專利名稱：物質gm-95的制備方法
技術領域：
本發明涉及具有抗癌活性的物質GM-95的制備方法及制備該物質的中間體。
即，本發明涉及下面通式[I]表示的物質GM-95的制備方法，其特征在于，(a)將下面通式[II]表示的環狀化合物的縮醛保護基(R1)脫保護，使其生成甲酰基，并且通過生成的甲酰基與酰胺基的分子內閉環反應，形成噁唑環，和(b)將得到的下面通式[III]表示的環狀化合物的硫醇基的保護基(R2)脫保護，使其生成硫醇基，并且通過生成的硫醇基與酰胺基的分子內閉環反應，形成噻唑啉環。 式中，R1相同或不同，各表示低級烷基，R2表示硫醇基的保護基。 其中，R2的定義同上。 另外，本發明涉及可用作制備物質GM-95的中間體的上述通式[II]和[III]表示的環狀化合物。
具體來說，本發明提供以下發明。
第1項通式[I]表示的物質GM-95的制備方法，其特征在于，將通式[III]表示的環狀化合物的硫醇基的保護基(R2)脫保護，使其生成硫醇基，通過生成的硫醇基與酰胺基的分子內閉環反應，形成噻唑啉環。
第2項通式[I]表示的物質GM-95的制備方法，其特征在于，(a)將通式[II]表示的環狀化合物的縮醛保護基(R1)脫保護，使其生成甲酰基，并且通過生成的甲酰基與酰胺基的分子內閉環反應，形成噁唑環，和(b)將得到的通式[III]表示的環狀化合物的硫醇基的保護基(R2)脫保護，使其生成硫醇基，并且通過生成的硫醇基與酰胺基的分子內閉環反應，形成噻唑啉環。
第3項通式[II]表示的環狀化合物。
第4項通式[III]表示的環狀化合物。
第5項通式[II]表示的環狀化合物的制備方法，其特征在于，(a)將通式[IV-a]表示的縮醛衍生物與通式[V-a]表示的硫醇衍生物脫水縮合，和(b)將得到的通式[VI]表示的酰胺衍生物的氨基保護基(R4)及羧基保護基(R3)脫保護后，進行分子內環化， 其中，R1的定義同上，R3表示羧基的保護基， 其中，R2的定義同上，R4表示氨基的保護基， 其中，R1、R2、R3和R4的定義同上。
6.通式[II]表示的環狀化合物的制備方法，其特征在于，(a)將通式[IV-b]表示的縮醛衍生物與通式[V-b]表示的硫醇衍生物脫水縮合，(b)將得到的通式[VII]表示的酰胺衍生物的氨基的保護基(R5)及羧基的保護基(R6)脫保護后，進行分子內環化， 其中，R1的定義同上，R5表示氨基的保護基， 其中R2的定義同上，R6表示羧基的保護基， 其中，R1、R2、R5和R6的定義同上。
本發明涉及的GM-95的制備方法的路線圖如下所示。
在本發明中，作為R1表示的低級烷基，可以例舉甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基等含1-6個碳原子的直鏈或支鏈低級烷基，優選甲基、乙基，更優選甲基。
作為R2表示的保護基，可以例舉Greene著“有機合成中的保護基”(Protective Groups in Organic Synthesis，1981年發行)記載的保護基，例如，芐基、對甲氧基芐基、4-甲基芐基、3，4-二甲基芐基、對羥基芐基、對乙酰氧基芐基、對硝基芐基等未被取代的或取代的芐基、二苯甲基、三苯甲基、叔丁基、乙酰基、苯甲酰基等，優選芐基、對甲氧基芐基、4-甲基芐基、3，4-二甲基芐基、對羥基芐基、對乙酰氧基芐基、對硝基芐基等未被取代的或取代的芐基、二苯甲基、三苯甲基、叔丁基，更優選芐基、三苯甲基、叔丁基。
在本發明中，作為R3或R6表示的羧基的保護基，可以例舉上述Greene著“有機合成中的保護基”中記載的保護基，例如甲基、乙基、丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基等含1-6個碳原子的直鏈或支鏈低級烷基、烯丙基、芐基、二苯甲基等，優選R3或R6為甲基或乙基。
作為R4或R5表示的氨基的保護基，可以例舉上述Greene著“有機合成中的保護基”中記載的保護基，例如，甲氧羰基、9-芴基甲氧羰基、環丙基甲氧羰基、環丙基甲氧羰基、二異丙基甲氧羰基、2-呋喃基甲氧羰基、異丁氧羰基、叔丁氧羰基、芐氧羰基、甲酰基等，優選R4或R5為叔丁氧羰基或芐氧羰基。
