專利名稱：咪唑并喹啉胺在dna疫苗接種中作為佐劑的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及對DNA疫苗接種的改進，并且特別而不僅僅涉及疫苗組合物，對哺乳動物進行疫苗接種從而抵抗疾病的方法，以及某些化合物在藥物制備中的用途。
背景技術：
對傳統疫苗接種技術已經知曉多年了，傳統疫苗接種技術包括將能夠誘導動物體內的免疫應答的抗原引入動物系統從而使動物能夠抵抗感染。九十年代初期就觀察到了質粒DNA能夠直接轉染動物體內細胞，接著進行了大量的研究從而在利用DNA質粒的基礎上開發出一種疫苗接種技術，該疫苗接種技術是通過將編碼抗原肽的DNA直接引入到動物體內來誘導免疫應答。這種被稱作“DNA免疫接種”或“DNA疫苗接種”的技術目前已被用來在臨床前使用的多種病毒、細菌和寄生蟲病動物模型中激發保護性抗體(體液的)和細胞-介導的(細胞的)免疫應答。還對DNA疫苗接種技術在防治癌癥、變態反應和自身免疫疾病中的應用進行了研究。
DNA疫苗通常由一種其中插入了一個強啟動子、編碼抗原肽的目的基因和一段聚腺苷酸化/轉錄終止序列的細菌質粒載體組成。由目的基因編碼的免疫原可以是與病原體、腫瘤或其它需要預防的病原體相關的全蛋白或簡單的抗原肽序列。在給宿主進行給藥前，根據所要采用的給藥方式使所述質粒在細菌如大腸桿菌體內進行繁殖然后進行分離并利用適當的介質進行配制。
有關DNA疫苗接種的有用背景技術信息被記載在″Donnelly，J等，免疫學年報(Annual Rev.Immunol).(1997)15617-648″中，該文獻的全部內容被本文引入作為參考。
與傳統疫苗接種技術相比，DNA疫苗接種具有許多優點。首先，可以預知由于由DNA序列編碼的蛋白是在宿主體內進行合成的，所以所述蛋白的結構或構象與天然的疾病相關蛋白的結構或構象類似。通過產生識別源于保守蛋白的表位的細胞毒性的T淋巴細胞應答，DNA疫苗接種還可能提供抵抗不同病毒株的作用。而且，由于質粒被直接引入能夠產生抗原蛋白的宿主細胞中，所以引發了持續時間較長的免疫應答。所述技術還提供了將不同免疫原組合成單一制劑從而有利于針對幾種病癥進行同時免疫的可能性。
盡管DNA疫苗接種比傳統疫苗接種治療有許多優勢，然而仍然需要開發佐劑化合物，該化合物能夠增強免疫應答，該免疫應答是由給動物給藥的質粒DNA編碼的蛋白誘導的。
DNA疫苗接種有時會伴隨發生使免疫應答由Th1應答異常偏向Th2應答，尤其是當DNA被直接給藥給表皮時更容易發生這種現象(Fuller和HaynesHum.Retrovir.(1994)101433-41)。已經認識到由核酸疫苗引起的免疫過程取決于所針對的疾病。優先引發的Th1應答似乎能夠提供疫苗針對多種病毒疾病和癌癥的效力，而優勢的Th2型應答可能對與某些自身免疫疾病有關的限制性變態反應和炎癥有效。因此定量增強免疫應答或將應答類型轉變成對病癥最有效的應答類型的方法可能是有用的。
因此，本發明的一個目的在于提供能夠與DNA疫苗接種方法結合使用的佐劑化合物。另外一個目的在于提供含有相關佐劑的組合物，以及改進涉及這類佐劑的DNA疫苗接種的方法。本發明的其它目的將通過以下詳細說明而顯而易見。然而，至今要達到這些目的仍有困難，主要是由于DNA疫苗接種與傳統疫苗接種技術相比具有本質上的差異。而且，合適化合物的鑒定并不簡單，已經進行了將多種已知免疫增強劑與DNA免疫接種技術結合的嘗試，結果是非常有限的或者最好也不過取得了很少的成功。例如，共同給藥IFN-γ和狂犬病毒糖蛋白的基因已經對T輔助細胞應答和抗體應答產生了抑制作用(Xiang和Ertl)。
考慮到這種背景技術，非常驚奇地注意到本發明人報道了當作為DNA疫苗接種的佐劑時，能夠有效促進免疫應答增強的佐劑化合物，尤其是能夠有效促進細胞免疫應答增強的佐劑化合物。咪唑并喹啉胺衍生物是包括IFN-α，IL-6和TNF-α在內的細胞因子的誘導劑(參見，例如Reiter等，白細胞生物學雜志(J.Leukocyte Biology)(1994)55234-240)。這些化合物劑及其制備方法已經被公開在公開號為WO 94/17043的PCT專利申請中。本發明人已經說明了這些衍生物可以被有效用作DNA疫苗接種的佐劑。
本發明概述本發明的一個實施方案提供了一種含有(i)一種含有1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物的佐劑成分和(ii)一種含有編碼抗原肽或疾病相關蛋白的核苷酸序列的免疫原成分的疫苗組合物，其中所述佐劑成分增強了哺乳動物體內針對抗原肽或蛋白的免疫應答。
