專利名稱：用作抗有絲分裂以及抗腫瘤藥物的紫杉類綴合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及紫杉類綴合物、包含該化合物的藥用制劑、所述化合物作為抗有絲分裂以及抗腫瘤藥物的使用方法，特別用于治療腫瘤例如乳腺癌和卵巢癌。
背景技術：
復合物雙萜紫杉醇(1)是一種令人激動的新型抗癌藥物，目前它以商品名Taxol在臨床上用于抗卵巢癌和乳腺癌。主要參見MerckIndex，Monograph No.7117(第12版，1996)。
紫杉醇通過與眾不同的機制起作用促進微管裝配。自發現紫杉醇為抗有絲分裂的抗腫瘤藥物以來，已經廣泛研究了它的化學性質與結構活性關系以開發更有效衍生物并克服其低水溶性和耐藥性問題。大量研究著重于對C2、C4、C7、C9、C10和C13側鏈的修飾，所得結構-活性關系導致出現更有效紫杉醇衍生物。同樣，對2’-羥基的選擇性修飾使得合成出一系列水溶性衍生物(A.Mathew等，J.Med.Chem.1992，35，145-151)。然而紫杉醇伴有的耐藥性仍然是一個主要難題，因此迫切需要新型衍生物。
以前，我們合成并評價了為喜樹堿(CPT)衍生物和依托泊苷(5)類似物的綴合物的兩種化合物(3和4)(K.Bastow等，Bioorg.Med.Chem.1997，5，1481-1488)。兩種化合物都通過濃度依賴性方式誘導藥物治療細胞中的蛋白連接性DNA斷裂(PLDB)。藥物誘導的PLDB可能是通過DNA拓撲異構酶(topo)I以及II介導。所述兩種綴合物抗CPT耐藥性細胞的活性比CPT高，抗依托泊苷耐藥性細胞的活性比依托泊苷高。多藥物抗性蛋白質GP170或MRP的過度表達對細胞毒性幾乎沒有影響。所述化合物對CPT敏感或依托泊苷耐藥性細胞與CPT的細胞毒性作用相同，對CPT耐藥性細胞與依托泊苷的細胞毒性作用相同。在裸小鼠體內，一種綴合物(3)的抗人KB和DU-145腫瘤細胞活性比依托泊苷或CPT的活性高。這些CPT-依托泊苷類似物的綴合物的topo I和II雙重抑制性質以及獨特的抗腫瘤作用說明作為抗癌藥物應該進一步探索這樣的雙分子模型。
發明概述本發明第一方面是一種式I化合物或其藥學上可接受的鹽T1-L-T2(I)其中T1為紫杉類基團，優選下式II基團 R1為C6H5，R2為O；L為連接基團；T2為選自以下的取代基表鬼臼毒素、安吖啶、橢圓玫瑰樹堿、蒽環類抗生素、米托蒽醌、絲裂霉素、喹諾酮和秋水仙堿基團。
本發明第二方面為藥用制劑，所述制劑包含式I化合物和藥學上可接受的載體。
本發明另一方面是治療腫瘤、尤其治療是實體瘤的方法，所述方法包括給予其需要患者治療有效量的上述式I化合物。可以治療的腫瘤實例包括但不限于肺癌、結腸癌、中樞神經系統癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌以及乳腺癌。
本發明再一方面是治療其需要患者癌癥的方法，所述方法包括給予所述患者癌癥治療有效量的式I化合物。本發明可以治療的示例性的癌癥包括但不限于小細胞肺癌、睪丸癌、淋巴瘤、白血病、食管癌、胃癌、結腸癌、乳腺癌、中樞神經系統癌、肝癌以及前列腺癌。
本發明又一方面是誘導細胞分化的方法，所述方法包括使癌細胞與分化有效量的以上式I化合物接觸(體內或體外)。
本發明另一方面是抑制細胞有絲分裂的方法，所述方法包括使細胞與有絲分裂抑制量的以上式I化合物接觸(體內或體外)。
本發明上述及其它目的和方面利用本發明附圖以及以下說明書詳細說明。
附圖簡要說明
圖1圖示用來實施本發明的各種前體化合物的結構。
圖2圖示制備本發明化合物的合成流程1。
優選實施方案的詳細說明本文使用的“烷基”是指直鏈或支鏈、飽和或不飽和烴基鏈，通常為C1-C4，包括例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基和叔丁基。
本文使用的“烷氧基”是指直鏈或支鏈、飽和或不飽和烴氧基鏈，包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基和叔丁氧基。
本文使用的“氨基”是指取代基-NR1R2，其中R1和R2各自獨立選自H和C1-C4烷基。
本文使用的“鹵代”、“鹵化物”或“鹵素”是指氟、氯、溴和碘。
本文使用的“治療”是指使患有疾病的患者受益的任何類型的治療，包括改善患者病情(例如改善一種或多種癥狀)、延緩疾病發展、預防或延緩疾病發病等。
本文使用的“藥學上可接受”是指所述化合物或組合物適合給予患者以實現本文所述治療，而且根據疾病嚴重性和治療需要沒有過度的有害副作用。1.活性化合物根據本發明公開內容可以按照已知方法或其本領域熟練技術人員顯而易見的各種變化方法合成本發明活性化合物。一般來說，本發明活性化合物具有下式結構T1-L-T2(I)其中T1為紫杉類基團，L為連接基團，T2為選自以下的取代基表鬼臼毒素、安吖啶、橢圓玫瑰樹堿、蒽環類抗生素、米托蒽醌、絲裂霉素、喹啉和秋水仙堿基團。本文使用的活性化合物包括其藥學上可接受的鹽。下面更詳細地論述可以用于與上述式I的各種基團。
紫杉類基團。可以用于實施本發明的紫杉類基團用式II表示 其中R1為C6H5，R2為O。本文使用的“Ac”是指式-C(O)CH3取代基。
紫杉醇為已知產品，可以按照已知技術制備。通常參見MerckIndex，Monograph No.7117(第12版，1996)。
可以用于實施本發明的紫杉類基團實例包括但不限于以下美國專利中的化合物Kingston等的5,614,645；Chattopadhyay等的6,028,206；Kingston等的5,411,984；Magnus的5,508,447。(申請人明確用意在于本發明引用的所有美國專利文獻通過引用將其全部內容結合到本發明)。這些文獻公開的化合物與連接基L的共價鍵可以在相同位置以上式II化合物給出的相同方式形成。
