽產生的多克隆抗體進行的免疫印跡，識別赭曲霉11α羥化酶和赭曲霉NADPH細胞色素p450還原酶將來自Sf9細胞裂解物的蛋白(從未感染的細胞和重組桿狀病毒感染的細胞獲得)以相等濃度(每孔10μg)加載到10％梯度丙烯酰胺微型凝膠(BioRad，Hercules，CA)的道上。使用含0.1％SDS的Tris-甘氨酸緩沖液(Sigma，St.Louis，MO)，以16mAmp衡流電泳分離蛋白約1小時。用70mAmp衡流將蛋白轉移到硝酸纖維素膜(Schleicher &Schuell，Keene，NH)40分鐘。1∶10稀釋第一抗體(從抗-11α羥化酶IgG(從肽11aOH肽2CRQILTPYIHKRKSLKGTTD(SEQ ID NO24)制備的抗體GN-1187和GN-1188)的貯液濃度0.34mg/ml，以及抗-氧化還原酶IgG(從oxr肽1CTYWAVAKDPYASAGPAMNG(SEQ ID NO26)制備的抗體GN-2023和GN-12024)的貯液濃度0.26mg/ml)，用于探測所述硝酸纖維素膜。用抗兔辣根過氧化物酶(HRP)連接的第二抗體，按照廠家(New England Biolabs，Beverly，MA)的推薦檢測抗原。使用魯米諾試劑和過氧化物試劑(New England Biolabs，Beverly，MA)，按照廠家提供的方法檢測化學發光。使用X-OMAT AR膜(Eastman Kodak Company，Rocchester，NY)記錄發光。使用MinoltaDimage V數字照相機(Minolta Corporation，Ramsey，NJ)記錄圖像。
實施例22表征編碼11α羥化酶和氧化還原酶的赭曲霉基因組DNA可以使用上文所述方法鑒定在赭曲霉和密切相關的微生物的基因組內的編碼類固醇羥化酶和氧化還原酶的基因，所述密切相關的微生物包括黑曲霉和構巢曲霉。其它優選生物是米根霉、匍枝根霉、弗氏鏈霉菌、巨大芽孢桿菌、克羅斯韋假單胞菌、粉紅單端孢、Fusariumoxysporum f.sp.cepae、少根根霉和Monosporium olivaceum。已知具有類固醇11α羥化酶活性的其它優選生物在本發明上文詳細描述中描述。
簡要地說，制備基因組DNA并通過鳥槍法克隆進在細菌內繁殖的低拷貝人工染色體。測序大量克隆，以保證完整基因組的統計學代表性，融合重疊克隆的序列，產生基因組的最終圖譜和序列。對可讀框的分析將揭示與本發明類固醇羥化酶和氧化還原酶基因同源的區，以及與使用如BLAST、CLUSTAL W和BoxShade等程序找到與上述酶同源的翻譯可讀框區，所述程序用于對核苷酸和蛋白質序列數據進行多序列排列對比。從人工染色體獲得編碼這些蛋白的基因，再次克隆進表達載體如pFastBacl，將所述表達載體轉化進合適宿主細胞，然后測定能夠轉化類固醇底物成為其氧化對應物的酶的存在。
應當根據所附權利要求確定本發明的范圍。人們知道可以根據本文所述對本發明作出多種改變，而不偏離本發明的范圍和精神，并且不損害其任何好處。包括從已知進行類固醇底物的11α羥化的微生物(最好是真菌和細菌)分離同源基因。本發明還涉及取代任何類似成分。包括但不限于使用上述技術分離涉及類固醇形成的其它P450(包括在核心分子的其它位置作用的羥化酶)，以及應用這些酶在改良的宿主微生物中生物轉化類固醇中間體。
本文引用的所有參考文獻、專利或申請通過引用完整地結合到本文中，就如同在本文寫出一樣。
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<221>CDS<222>(146)...(1690)<223>赭曲霉11α羥化酶<400>1tggaagtttt tacacttatt atgccggagc cgaaagattc tgagtcgagg ggttggggaa 60caacactata agacctacaa ccacttggat ttggtgaatt tacacgggca ttatcaaaac120agccacaagc tgacagctca ttatc atg ccc ttc ttc act ggg ctt ctg gcg 172Met Pro Phe Phe Thr Gly Leu Leu Ala1 5att tac cat agt ctc ata ctc gac aac cca gtc caa acc ctg agc acc 220Ile Tyr His Ser Leu Ile Leu Asp Asn Pro Val Gln Thr Leu Ser Thr
10 15 20 25att gtc gta ttg gcg gca gcg tac tgg ctc gca acg ctc cag ccg agc 268Ile Val Val Leu Ala Ala Ala Tyr Trp Leu Ala Thr Leu Gln Pro Ser30 35 40gac ctt cct gag ctg aat ccc gcc aaa cca ttc gag ttc acc aat cgt 316Asp Leu Pro Glu Leu Ash Pro Ala Lys Pro Phe Glu Phe Thr Asn Arg45 50 55cgt cgt gtt cat gag ttt gtt gaa aat agt aag agc ttg ctt gct cgg 364Arg Arg Val His Glu Phe Val Glu Asn Ser Lys Ser Leu Leu Ala Arg60 65 70ggg agg gaa ttg cac ggg cac gag ccg tac aga ctc atg tct gaa tgg 412Gly Arg Glu Leu His Gly His Glu Pro Tyr Arg Leu Met Ser Glu Trp75 80 85gga tcc ttg att gtc ctg ccc cca gag tgc gcc gac gag ctg cgc aac 460Gly Ser Leu Ile Val Leu Pro Pro Glu Cys Ala Asp Glu Leu Arg Asn90 95 100 105gac cca aga atg gac ttt gag acg ccc acc acc gac gac tcc cac gga 508Asp Pro Arg Met Asp Phe Glu Thr Pro Thr Thr Asp Asp Ser His Gly110 115 120tat atc cct ggc ttc gac gct ctc aac gca gac ccg aac ctg act aaa 556Tyr Ile Pro Gly Phe Asp Ala Leu Asn Ala Asp Pro Asn Leu Thr Lys125 130 135gtg gtc acc aag tac ctc aca aaa gca ttg aac aag ctt act gct ccg 604Val Val Thr Lys Tyr Leu Thr Lys Ala Leu Asn Lys Leu Thr Ala Pro140 145 150atc tcg cat gaa gcg tcc atc gcc atg aaa gcg gtg ctg ggt gac gat 652Ile Ser His Glu Ala Ser Ile Ala Met Lys Ala Val Leu Gly Asp Asp155 160 165cca gat tgg cgt gag atc tac cca gcc aga gac ttg ctc cag ctc gtc 700Pro Asp Trp Arg Glu Ile Tyr Pro Ala Arg Asp Leu Leu Gln Leu Val170 175 180 185gcc cgg atg tcg aca aga gtg ttc ctt ggc gag gaa atg tgc aat aac 748Ala Arg Met Ser Thr Arg Val Phe Leu Gly Glu Glu Met Cys Asn Asn190 195 200cag gat tgg atc caa acc tca tca caa tac gcg gcc ctt gcc ttc ggt 796Gln Asp Trp Ile Gln Thr Ser Ser Gln Tyr Ala Ala Leu Ala Phe Gly205 210 215
gtc ggt gac aag ctt aga ata tac ccg aga atg atc aga ccg ata gta 844Val Gly Asp Lys Leu Arg Ile Tyr Pro Arg Met Ile Arg Pro Ile Val220 225 230cat tgg ttc atg cca tcc tgt tgg gag ctg cgc cga tcg ctg cga cgc 892His Trp Phe Met Pro Ser Cys Trp Glu Leu Arg Arg Ser Leu Arg Arg235 240 245tgc cga cag att ctc acg ccg tac att cac aaa cgc aag tcc ctg aag 940Cys Arg Gln Ile Leu Thr Pro Tyr Ile His Lys Arg Lys Ser Leu Lys250 255 260 265ggg acc acg gac gag cag ggc aag ccc ctt atg ttt gat gat tcc atc 988Gly Thr Thr Asp Glu Gln Gly Lys Pro Leu Met Phe Asp Asp Ser Ile270 275 280gag tgg ttc gag cga gag ctg ggt ccc aac cac gac gcg gtc ctg aag 1036Glu Trp Phe Glu Arg Glu Leu Gly Pro Asn His Asp Ala Val Leu Lys285 290 295cag gtc acg ctc tcc ata gtt gct atc cac acc acg agt gac cta ctc 1084Gln Val Thr Leu Ser Ile Val Ala Ile His Thr Thr Ser Asp Leu Leu300 305 310ttg cag gcc atg agc gat ctc gcg cag aac ccg aaa gtg cta caa gca 1132Leu Gln Ala Met Ser Asp Leu Ala Gln Asn Pro Lys Val Leu Gln