從化合物[II]制備化合物[I](物質GM-95)的步驟(a)從化合物[II]制備化合物[III]本步驟是將通式[I]表示的環狀化合物的縮醛保護基(R1)脫保護，并通過生成的甲酰基與酰胺基的分子內閉環反應形成噁唑環的步驟。
i)在上述反應中，將縮醛保護基(R1)脫保護時，在適當的溶劑中、酸存在下進行。作為溶劑，只要不參與反應即可，例如，四氫呋喃、二氧六環、乙酸乙酯等。這些溶劑可單獨使用，或者也可混合使用。作為使用的酸，可以例舉三氟乙酸、甲酸等有機酸、或氯化氫、硫酸等無機酸。另外，使用的酸本身也可作為溶劑使用。酸的使用量相對于通式[II]表示的化合物1摩爾為100-2000摩爾，優選500-1000摩爾。反應溫度為室溫至約100℃，優選約40-80℃。反應時間為約1-48小時，優選約10-30小時。
ii)接下來，為通過上述脫保護生成的甲酰基與酰胺基的分子內閉環反應形成噁唑環，需要在適當溶劑中，使甲酰基與酰胺基間發生脫水反應。作為所使用的溶劑，只要不參與反應即可，例如，氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、二甲基甲酰胺等。這些溶劑可以單獨使用，或者也可混合使用。作為在脫水反應中使用的脫水劑，可以例舉三價的磷/鹵素/有機叔胺的組合，優選三苯膦/碘/三乙胺的組合。相對于將通式[II]化合物的縮醛保護基脫保護得到的化合物1摩爾，它們的使用比例為三價的磷為1-5摩爾，鹵素為1-5摩爾，有機叔胺為2-10摩爾。具體地，相對于將通式[II]化合物的縮醛保護基脫保護得到的化合物1摩爾，三苯膦為1-5摩爾，碘為1-5摩爾，三乙胺為2-10摩爾。
關于添加順序，優選在三價的磷與鹵素的混合物中添加將通式[II]化合物的縮醛保護基脫保護得到的化合物及有機叔胺。反應溫度為約0-100℃，優選約20-50℃。反應時間為約1-36小時，優選約12-24小時。
通過本反應得到的通式[III]表示的化合物可以在分離后、或者不分離而用于下一反應步驟。進行分離時，可以通過通常的提純方法，例如萃取、濃縮、結晶、柱色譜等操作進行提純。
(b)從化合物[III]制備化合物[I]本步驟是將通式[III]表示的環狀化合物的硫醇保護基(R2)脫保護，使其生成硫醇基，然后通過硫醇基與酰胺基的分子內閉環反應形成噻唑啉環的步驟。
使用(a)中得到的通式[III]表示的環狀化合物，通過在適當溶劑中、在強酸性條件下進行反應，同時進行硫醇基保護基(R2)的脫保護和分子內閉環反應，生成通式[I]表示的物質GM-95。作為溶劑，只要不參與反應即可，例如，氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、二甲基甲酰胺等，優選二氯甲烷。這些溶劑可以單獨使用，或者也可混合使用。作為設定強酸性條件中使用的酸，可以例舉四氯化鈦、三氟乙酸/茴香醚、氟化氫/茴香醚、氯化氫/乙酸、HF等，優選四氯化鈦。酸的使用量相對于通式[III]表示的化合物1摩爾為1-100摩爾，優選30-60摩爾。反應溫度為約0-100℃，優選20-40℃。反應時間為1-5天，優選2-4天。
通過本反應得到的通式[I]表示的物質GM-95，可以通過通常的提純方法，例如萃取、濃縮、結晶、柱色譜等操作提純。
從化合物[IV-a]和化合物[V-a]制備化合物[II]的步驟(a)從化合物[IV-a]和化合物[V-a]制備化合物[VI]本步驟是使通式[IV-a]表示的縮醛衍生物與通式[V-a]表示的硫醇衍生物在適當溶劑中發生分子間脫水縮合的步驟。
作為所述分子間脫水縮合反應中使用的溶劑，只要不參與反應即可，例如氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、乙腈、二甲基甲酰胺等，優選二甲基甲酰胺。這些溶劑可以單獨使用，或者也可混合使用。作為使用的脫水縮合劑，可以例舉，二環己基碳二亞胺、水溶性碳二亞胺、氰基磷酸二乙酯、疊氮基磷酸二苯酯、三苯膦/偶氮二甲酸二乙酯等，優選水溶性碳二亞胺。作為水溶性碳二亞胺，優選1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽。反應時，相對于通式[IV-a]表示的化合物1摩爾，可以使用通式[V-a]表示的化合物0.8-1.2摩爾，脫水縮合劑1-2摩爾、優選1.0-1.3摩爾。而且，為促進反應及抑制副反應，優選加入1-羥基苯并三唑一水合物，其使用比例相對于通式[IV-a]表示的化合物1摩爾為約1-1.5摩爾。反應溫度為約0-100℃，優選約10-30℃。反應時間為6-30小時，優選約8-24小時。