表鬼臼毒素基團。可以用于實施本發明的表鬼臼毒素基團實例包括式III-A化合物 其中R10、R11、R12、R13、R15和R16各自獨立選自以下基團H、烷基、羥基、烷氧基、烷基羥基和鹵代；R14選自以下基團H、烷基、羥基、烷氧基、烷基羥基、鹵代和磷酸鹽；R17為NH或不存在。
可以用于實施本發明的表鬼臼毒素基團實例包括但不限于以下美國專利介紹的化合物Saulnier等的Re 35,524；Terada等的5,571,914；Ohnuma等的5,066,645。這些文獻公開的化合物與連接基L的共價鍵可以在相同位置以上式III-A化合物給出的相同方式形成。
安吖啶基團。可以用于實施本發明的安吖啶基團實例包括式III-B化合物 其中R20和R21各自獨立選自以下基團H、烷基、羥基、烷氧基和烷基羥基；R22和R23各自獨立選自以下基團H、烷基、羥基、烷氧基、烷基羥基和鹵代；R24為NH或不存在。
可以用于實施本發明的安吖啶基團實例包括但不限于以下美國專利介紹的化合物Watanabe等的5,358,864；Su等的5,939,428(參見例如C.Bostock-Smith，Biochemistry 38，6723-6731(1999)，關于m-AMSA)。這些文獻公開的化合物與連接基L的共價鍵可以在相同位置以上式III-B化合物給出的相同方式形成。
橢圓玫瑰樹堿基團。可以用于實施本發明的橢圓玫瑰樹堿基團實例包括但不限于式III-C化合物 其中R30為H或烷基、或者不存在；
R31為H、烷基、羥基、烷氧基、烷基羥基(alkyhyroxy)、鹵代或-C(O)-N(R36)-(CH2)n-N(R37)(R38)，其中R36、R37和R38各自獨立選自H和烷基，n為1-6的整數；R32和R33各自獨立選自以下基團H、烷基、羥基、烷氧基、烷基羥基和鹵代；R34為H或烷基；R35為O或不存在。
可以用于實施本發明的橢圓玫瑰樹堿基團實例包括但不限于以下美國專利公開的化合物Bisagni等的5,407,940；Bisagni等的5,498,611；Honda等的4,698,423；LePecq等的4,045,565，這些文獻公開的化合物至連接基L的共價鍵可以在相同位置以上式III-C化合物給出的相同方式形成。
蒽環類抗生素基團。可以用于實施本發明的蒽環類抗生素基團實例包括但不限于式III-D化合物 其中R40為H、烷基、羥基、烷氧基、烷基羥基或鹵代；R41為羥基O-或共價鍵；R42為烷基、烷基羥基、CH2O-或CH2-；R43和R44各自獨立選自H和羥基；R45為羥基或NH2；
R46為H或鹵代；條件是如果R41不為O-或共價鍵，則R42為CH2O-或CH2-；如果R42不為CH2O-或CH2-，則R41為O-或共價鍵。
可以用于實施本發明的蒽環類抗生素基團實例包括但不限于以下美國專利公開的化合物Takeuchi等的5,958,889；Rahman等的5,560,923；Suarato等的5,744,454。這些文獻公開的化合物至連接基L的共價鍵可以在相同位置以上式III-D化合物給出的相同方式形成。
米托蒽醌基團。可以用于實施本發明的米托蒽醌基團實例包括式III-E化合物 其中R50、R51、R52和R53各自獨立選自OH或O-；條件是R50、R51、R52和R53其中之一為O-。
可以用于實施本發明的米托蒽醌化合物在Tsou的5,378,456和Lim等的5,858,397的美國專利中有介紹。這些文獻公開的化合物至連接基L的共價鍵可以在相同位置以上式III-E化合物給出的相同方式形成。
絲裂霉素基團。可以用于實施本發明的絲裂霉素基團實例包括式III-F化合物 其中
X為NH2、NH-或脂肪族胺；R71為烷基或鹵代；R72為羥基或烷氧基；R73為H或不存在；Y為H或烷基。
秋水仙堿基團。可以用于實施本發明的秋水仙堿基團實例包括式III-G化合物 其中R60和R61各自獨立為H、烷基、羥基、O-或烷氧基；R62為H、NH2、NH-、OH、O-、＝O或NHCOCH3，X為S或O，條件是R60或R61其中一個為O-，或者R62為NH-或O-，(為綴合物提供一個連接基團)。
可以用于實施本發明的秋水仙堿基團實例包括但不限于以下美國專利介紹的化合物Bombardelli等的5,880,160、Bombardelli的5,973,204和Bombardelli等的5,843,910。這些文獻公開的化合物至連接基L的共價鍵可以在相同位置以上式III-G化合物給出的相同方式形成。
喹諾酮基團。可以用于實施本發明的喹諾酮基團實例包括但不限于式III-H化合物 其中R81選自以下基團H、羥基、低級烷基、低級烷氧基、羥基、鹵代和氨基(優選H或低級烷基；最優選H)；R82選自以下基團H、羥基、低級烷基、低級烷氧基、羥基、鹵代和氨基(優選H或低級烷基；最優選H)；R83選自以下基團H、羥基、低級烷基、低級烷氧基、羥基、鹵代和氨基(優選H或低級烷基；最優選H)；R84選自以下基團H、羥基、低級烷基、低級烷氧基、羥基、鹵代和氨基(優選H或低級烷基；最優選H)；R85各自獨立選自以下基團H，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基，鹵代和氨基(優選H或低級烷基；最優選H)；n為0、1、2、3或4(應當理解的是當n為0時，則所有位置被H取代)(在一個優選實施方案中，至少存在一個R85并且為F)。