Ala315 320 325gtg cgc gag gag gtg gtc cga gtg ctg agc acc gag ggg ctc agc aag 1180Val Arg Glu Glu Val Val Arg Val Leu Ser Thr Glu Gly Leu Ser Lys330 335 340 345gtc tcg ctt cac agt ctc aag ctc atg gac agc gcg ttg aag gaa agc 1228Val Ser Leu His Ser Leu Lys Leu Met Asp Ser Ala Leu Lys Glu Ser350 355 360cag cgt ctc agg cct acg ctt ctc ggc tcc ttt cgt cgg cag gca acg 1276Gln Arg Leu Arg Pro Thr Leu Leu Gly Ser Phe Arg Arg Gln Ala Thr365 370 375aat gac atc aag ctg aag agc ggg ttt gtc ata aag aaa ggg act aga 1324Asn Asp Ile Lys Leu Lys Ser Gly Phe Val Ile Lys Lys Gly Thr Arg380 385 390gtc gtg atc gac agc acc cat atg tgg aat ccc gag tat tac act gac 1372Val Val Ile Asp Ser Thr His Met Trp Asn Pro Glu Tyr Tyr Thr Asp395 400 405
cct ctc cag tac gac ggg tac cgc tac ttc aac aag cgg cag aca ccc 1420Pro Leu Gln Tyr Asp Gly Tyr Arg Tyr Phe Asn Lys Arg Gln Thr Pro410 415 420 425ggc gag gac aag aac gcg ttg ctc gtc agc aca agc gcc aac cac atg 1468Gly Glu Asp Lys Asn Ala Leu Leu Val Ser Thr Ser Ala Asn His Met430 435 440gga ttc ggt cac ggc gtt cac gcc tgt cct ggc aga ttc ttc gcc tcc 1516Gly Phe Gly His Gly Val His Ala Cys Pro Gly Arg Phe Phe Ala Ser445 450 455aac gag atc aag att gcc ttg tgt cat atc atc tta aat tat gag tgg 1564Asn Glu Ile Lys Ile Ala Leu Cys His Ile Ile Leu Asn Tyr Glu Trp460 465 470cgt ctt cca gac ggc ttc aag ccc cag cct ctc aac arc ggg atg act 1612Arg Leu Pro Asp Gly Phe Lys Pro Gln Pro Leu Asn Ile Gly Met Thr475 480 485tat ctg gcg gat ccc aat acc agg atg ctg atc agg cca cgc aag gcg 1660Tyr Leu Ala Asp Pro Asn Thr Arg Met Leu Ile Arg Pro Arg Lys Ala490 495 500 505gag atc gat atg gcg agt tta act gtg tag gtcgaacacg aagtcctgat 1710Glu Ile Asp Met Ala Ser Leu Thr Val *510gaagtgttat tggtcagtgg gtgaagcaag tcgcagaaat gtgtaacaat ttataagaat 1770aaaaaa 1776<210>2<211>514<212>PRT<213>赭曲霉<400>2Met Pro Phe Phe Thr Gly Leu Leu Ala Ile Tyr His Ser Leu Ile Leu1 5 10 15Asp Asn Pro Val Gln Thr Leu Ser Thr Ile Val Val Leu Ala Ala Ala20 25 30Tyr Trp Leu Ala Thr Leu Gln Pro Ser Asp Leu Pro Glu Leu Asn Pro35 40 45Ala Lys Pro Phe Glu Phe Thr Asn Arg Arg Arg Val His Glu Phe Val50 55 60Glu Asn Ser Lys Ser Leu Leu Ala Arg Gly Arg Glu Leu His Gly His65 70 75 80Glu Pro Tyr Arg Leu Met Ser Glu Trp Gly Ser Leu Ile Val Leu Pro85 90 95
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<221>CDS<222>(233)...(2320)<223>赭曲霉氧化還原酶<400>5
cttatttcgt ttaggaagag caccggcttc ggtgtccttc cttaccctct tattcttcct 60cttctgactc cctttttgtt attgatcgcc catctcggtg aacatttggg atatctttcc120ctctccccct cccgccccga ccctccttat cttctcctcc cgtccagcat ttagctcgcc180atcgaattcg caattccttc ctcgtgactc ttcatcgctg agcgtcctca tc atg gcg238Met Ala1caa ctc gat act ctc gat ttg gtc gtc ctg gtg gcg ctc ttg gtg ggt 286Gln Leu Asp Thr Leu Asp Leu Val Val Leu Val Ala Leu Leu Val Gly5 10 15agc gtg gcc tac ttc acc aag ggc acc tac tgg gcc gtc gcc aaa gac 334Ser Val Ala Tyr Phe Thr Lys Gly Thr Tyr Trp Ala Val Ala Lys Asp20 25 30cct tat gcc tcg gct ggt ccg gcg atg aat gga ggc gcc aag gcc ggc 382Pro Tyr Ala Ser Ala Gly Pro Ala Met Asn Gly Gly Ala Lys Ala Gly35 40 45 50aag act cgc gac att gtt cag aaa atg gac gaa act ggc aaa aac tgt 430Lys Thr Arg Asp Ile Val Gln Lys Met Asp Glu Thr Gly Lys Asn Cys55 60 65gtg att ttc tac ggc tcg caa acc ggt acc gct gag gac tac gcg tcc 478Val Ile Phe Tyr Gly Ser Gln Thr Gly Thr Ala Glu Asp Tyr Ala Ser70 75 80aga ctg gcc aag gaa ggc tcc cag cga ttc ggt ctc aag acc atg gtg 526Arg Leu Ala Lys Glu Gly Ser Gln Arg Phe Gly Leu Lys Thr Met Val85 90 95gcc gat ctg gag gac tac gac tac gaa aac ctg gaa aag ttc ccc gag 574Ala Asp Leu Glu Asp Tyr Asp Tyr Glu Asn Leu Glu Lys Phe Pro Glu100 105 110gac aag gtt gtt ttc ttc gtt ctg gcc act tat ggc gag ggt gaa ccc 622Asp Lys Val Val Phe Phe Val Leu Ala Thr Tyr Gly Glu Gly Glu Pro115 120 125 130acg gat aat gcg gtt gaa ttc tac cag ttc gtc acg ggc gaa gat gct 670Thr Asp Asn Ala Val Glu Phe Tyr Gln Phe Val Thr Gly Glu Asp Ala135 140 145gct ttc gag agc ggc gct acc gcc gac gat aag cct ctg tct tct ctc 718Ala Phe Glu Ser Gly Ala Thr Ala Asp Asp Lys Pro Leu Ser Ser Leu150 155 160aag tat gtc acg ttt ggt ctg ggt aac aac acc tat gag cac tac aac 766Lys Tyr Val Thr Phe Gly Leu Gly Asn Asn Thr Tyr Glu His Tyr Asn