通過本反應得到的通式[VI]表示的化合物可以在分離后、或者不分離而用于下一反應步驟。進行分離時，可以通過通常的提純方法，例如萃取、濃縮。結晶、柱色譜等操作進行提純。
(b)從化合物[VI]制備化合物[II]本步驟是將化合物[VI]表示的酰胺衍生物的羧基保護基及氨基保護基(R3和R4)脫保護后，通過胺基與羧基的分子內脫水縮合進行分子內環化的步驟。
i)上述反應中，通式[VI]表示的酰胺衍生物的羧基的保護基(R3)或氨基的保護基(R4)的脫保護按以下方法進行。
通式[VI]表示的酰胺衍生物的氨基保護基(R4)脫保護時，在適當溶劑中、酸存在下進行。作為溶劑，只要不參與反應即可，例如，二氯甲烷、甲醇、乙醇、四氫呋喃、二甲基甲酰胺等，優選二氯甲烷、甲醇。它們可以單獨使用，也可以混合使用。作為使用的酸，可以例舉如氯化氫、硫酸等無機酸、三氟乙酸、甲酸等有機酸，優選氯化氫。
在該步驟中，選擇R4與R1使得R4被選擇性脫保護而R1不受影響是優選的。R4與R1的優選組合是，R4為叔丁氧羰基，R1為甲基。
在本步驟中，為防止R1的脫保護，在無水條件下進行。酸的使用量相對于基質1摩爾為1-10摩爾，優選4-6摩爾。反應溫度為約0-80℃，優選約20-50℃。反應時間為約1-24小時，優選約8-18小時。
通式[VI]表示的酰胺衍生物的羧基保護基(R3)的脫保護時，在適當溶劑中、堿的存在下進行。作為溶劑，只要不參與反應即可，例如，甲醇、乙醇、四氫呋喃、二甲基甲酰胺等，優選甲醇。這些溶劑可以單獨使用，或者也可以混合使用。作為使用的堿，可以例舉氫氧化鈉、氫氧化鉀等。堿的使用量相對于基質1摩爾為1-10摩爾，優選2-6摩爾。反應溫度為約0-80℃，優選約20-50℃。反應時間為約1-24小時，優選約4-18小時。
在該步驟中，選擇R2與R3使得R3被選擇性脫保護而R2不受影響是優選的。R2與R3的優選組合為，R2是三苯甲基，R3為甲基或乙基。
上述酸處理及堿處理的順序是哪個在先都可以，但優選在酸處理后進行堿處理。
ii)上述脫保護后，通過在適當溶劑中進行分子內脫水縮合反應，可以得到通式[II]表示的環狀化合物。作為溶劑，只要不參與反應即可，例如，氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、二甲基甲酰胺等，優選二甲基甲酰胺，這些溶劑可以單獨使用，或者也可以混合使用。作為脫水縮合劑，可以例舉二環己基碳二亞胺、水溶性碳二亞胺、氰基磷酸二乙酯、疊氮基磷酸二苯酯、三苯膦/偶氮二甲酸二乙酯，優選疊氮基磷酸二苯酯。此時，為抑制分子間的反應，優選將化合物[VI]的羧基保護基及氨基保護基脫保護后的化合物的濃度高度稀釋后進行反應。化合物[VI]的羧基保護基及氨基保護基脫保護后的化合物的反應濃度為1-100mM，優選2-20mM。另外，相對于化合物[VI]的羧基保護基及氨基保護基脫保護后的化合物1摩爾，脫水縮合劑的用量可以為0.8-3摩爾，優選1-2摩爾。
為促進反應及抑制副反應，優選同時存在1-羥基苯并三唑一水合物、4-二甲胺基吡啶、三乙胺。其使用比例是，相對于化合物[VI]的羧基保護基及氨基保護基脫保護后的化合物1摩爾，1-羥基苯并三唑一水合物為1-1.5摩爾，4-二甲胺基吡啶為1-1.5摩爾，三乙胺為1-2摩爾。反應溫度為約10-60℃，優選約25-35℃。反應時間為約1-6天，優選約2-4天。
通過本反應得到的通式[II]表示的環狀化合物，必要時可以通過通常的提純方法，例如，萃取、濃縮、結晶、柱色譜等操作進行提純。
從化合物[IV-b]和化合物[V-b]制備化合物[II]的步驟(a)從化合物[IV-b]和化合物[V-b]制備化合物[VII]本步驟是在適當溶劑中，使通式[IV-b]表示的縮醛衍生物和通式[V-b]表示的硫醇衍生物發生分子間脫水縮合的步驟。