連接基團。可以用來形成兩個官能團的共價綴合物的連接基團(接頭、連接橋等)是本領域已知的。用以實現本發明的具體連接基團并非決定性的，可以使用的連接基團包括但不限于以下美國專利公開的基團Rokita等的5,650,399和Greenfield等的5,122,368。通常，所述連接基團可以包括脂肪族、芳族或者脂肪族與芳族的混合基團(例如烷基、芳基、烷基芳基等)并且包含一個或多個雜原子例如N、O、S等。例如，連接基團L可以為式-La-Lb-化合物，其中Lb存在或不存在，La和Lb各自獨立選自以下基團 和 其中a為0-3，b為0-3；R70選自亞烷基、鏈烯基和亞芳基。
可以由使用的具體連接基化學性質確定本發明化合物合成。例如，流程1中給出了2’-(4”-O-脫甲基表鬼臼毒素)紫杉類系列的合成。合成化學的許多變化對本領域熟練技術人員來講是顯而易見的。
本發明公開的活性化合物可以如上所述制備成它們的藥學上可接受的鹽。藥學上可接受的鹽保持所需要的母體化合物的生物學活性并且不會產生不需要的毒性作用。這樣的鹽的實例有(a)與以下無機酸生成的酸加成鹽例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等；以及與以下有機酸生成的鹽例如乙酸、乙二酸、酒石酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、葡萄糖酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、苯甲酸、鞣酸、棕櫚酸、藻酸、多聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等；(b)與元素陰離子(例如氯、溴和碘)形成的鹽；(c)由堿獲得的鹽，例如銨鹽、堿金屬鹽(例如鈉鹽和鉀鹽)、堿土金屬鹽(例如鈣鹽和鎂鹽)以及與有機堿(例如二環己胺和N-甲基-D-葡糖胺)形成的鹽。2.藥用制劑上述活性化合物可以按照已知技術以藥用載體配制用于給藥。參見例如Remington，The Science And Practice of Pharmacy(第9版，1995)。在制造根據本發明藥用制劑時，所述活性化合物(包括其生理學可接受的鹽)通常還特別與可接受的載體混合。所述載體當然必須為可接受的，也就是與制劑任何其它成分相容，并且必須對患者無害。所述載體可以為固體或液體，或者固體和液體兩種狀態，并且優選用所述化合物配制為單位劑量制劑(例如片劑)，它可以包含從0.01％或0.5％至95％或99％(重量)的所述活性化合物。一種或多種活性化合物可以加入本發明制劑中，它可以通過藥學上已知的任何技術制備，基本包括混合各種組分，任選包含一種或多種輔助成分。
本發明制劑包括適合以下給藥途徑的制劑口服、直腸、局部、口腔(例如舌下)、陰道、胃腸外(例如皮下、肌內、真皮內或靜脈內)、局部(即皮膚以及粘膜表面，包括氣道表面)以及透皮，但是在任何特定情況下最適合的給藥途徑取決于所治療病癥的性質和嚴重性以及所用具體活性化合物的性質。
適合口服給藥的制劑可以為獨立單位，例如膠囊劑、扁囊劑、錠劑或片劑，每個單位包含預定量的活性化合物；粉劑或顆粒劑；水性或非水性液體的溶液劑或混懸劑；或者水包油或油包水乳劑。所述制劑可以用任何藥學上適當的方法制備，包括使活性化合物與適當載體(可以包括一種或多種上述輔助成分)混合的步驟。通常，本發明制劑的制備是將活性化合物與液體或微細固體載體或這兩類載體均勻、緊密地混合，如果需要，然后將所得混合物成型。例如可以通過壓制或模塑包含所述活性化合物以及任選與一種或多種輔助成分的粉末或顆粒制備片劑。壓縮片劑的制備是可以用合適的機器壓制自由流動形式的所述化合物(例如粉末或顆粒)，任選混合粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑和/或表面活性/分散劑。模塑片劑的制備可以用合適的機器模塑經惰性液體粘合劑潤濕的粉狀化合物。
適合口腔(舌下)給藥的制劑包括所述活性化合物包含在調味基質(通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠)中的錠劑以及所述活性化合物包含在惰性基質(例如明膠和甘油或者蔗糖和阿拉伯膠)中的錠劑。
適合胃腸外給藥的本發明制劑包括所述活性化合物的無菌水性和非水性注射溶液，優選與預定接受者血液等滲的制劑。這些制劑可以包含抗氧劑、緩沖劑、制菌劑以及使所述制劑與預定接受者血液等滲的溶質。水性或非水性無菌混懸劑可以包括混懸劑以及增稠劑。所述制劑可以裝在單位劑量或多劑量容器中，例如密封的安瓿以及小瓶，可以貯存在冷凍干燥環境下，在臨用前只需要直接加入無菌液體載體，例如鹽水或注射用水。臨時配制的注射溶液劑和混懸劑可以用前述類型的無菌粉劑、顆粒劑及以及片劑制備。例如本發明一個方面提供包含式(I)化合物或其鹽的可注射的穩定無菌組合物，該組合物以單位劑型包裝于密封容器中。所述化合物或鹽以凍干品的形式提供，凍于制品能夠用適當的藥學上可接受載體復原以形成適合注射到患者的液體組合物。單位劑型通常包含約10mg～約10g所述化合物或鹽。當所述化合物或鹽基本不溶于水時，可以用足以使所述化合物或鹽在水性載體中乳化的足夠量生理學上可接受的乳化劑。一種這樣的有效乳化劑為磷脂酰膽堿。
適合直腸給藥的制劑優選為單位劑量的栓劑。它們的制備可以是將所述活性化合物與一種或多種常規固體載體(例如可可脂)混合，然后將所得混合物成型。
適合皮膚局部給藥的制劑優選采用以下形式軟膏、乳膏、洗劑、糊劑、凝膠、噴霧劑、煙霧劑或油。可以使用的載體包括凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇類、透皮增強劑以及兩種或多種所述載體的組合物。