另一方面，本發明提供了一種增強針對抗原的免疫應答的方法，所述方法包括順序或同時給藥一種編碼抗原的核酸和一種咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物。
另一個實施方案提供了一種咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物在制備能夠增強針對由核苷酸序列編碼的抗原的免疫應答的藥物中的用途，所述核苷酸序列與所述衍生物被順序或同時給藥。
本發明的另一個實施方案提供了一種含有咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物的藥物組合物，該咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物用于增強針對由核酸序列編碼的抗原的免疫應答。
優選地，1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物是一種由本文所述通式I-VI中的一個通式所定義的化合物。更優選地，它是一種由通式VI所定義的化合物。特別優選1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物是一種選自下列一組通式VI的化合物1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；1-(2-羥基-2-甲基丙基)-2-甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；1-(2-羥基-2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；1-(2-羥基-2-甲基丙基)-2-乙氧基甲基-1-H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺。
在另一個實施方案中，本發明提供了一種增強哺乳動物體內抵抗疾病的免疫應答的方法，包括向所述哺乳動物給藥一種合適的載體和一種編碼與疾病相關的抗原肽的核苷酸序列。還提供增強哺乳動物對免疫原的免疫應答的方法，包括以足以有效刺激免疫應答的量向所述哺乳動物給藥合適載體和編碼所述免疫原的核甘酸序列；另外以足以有效增強所述免疫應答的量向所述哺乳動物給藥一種作為疫苗佐劑的1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物。在所述方法中，1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物優選地是一種通式VI的化合物。
在另一個實施方案中，本發明提供了1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物在制備用于增強由抗原肽或蛋白引發的免疫應答的藥物中的用途，所述肽/蛋白是通過對哺乳動物給藥了編碼所述肽的核苷酸序列而被表達的。
附圖的簡要說明
圖1.
在接種了編碼流感病毒核蛋白的質粒(pVAC1.PR)后，咪喹莫特(imiguimod)增強了細胞毒性T-細胞的應答。pVACl由載體控制。
圖2.
在免疫接種了編碼卵白蛋白的質粒后，咪喹莫特增強了體內CD4 T細胞的克隆擴充，測定結果為CD4+T細胞的增殖水平被提高了。
圖3.
在免疫接種了編碼卵白蛋白的質粒后，咪喹莫特增加了體內被激活的CD4 T細胞的數目，測定結果為IFN-λ和IL-4產生細胞的數目增多了。
圖4.
在免疫接種了編碼卵白蛋白的質粒后，咪喹莫特既誘導了體內的Th1應答又誘導了Th2應答，測定結果為IFN-λ和IL-4-產生細胞的數目分別增多了。
圖5.
在免疫接種了編碼HIV抗原Gag和Nef的質粒(WRG7077.Gag/Nef)后，咪喹莫特增強了細胞毒性T細胞的應答。WRG7077由載體控制。
圖6.
在免疫接種了編碼卵白蛋白的質粒后，Resiquimod(1-(2-羥基-2-甲基丙基)-2-乙氧基甲基-1-H-咪唑并[4，5c]喹啉-4-胺)，咪喹莫特的一種類似物，增加了體內被激活的CD4 T細胞的數目，測定結果為IFN-λ和IL-4-產生細胞的數目增多了(分別由6A和6B所示)。
圖7.
在免疫接種了編碼卵白蛋白的質粒后，咪喹莫特的兩種類似物，1-(2-羥基-2-甲基丙基)-2-甲基-1H-咪唑并[4，5c]喹啉-4-胺和1-(2-羥基-2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5c]喹啉-4-胺，增加了體內被激活的CD4 T細胞的數目，測定結果為IFN-λ和IL-4產生細胞的數目增多了(分別由7A和7B所示)。
圖8.