作為上述分子間脫水縮合反應中使用的溶劑，只要不參與反應即可，例如，氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、乙腈、二甲基甲酰胺等，優選二甲基甲酰胺，這些溶劑可以單獨使用，或者也可以混合使用。作為使用的脫水縮合劑，可以例舉二環己基碳二亞胺、水溶性碳二亞胺、氰基磷酸二乙酯、疊氮基磷酸二苯酯、三苯膦/偶氮二甲酸二乙酯等，優選水溶性碳二亞胺。作為水溶性碳二亞胺，優選1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽。反應時，相對于通式[IV-b]表示的化合物1摩爾，通式[V-b]表示的化合物的使用量可以為0.8-1.2摩爾，脫水縮合劑的使用量可以為1-2摩爾、優選1.0-1.3摩爾。為促進反應及抑制副反應，優選加入1-羥基苯并三唑一水合物，其使用比例相對于通式[IV-b]表示的化合物1摩爾為約1-1.5摩爾。反應溫度為約0-100℃，優選約10-30℃。反應時間為約4-30小時，優選約8-24小時。
通過本反應得到的通式[VII]表示的化合物可以在分離后、或者可以不分離而用于下一反應步驟。進行分離時，可以通過通常的提純方法，例如，萃取、濃縮、結晶、柱色譜等操作進行提純。
(b)從化合物[VII]制備化合物[II]本步驟是將通式[VII]表示的酰胺衍生物的氨基保護基及羧基保護基(R5和R6)脫保護后，通過胺基與羧基的分子內脫水縮合進行分子內環化的步驟。
i)上述反應中，將通式[VII]表示的酰胺衍生物的羧基保護基及氨基保護基(R5和R6)脫保護時，可以按照與通式[VI]表示的酰胺衍生物的羧基保護基(R3)或氨基保護基(R4)的脫保護同樣的方法進行。
具體地，將通式[VII]表示的酰胺衍生物的氨基保護基(R5)脫保護時，在適當的溶劑、酸的存在下進行。作為溶劑，只要不參與反應即可，例如，二氯甲烷、甲醇、乙醇、四氫呋喃、二甲基甲酰胺等，優選二氯甲烷、甲醇。這些溶劑可以單獨使用，或者也可以混合使用。作為使用的酸，可以例舉氯化氫、硫酸等無機酸、三氟乙酸、甲酸等有機酸，優選氯化氫。
在該步驟中，選擇R5與R1使得R5被選擇性脫保護而R1不受影響是優選的。R5與R1的優選組合是，R5為叔丁氧羰基，R1為甲基。
在本步驟中，為防止R1的脫保護，在無水條件下進行。酸的使用量相對于基質1摩爾為1-10摩爾，優選4-6摩爾。反應溫度為約0-80℃，優選約20-50℃。反應時間為約1-24小時，優選約8-18小時。
通式[VII]表示的酰胺衍生物的羧基保護基(R6)的脫保護時，在適當的溶劑中、堿的存在下進行。作為溶劑，只要不參與反應即可，例如，甲醇、乙醇、四氫呋喃、二甲基甲酰胺等，優選甲醇。這些溶劑可以單獨使用，或者也可以混合使用。作為使用的堿，可以例舉氫氧化鈉、氫氧化鉀等。堿的使用量相對于基質1摩爾為1-10摩爾，優選2-6摩爾。反應溫度為約0-80℃，優選約20-50℃。反應時間為約1-24小時，優選約4-20小時。
在該步驟中，選擇R2與R6使得R6被選擇性脫保護而R2不受影響是優選的。R2與R6的優選組合為，R2是三苯甲基，R6為甲基或乙基。
上述酸處理及堿處理的順序是哪個在先都可以，但優選在酸處理后進行堿處理。
ii)上述脫保護后，通過在適當溶劑中進行分子內脫水縮合反應，可以得到通式[II]表示的環狀化合物。分子內脫水縮合反應可以利用上述的反應(從[VI]制備[II])。
具體地，作為溶劑，只要不參與反應即可，例如，氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、二甲基甲酰胺等，優選二甲基甲酰胺，這些溶劑可以單獨使用，或者也可以混合使用。作為脫水縮合劑，可以例舉二環己基碳二亞胺、水溶性碳二亞胺、氰基磷酸二乙酯、疊氮基磷酸二苯酯、三苯膦/偶氮二甲酸二乙酯，優選疊氮基磷酸二苯酯。此時，為抑制分子間的反應，優選將化合物[VII]的羧基保護基及氨基保護基脫保護后的化合物的濃度高度稀釋后進行反應。化合物[VII]的羧基保護基及氨基保護基脫保護后的化合物的反應濃度為1-100mM，優選2-20mM。另外，相對于化合物[VII]的羧基保護基及氨基保護基脫保護后的化合物1摩爾，脫水縮合劑的用量可以為0.8-3摩爾，優選1-2摩爾。
為促進反應及抑制副反應，優選同時存在1-羥基苯并三唑一水合物、4-二甲胺基吡啶、三乙胺。其使用比例是，相對于化合物[VII]的羧基保護基及氨基保護基脫保護后的化合物1摩爾，1-羥基苯并三唑一水合物為1-1.5摩爾，4-二甲胺基吡啶為1-1.5摩爾，三乙胺為1-2摩爾。