適合透皮給藥的制劑可以為離散型貼劑，貼劑適合與接受者表皮保持長時間緊密接觸。適合透皮給藥的制劑還可以通過離子電滲療法給藥(參見例如Pharmaceutical Research 3(6)318(1986))，典型采用所述活性化合物的任選緩沖的水溶液形式。合適的制劑包含檸檬酸鹽或雙\三緩沖劑(pH6)或乙醇/水并且包含0.1～0.2M活性成分。
進一步，本發明提供本文公開的化合物及其鹽的脂質體制劑。形成脂質體混懸劑的技術在本領域眾所周知。當所述化合物或其鹽為水溶性鹽時，用常規脂質體技術可以將前述化合物摻入到脂質囊中。在這種情況下，由于所述化合物或鹽的水溶性，所述化合物或鹽基本上被帶入親水中心或脂質體核。使用的脂質層可以為任何常規組合物，可以包含膽固醇也可以不包含膽固醇。當目標化合物或鹽不溶于水時，再使用常規脂質體形成技術，則所述鹽可能基本上被帶入形成脂質體結構的疏水性脂質雙分子層。在任一情況下，所制備的脂質體可以通過使用標準超聲處理或者均化技術減小粒徑。
當然，可以冷凍干燥包含本文公開的化合物或其鹽的脂質體制劑制備凍干制品，該制品可以用藥學上可接受載體(例如水)復原再生脂質體混懸劑。
其它藥用組合物可以用本文公開的不溶于水的化合物或其鹽制備，例如水性基質乳劑。在這樣的情況下，所述組合物包含足夠量的藥學上可接受的乳化劑以乳化需要量的所述化合物或其鹽。特別有效的乳化劑包括磷脂酰膽堿以及卵磷脂。
除了式(I)化合物或它們的鹽外，藥用組合物還可以包含其它添加劑，例如pH-調節添加劑。具體地講，有效的pH-調節劑包括酸(例如鹽酸)、堿或緩沖劑(例如乳酸鈉、乙酸鈉、磷酸鈉、檸檬酸鈉、硼酸鈉或葡萄糖酸鈉)。進一步，所述組合物可以包含微生物防腐劑。有效的微生物防腐劑包括對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯以及芐醇。通常在所述制劑置于多劑量使用的小瓶時使用微生物防腐劑。當然，如上所述，本發明藥用制劑可以用本領域熟知的技術冷凍干燥。3.給藥劑量和給藥途徑本文介紹的活性化合物抑制微管蛋白聚合和/或具有抗有絲分裂活性。這樣的化合物用于治療的病癥包括牛皮癬、痛風、乳頭狀瘤(papiloma)、疣以及各種腫瘤，特別是實體瘤，包括但不限于肺癌(例如非小細胞肺癌)、結腸癌、中樞神經系統癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌以及乳腺癌。
用本發明方法治療的患者通常為人類患者，但是本發明方法可以用于任何本領域熟練技術人員已知的合適患者，特別是哺乳動物患者，除人外還包括馬、牛、狗、兔、雞、綿羊等。如上所述，本發明提供藥用制劑，所述制劑包含式I化合物或其藥學上可接受的鹽和藥學上可接受的以下給藥途徑的載體口服、直腸、局部、口腔、胃腸外、真皮內或靜脈內以及透皮。
任何具體化合物(其用途屬于本發明范圍)的治療有效劑量在化合物與化合物之間、患者與患者之間略有不同并且取決于患者的病癥以及給藥途徑。一般建議是，劑量約0.1～約50mg/kg具有治療作用，但是口服和/或煙霧劑給藥時可能使用更高劑量。在更高水平涉及的毒性可能限制靜脈內劑量至更低的水平，例如至多約10mg/kg，所有重量計算基于活性基質的重量，包括使用鹽的情況。靜脈內或肌內給藥可以使用的典型劑量為約0.5mg/kg～約5mg/kg。口服給藥可以使用的劑量為約10mg/kg約50mg/kg。
本發明用以下的非限制性實施例作更詳細的說明。
實施例A.原料和方法紫杉酚和cephalomannine由Yung-Shin Pharm.Co.，Taiwan惠贈。質子核磁共振(1H-NMR)譜用Bruker AC-300分光計或Varian Inova 600測定，用Me4Si(TMS)作內標，CDCl3作溶劑。大氣壓化學電離(APCI)質譜通過PE Sciex API 150質譜儀測定。薄層色譜法(TLC)硅膠板購自Alltech，Inc。
合成(4-甲酰基)苯甲酰紫杉類的常規方法。
紫杉類的無水二氯甲烷溶液中加入等摩爾比例的4-羧基苯甲醛(除了在10中用2當量外)和4-二甲基氨基吡啶(4-DMAP)。然后在混合物中加入等摩爾量的1，3-二環己基碳二亞胺(DCC)。將混合物在室溫下氮氣氛中攪拌24小時，同時用TLC監測。濾出二環己基脲沉淀，用二氯甲烷洗滌。濃縮濾液獲得白色固體，將其進一步用硅膠色譜法(Elutflash快速硅膠柱，洗提液CH2Cl2∶MeOH-10∶0至20∶1)處理獲得所需白色粉末產物9。
2’-(4-甲酰基)苯甲酰紫杉酚(9)。
收率92％(開始用11.7g紫杉酚)；無定形；1H NMRθ(CDCl3)參見表1；APCI-MSm/z986.6(M+H+)。
2’，7-雙(4-甲酰基)-苯甲酰紫杉酚(10)。
與常規方法相同，除了使用1mmol紫杉酚和2mmol 4-羧基苯甲醛以及DCC。收率95％(開始用19.7mg.紫杉酚)。1H NMRθ(CDCl3)參見表1；APCI-MSm/z1118.8(M+H+)。
2’-(4-甲酰基)苯甲酰cephalomannine(11)。
收率95％(開始用205mg cephalomannine)；無定形；1H NMRθ(CDCl3)參見表1；APCI-MSm/z964.6(M+H+)。
合成目的化合物12-16的常規方法。
單或雙2’-(4-甲酰基)苯甲酰紫杉類(9-11)的無水苯溶液中加入適當的表鬼臼毒素衍生物(1當量或2當量的6或8)。將混合物用DeanStark捕集器加熱回流24小時。蒸去溶劑，將殘余物用硅膠柱色譜法(用CH2Cl2∶MeOH＝20∶1洗提)提純獲得所需化合物。
綴合物12。
黃色粉末，92％收率[開始用22.5mg(0.023mmol)9和10.0mg(0.025mmol)4’-O-脫甲基-4β-氨基-4-脫氧鬼臼毒素(6)]；無定形；1HNMRθ(CDCl3)參見表1；APCI-MSm/z 1367.7(M+H+)。
綴合物13.