165 170 175gct atg gtt cgc aat gtg gac gcc gct ctc aca aag ttc ggc gcc caa 814Ala Met Val Arg Asn Val Asp Ala Ala Leu Thr Lys Phe Gly Ala Gln180 185190cgc att ggc tct gct ggt gag ggt gac gac ggc gct ggt aca atg gaa 862Arg Ile Gly Ser Ala Gly Glu Gly Asp Asp Gly Ala Gly Thr Met Glu195 200205 210gag gat ttc ctg gcc tgg aag gaa ccc atg tgg gct gcc crt tct gag 910Glu Asp Phe Leu Ala Trp Lys Glu Pro Met Trp Ala Ala Leu Ser Glu215 220 225gcg atg aac ctg caa gag cgc gat gcg gtc tac gag ccg gtc ttc aat 958Ala Met Asn Leu Gln Glu Arg Asp Ala Val Tyr Glu Pro Val Phe Asn230 235 240gtc acc gag gac gag tcc ctg agc ccc gaa gat gag aac gtt tac ctc 1006Val Thr Glu Asp Glu Ser Leu Ser Pro Glu Asp Glu Asn Val Tyr Leu245 250 255ggt gag ccc act caa ggt cat ctc caa ggc gag ccc aag ggc ccg tac 1054Gly Glu Pro Thr Gln Gly His Leu Gln Gly Glu Pro Lys Gly Pro Tyr260 265 270tct gcg cac aac ccg ttc atc gct ccc atc tcc gaa tct cgt gaa ctg 1102Ser Ala His Asn Pro Phe Ile Ala Pro Ile Ser Glu Ser Arg Glu Leu275 280 285 290ttc aac gtc aag gac cgc aac tgt ctg cac atg gaa atc agc atc gcc 1150Phe Asn Val Lys Asp Arg Asn Cys Leu His Met Glu Ile Ser Ile Ala295 300 305ggt agc aac ctc act tac cag act ggt gac cac atc gct gtt tgg ccc 1198Gly Ser Asn Leu Thr Tyr Gln Thr Gly Asp His Ile Ala Val Trp Pro310 315 320acc aac gcc ggt tcc gag gtc gat cgg ttc ctg cag gct ttt ggt ctc 1246Thr Asn Ala Gly Ser Glu Val Asp Arg Phe Leu Gln Ala Phe Gly Leu325 330 335gaa gga aag cgc cac tcc gtc atc aac att aag ggt atc gat gtg acc 1294Glu Gly Lys Arg His Ser Val Ile Asn Ile Lys Gly Ile Asp Val Thr340 345 350gct aag gtt ccg att ccc act cct acg acc tat gac gcc gca gtt cgc 1342Ala Lys Val Pro Ile Pro Thr Pro Thr Thr Tyr Asp Ala Ala Val Arg355 360 365 370
tac tac ctg gaa gtc tgt gcc ccc gtt tcc cgt cag ttt gtc tcg act 1390Tyr Tyr Leu Glu Val Cys Ala Pro Val Ser Arg Gln Phe Val Ser Thr375 380 385ctc gct gcc ttt gcc cct gat gaa gcg acc aag gcg gag atc gtt cgt 1438Leu Ala Ala Phe Ala Pro Asp Glu Ala Thr Lys Ala Glu Ile Val Arg390 395 400ttg ggt ggc gac aag gac tat ttc cat gag aag att acc aac cga tgc 1486Leu Gly Gly Asp Lys Asp Tyr Phe His Glu Lys Ile Thr Asn Arg Cys405 410 415ttc aac atc gct cag gct ctc cag agc atc acg tcc aag cct ttc acc 1534Phe Asn Ile Ala Gln Ala Leu Gln Ser Ile Thr Ser Lys Pro Phe Thr420 425 430gcc gtc ccg ttc tcc ctg ctt atc gaa ggt atc acc aag ctt cag ccc 1582Ala Val Pro Phe Ser Leu Leu Ile Glu Gly Ile Thr Lys Leu Gln Pro435 440 445 450cgt tac tac tcg atc tcc tcg tct tcc ctg gtt cag aag gac aag att 1630Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser Ser Ser Ser Leu Val Gln Lys Asp Lys Ile455 460 465agc att acc gcc gtt gtg gag tcg gtt cgc ttg cct ggt gag gaa cac 1678Ser Ile Thr Ala Val Val Glu Ser Val Arg Leu Pro Gly Glu Glu His470 475 480att gtc aag ggt gtg acc acg aac tat ctt ctc gcg ctc aag gaa aag 1726Ile Val Lys Gly Val Thr Thr Asn Tyr Leu Leu Ala Leu Lys Glu Lys485 490 495caa aac ggc gag cct tcc cct gac ccg cac ggc ttg act tac tct atc 1774Gln Asn Gly Glu Pro Ser Pro Asp Pro His Gly Leu Thr Tyr Ser Ile500 505 510act gga ccc cgt aac aag tac gat ggc atc cat gtc ccc gtt cac gtc 1822Thr Gly Pro Arg Asn Lys Tyr Asp Gly Ile His Val Pro Val His Val515 520 525 530cgc cac tcg aac ttc aaa ttg ccc tcg gat ccc tcg cga cct gtg atc 1870Arg His Ser Asn Phe Lys Leu Pro Ser Asp Pro Ser Arg Pro Val Ile535 540 545atg gtt gga ccc ggt act ggt gtt gct cct ttc cgt ggg ttt atc cag 1918Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg Gly Phe Ile Gln550 555 560
gag cgt gct gcc ttg gcc gcg aag ggc gag aag gtc gga act acc ttg 1966Glu Arg Ala Ala Leu Ala Ala Lys Gly Glu Lys Val Gly Thr Thr Leu565 570 575ctt ttc ttc ggc tgc cgt aag tcc gac gaa gat ttc ttg tac aag gat2014Leu Phe Phe Gly Cys Arg Lys Ser Asp Glu Asp Phe Leu Tyr Lys Asp580 585 590gaa tgg aag act ttt cag gag cag ctt ggc gac tcg ctc aag atc atc 2062Glu Trp Lys Thr Phe Gln Glu Gln Leu Gly Asp Ser Leu Lys Ile Ile595 600 605 610act gcc ttc tct cgt gaa tcg gct gag aaa gtc tac gtc cag cac agg 2110Thr Ala Phe Ser Arg Glu Ser Ala Glu Lys Val Tyr Val Gln His Arg615 620 625ctg cgt gag cat gcc gag ctg gtc agt gac ctg ctg aag cag aaa gcc 2158Leu Arg Glu His Ala Glu Leu Val Ser Asp Leu Leu Lys Gln Lys Ala630 635 640act ttc tat gtt tgc ggt gac gct gcc aac atg gcc cgt gaa gtc aac 2206Thr Phe Tyr Val Cys Gly Asp Ala Ala Asn Met Ala Arg Glu Val Asn645 650 655ctc gtg ctt ggg caa atc att gcc aag cag cgc ggt ctc cct gcc gag 2254Leu Val Leu Gly Gln Ile Ile Ala Lys Gln Arg Gly Leu Pro Ala Glu660 665 670aag ggc gag gag atg gtg aag cac atg cgc agc agc ggc agc tac cag 2302Lys Gly Glu Glu Met Val Lys His Met Arg Ser Ser Gly Ser Tyr Gln675 680 685 690gac gat gtc tgg tcc taa aa 2322Asp Asp Val Trp Ser *695<210>6<211>695<212>PRT<213>赭曲霉<400>6Met Ala Gln Leu Asp Thr Leu Asp Leu Val Val Leu Val Ala Leu Leu1 5 10 15Val Gly Ser Val Ala Tyr Phe Thr Lys Gly Thr Tyr Trp Ala Val Ala20 25 30Lys Asp Pro Tyr Ala Ser Ala Gly Pro Ala Met Asn Gly Gly Ala Lys35 40 45