反應溫度為約10-60℃，優選約25-35℃。反應時間為約1-6天，優選約2-4天。
通過本反應得到的通式[II]表示的環狀化合物，必要時可以通過通常的提純方法，例如，萃取、濃縮、結晶、柱色譜等操作進行提純。
作為原料的通式[IV-a]、[IV-b]、[V-a]或[V-b]表示的三噁唑衍生物或者是公知的化合物，或者可以根據例如J.Org.Chem.，58，1575(1993)；J.Org.Chem.，58，3604(1993)；Tetrahedron Lett.，33，6267(1992)；Tetrahedron Lett.，35，2477(1994)；Tetrahedron，51，7321(1995)；J.Am.Chem.Soc.，115，8449(1993)；Tetrahedron Lett.，27，163(1986)；J.Org.Chem.，43，1624(1978)；Tetrahedron Lett.，38，331(1997)等文獻記載的方法進行合成。
另外，在本發明中，由于用作原料的化合物的不對稱碳原子，使得每個反應步驟都可能存在光學異構體或非對映異構體，但這些異構體的任一種，或者它們的混合物形式也包含在本發明中，可以用于本發明的反應步驟中。
例如，本發明的反應路線中，如果化合物[V-a]或[V-b]中的*表示的不對稱碳原子的立體構型為R型，則化合物[I]中的噻唑啉環中的*表示的不對稱碳原子的立體構型也是R型；如果化合物[V-a]或[V-b]中的*表示的不對稱碳原子的立體構型為S型，則化合物[I]中的噻唑啉環中的*表示的不對稱碳原子的立體構型也是S型。另外，如果化合物[V-a]或[V-b]中的*表示的不對稱碳原子的立體構型為RS型，則化合物[I]中的噻唑啉環中的*表示的不對稱碳原子的立體構型也是RS型，并且必要時可以進行旋光拆分。
圖2是使用參考例3記載的國際公開WO00/24747號記載的物質GM-95生產菌得到的GM-95(天然品)和本發明的實施例6得到的GM-95(合成品)的紫外吸收光譜圖。
圖3是使用參考例3記載的國際公開WO00/24747號記載的物質GM-95生產菌得到的GM-95(天然品)和本發明的實施例6得到的GM-95(合成品)的HPLC譜圖。
以下，通過參考例、實施例更詳細地說明本發明，但這些實施例不是對本發明范圍的限定。參考例12-{2-[2-(1-氨基-2，2-二甲氧基乙基)-1，3-噁唑-4-基]-1，3-噁唑-4-基}-1，3-噁唑-4-羧酸甲酯(化合物1)的合成([IV-a]) 根據J.Org.Chem.，58，1575(1993)；J.Org.Chem.，58，3604(1993)；Tetrahedron Lett.，33，6267(1992)；Tetrahedron Lett.，35，2477(1994)；Tetrahedron，51，7321(1995)；J.Am.Chem.Soc.，115，8449(1993)；Tetrahedron Lett.，27，163(1986)；J.Org.Chem.，43，1624(1978)；Tetrahedron Lett.，38，331(1997)等文獻記載的方法進行合成，得到作為白色固體的標題化合物3.90g(收率92.0％)。物理性質如下所示。
mp186～188℃1H-NMR(CDCl3)δ8.43(s，1H)，8.34(s，1H)，8.32(s，1H)，4.62(d，J＝5.7Hz，1H)，4.29(d，J＝5.7Hz，1H)，3.95(s，3H)，3.48(s，3H)，3.43(s，3H)，1.72(brs，2H)陽離子FAB-MSm/z＝365[M+H]+。參考例22-{2-[2-(1-叔丁氧羰基氨基-2-三苯甲基硫乙基)-5-甲基-1，3-噁唑-4-基]-5-甲基-1，3-噁唑-4-基}-1，3-噁唑-4-羧酸(化合物2)的合成([V-a]) 根據J.Org.Chem.，58，1575(1993)；J.Org.Chem.，58，3604(1993)；Tetrahedron Lett.，33，6267(1992)；Tetrahedron Lett.，35，2477(1994)；Tetrahedron，51，7321(1995)；J.Am.Chem.Soc.，115，8449(1993)；Tetrahedron Lett.，27，163(1986)；J.Org.Chem.，43，1624(1978)；Tetrahedron Lett.，38，331(1997)等文獻記載的方法進行合成，得到標題化合物。物理性質如下所示。