黃色粉末，89％收率[開始用7.0mg(0.006mmol)2’，7-雙(4-甲酰基)苯甲酰紫杉酚(10)和5.1mg(0.013mmol)6]；無定形；1H NMRθ(CDCl3)參見表1；APCI-MSm/z 1864.7(M+H+)。
綴合物14.
微黃色粉末，89％收率[開始用39mg(0.040mmol)2’-(4-甲酰基)苯甲酰Cephalomannine(11)和16mg(0.040mmol)6]；無定形；1H NMRθ(CDCl3)參見表1；APCI-MSm/z 1345.8(M+H+)。
綴合物15.
黃色固體，70％收率[開始用20.0mg(0.023mmol)化合物9和10.6mg(0.025mmol)8]；無定形；1H NMRθ(CDCl3)參見表1；APCI-MSAm/z 1458.8(M+H+)。
綴合物16.
黃色固體，85％收率開始用39mg(0.040mmol)化合物11和20mg(0.040mmol)8]；無定形，1H NMRθ(CDCl3)參見表1；APCI-MSm/z 1437.9(M+H+)。
生物學分析體外細胞毒性分析按照Rubinstein等(P.Ferguson等，Cancer Res.1988，48，5956-5964)介紹的方法進行。藥物原液用DMSO制備，最終溶劑濃度為對細胞復制沒有影響的濃度，即≤2％ DMSO(v/v)。人腫瘤細胞包括鼻咽上皮類癌(KB)、肺癌(A-549)、回盲腸癌(HCT-8)、腎癌(CAKI-1)、乳腺癌(MCF-7)、黑素瘤癌(SKMEL-2)以及卵巢癌(1A9)。耐藥細胞系包括三種KB-衍生細胞，即KB-7d、KB-CPT和KB-VCR。這些細胞的性質在別處有介紹(P.Ferguson等，Cancer Res.1988，48，5956-5964；D.Beidler等，Cancer Res.1996，56，345-353)。1A9細胞的PAX-10和PAX-22亞系衍生細胞對紫杉醇具有耐藥性并且其β-微管蛋白存在突變。它們由Dr.P.Giannakakou(P.Giannakakou等，J.Biol.Chem.1997，27，17118-17125)慷慨贈予。細胞在含5％二氧化碳的潮濕空氣中用含100ug/mL卡拉霉素和10％(v/v)胎牛血清的RPMI-1640于37℃培養。最初接種密度根據細胞系不同以保證最終吸光度為1-2.5 A562單位。藥物暴露3天，根據劑量反應數據內推減少50％吸光度的藥物濃度即ED50值。各測試一式三份進行測試并且吸光度讀數變化不超過5％。
蛋白結合性DNA斷裂和拓撲異構酶II活性分析按照詳細公開的方法完成各步驟(K.Bastow等，Bioorg.Med.Chem.1997，5，1481-1488)。B.結果和討論紫杉醇的2’-羥基比空間位阻7-羥基反應性高(J.Deutsch等，JMed.Chem.1989，32，788-792；N.Magri等，J Org.Chem.1986，51，797-802)。因此，可以通過苯甲醛橋將4’-O-脫甲基表鬼臼毒素類似物選擇性引入紫杉醇的2’-位。分別在1，3-二環己基碳二亞胺(DCC)和4-二甲基氨基吡啶(4-DMAP)存在下使紫杉醇(1)或cephalomannine(2)與4-羧基苯甲醛反應(流程1)合成三種單-和雙-(4-甲酰基)苯甲酰紫杉類(9-11)(流程1)。按照文獻方法合成4’-O-脫甲基-4β-氨基-4-脫氧鬼臼毒素6(X.Zhou等，J.Med.Chem.1991，34，3346-3350)。4-O-脫甲基-4β-(對氨基苯氨基)-4-脫氧鬼臼毒素8的合成是用三甲基甲硅烷碘(TMSI)的二氯甲烷溶液處理鬼臼毒素，接著在碳酸鋇存在下用對硝基苯胺取代(L.Daley等，Terahedron Lett.1997，38，2673-2676)，最后氫化所得硝基化合物。使9-11與6或8在回流苯中反應形成亞胺鍵完成所需綴合物(12-16)的合成(流程1)。這些綴合物的結構由NMR和質譜數據得到明確確認。NMR信號的詳細分配列于表1中。
本實驗室按照標準細胞毒性分析人腫瘤(HTCL)細胞系和耐藥(DRCL)細胞系對新合成的紫杉類-4’-O-脫甲基表鬼臼毒素綴合物進行了評價。對照化合物為紫杉醇(1)、cephalomannine(2)以及表鬼臼毒素[依托泊苷(5)和GL-331(7)，參見圖1]。HTCL包括KB、A549、HCT-8、CAKI-1、MCF-7、SK-MEL-2以及1A9細胞系。稱為PAX-10和PAX-22的兩種紫杉酚耐藥性1A9亞系也作為DRCL一部分進行了測試。其它耐藥性細胞系為在別處有介紹的表現出不同機制或多種藥物耐藥性的KB衍生細胞(P.Ferguson等，Cancer Res.1988，48，5956-5964；D.Beidler等，Cancer Res.1996，56，345-353)。
除13以外的所有綴合物具有顯著的細胞毒性(表2數據)。盡管它們的活性不如紫杉醇和cephalomanine，但是對大多數腫瘤細胞系12和14-16具有與表鬼臼毒素衍生物相當或更好的活性。有趣的是紫杉醇和8的綴合物15與其兩種前體具有不同的細胞毒素活性，這說明殺死細胞的新機制是通過綴合作用實現。在紫杉類的2’-和7-羥基基團都結合表鬼臼毒素(epipodothyllotoxin)的化合物13活性較低。因此，紫杉類7-羥基基團對細胞毒素活性可能是決定性的；以前Mathew等(A.Mathew等，J.Med.Chem.1992，35，145-151)也發現了類似的結果。與非結合組分相比，12、15和16對抗紫杉酚耐藥性細胞具有更高活性(表3)。選擇化合物12、13和15用NCI的大約60種腫瘤細胞系進一步評價細胞毒性。各種腫瘤類型的所有細胞系的logGI50平均值在表4中列出。化合物12對多種腫瘤細胞系、尤其是白血病、結腸癌以及前列腺癌細胞系具有最強的抑制效果。