Ala Gly Lys Thr Arg Asp Ile Val Gln Lys Met Asp Glu Thr Gly Lys50 55 60Asn Cys Val Ile Phe Tyr Gly Ser Gln Thr Gly Thr Ala Glu Asp Tyr65 70 75 80Ala Ser Arg Leu Ala Lys Glu Gly Ser Gln Arg Phe Gly Leu Lys Thr85 90 95Met Val Ala Asp Leu Glu Asp Tyr Asp Tyr Glu Asn Leu Glu Lys Phe100 105 110Pro Glu Asp Lys Val Val Phe Phe Val Leu Ala Thr Tyr Gly Glu Gly115 120 125Glu Pro Thr Asp Asn Ala Val Glu Phe Tyr Gln Phe Val Thr Gly Glu130 135 140Asp Ala Ala Phe Glu Ser Gly Ala Thr Ala Asp Asp Lys Pro Leu Ser145 150 155 160Ser Leu Lys Tyr Val Thr Phe Gly Leu Gly Asn Asn Thr Tyr Glu His165 170 175Tyr Asn Ala Met Val Arg Asn Val Asp Ala Ala Leu Thr Lys Phe Gly180 185 190Ala Gln Arg Ile Gly Ser Ala Gly Glu Gly Asp Asp Gly Ala Gly Thr195 200 205Met Glu Glu Asp Phe Leu Ala Trp Lys Glu Pro Met Trp Ala Ala Leu210 215 220Ser Glu Ala Met Asn Leu Gln Glu Arg Asp Ala Val Tyr Glu Pro Val225 230 235 240Phe Asn Val Thr Glu Asp Glu Ser Leu Ser Pro Glu Asp Glu Asn Val245 250 255Tyr Leu Gly Glu Pro Thr Gln Gly His Leu Gln Gly Glu Pro Lys Gly260 265 270Pro Tyr Ser Ala His Asn Pro Phe Ile Ala Pro Ile Ser Glu Ser Arg275 280 285Glu Leu Phe Asn Val Lys Asp Arg Asn Cys Leu His Met Glu Ile Ser290 295 300Ile Ala Gly Ser Asn Leu Thr Tyr Gln Thr Gly Asp His Ile Ala Val305 310 315 320Trp Pro Thr Asn Ala Gly Ser Glu Val Asp Arg Phe Leu Gln Ala Phe325 330 335Gly Leu Glu Gly Lys Arg His Ser Val Ile Asn Ile Lys Gly Ile Asp340 345 350Val Thr Ala Lys Val Pro Ile Pro Thr Pro Thr Thr Tyr Asp Ala Ala355 360 365Val Arg Tyr Tyr Leu Glu Val Cys Ala Pro Val Ser Arg Gln Phe Val370 375 380Ser Thr Leu Ala Ala Phe Ala Pro Asp Glu Ala Thr Lys Ala Glu Ile385 390 395 400Val Arg Leu Gly Gly Asp Lys Asp Tyr Phe His Glu Lys Ile Thr Asn405 410 415Arg Cys Phe Asn Ile Ala Gln Ala Leu Gln Ser Ile Thr Ser Lys Pro420 425 430Phe Thr Ala Val Pro Phe Ser Leu Leu Ile Glu Gly Ile Thr Lys Leu
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<221>修飾堿基<222>(4)....(4)<223>I-肌苷<221>修飾堿基
<222>(10)...(10)<223>I-肌苷<221>修飾堿基<222>(16)...(16)<223>I-肌苷<221>misc_feature<222>(1)...(26)<223>n＝肌苷<400>12ttangaccan acatcntcct ggtagc 26<210>13<211>28<212>DNA<213>大腸桿菌引物pSport-for1<400>13caagctctaa tacgactcac tataggga 28<210>14<211>22<212>DNA<213>曲霉引物曲霉氧化還原酶-rev2<400>14caggaaccga tcgacctcgg aa 22<210>15<211>25<212>DNA<213>曲霉引物曲霉氧化還原酶-rev3<400>15gtcaccctca ccagcagagc caatg25<210>16<211>28<212>DNA<213>曲霉引物曲霉氧化還原酶-rev4<400>16ccacattgcg aaccatagcg ttgtagtg 28<210>17<211>34<212>DNA
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<223>具有NotI位點聚dT尾的合成接頭<221>misc_structure<222>(1)...(1)<223>第一個堿基磷酸化<400>58gactagttct agatcgcgag cggccgccct tttttttttt tttt 44<210>59<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>SalI接頭的上面一條鏈<400>59tcgacccacg cgtccg16<210>60<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>SalI接頭的下面一條鏈，第一個堿基磷酸化
<221>misc_feature<222>(1)...(1)<223>第一個堿基磷酸化<400>60gcctgcgcac cc12<210>61<211>21<212>DNA<213>人氧化還原酶引物1C<400>61gtggaccaca agctcgtact g 21<210>62<211>22<212>DNA<213>人氧化還原酶引物2C<400>62catcgaccac ctgtgtgagc tg 22<210>63<211>22<212>DNA<213>人氧化還原酶引物2D<400>63gtacaggtag tcctcatccg ag 22<210>64<211>3710<212>DNA<213>黑曲霉NADP CYP450氧化還原酶Z26838<400>64cctgtatcct gataactcct cagcaaatcg gagtaaacag aaggacaagt cattggagta 60ctaagtagct ccgtgtcaga gacccggaca ggatcagctt ctccgaaccc gagactccgg 120gcgaaaaggc caccatcgct caggctacca cctgtgttcc ttccgtcgat cgtcctccct 180cgtttccggc tcacggcccc ccaaattatt gcggtctgct tagcagtggg ttcggcctct 240ctgttcttcc tggatcacac cacggcttac tttcttatcc ttttcctttt cctttcttcc 300tttcttcctg ttctcctttc ttcctttcca cccccttctt tcttttaacc ccatagcgtc 360attctttctt ccgttttatc tttggttttg ggacgccgcc accttatctc ggttcctgcc 420tcggtctccg gtgatcgcac ctggataggc taagcgtagg gaggtgtgac attcttcttt 480cacctcctct ccttttcccg cctcactccg ttcaatcccc cgctccaccc tttcagactc 540gccatcgtat caagtcgggg cctttgcttg cgccgctgaa cagcctcacc atggcgcaac 600tcgataccct cgatctggtg gtcctggcgg tgcttttggt gggtagcgtg gcctacttca 660
ccaagggcac ctactgggca gttgcaaaga cccgtatgcc tctaccggcc ccgcggatga 720acggcgccgc taaggctggc aagactcgga acatcattga gaagatggaa gaaacgggca 780agaattgtgt tattttctac ggatcgcaaa ctggaaccgc tgaggactac gcctccagat 840tggccaagga aggatctcag cgcttcggcc tcaagaccat ggtggctgac ctcgaggaat 900acgactatga gaacctggac caattcccgg aggacaaggt tgcgtttttc gtgctcgcca 960cctacggaga gggtgagcct acggataatg ctgttgagtt ctaccagttc ttcaccggtg1020acgacgttgc ttttgagagc gcgtccgcgg acgagaagcc tctgtccaag ctgaagtatg1080ttgctttcgg tctgggtaac aacacttatg agcactacaa cgccatggtt cgtcaagtcg1140atgctgcttt ccagaagctc gggccgcagc gtattggttc tgctggcgag ggtgatgacg1200gtgccggtac aatggaagaa gacttcttgg cctggaagga gcccatgtgg gcagcactgt1260cggagtcgat ggatctcgaa gagcgtgaag cggtctacga acctgttttc tgcgtcaccg1320aaaacgagtc cctgagccct gaggacgaga cggtctatct tggagagccc acccagagcc1380accttcaggg tactcccaaa ggcccgtact ctgcgcacaa cccctttatc