在免疫接種了編碼HIV抗原Gag和Nef的質粒(WRG7077.Gag/Nef)后，局部給藥咪喹莫特增強了細胞毒性T細胞的應答。WRG7077由載體控制。
圖9.
在免疫接種了編碼卵白蛋白的質粒進行后，咪喹莫特延緩了腫瘤在動物體內的生長，所述動物受到表達卵白蛋白的EG7.OVA腫瘤細胞的攻擊。
圖10.
咪喹莫特降低了被植入動物體內的表達卵白蛋白的EG7.OVA腫瘤細胞的致瘤力，所述動物預先免疫接種了編碼卵白蛋白的質粒。
本發明的詳細描述在整個說明書和所附權利要求書中，除非本文另有說明，術語“含有”和“包括”或其變化形式如現在分詞形式的“含有”、第三人稱單數形式的“含有”、現在分詞形式的“包括”、第三人稱單數形式的“包括”等被解釋為包含的意思，即，使用這些術語隱含了可能包括全部要素或者沒有具體列出的要素。
如上所述，本發明涉及免疫原性組合物如疫苗組合物、免疫接種方法和改進的免疫接種方法，該改進的免疫接種方法包括將編碼免疫原的核苷酸序列引進哺乳動物體內，該免疫原是一種抗原蛋白或抗原肽，以便使得所述蛋白或肽在哺乳動物體內進行表達從而在哺乳動物體內誘導抵抗抗原蛋白或抗原肽的免疫應答。這種免疫接種方法是已經熟知的并且在上文所引用的Donnelly等人撰寫的文章中已被進行了充分的描述。
如本文所使用的術語“疫苗組合物”是指含有一種編碼免疫原的核苷酸序列的免疫原成分與一種含有1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物的佐劑成分的組合。所述組合是，例如處于單一藥用制劑中的兩種成分的混合物形式或者例如處于一個試劑盒中的各個成分的分離形式，所述試劑盒包括含有一種編碼免疫原的核苷酸序列的免疫原成分和一種含有1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物的佐劑成分，其中所述兩種成分是分開、順序或同時進行給藥的。優選地，兩種組分基本上同時進行給藥。
本說明書和權利要求中所述的1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物優選地是由下面的通式I-VI中的一個所定義的化合物
(貼第8頁的化學結構式I) 其中R11選自直鏈或支鏈烷基、羥烷基、酰氧烷基、芐基、(苯基)乙基和苯基，所述芐基、(苯基)乙基或苯基取代基任選地被獨立地選自一個至約四個碳原子的烷基、一個至約四個碳原子的烷氧基和鹵素的一個或兩個基團在苯環上進行了取代，條件是如果所述苯環被所述基團中的兩個所取代，那么所述基團總共含有不超過6個碳原子；R21選自氫、一個至約八個碳原子的烷基、芐基、(苯基)乙基和苯基，所述芐基、(苯基)乙基或苯基取代基任選地被獨立地選自一個至約四個碳原子的烷基、一個至約四個碳原子的烷氧基和鹵素的一個或兩個基團在苯環上進行了取代，條件是如果所述苯環被所述基團中的兩個所取代，那么所述基團總共含有不超過6個碳原子；和每個R1獨立的選自氫、一個至約四個碳原子的烷氧基、鹵素和一個至約四個碳原子的烷基，以及n是0至2的整數，條件是如果n是2，那么所述R11基團總共含有不超過6個碳原子；(貼第8頁的化學結構式II) 其中R12選自含有2至約10個碳原子的直鏈或支鏈烯基和含有2至約10個碳原子的被取代的直鏈或支鏈烯基，其中所述取代基選自含有1至約4個碳原子的直鏈或支鏈烷基和含有3至約6個碳原子的環烷基；和被含有1至約4個碳原子的直鏈或支鏈烷基取代的含有3至約6個碳原子的環烷基；以及R22選自氫、含有一個至約八個碳原子的直鏈或支鏈烷基、芐基、(苯基)乙基和苯基，所述芐基、(苯基)乙基或苯基取代基任選地被獨立地選自含有一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷基、含有一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基和鹵素的一個或兩個基團在苯環上進行了取代，條件是如果所述苯環被所述基團中的兩個所取代，那么所述基團總共含有不超過6個碳原子；和R2獨立的選自含有一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基、鹵素和含有一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷基，以及n是0至2的整數，條件是如果n是2，那么所述R2基團總共含有不超過6個碳原子；(貼第9頁的化學結構式III) 