在拓撲異構酶分析中，所有三種綴合物在體內都抑制topo II，但是只有12和15為細胞內毒物(表5)。包含兩個表鬼臼毒素部分的化合物13沒有在細胞內刺激蛋白-DNA斷裂。但是在topo II抑制分析中，13的活性是12和15的兩倍，并且與GL-331相當，這說明游離羥基有可能在將藥物轉運入腫瘤細胞中起作用。
表1.紫杉類和它們的綴合物的1H NMR測定結果質子編號 9 10 11 12 13 14 15 16屬于紫杉類部分的信號2 5.68(d，7) 5.80(d，7) 5,68(d，7) 5.68(d，7) 5.69(d，7) 5.68(d，7) 5.68(d，7)5.68(d，7)3 4.20(d，8) 4.06(d，8) 3.81(d，7) 3.81(d，7) 4.04(dd，7，3.81(d，7) 3.82(d，7)3.81(d，7)2)5 4.98(d，9) 5.02(d，9) 4.97(d，9) 4.97(d，10) 5.04(br.d， 4.96(d，9) 4.97(dd，8，2)4.96(d，9)9)6α，β1.90(tt，13，3) 1.92(m) 1.87(m) 1.88(br.t，13) 1.92(m) 1.88(m) 1.88(ddd，16，11，1.88(br.t，13)2)7 4.45(m) 5.81(dd，10，4) 4.46(m) 4.44(dd，10， 5.82(m) 4.44(m) 4.45(dd，11，7) 4.45(m)7)10 6.30(s) 6.38(s) 6.30(s) 6.30(s) 6.38(s) 6.30(s) 6.30(s) 6.30(s)13 6.27(t，9) 6.25(t，9) 6.26(br.t，9) 6.26(t，9) 6.24(t，9) 6.26(br.t，9) 6.27(t，9)6.26(br.t，9)14α，β 2.14(dd，15，9) 2.17(dd，15，9) 2.55(m) 2.14(dd，15， 2.18(m) 2.55(m) 2.14(dd，15，9) 2.55(m)0)2.34(dd，15，9) 2.38(dd，15，9) 2.33(dd，15， 2.36(m) 2.33(dd，15，9)9)16-CH31.23(s) 1.21(m) 1.26(s) 1.23(m) 1.26(s) 1.25(s) 1.24(s) 1.26(s)17-CH31.14(s) 1.18(s) 1.15(s) 1.14(s) 1.19(s) 1.14(s) 1.14(s) 1.15(s)18-CH31.97(s) 1.97(s) 1.82(s) 1.96(s) 1.97(s) 1.82(s) 1.96(s) 1.83(s)19-CH31.68(s) 1.95(s) 1.68(s) 1.68(s) 1.96(s) 1.68(s) 1.68(s) 1.68(s)20α 4.32(d，84) 4.37(d，8) 4.30(d，8) 4.31(d，9) 4.37(d，8) 4.30(d，8) 4.31(d，9)4.29(d，8)質子編號 9 10 1112 13 14 151620β4.20(d，8) 4.25(d，8) 4.20(d，8) 4.19(d，9) 4.27(d，8) 4.19(d，8) 4.20(d，9) 4.19(d，8)2’ 5,72(d，4) 5.75(d，4) 5.64(d，3) 5.70(d，4) 5.70(d，4) 5.62(br.s) 5.71(d，4) 5.65(br.s)3’ 6.08(dd，10，4)6.09(dd，9，4) 5.94(dd，9，3) 6.04(dd，9，4) 6.08(dd，9， 5.92(br.s) 6.05(dd，9，4) 5.92(br.dd，4) 9，3)3’-NH 6.97(d，9.6) 7.07(d，8) 6.55(d，9) 7.02(d，9) *6.56(d，9) 7.06(d，9) 6.61(d，8)2-OBz(o)8.13(d，7)8.13(d，8) 8.12(d，8) 8.13(d，7) 8.14(d，7)8.12(d，8) 8.11(d，7.5) 8.11(d，8)2-OBz(m)7.52(t，7)7.53(d，8) 7.51(t，8) 7.52(d，7) 7.52(d，7)7.52(t，8) 7.52(d，75)7.51(t，8)2-OBz(p)7.62(m) 7.64(t，8) 7.62(t，8) 7.62(t，8) 7.64(t，7)7.62(t，8) 7.61(t，75)7.61(t，8)7-OBz(o)- 7.93(d，8) - - 7.97(d，8)- - -7-OBz(m)- 8.07(d，8) - - 7.81(d，8)- - -2’-OBz(o) 8.14(d，8)8.15(d，8) 8.12(d，8) 8.04(dd，7，2) 8.08(d，8)7.85(d，8) 8.15(d，8) 8.11(br.d，8)2’OBz(m) 7.98(d，8)7.97(d，8) 7.97(d，8) 7.85(dd，7，2) 7.86(d，8)8.01(d，8) 7.76(d，8) 7.52(br.d，8)3’-Ph(o) 7.45(d，8)7.48(m)7.40(br.s) 7.44(t，8) 7.43(d，7)7.40(m)7.43(d，8) 7.40(m)3’-Ph(m) 7.41(t，8)7.42(m)7.40(br.s) 