gcccctattg1440ccgaatctcg tgagcttttc accgtcaagg atcgcaactg tctgcacatg gaaattagca1500tcgctggaag taacttgtcc taccagactg gtgaccacat cgctgtttgg cccacaaacg1560ctggtgccga agtggatcgg ttccttcagg tcttcggtct cgagggcaag cgtgattcgg1620tcatcaacat caagggtatc gatgttacgg ccaaggtccc aatcccgacc ccgaccacgt1680acgatgccgc tgttcggtac tatatggaag tctgcgcccc tgtgtcccgt cagtttgtag1740ccactctggc cgcgttcgct ccgatgagga aagcaaggca gagattgtgc gtctgggtag1800cacaaggact atttccacga gaaggtcacc aaccaatgct tcaacatgcc caggctcttc1860agagcatcac gtccaagcct ttctctgctg ttccgttctc tctgcttatt gaaggcatta1920cgaagctgca gcctcgctac tactcgatct cttcgtcctc ccttgtccag aaggacaaga1980tcagcatcac ggccgttgtg gaatctgttc gtctgcccgg tgcctctcac atggtgaagg2040gtgtgactac gaattatctc ctcgcgctca agcagaagca gaacgggcga tccctctccc2100gaccctcacg gcttgactta ctccatcacg gtccccggaa caagtacgac ggtatccacg2160ttcccgtgca tgttcgccac tcgaacttca agctgccctc tgatccctct cggcccatta2220tcatggttgg tcctggtact ggtgttgctc ctttccgtgg tttcattcag gaacgtgctg2280ctttggcggc caagggcgag aaggttggac ccactgttct cttcttcggt tgccgcaaga2340gtgacgagga tttcttgtac aaggatgaat ggaaggtaag atatcttttt ttcttttccg2400cagctacctt catacatctc ggatgctaac atatcgcgat tcgcagacct atcaggacca2460gcttggagac aacttgaaga tcatcactgc gttctcgcgt gagggtcctc agaaggtcta2520cgttcagcac agactccgcg agcactccga acttgtcagc gaccttctga agcagaaagc2580taccttctac gtctgtggtg acgctgcaaa catggctcgc gaggttaacc ttgtgcttgg2640ccagatcatt gctgcgcagc gtggtctgcc cgccgagaag ggcgaagaaa tggtcaagca2700catgcgtaga cgtggacgct accaggaaga tgtgtggtca taatctttca atgcatcgac2760ttttctttct tgtctatcac gacggccttc tcgatccatt attttattta acgcctagat2820gatctttgca tatatactcc gctgattttg cctattcatc tgttttgctt ggcgtggttt2880atgtatgcct agtttatttg ttttgtgcac cgaccggcca gccacacatt gaagtggctt2940gagcatgagt gcggtagcca gtgtcgaaag aacaggatag acgatcatga ttattgcggg3000aacatgttat gccattctgg gcatattgat atctggttgc atgagcccag aggatacgaa3060aagatgaatc catatttaat ttgcacaata cttttcgcct tcttcatcta gtaattaaat3120taattgagca ctgaccgaac gagctgacac ctgctgctcg gaatagccga caacgcattg3180acgtgcaaga gatgcataat cattacaatc aacaagtaga ctggtaacta aatcactgaa3240tactacagtt actgcctact ttcagccaaa aagtaatact gaagatttcg gggaatcaaa3300tagaagaaac atgcataagc ccaacctcgg caataccggg agttaagcac agtaaccaaa3360accaaaccaa actagaaccg gcgcgcgacc agtgacccat cgtcattccc ggtatcagca3420gttcagtcag actggctggc tagcccgaac ccaactgccg caatcatcca tccatcctca3480acccgcccct cccatgccaa cctctctact ccgcagagcg agggacaaaa aaatgagatg3540cagcaattaa ccacgataat ctagcaaaaa gaaagttaga agccggaaga acatacatat3600
cgcttttacc gctgttcgac tgcgacgacg ggtcttgaga gcagttccgc cacgtgggcg3660aaaagctgga ctgcacacta cttacgctac cctacgctac ctcggtaccc 3710<210>65<211>693<212>PRT<213>黑曲霉NADPCYP450氧化還原酶CAA81550<400>65Met Ala Gln Leu Asp Thr Leu Asp Leu Val Val Leu Ala Val Leu Leu1 5 10 15Val Gly Ser Val Ala Tyr Phe Thr Lys Gly Thr Tyr Trp Ala Val Ala20 25 30Lys Thr Arg Met Pro Leu Pro Ala Pro Arg Met Asn Gly Ala Ala Lys35 40 45Ala Gly Lys Thr Arg Asn Ile Ile Glu Lys Met Glu Glu Thr Gly Lys50 55 60Asn Cys Val Ile Phe Tyr Gly Ser Gln Thr Gly Thr Ala Glu Asp Tyr65 70 75 80Ala Ser Arg Leu Ala Lys Glu Gly Ser Gln Arg Phe Gly Leu Lys Thr85 90 95Met Val Ala Asp Leu Glu Glu Tyr Asp Tyr Glu Asn Leu Asp Gln Phe100 105 110Pro Glu Asp Lys Val Ala Phe Phe Val Leu Ala Thr Tyr Gly Glu Gly115 120 125Glu Pro Thr Asp Asn Ala Val Glu Phe Tyr Gln Phe Phe Thr Gly Asp130 135 140Asp Val Ala Phe Glu Ser Ala Ser Ala Asp Glu Lys Pro Leu Ser Lys145 150 155 160Leu Lys Tyr Val Ala Phe Gly Leu Gly Asn Asn Thr Tyr Glu His Tyr165 170 175Asn Ala Met Val Arg Gln Val Asp Ala Ala Phe Gln Lys Leu Gly Pro180 185 190Gln Arg Ile Gly Ser Ala Gly Glu Gly Asp Asp Gly Ala Gly Thr Met195 200 205Glu Glu Asp Phe Leu Ala Trp Lys Glu Pro Met Trp Ala Ala Leu Ser210 215 220Glu Ser Met Asp Leu Glu Glu Arg Glu Ala Val Tyr Glu Pro Val Phe225 230 235 240Cys Val Thr Glu Asn Glu Ser Leu Ser Pro Glu Asp Glu Thr Val Tyr245 250 255Leu Gly Glu Pro Thr Gln Ser His Leu Gln Gly Thr Pro Lys Gly Pro260 265 270Tyr Ser Ala His Asn Pro Phe Ile Ala Pro Ile Ala Glu Ser Arg Glu275 280 285Leu Phe Thr Val Lys Asp Arg Asn Cys Leu His Met Glu Ile Ser Ile290 295 300Ala Gly Ser Asn Leu Ser Tyr Gln Thr Gly Asp His Ile Ala Val Trp305 310 315 320