1H-NMR(CDCl3)δ9.45-8.75(brs，1H)，8.37(s，1H)，7.48-7.15(m，15H)，5.43-5.25(m，1H)，4.95-4.77(m，1H)，2.79(s，3H)，2.88-2.60(m，2H)，2.68(s，3H)，1.43(s，9H)陽離子FAB-MSm/z＝715[M+Na]+。實施例1下述化合物3的合成 化合物3將2.5g(3.5mmol)參考例2得到的化合物2溶解于脫水的二甲基甲酰胺30ml中，冰冷下加入1-羥基苯并三唑一水合物590mg(3.85mmol)、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽800mg(4.17mmol)、含有1.34g(3.68mmol)參考例1得到的化合物1的脫水的二甲基甲酰胺溶液40ml，然后在室溫下攪拌15小時。減壓蒸餾反應液除去溶劑，用乙酸乙酯稀釋所得的殘留物，連續用1N鹽酸、水、飽和碳酸氫鈉水溶液、水、飽和食鹽水洗滌有機層，然后用無水硫酸鈉干燥。濾去干燥劑，減壓除去溶劑，在所得的殘留物中加入醚，過濾析出的固體，得到3.44g作為白色固體的標題化合物(收率94.6％)。
mp142～143℃1H-NMR(CDCl3)δ8.42(s，1H)，8.35(s，1H)，8.32(s，1H)，8.28(s，1H)，7.77(d，J＝8.9Hz，1H)，7.43-7.17(m，15H)，5.69(dd，J＝8.9，4.6Hz，1H)，5.30-5.10，(m，1H)，4.90(d，J＝4.6Hz，1H)，4.93-4.75(m，1H)，3.95(s，3H)，3.49，3.49(s，s，各3H)，2.80(s，3H)，2.85-2.65(m，2H)，2.71(s，3H)，1.43(s，9H)陽離子FAB-MSm/z＝1061[M+Na]+。實施例2下述化合物4的合成 化合物4將3.33g(3.2mmol)實施例1得到的化合物3溶解于脫水的二氯甲烷20ml和脫水的甲醇20ml中，冰冷下加入4N氯化氫-乙酸乙酯溶液4.0ml(16.0mmol)，并在室溫下攪拌14小時，然后在35℃下攪拌2小時。減壓除去溶劑，在得到的殘留物中加入醚，并過濾析出的固體，得到3.01g作為白色固體的標題化合物(收率96.4％)。
mp163～165℃1H-NMR(DMSO-d6)δ9.09(s，1H)，9.03(s，1H)，9.01(s，1H)，8.84(s，1H)，9.15-8.75(m，4H)，7.45-7.15(m，15H)，5.55-4.37(m，1H)，5.11(d，J＝6.6Hz，1H)，4.23-4.08，(m，1H)，3.85(s，3H)，3.39，3.38(s，s，各3H)，2.82(s，3H)，3.0-2.60(m，2H)，2.72(s，3H)陽離子FAB-MSm/z＝939[M+H]+。實施例3下述化合物5的合成 化合物5
將2.93g(3.0mmol)實施例2得到的化合物4溶解于40ml甲醇中，在冰冷下加入1N氫氧化鈉水溶液9.0ml(9.0mmol)，然后在室溫下攪拌3小時、45℃下攪拌2小時、及60℃下攪拌1小時。將反應液冷卻至室溫后，減壓除去溶劑，在得到的殘留物中加入50ml水和1N鹽酸9.0ml，過濾析出的固體，用水、醚洗滌，并減壓干燥，得到2.04g作為白色固體的標題化合物(收率73.5％)。