7.41(t，8) 7.47(d，7)7.40(m)7.41(t，8) 7.40(m)3’-Ph(p) 7.44(t，8)7.35(dd，7，2) 7.33(t，7) 7.43(d，8) 7.33(br.t，7) 7.32(m)7.42(d，8) 7.32(m)NBz(o) 7.76(d，8)7.77(br.d，8) - 7.75(d，8) 7.75(d，7)- 7.76(d，8)-NBz(m) 7.52(br，t，7)7.45(m)- 7.51(t，7) 7.47(t，7)- 7.51(t，7) -NBz(p) 7.52(br，t，7)7.46(m)- 7.52(t，7) 7.53(t，7)- 7.52(t，7) -1-OH1.89(br.t，11，2) 1.92(br.s) - 1.97(s)1.97(s) - 1.96(s)-7-OH2.54(br.s)- - 2.49(br.s) - - 2.50(br.s) -2’OH - - - - - - - -4-OAc 2.46(s) 2.49(s)2.43(s)2.44(s)2.49(s) 2.41(s)2.43(s)2.41(s)10-OAc 2.23(s) 2.06(s)2.23(s)2.23(s)2.07(s) 2.23(s)2.22(s)2.23(s)2”-CH3- - 1.97(s) - -1.96(br.s) - 1.96(s)質子編號 9 10 11 12 13 14 15163”- -6.43(br.q，7) - - 6.43(br.q， - 6.45(br.q，7)7)4”-CH3-- 1.72(d，7)- - 1.72(d，7) - 1.73(d，7)CHO 10.13(s) 10.10(s)，10.12 10.11(s) -- - - -(s)屬于表鬼臼毒素部分的信號1 4.61(br.d，4)4.71(2H，d，5) 4.67(br，s) 4.62(d，5)4.61(br.d，4)2 3.13(m) 3.12(2H，m)3.13(m) 3.14(dd，15，5) 3.14(dd，14，4)3 3.11(m) 3.05(2H，m)3.12(m) 3.02(tdd，15，7， 3.04(m)4)4 4.71(d，5) 4.68(2H，t，4) 4.71(d，5) 4.73(dd，5，5)4.73(br.s)5 6.58(s) 6.39(2H，s)6.59(s) 6.80(s) 6.80(s)8 6.39(s) 6.60(2H，s)6.39(s) 6.55(s) 6.54(s)114.00，4.27(t，9) 4.26(2H，m)4.20，4.27(t，9) 4.22(td，11，5) 4.01，4.40(t，9)4.00(2H，m) 4.00(td，11，5)OCH2O 5.92，5.98(br.s) 5.98，5.92 5.98(br.s) 5.92，5.99(d，1) 5.96，5.98(均為2H，分別為 (br.s)br.s)2””，6”” 6.39(s) 6.38(4H，s) 6.39(s) 6.34(s) 6.34(s)OCH3X23.81(s) 3.81(6H，s) 3.81(s) 3.80(s) 3.80(s)CH＝N 8.51(s) 8.51(s)，8.53 8.51(s) 8.57(s) 8.57(s)質子編號 9 10 11 12 13 14 15 16(s)NHC6H4-N＝ - - - 7.97，8.07(d，9) 7.97，8.04(d，8)*由于譜圖復雜不能確定質子表2.12-16對所選人腫瘤細胞系的細胞毒性(ED50)(μM)化合物 KBA549HCT-8CAKI-1MCF-7SK-MEL-21A9(OVCAR)12 0.003 0.210.54 ＞0.250.33 ＞0.40 0.0313 16.5 NA1NA ＞4 ＞4 NA ND14 0.03 0.702.78 ＞5 1.23 8.900.1415 0.23 2.80＞0.1＞4 1.86 ＞400.3016 1.40 3.55＞40 ＞10 ＞5 ＞401.12GL-331 1.86 0.483.38 1.80 9.29 5.950.20依托泊苷 0.20 1.95＞5 2.2 ＞5 ND 0.60Cephalomannine 0.002 0.009 0.047＞0.3 0.1670.134 0.003紫杉醇 0.016 0.006 0.013ND2ND ND 0.0021NA＝沒有活性2ND＝未測定表3.12-16對耐藥性細胞系的細胞毒性(耐藥性倍數)化合物 KB-7D KB-VCR KB-CPT PAX-10 PAX-2212 1 17 1 7 1713 0.6 -1- - -14 - - - ＞36 -15 1 8 1 ＞17 816 - - - 7.5-GL-331 2 3 1 13 8依托泊苷 119 1531 ＞16 ＞16Cephalomannine - - - 40 -紫杉醇 1 15 1 24 241ND＝未測定表4.12-16對NCI人腫瘤細胞系的細胞毒性(log GI50)1化合物 白血病 NSCL2結腸癌 CNS3黑素瘤 卵巢癌 腎癌 前列腺癌 乳腺癌12 -7.60-6.58 -7.20-6.93 -6.29-6.55- -7.22 -6.56.1313 -4.95-5.78 -4.90-5.20 -5.16-5.03- -5.06 -4.95.0815 -6.02-5.50 -5.12-5.54 -5.01-4.95- -5.06 -4/95/881數據由NCI提供。GI50為使腫瘤生長抑制50％的濃度。2非小細胞肺癌。3中樞神經系統癌。