Pro Thr Asn Ala Gly Ala Glu Val Asp Arg Phe Leu Gln Val Phe Gly325 330 335Leu Glu Gly Lys Arg Asp Ser Val Ile Asn Ile Lys Gly Ile Asp Val340 345 350Thr Ala Lys Val Pro Ile Pro Thr Pro Thr Thr Tyr Asp Ala Ala Val355 360 365Arg Tyr Tyr Met Glu Val Cys Ala Pro Val Ser Arg Gln Phe Val Ala370 375 380Thr Leu Ala Ala Phe Ala Pro Met Arg Lys Ala Arg Gln Arg Leu Cys385 390 395 400Val Trp Val Ala Gln Gly Leu Phe Pro Arg Glu Gly His Gln Pro Met405 410 415Leu Gln His Ala Gln Ala Leu Gln Ser Ile Thr Ser Lys Pro Phe Ser420 425 430Ala Val Pro Phe Ser Leu Leu Ile Glu Gly Ile Thr Lys Leu Gln Pro435 440 445Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser Ser Ser Ser Leu Val Gln Lys Asp Lys Ile450 455 460Ser Ile Thr Ala Val Val Glu Ser Val Arg Leu Pro Gly Ala Ser His465 470 475 480Met Val Lys Gly Val Thr Thr Asn Tyr Leu Leu Ala Leu Lys Gln Lys485 490 495Gln Asn Gly Arg Ser Leu Ser Arg Pro Ser Arg Leu Asp Leu Leu His500 505 510His Gly Pro Arg Asn Lys Tyr Asp Gly Ile His Val Pro Val His Val515 520 525Arg His Ser Asn Phe Lys Leu Pro Ser Asp Pro Ser Arg Pro Ile Ile530 535 540Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg Gly Phe Ile Gln545 550 555 560Glu Arg Ala Ala Leu Ala Ala Lys Gly Glu Lys Val Gly Pro Thr Val565 570 575Leu Phe Phe Gly Cys Arg Lys Ser Asp Glu Asp Phe Leu Tyr Lys Asp580 585 590Glu Trp Lys Thr Tyr Gln Asp Gln Leu Gly Asp Asn Leu Lys Ile Ile595 600 605Thr Ala Phe Ser Arg Glu Gly Pro Gln Lys Val Tyr Val Gln His Arg610 615 620Leu Arg Glu His Ser Glu Leu Val Ser Asp Leu Leu Lys Gln Lys Ala625 630 635 640Thr Phe Tyr Val Cys Gly Asp Ala Ala Asn Met Ala Arg Glu Val Asn645 650 655Leu Val Leu Gly Gln Ile Ile Ala Ala Gln Arg Gly Leu Pro Ala Glu660 665 670Lys Gly Glu Glu Met Val Lys His Met Arg Arg Arg Gly Arg Tyr Gln675 680 685Glu Asp Val Trp Ser690
權利要求
1.一種分離純化的核酸，所述核酸編碼赭曲霉(Aspergillusochraceus)11α羥化酶。
2.一種分離的DNA，所述DNA編碼赭曲霉11α羥化酶。
3.一種分離的eDNA，所述cDNA編碼赭曲霉11α羥化酶。
4.一種分離的基因，所述基因編碼赭曲霉11α羥化酶。
5.一種基因的分離的等位基因，所述基因編碼赭曲霉11α羥化酶。
6.一種分離純化的核酸，其中所述核酸序列為SEQ ID NO1。
7.一種分離的DNA，其中所述DNA序列為SEQ ID NO1。
8.一種分離的cDNA，其中所述cDNA序列為SEQ ID NO1。
9.一種分離的基因，其中所述基因序列為SEQ ID NO1。
10.一種基因的分離的等位基因，其中所述基因序列為SEQ IDNO1。
11.一種分離的蛋白，所述蛋白具有赭曲霉11α羥化酶的氨基酸序列。
12.一種分離的蛋白變異體，所述蛋白具有赭曲霉11α羥化酶的氨基酸序列。
13.一種融合蛋白，所述融合蛋白包含赭曲霉11α羥化酶的氨基酸序列。
14.一種分離的蛋白，其中所述蛋白的氨基酸序列為SEQ IDNO2。
15.一種分離的蛋白變異體，其中所述蛋白的氨基酸序列為SEQID NO2。
16.一種純化多肽，所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO2，并且具有至少一個保守氨基酸取代。
17.一種純化多肽，所述多肽的氨基酸序列包含與SEQ ID NO2至少99％相同的序列。
18.一種純化多肽，所述多肽的氨基酸序列包含與SEQ ID NO2至少95％相同的序列。
19.一種純化多肽，所述多肽的氨基酸序列包含與SEQ ID NO2至少90％相同的序列。
20.一種純化多肽，所述多肽的氨基酸序列包含與SEQ ID NO2至少75％相同的序列。
21.一種純化多肽，所述多肽的氨基酸序列包含與SEQ ID NO2至少50％相同的序列。
22.一種分離純化的核酸，所述核酸編碼赭曲霉11α氧化還原酶。
23.一種分離的DNA，所述DNA編碼赭曲霉氧化還原酶。
24.一種分離的cDNA，所述cDNA編碼赭曲霉氧化還原酶。
25.一種分離的基因，所述基因編碼赭曲霉氧化還原酶。
26.一種基因的分離的等位基因，所述基因編碼赭曲霉氧化還原酶。
27.一種分離純化的核酸，其中所述核酸序列為SEQ ID NO5。
28.一種分離的DNA，其中所述DNA序列為SEQ ID NO5。
29.一種分離的cDNA，其中所述cDNA序列為SEQ ID NO5。
30.一種分離的基因，其中所述基因序列為SEQ ID NO5。
31.一種基因的分離的等位基因，其中所述基因序列為SEQ IDNO5。
32.一種分離的蛋白，所述蛋白具有赭曲霉氧化還原酶的氨基酸序列。
33.一種分離的蛋白變異體，所述蛋白具有赭曲霉氧化還原酶的氨基酸序列。
34.一種融合蛋白，所述融合蛋白包含赭曲霉氧化還原酶的氨基酸序列。
35.一種分離的蛋白，其中所述蛋白的氨基酸序列為SEQ IDNO6。
36.一種分離的蛋白變異體，其中所述蛋白的氨基酸序列為SEQID NO6。
37.一種純化多肽，所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO6，并且具有至少一個保守氨基酸取代。
38.一種純化多肽，所述多肽的氨基酸序列包含與SEQ ID NO6至少99％相同的序列。
39.一種純化多肽，所述多肽的氨基酸序列包含與SEQ ID NO6至少95％相同的序列。
40.一種純化多肽，所述多肽的氨基酸序列包含與SEQ ID NO6至少90％相同的序列。
41.一種純化多肽，所述多肽的氨基酸序列包含與SEQ ID NO6至少75％相同的序列。
42.一種純化多肽，所述多肽的氨基酸序列包含與SEQ ID NO6至少50％相同的序列。
43.一種分離純化的核酸，所述核酸編碼可以催化如下反應的酶3酮δ4，5類固醇(3酮δ4類固醇)、3酮δ4，5δ6，7類固醇(3酮δ4δ6類固醇)、3酮δ6，7類固醇(3酮δ6類固醇)或3酮δ1，2δ4，5類固醇(3酮δ1δ4類固醇)的11α羥化。
44.權利要求43的分離純化核酸，其中所述酶不催化以下反應3酮δ4，5類固醇、3酮δ4，5δ6，7類固醇或3酮δ6，7類固醇的15β羥化。
45.權利要求43或權利要求44的分離純化核酸，其中所述羥化反應選自以下(a)從坎利酮到11α羥基坎利酮；(b)從雄甾烯二酮到11α羥基雄甾烯二酮；(c)從aldona到11α羥基aldona；(d)從ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羥基ADD；(e)從孕甲酯丙酸酮(mexrenone)到11α羥基孕甲酯丙酸酮；(f)從6β孕甲酯丙酸酮到11α羥基6β孕甲酯丙酸酮；(g)從9α孕甲酯丙酸酮到11α羥基9α孕甲酯丙酸酮；(h)從12β孕甲酯丙酸酮到11α羥基12β孕甲酯丙酸酮；(i)從δ12孕甲酯丙酸酮到11α羥基δ12孕甲酯丙酸酮；(j)從睪酮到11α羥基睪酮；(k)從孕酮到11α羥基孕酮；(l)從孕甲酯丙酸酮6，7-二內酯到11α羥基孕甲酯丙酸酮6，7-二內酯；(m)從孕甲酯丙酸酮7，9-二內酯到11α羥基孕甲酯丙酸酮7，9-二內酯。
46.權利要求45的分離純化核酸，其中所述羥化反應選自以下(a)從坎利酮到11α羥基坎利酮；(b)從雄甾烯二酮到11α羥基雄甾烯二酮；(c)從aldona到11α羥基aldona；(d)從ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羥基ADD。
47.權利要求46的分離純化核酸，其中所述羥化反應是從坎利酮到11α羥基坎利酮。
48.一種表達蛋白的方法，所述蛋白能夠催化3酮δ4，5類固醇、3酮δ4，5δ6，7類固醇、3酮δ6，7類固醇或3酮δ1，2δ4，5類固醇的11α羥化，所述方法包括(a)用表達盒轉化或轉染宿主細胞，所述表達盒包含啟動子和與之有效連接的編碼所述蛋白的核酸，(b)在所述宿主細胞中表達所述蛋白。
49.權利要求48的生產蛋白的方法，所述方法還包括回收所述蛋白的步驟。
50.權利要求48或權利要求49的方法，其中所述蛋白是赭曲霉11α羥化酶。
51.權利要求50的方法，所述方法還包括表達電子供體蛋白，其中所述電子供體蛋白能夠為催化以下反應的所述蛋白提供電子3酮δ4，5類固醇、3酮δ4，5δ6，7類固醇、3酮δ6，7類固醇或3酮δ1，2δ4，5類固醇的11α羥化。
52.權利要求51的方法，其中所述電子供體蛋白選自人氧化還原酶和赭曲霉氧化還原酶。
53.權利要求51的方法，其中所述電子供體蛋白是赭曲霉氧化還原酶。
54.權利要求51的方法，其中編碼所述類固醇11α羥化酶和所述電子供體蛋白的核酸在獨立表達盒上。
55.權利要求51的方法，其中編碼所述類固醇11α羥化酶和所述電子供體蛋白的核酸在同一表達盒上。
56.權利要求54或權利要求55的方法，其中所述類固醇11α羥化酶是赭曲霉11α羥化酶，所述電子供體蛋白是人氧化還原酶。
57.權利要求54或權利要求55的方法，其中所述類固醇11α羥化酶是赭曲霉11α羥化酶，所述電子供體蛋白是赭曲霉氧化還原酶。
58.權利要求48的方法，其中所述表達盒在表達載體上。
59.權利要求58的方法，其中所述表達載體是一種桿狀病毒。
60.權利要求59的方法，其中所述桿狀病毒是選自以下的核型多角體病毒苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體病毒和家蠶(Bombyx mori)核型多角體病毒。