其中R23選自氫、一個至約八個碳原子的直鏈或支鏈烷基、芐基、(苯基)乙基和苯基，所述芐基，(苯基)乙基或苯基取代基任選地被一個或兩個獨立地選自一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷基、一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基和鹵素的基團在苯環上進行了取代，條件是如果所述苯環被所述基團中的兩個所取代，那么所述基團總共含有不超過6個碳原子；和R5獨立的選自一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基、鹵素和一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷基，以及n是0至2的整數，條件是如果n是2，那么所述R3基團總共含有不超過6個碳原子； 其中R14是-CHRARB，其中RB是氫或碳-碳鍵，條件是當RB是氫時，RA是一個至約四個碳原子的烷氧基、一個至約四個碳原子的羥烷氧基、兩個至約十個碳原子的1-炔基、四氫吡喃基、其中烷氧基部分含有一個至約四個碳原子以及烷基部分含有一個至約四個碳原子的烷氧基烷基、2-、3-或4-吡啶基，以及另外一個條件是當RB是碳-碳鍵時，RB和RA共同形成四氫呋喃基團，該基團任選地被一個或多個獨立地選自羥基和一個至約四個碳原子的羥烷基的取代基所取代；R24選自氫、一個至約四個碳原子的烷基、苯基和被取代的苯基，其中取代基選自一個至約四個碳原子的烷基、一個至約四個碳原子的烷氧基和鹵素；R4選自氫、含有一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基、鹵素和含有一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷基；(貼第11頁的化學結構式V) 其中R15選自氫、含有一個至約十個碳原子的直鏈或支鏈烷基和被取代的含有一個至約十個碳原子的直鏈或支鏈烷基，其中所述取代基選自含有三個至約六個碳原子的環烷基和被含有一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷基取代的含有三個至約六個碳原子的環烷基；含有兩個至約十個碳原子的直鏈或支鏈烯基和被取代的含有兩個至約十個碳原子的直鏈或支鏈烯基，其中所述取代基選自含有三個至約六個碳原子的環烷基和被含有一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷基取代的含有三個至約六個碳原子的環烷基；一個至約六個碳原子的羥烷基；其中烷氧基部分含有一個至約四個碳原子以及烷基部分含有一個至約六個碳原子的烷氧基烷基；其中酰氧基部分是兩個至約四個碳原子的鏈烷酰氧基基或苯甲酰氧基以及烷基部分含有一個至約六個碳原子的酰氧烷基；芐基；(苯基)乙基；和苯基；所述芐基，(苯基)乙基或苯基取代基任選地被一個或兩個獨立地選自一個至約四個碳原子的烷基、一個至約四個碳原子的烷氧基和鹵素的基團在苯環上進行了取代，條件是當所述苯環被兩個所述基團取代時，所述基團總共含有不超過六個碳原子；R25是 其中Rx和Ry獨立地選自氫、一個至約四個碳原子的烷基、苯基和其中取代基選自一個至約四個碳原子的烷基、一個至約四個碳原子的烷氧基和鹵素的被取代的苯基；X選自含有一個至約四個碳原子的烷氧基、其中烷氧基部分含有一個至約四個碳原子以及烷基部分含有一個至約四個碳原子的烷氧基烷基、一個至約四個碳原子的鹵烷基、其中烷基含有一個至約四個碳原子的烷酰氨基、氨基、其中取代基為一個至約四個碳原子的烷基或羥烷基的被取代的氨基、疊氮基、一個至約四個碳原子的烷硫基；以及R5選自氫、一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基、鹵素、一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基；或上述任意一種化合物的藥用鹽。
優選地烷基是C1-C4烷基，例如甲基，乙基，丙基，2-甲基丙基和丁基。最優選的烷基是甲基，乙基和2-甲基-丙基。優選的烷氧基是甲氧基，乙氧基和乙氧基甲基。
以上列舉的化合物及其制備方法被公開在公開號為WO 94/17043的PCT專利申請中。
當n可以是0、1或2時，n優選地是0或1。
上述取代基R1-R5在本文中通常被稱作“苯并取代基”。優選的苯并取代基是氫。
上述取代基R11-R15在本文中通常被稱作“1-取代基”。優選的1-取代基是2-甲基丙基或2-羥基-2-甲基丙基。