mp171～174℃1H-NMR(DMSO-d6)δ9.05(s，1H)，9.02(s，1H)，8.86(s，1H)，8.82(s，1H)，8.95-8.80(m，1H)，7.45-7.15(m，15H)，5.47(dd，J＝8.6，6.9Hz，1H)，5.12(d，J＝6.9Hz，1H)，3.78-3.65，(m，1H)，3.39，3.38(s，s，各3H)，2.80(s，3H)，2.90-2.50(m，2H)，2.66(s，3H)陰離子FAB-MSm/z＝923[M-H]-。實施例4下述化合物6的合成([II]) 化合物6將1-羥基苯并三唑一水合物354mg(2.31mmol)溶解于脫水的二甲基甲酰胺600ml中，冰冷下加入含有疊氮基磷酸二苯酯636mg(2.31mmol)的脫水二甲基甲酰胺溶液10ml、及含有4-二甲胺基吡啶308mg(2.52mmol)、三乙胺319mg(3.15mmol)的脫水二甲基甲酰胺溶液10ml，然后用15小時滴加用冰冷卻的含有1.94g(2.10mmol)實施例3得到的化合物5的脫水二甲基甲酰胺溶液50ml。將得到的反應液(化合物5的濃度3.1mM)在室溫下再攪拌3天后，減壓除去溶劑，用氯仿稀釋所得的殘留物，連續用1N鹽酸、水、飽和碳酸氫鈉水溶液、水、飽和食鹽水洗滌，然后用無水硫酸鈉干燥。濾去干燥劑，減壓除去溶劑，然后通過中壓硅膠快速柱色譜(フラツシユカラムクロマトグラフイ一)(甲醇∶氯仿＝1∶50～1∶20)純化所得的殘留物，得到1.56g作為兩種非對映異構體的混合物的白色固體狀標題化合物(收率81.9％)。
mp253～256℃(分解)1H-NMR(DMSO-d6)δ9.14，9.13，9.10，9.07，9.02，8.97，8.94，8.91(s，共4H)，8.46-8.18(m，2H)，7.42-7.13(m，15H)，5.60-5.40(m，2H)，4.80-4.70(m，1H)，3.46，3.44，3.36，3.30(s，共6H)，2.77，2.76，2.73，2.71(s，共6H)，2.88-2.50(m，2H)陽離子FAB-MSm/z＝907[M+H]+。實施例5下述化合物7的合成([III]) 化合物7將0.907g(1.0mmol)實施例4得到的化合物6溶解于50ml甲酸中，然后在50℃攪拌20小時、及在60℃攪拌6小時。將得到的反應液冷卻至室溫后，減壓除去溶劑，在得到的殘留物中加入飽和碳酸氫鈉水溶液、水，然后過濾析出的固體。用水、醚將固體洗凈后，減壓干燥，得到白色固體760mg(收率88.3％)。接下來，室溫下在含有三苯膦923mg(3.52mmol)的脫水二氯甲烷溶液60ml中加入碘893mg(3.52mmol)并攪拌15分鐘后，在該溶液中滴加含有上述白色固體760mg(0.88mmol)和三乙胺720mg(7.12mmol)的脫水二氯甲烷溶液70ml，并在室溫下攪拌20小時。用氯仿稀釋所得的反應液，連續用1N鹽酸、水、飽和碳酸氫鈉水溶液、水、飽和食鹽水洗滌后，用無水硫酸鈉干燥。濾去干燥劑，減壓除去溶劑，通過中壓硅膠快速柱色譜(甲醇∶氯仿＝1∶20～1∶3)純化所得的殘留物，得到234mg作為白色固體的標題化合物(收率31.5％)。
mp246～248℃1H-NMR(DMSO-d6)δ9.11(s，1H)，9.05(s，1H)，8.98(s，1H)，8.96(s，1H)，8.96(s，1H)，8.32-8.15(m，1H)，7.40-7.12(m，15H)，5.55-5.42(m，1H)，3.05-2.88(m，1H)，2.73(s，3H)，2.70-2.40(m，1H)，2.68(s，3H)陽離子FAB-MSm/z＝865[M+Na]+。實施例6下述化合物8的合成([I]物質GM-95) 化合物8將42mg(O.050mmol)實施例5得到的化合物7溶解于脫水的二氯甲烷25ml中，并在室溫下加入四氯化鈦474mg(2.50mmol)，然后在相同溫度下攪拌3天。將反應液減壓蒸餾除去溶劑，并通過中壓硅膠快速柱色譜(甲醇∶氯仿＝1∶10～1∶4)純化所得的殘留物，得到10mg作為白色固體的標題化合物(收率34.3％)。
mp257～260℃(分解)1H-NMR(DMSO-d6)δ9.05(s，1H)，9.04(s，1H)，9.00(s，2H)，8.91(s，1H)，6.11-5.98(m，1H)，4.23-4.10(m，1H)，3.72-3.58(m，1H)，2.74(s，3H)，2.69(s，3H)陽離子FAB-MSm/z＝605[M+Na]+。參考例3化合物8的結構確定(1)物質GM-95晶體的分離、提純使用國際公開WO00/24747號記載的物質GM-95生產菌，在同樣的培養條件下培養得到物質GM-95，并將含物質GM-95的甲醇提取物約100g加載在硅膠柱色譜(60mm內徑×500mm)上，以40ml/分的速度流過甲醇∶二氯甲烷＝1∶9的流動相。