表5.12-16的拓撲異構酶II抑制活性化合物 抑制Topo II細胞蛋白質-DNAIC100(μM) 復合物形成(％)12 100 8+/-213 50 NA114 NA2NA215 100 25+/-1116 NA2NA2GL-331 50 134+/-7依托泊苷 100 100Cephalomannine NA2NA2紫杉醇 NA1NA11在50μM沒有活性；2在100μM沒有活性。
前面為本發明的示例性說明，不能解釋為對本發明的限制。本發明通過以下權利要求限定，與權利要求等同的實施方案也包括在本發明。
權利要求
1.一種式I化合物或其藥學上可接受的鹽T1-L-T2(I)其中T1為式II的紫杉類基團 其中R1為C6H5，R2為O；L為連接基團；T2為選自以下的取代基表鬼臼毒素、安吖啶、橢圓玫瑰樹堿、蒽環類抗生素、米托蒽醌、絲裂霉素、喹諾酮和秋水仙堿基團。
2.權利要求1的化合物，其中T2為式III-A表鬼臼毒素基團 其中R10、R11、R12、R13、R15和R16各自獨立選自以下基團H、烷基、羥基、烷氧基、烷基羥基和鹵代；R14選自以下基團H、烷基、羥基、烷氧基、烷基羥基、鹵代和磷酸鹽；R17為NH或不存在。
3.權利要求1的化合物，其中T2為式III-B安吖啶基團 其中R20和R21各自獨立選自以下基團H、烷基、羥基、烷氧基和烷基羥基；R22和R23各自獨立選自以下基團H、烷基、羥基、烷氧基、烷基羥基和鹵代；R24為NH或不存在。
4.權利要求1的化合物，其中T2為式III-C橢圓玫瑰樹堿基團 其中R30為H或烷基、或者不存在；R31為H、烷基、羥基、烷氧基、烷基羥基(alkyhyroxy)、鹵代或-C(O)-N(R36)-(CH2)n-N(R37)(R38)，其中R36、R37和R38各自獨立選自H和烷基，n為1-6的整數；R32和R33各自獨立選自以下基團H、烷基、羥基、烷氧基、烷基羥基和鹵代；R34為H或烷基；R35為O或不存在。
5.權利要求1的化合物，其中T2為式III-D蒽環類抗生素基團 其中R40為H、烷基、羥基、烷氧基、烷基羥基或鹵代；R41為羥基O-或共價鍵；R42為烷基、烷基羥基、CH2O-或CH2-；R43和R44各自獨立選自H和羥基；R45為羥基或NH2；R46為H或鹵代；條件是如果R41不為O-或共價鍵，則R42為CH2O-或CH2-；如果R42不為CH2O-或CH2-，則R41為O-或共價鍵。
6.權利要求1的化合物，其中T2為式III-E米托蒽醌基團 其中R50、R51、R52和R53各自獨立選自OH或O-；條件是R50、R51、R52和R53其中之一為O-。
7.權利要求1的化合物，其中T2為式III-F絲裂霉素基團 其中X為NH2、NH-或脂肪族胺；R71為烷基或鹵代；R72為羥基或烷氧基；R73為H或不存在；Y為H或烷基。
8.權利要求1的化合物，其中T2為式III-G秋水仙堿基團 其中R60和R61各自獨立為H、烷基、羥基、O-或烷氧基；R62為H、NH2、NH-、OH、O-、＝O或NHCOCH3，X為S或O，條件是R60或R61其中一個為O-，或者R62為NH-或O-。
9.權利要求1的化合物，其中T2為式III-H喹諾酮基團 其中R81選自以下基團H、羥基、低級烷基、低級烷氧基、羥基、鹵代和氨基；R82選自以下基團H、羥基、低級烷基、低級烷氧基、羥基、鹵代和氨基；R83選自以下基團H、羥基、低級烷基、低級烷氧基、羥基、鹵代和氨基；R84選自以下基團H、羥基、低級烷基、低級烷氧基、羥基、鹵代和氨基；R85各自獨立選自以下基團H、羥基、低級烷基、低級烷氧基、羥基、鹵代和氨基；n為0-4。
10.權利要求1的化合物，其中L為式-La-Lb-的共價連接基團，其中Lb存在或不存在，La和Lb各自獨立選自以下基團 和 其中a為0-3，b為0-3；R70選自亞烷基、鏈烯基和亞芳基。
11.一種藥用制劑，所述制劑包含根據權利要求1的化合物和藥學上可接受的載體。
12.權利要求11的藥用制劑，其中所述載體為水性載體。
13.一種治療腫瘤的方法，所述方法包括給予其需要患者治療有效量的權利要求1化合物。
14.權利要求13的方法，其中所述腫瘤為實體瘤。
15.權利要求13的方法，其中所述腫瘤選自肺癌、結腸癌、中樞神經系統癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌和乳腺癌。
16.權利要求13的方法，其中所述腫瘤為乳腺癌。
17.權利要求13的方法，其中所述腫瘤為前列腺癌。
18.一種治療其需要患者癌癥的方法，所述方法包括給予所述患者癌癥治療有效量的權利要求1化合物。
19.權利要求18的方法，其中所述癌癥選自小細胞肺癌、睪丸癌、淋巴瘤、白血病、食管癌、胃癌、結腸癌、乳腺癌、中樞神經系統癌、肝癌和前列腺癌。
20.一種誘導細胞分化的方法，所述方法包括使癌細胞與分化有效量的權利要求1化合物接觸。
21.權利要求20的方法，其中所述接觸步驟在體內進行。
22.權利要求20的方法，其中所述接觸步驟在體外進行。
23.一種抑制細胞有絲分裂的方法，所述方法包括使細胞與有絲分裂抑制量的權利要求1化合物接觸。
24.權利要求23的方法，其中所述接觸步驟在體內進行。
25.權利要求23的方法，其中所述接觸步驟在體外進行。
全文摘要
本發明提供根據式(I)的化合物及其藥學上可接受的鹽T
文檔編號C07H15/26GK1474703SQ01819203
公開日2004年2月11日 申請日期2001年9月25日 優先權日2000年9月25日
發明者K·-H·李, Q·施, K·巴斯托, H·-K·王, K -H 李, ね, 雇 申請人:北卡羅來納查佩爾山大學