61.權利要求60的方法，其中所述核型多角體病毒是苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒。
62.權利要求58的方法，其中所述宿主細胞是昆蟲細胞。
63.權利要求62的方法，其中所述昆蟲細胞選自以下秋粘蟲(Spodoptera frugiperda)細胞、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)細胞、苜蓿銀紋夜蛾細胞和煙草天蛾(Manduca sexta)細胞。
64.權利要求63的方法，其中所述昆蟲細胞是秋粘蟲細胞。
65.權利要求48到權利要求64中任一項的方法，其中所述赭曲霉11α羥化酶是SEQ ID NO2。
66.權利要求48到權利要求64中任一項的方法，其中所述人氧化還原酶是SEQ ID NO4。
67.權利要求48到權利要求64中任一項的方法，其中所述赭曲霉氧化還原酶是SEQ ID NO6。
68.一種分離純化的多肽，所述多肽能夠催化以下反應3酮δ4，5類固醇(3酮δ4類固醇)、3酮δ4，5δ6，7類固醇(3酮δ4δ6類固醇)、3酮δ6，7類固醇(3酮δ6類固醇)或3酮δ1，2δ4，5類固醇(3酮δ1δ4類固醇)的11α羥化。
69.權利要求68的分離純化多肽，其中所述酶不催化以下反應3酮δ4，5類固醇、3酮δ4，5δ6，7類固醇或3酮δ6，7類固醇的15β羥化。
70.權利要求68或權利要求69的分離純化多肽，其中所述羥化反應選自以下(a)從坎利酮到11α羥基坎利酮；(b)從雄甾烯二酮到11α羥基雄甾烯二酮；(c)從aldona到11α羥基aldona；(d)從ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羥基ADD；(e)從孕甲酯丙酸酮到11α羥基孕甲酯丙酸酮；(f)從6β孕甲酯丙酸酮到11α羥基6β孕甲酯丙酸酮；(g)從9α孕甲酯丙酸酮到11α羥基9α孕甲酯丙酸酮；(h)12β孕甲酯丙酸酮到11α羥基12β孕甲酯丙酸酮；(i)從δ12孕甲酯丙酸酮到11α羥基δ12孕甲酯丙酸酮；(j)從睪酮到11α羥基睪酮；(k)從孕酮到11α羥基孕酮；(l)從孕甲酯丙酸酮6，7-二內酯到11α羥基孕甲酯丙酸酮6，7-二內酯；(m)從孕甲酯丙酸酮7，9-二內酯到11α羥基孕甲酯丙酸酮7，9-二內酯。
71.權利要求70的分離純化多肽，其中所述羥化反應選自以下(a)從坎利酮到11α羥基坎利酮；(b)從雄甾烯二酮到11α羥基雄甾烯二酮；(c)從aldona到11α羥基aldona；(d)從ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羥基ADD。
72.權利要求71的分離純化的酶，其中所述羥化反應是從坎利酮到11α羥基坎利酮。
73.一種表達盒，所述表達盒包含啟動子以及與之有效連接的編碼一種多肽的分離純化核酸，所述多肽催化3酮δ4，5類固醇(3酮δ4類固醇)、3酮δ4，5δ6，7類固醇(3酮δ4δ6類固醇)、3酮δ6，7類固醇(3酮δ6類固醇)或3酮δ1，2δ4，5類固醇(3酮δ1δ4類固醇)的11α羥化。
74.權利要求73的表達盒，其中所述多肽不催化3酮δ4，5類固醇、3酮δ4，5δ6，7類固醇或3酮δ6，7類固醇的15β羥化。
75.權利要求73或權利要求74的表達盒，其中所述羥化反應選自以下(a)從坎利酮到11α羥基坎利酮；(b)從雄甾烯二酮到11α羥基雄甾烯二酮；(c)從aldona到11α羥基aldona；(d)從ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羥基ADD；(e)從孕甲酯丙酸酮到11α羥基孕甲酯丙酸酮；(f)從6β孕甲酯丙酸酮到11α羥基6β孕甲酯丙酸酮；(g)從9α孕甲酯丙酸酮到11α羥基9α孕甲酯丙酸酮；(h)12β孕甲酯丙酸酮到11α羥基12β孕甲酯丙酸酮；(i)從δ12孕甲酯丙酸酮到11α羥基δ12孕甲酯丙酸酮；(j)從睪酮到11α羥基睪酮；(k)從孕酮到11α羥基孕酮；(l)從孕甲酯丙酸酮6，7-二內酯到11α羥基孕甲酯丙酸酮6，7-二內酯；(m)從孕甲酯丙酸酮7，9-二內酯到11α羥基孕甲酯丙酸酮7，9-二內酯。
76.權利要求75的表達盒，其中所述羥化反應選自以下(a)從坎利酮到11α羥基坎利酮；(b)從雄甾烯二酮到11α羥基雄甾烯二酮；(c)從aldona到11α羥基aldona；(d)從ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羥基ADD。
77.權利要求76的表達盒，其中所述羥化反應是從坎利酮到11α羥基坎利酮。
78.一種表達盒，所述表達盒包含啟動子以及與之有效連接的編碼赭曲霉氧化還原酶的分離純化核酸。
79.權利要求78的表達盒，其中所述核酸是SEQ ID NO06。
80.一種表達盒，所述表達盒包含編碼從谷固醇合成依普利酮的代謝途徑中一種酶的異源DNA，其中所述酶催化選自以下的至少一種轉化(a)從坎利酮到11α羥基坎利酮；(b)從雄甾烯二酮到11α羥基雄甾烯二酮；(c)從alona到11α羥基aldona；(d)從ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羥基ADD；(e)從孕甲酯丙酸酮到11α羥基孕甲酯丙酸酮；(f)從6β孕甲酯丙酸酮到11α羥基6β孕甲酯丙酸酮；(g)從9α孕甲酯丙酸酮到11α羥基9α孕甲酯丙酸酮；(h)12β孕甲酯丙酸酮到11α羥基12β孕甲酯丙酸酮；(i)從δ12孕甲酯丙酸酮到11α羥基δ12孕甲酯丙酸酮；(j)從睪酮到11α羥基睪酮；(k)從孕酮到11α羥基孕酮；(l)從孕甲酯丙酸酮6，7-二內酯到11α羥基孕甲酯丙酸酮6，7-二內酯；(m)從孕甲酯丙酸酮7，9-二內酯到11α羥基孕甲酯丙酸酮7，9-二內酯；并且其中所述異源DNA與在重組宿主中表達其編碼的酶所需的控制序列有效連接。
81.依照權利要求80的表達盒，所述表達盒的特征在于所述異源DNA編碼序列選自以下屬和物種赭曲霉、赭曲霉、黑曲霉(Aspergillusniger)、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)、米根霉(Rhizopus oryzae)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、克羅斯韋假單胞菌(Pseudomonascruciviae)、粉紅單端孢(Trichothecium roseum)、尖鐮孢(Fusariumoxysporum)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、藍色梨頭霉(Absidiacoerula)、灰綠梨頭霉(Absidia glauca)、雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)、黃柄曲霉(Aspergillus flavipes)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、白僵菌(Beauveria bassiana)、Botryosphaeria obtusa、Calonectria decora、螺卷毛殼(Chaetomium cochliodes)、山扁豆生棒孢(Corynespora cassiicoa)、短刺小克銀汗霉(Cunninghamellablakesleeana)、刺孢小克銀汗霉(Cunninghamella echinulata)、雅致小克銀汗霉(Cunninghamella elegans)、Curvularia clavata、彎孢(Curvularialunata)、Cylindrocarpon radicicola、Epicoccum humicola、卵形孢球托霉(Gongronella butleri)、金孢菌寄生(Hypomyces chrysospermus)、Monosporium olivaceum、深黃被孢霉(Mortierella isabellina)、大毛霉(Mucor mucedo)、灰藍毛霉(Mucor griseocyanus)、疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)、Nocardia corallina、Paecilomyces carneus、展青霉(Penicillum patulum)、Pithomyces atroolivaceus、Pithomycescynodontis、Pycnosporium sp.、紅色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythrae)、黃瘤孢(Sepedonium chrysospermum)、Stachylidium bicolor、吸水鏈霉菌(Streptomyces hyqroscopicus)、淺絳紅鏈霉菌(Streptomycespurpurascens)、總狀共頭霉(Syncephalastrum racemosum)、Thamnostylum piriforme、Thielavia terricola和可可輪枝孢(Verticilliumtheobromae)、Cephalosporium aphidicola、Cochliobolus lunatas、Tieghemella orchidis、Tieghemella hyalospora、Monosporiumolivaceum、焦曲霉(Aspergillus ustus)、禾本科鐮孢(Fusariumgraminearum)、灰綠輪枝孢(Verticillium glaucum)和Rhizopusnigricans。
82.依照權利要求81的表達盒，其中所述屬和物種選自以下赭曲霉、赭曲霉、黑曲霉、構巢曲霉、米根霉、匍枝根霉、弗氏鏈霉菌、巨大芽孢桿菌、克羅斯韋假單胞菌、粉紅單端孢、尖鐮孢、少根根霉和Monosporium olivaceum。
83.依照權利要求82的表達盒，其中所述屬種是赭曲霉。
84.一種重組宿主細胞及其后代，所述重組宿主細胞及其后代包含至少一種依照權利要求80的表達盒。
85.依照權利要求84的重組宿主細胞及其后代，其中所述宿主是一種微生物。
86.依照權利要求85的重組宿主細胞及其后代，其中所述宿主是一種細菌。
87.一種制造一種或多種酶的方法，所述酶來自從谷固醇合成依普利酮的代謝途徑，所述方法包括在表達和積累所述異源DNA所編碼的一種或多種酶的條件下，在營養培養基中培養權利要求86的重組宿主細胞。
88.一種將化合物選擇性氧化成為羥化產物的方法，所述方法包括下面步驟(a)在羥化所述化合物并積累所述羥化產物的條件下，在權利要求86的重組宿主細胞存在下溫育需要羥化的化合物，然后(b)回收所述羥化產物。