通過國際公開WO00/24747號記載的方法檢測含有物質GM-95的級分(フラクシヨン)。將該操作實施4次得到，并通過用乙酸乙酯處理得到的級分濃縮殘留物得到759mg不溶物。將得到的不溶物加載在硅膠柱色譜(50mm內徑×500mm)上，以40ml/分的速度流過甲醇∶二氯甲烷＝1∶9～1∶5的流動相。在上述檢測條件下收集物質GM-95的單一級分并濃縮，用乙酸乙酯處理得到的殘留物，得到117mg粉末狀物質GM-95的結晶。得到的物質GM-95結晶的物理化學性質除熔點外與國際公開WO00/24747號記載的物質GM-95蒸發干燥固體物的物理化學性質一致。在本提純條件下得到的物質GM-95結晶的熔點為235℃以上(分解)。
以通過上述提純得到的物質GM-95結晶作為標準品，用于本發明得到的化合物8的鑒定。
(2)化合物8的結構確定將實施例6得到的化合物8與上述(1)得到的物質GM-95結晶的1H-NMR(DMSO-d6)進行比較(參照
圖1)。另外，也對高效液相色譜(HPLC)的保持時間(Rt)及UV光譜分析進行了比較(參照圖2及圖3)。HPLC的分析條件根據國際公開WO00/24747號記載方法進行設定。即在下述條件下進行測定柱PEGASIL ODS(4.6mm內徑×250mm；(株)センシユ一科學制造)流動相乙腈/三氟乙酸/水(70∶0.1∶30v/v/v)流速1ml/分檢測254nm。
從這些結果(紫外吸收光譜一致，核磁共振光譜一致，高效液相色譜的保護時間一致)及實施例6所示的質譜結果可以判定，化合物8與物質GM-95具有相同的結構。工業實用性通過本發明的制備方法，可以用化學方法合成具有抗癌活性的物質GM-95。
另外，通式[II]及[III]表示的化合物可以用作化學合成物質GM-95的制備中間體。
權利要求
1.通式[I]表示的物質GM-95的制備方法，其特征在于，將通式[III]表示的環狀化合物的硫醇基的保護基(R2)脫保護，使其生成硫醇基，并且通過生成的硫醇基與酰胺基的分子內閉環反應，形成噻唑啉環， 其中，R2表示硫醇基的保護基。
2.通式[I]表示的物質GM-95的制備方法，其特征在于，(a)將通式[II]表示的環狀化合物的縮醛保護基(R1)脫保護，使其生成甲酰基，并且通過生成的甲酰基與酰胺基的分子內閉環反應，形成噁唑環，和(b)將得到的通式[III]表示的環狀化合物的硫醇基的保護基(R2)脫保護，使其生成硫醇基，并且通過生成的硫醇基與酰胺基的分子內閉環反應，形成噻唑啉環， 其中，R1相同或不同，各表示低級烷基，R2表示硫醇基的保護基， 其中，R2的定義同上。
3.通式[II]表示的環狀化合物， 其中，R1及R2的定義同上。
4.通式[III]表示的環狀化合物， 其中，R2的定義同上。
5.通式[II]表示的環狀化合物的制備方法，其特征在于，(a)將通式[IV-a]表示的縮醛衍生物與通式[V-a]表示的硫醇衍生物脫水縮合，和(b)將得到的通式[VI]表示的酰胺衍生物的氨基保護基(R4)及羧基保護基(R3)脫保護后，進行分子內環化， 其中，R1和R2的定義同上， 其中，R1的定義同上，R3表示羧基的保護基， 其中，R2的定義同上，R4表示氨基的保護基， 其中，R1、R2、R3和R4的定義同上。
6.通式[II]表示的環狀化合物的制備方法，其特征在于，(a)將通式[IV-b]表示的縮醛衍生物與通式[V-b]表示的硫醇衍生物脫水縮合，和(b)將得到的通式[VII]表示的酰胺衍生物的氨基保護基(R5)及羧基保護基(R6)脫保護后，進行分子內環化， 其中，R1和R2的定義同上， 其中，R1的定義同上，R5表示氨基的保護基， 其中R2的定義同上，R6表示羧基的保護基， 其中，R1、R2、R5和R6的定義同上。
全文摘要
本發明涉及物質GM－95[I]的制備方法，其特征在于(a)將通式[II]表示的環狀化合物(式中，R
文檔編號C07D498/22GK1479742SQ01820498
公開日2004年3月3日 申請日期2001年12月12日 優先權日2000年12月12日
發明者山田省三, 重野和彥, 北川和廣, 岡島茂雄, 淺尾哲次, 廣, 彥, 次, 雄 申請人:大鵬藥品工業株式會社, 壯生株式會社