89.一種在體外將化合物選擇性羥化成為羥化產物的方法，所述方法包括下面步驟(a)在羥化所述化合物并積累所述羥化產物的條件下，在用權利要求88的方法生產的酶存在下溫育需要羥化的化合物，然后(b)回收所述羥化產物。
90.攜帶權利要求73到83中任一項的表達盒的宿主細胞。
91.權利要求90的宿主細胞，其中所述表達盒整合入所述宿主細胞的染色體。
92.權利要求90的宿主細胞，其中所述表達盒整合入一種表達載體。
93.一種測定克隆的11α羥化酶的比活的方法，所述方法包括下面步驟(a)用表達載體轉化宿主細胞，所述表達載體包含編碼所述11α羥化酶的核酸；(b)在所述宿主細胞中表達所述11α羥化酶；(c)從所述細胞制備亞細胞膜組份；(d)將所述亞細胞膜組份微粒體與類固醇底物溫育，然后(e)監測所述類固醇底物轉化為其11α羥基類固醇對應物的轉化情況。
94.權利要求93的方法，所述方法還包括用編碼氧化還原酶的表達載體核酸轉化宿主細胞，然后在所述宿主細胞中表達所述氧化還原酶。
95.權利要求94的方法，其中所述氧化還原酶來自人或赭曲霉。
96.權利要求95的方法，其中所述氧化還原酶是人氧化還原酶。
97.權利要求95的方法，其中所述氧化還原酶是赭曲霉氧化還原酶。
98.一種具有SEQ ID NO2的蛋白及其變異體，所述變異體與SEQID NO2至少95％相同，它們催化3酮δ4，5類固醇、3酮δ4，5δ6，7類固醇、3酮δ6，7類固醇或3酮δ1，2δ4，5類固醇的11α羥化，其中所述羥化反應選自以下(a)從坎利酮到11α羥基坎利酮；(b)從雄甾烯二酮到11α羥基雄甾烯二酮；(c)從aldona到11α羥基aldona；(d)從ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羥基ADD；(e)從孕甲酯丙酸酮到11α羥基孕甲酯丙酸酮；(f)從6β孕甲酯丙酸酮到11α羥基6β孕甲酯丙酸酮；(g)從9α孕甲酯丙酸酮到11α羥基9α孕甲酯丙酸酮；(h)12β孕甲酯丙酸酮到11α羥基12β孕甲酯丙酸酮；(i)從δ 12孕甲酯丙酸酮到11α羥基δ12孕甲酯丙酸酮；(j)從睪酮到11α羥基睪酮；(k)從孕酮到11α羥基孕酮；(l)從孕甲酯丙酸酮6，7-二內酯到11α羥基孕甲酯丙酸酮6，7-二內酯；(m)從孕甲酯丙酸酮7，9-二內酯到11α羥基孕甲酯丙酸酮7，9-二內酯。
99.權利要求98的蛋白，所述蛋白不催化3酮δ4，5類固醇、3酮δ4，5δ6，7類固醇或3酮δ6，7類固醇的15β羥化。
100.一種純化多肽，所述多肽的氨基酸序列選自SEQ IDNO23、SEQ ID NO24、SEQ ID NO25。
101.一種純化免疫原性多肽，所述多肽的氨基酸序列包含SEQ IDNO2的至少十個連續殘基。
102.一種分離純化的抗體，所述抗體對具有SEQ ID NO2氨基酸序列的11α羥化酶具有結合特異性。
103.權利要求102的抗體，所述抗體結合選自以下的蛋白區(a)SEQ ID NO2的N末端氨基酸1-10；(b)SEQ ID NO2的最后10個C末端氨基酸；(c)氨基酸SEQ ID NO23；(d)氨基酸SEQ ID NO24；(e)氨基酸SEQ ID NO25。
104.權利要求102或權利要求103的抗體，其中所述抗體在肽柱上純化，其中所述肽選自(a)SEQ ID NO2的N末端氨基酸1-10；(b)SEQ ID NO2的最后10個C末端氨基酸；(c)氨基酸SEQ ID NO23；(d)氨基酸SEQ ID NO24；(e)氨基酸SEQ ID NO25。
105.一種純化多肽，所述多肽的氨基酸序列選自SEQ ID NO26。
106.一種純化免疫原性多肽，所述多肽的氨基酸序列包含SEQ IDNO6的至少十個連續殘基。
107.一種分離純化的抗體，所述抗體對具有SEQ ID NO6氨基酸序列的11α羥化酶具有結合特異性。
108.權利要求107的抗體，所述抗體結合選自以下的蛋白區(a)SEQ ID NO6的N末端氨基酸1-10；(b)SEQ ID NO6的最后10個C末端氨基酸；(c)氨基酸SEQ ID NO26。
109.權利要求107或權利要求108的抗體，其中所述抗體在肽柱上純化，其中所述肽選自(a)SEQ ID NO6的N末端氨基酸1-10；(b)SEQ ID NO6的最后10個C末端氨基酸；(c)氨基酸SEQ ID NO26。
110.一種組合物，所述組合物包含權利要求102、103、104、107、108或109的抗體以及有效載體、媒介物或輔助劑。
111.一種組合物，所述組合物包含權利要求102、103、104、107、108或109的抗體以及溶液。
112.權利要求102、103、104、107、108或109的抗體，其中所述抗體是多克隆抗體。
113.權利要求102、103、104、107、108或109的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
114.權利要求102、103、104、107、108或109的抗體，所述抗體綴合免疫親和基質。
115.一種方法，其利用權利要求114的免疫親合基質從生物體液或細胞裂解物中純化多肽。
116.權利要求114的抗體，其中所述免疫親和基質是SEPHAROSE 4B。
117.一種方法，其利用權利要求116的免疫親合基質從生物體液或細胞裂解物中純化多肽。
118.一種使用肽柱純化抗體的方法，其中所述肽選自以下(a)SEQ ID NO2的N末端氨基酸1-10；(b)SEQ ID NO2的最后10個C末端氨基酸；(c)氨基酸SEQ ID NO23；(d)氨基酸SEQ ID NO24；(e)氨基酸SEQ ID NO25。
119.一種使用肽柱純化抗體的方法，其中所述肽選自以下(a)SEQ ID NO6的N末端氨基酸1-10；(b)SEQ ID NO6的最后10個C末端氨基酸；(c)氨基酸SEQ ID NO26。
120.一種檢測生物體液中的第一種多肽的方法，其中所述第一種多肽是11α羥化酶或氧化還原酶，所述方法包括以下步驟(a)使所述體液與第二種多肽接觸，所述第二種多肽對所述第一種多肽具有結合特異性，然后(b)測定所述第二種多肽的存在，從而確定所述第一種多肽的水平。
121.權利要求120的方法，其中所述第二種多肽是抗體。
122.權利要求120或權利要求121的方法，其中所述第二種多肽進行了放射性標記。
123.一種生產分離核酸的方法，所述方法包括在6XSSC中于65℃使SEQ ID NO1與基因組DNA雜交，然后分離用SEQ ID NO1檢測到的核酸。
124.根據權利要求123的方法制備的分離DNA核酸。
125.一種分離的核酸，所述核酸在高度嚴格條件下與SEQ IDNO1序列的互補物特異性雜交。
123.一種生產分離核酸的方法，所述方法包括在6XSSC中于65℃使SEQ ID NO5與基因組DNA雜交，然后分離用SEQ ID NO5檢測到的核酸。
124.根據權利要求123的方法制備的分離DNA核酸。
125.一種分離的核酸，所述核酸在高度嚴格條件下與SEQ IDNO5序列的互補物特異性雜交。
126.一種DNA構建物，當將所述DNA構建物插入細胞的染色體DNA時，所述DNA構建物改變通常在所述細胞內不表達的類固醇11α羥化酶基因的表達，所述DNA構建物包括a)導向序列；b)調節序列；c)類固醇11α羥化酶的結構基因。
127.攜帶權利要求126的DNA構建物的宿主細胞。
128.攜帶克隆的11α羥化酶的宿主細胞的應用，所述宿主細胞用于生產治療性用于治療心臟病、炎癥、關節炎或癌癥的藥物。
129.一種組合物，所述組合物包含約0.5-500g/L糖蜜，0.5-50g/L玉米漿，0.5-50g/L KH2PO4，2.5-250g/L NaCl，2.5-250g/L葡萄糖和0.04-4g/L孕酮，pH 3.5-7。
130.一種組合物，所述組合物包含約10-250g/L糖蜜，1-25g/L玉米漿，1-25g/L KH2PO4，5-125g/L NaCl，5-125g/L葡萄糖和0.08-2g/L孕酮，pH4.5-6.5。
131.一種組合物，所述組合物包含約25-100g/L糖蜜，2.5-10g/L玉米漿，2.5-10g/L KH2PO4，12.5-50g/L NaCl，12.5-50g/L葡萄糖和0.2-8g/L孕酮，pH5.5-6.0。
132.一種組合物，所述組合物包含約50g/L糖蜜，5g/L玉米漿，5g/L KH2PO4，25g/L NaCl，25g/L葡萄糖，20g/L瓊脂和0.4g/L孕酮，pH5.8。
133.權利要求129-132中任一項的組合物，所述組合物還包含約4-100g/L瓊脂。
134.權利要求129-132中任一項的組合物，所述組合物還包含約10-40g/L瓊脂。
135.權利要求129-132中任一項的組合物，所述組合物還包含約20g/L瓊脂。
136.權利要求129-135中任一項的組合物的應用，所述組合物用于生產選自以下的微生物的孢子赭曲霉、黑曲霉、構巢曲霉、米根霉、匍枝根霉和粉紅單端孢、尖鐮孢、少根根霉、Monosporiumolivaceum、產黃青霉(Penicillum chrysogenum)和藍色梨頭霉。
136.權利要求129-135中任一項的組合物的應用，所述組合物用于生產赭曲霉孢子。
全文摘要
本發明涉及新型細胞色素P450樣酶(赭曲霉)，所述酶分離自赭曲霉孢子mRNA產生的cDNA文庫。當編碼所述11α羥化酶的cDNA與編碼作為電子供體的人氧化還原酶的cDNA在秋粘蟲(Spodopterafrugiperda)(Sf－9)昆蟲細胞內共表達時，根據HPLC分析，所述11α羥化酶成功催化從類固醇底物4－雄烯－3，17－二酮(AD)到11α－羥基－AD的轉化。本發明還涉及與這些cDNA有關的核酸分子或衍生自這些cDNA的核酸分子，包括它們的互補物、同源物和片段，以及使用這些核酸分子產生例如多肽及其片段的方法。本發明還涉及產生識別赭曲霉11α羥化酶和氧化還原酶的抗體，以及使用這些抗體檢測分別在未改變的宿主細胞和轉化的宿主細胞內的這些天然和重組多肽的存在的方法。本發明還提供下面方法在異源宿主細胞內分別表達或聯合表達曲霉(Aspergillus)11α羥化酶基因和人或曲霉氧化還原酶，以便有利于類固醇底物到它們的11α羥基對應物的生物轉化。
文檔編號C07K16/40GK1531590SQ01821405
公開日2004年9月22日 申請日期2001年10月26日 優先權日2000年10月30日
發明者蘇珊尼·博爾藤, 羅伯特·克萊頓, 阿倫·伊斯頓, 勒斯利·恩格爾, 迪安·梅辛, J·S·吳, B·雷茨, M·C·瓦爾克, P·T·王, 克萊頓, 恩格爾, 伊斯頓, 吳, 梅辛, 王, 瓦爾克, 蘇珊尼 博爾藤 申請人:法馬西亞公司