上述取代基R21-R25在本文中通常被稱作“2-取代基”。優選的2-取代基是氫、一個至約六個碳原子的烷基，其中烷氧基部分含有一個至約四個碳原子的以及烷基部分含有一個至約四個碳原子的烷氧基烷基。最優選的2-取代基是氫、甲基或乙氧基甲基。
特別優選地是1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺是一種由下面的通式VI所定義的化合物 其中Rt選自氫、含有一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基、鹵素和含有一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷基；Ru是2-甲基丙基或2-羥基-2-甲基丙基；和Rv是氫、一個至約六個碳原子的烷基，或其中烷氧基部分含有一個至約四個碳原子以及烷基部分含有一個至約四個碳原子的烷氧基烷基；或如果合適，上述任意一種化合物的藥用鹽。
在式V1中，Rt優選地是氫，Ru優選地是2-甲基丙基或2羥基-2-甲基丙基，以及Rv優選地是氫、甲基或乙氧基甲基。
優選的1 H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺包括下列化合物1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(一種通式VI化合物，其中Rt是氫，Ru是2-甲基丙基以及Rv是氫)；1-(2-羥基-2-甲基丙基)-2-甲基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-4-胺(一種式VI化合物，其中Rt是氫，Ru是2-羥基-2-甲基丙基，以及Rv是甲基)；1-(2-羥基-2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(一種通式VI化合物，其中Rt是氫，Ru是2-羥基-2-甲基丙基，以及Rv是氫)；1-(2-羥基-2-甲基丙基)-2-乙氧基甲基-1-H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(一種通式VI化合物，其中Rt是氫，Ru是2-羥基-2-甲基丙基，以及Rv是乙氧基甲基)；或其藥用鹽。
本申請的疫苗接種方法和組合物可適用于哺乳動物對各種疾病如病毒、細菌或寄生蟲感染、癌癥、變態反應和自身免疫疾病的防治。通過采用本發明的方法或組合物防治的機能紊亂或疾病的某些特定實例如下病毒感染甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎病毒，1，2，6和7型皰疹病毒、巨細胞病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、乳頭狀瘤病毒、埃-巴二氏病毒、流感病毒、副流感病毒、腺病毒、柯薩奇病毒、細小核糖核酸病毒、輪狀病毒、呼吸道合胞病毒、痘病毒、鼻病毒、風疹病毒、乳多空病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒。
細菌感染引起TB和麻風病的分支桿菌、肺炎球菌、需氧革蘭氏陰性菌、支原體、葡萄球菌、沙門氏菌、衣原體。
寄生蟲瘧疾、利什曼病、錐蟲病、弓形體病、血吸蟲病、絲蟲病。
癌癥乳腺癌、結腸癌、直腸癌、頭部和頸部癌癥、腎癌、惡性黑色素瘤、喉癌、卵巢癌、子宮頸癌、前列腺癌。
變態反應由室內塵螨、花粉和其它環境變應原引起的鼻炎。
自身免疫疾病系統性紅斑狼瘡。
優選地，本發明的方法或組合物被用來預防或治療病毒性疾病如乙型肝炎、丙型肝炎、人乳頭狀病毒、人免疫缺陷病毒或單純性皰疹病毒；細菌疾病TB；乳腺癌、結腸癌、卵巢癌、子宮頸癌和前列腺癌；或哮喘自身免疫疾病、類風濕性關節炎和阿爾茨海默氏病。
應當認識到這些特定疾病只是舉例說明性質的，而不是用來限定本發明的范圍。
本申請所涉及的在哺乳動物系統內進行表達從而誘導抗原性應答的核苷酸序列可以編碼全蛋白或者僅僅編碼能夠啟動抗原性應答的短肽序列。在整個說明書和所附的權利要求書中，術語“抗原肽”或“免疫原”是指包括所有能夠在所涉及的動物體內誘導免疫應答的肽或蛋白序列。然而，最優選地是所述核苷酸序列能夠編碼與疾病相關的全蛋白，這是由于全蛋白在哺乳動物系統內的表達與天然抗原模擬過程似乎更相似，從而能夠誘發完全的免疫應答。與特定疾病相關的一些已知抗原肽的非限制性實例如下能夠誘發抵抗人病原體的免疫應答的抗原，該抗原或抗原組合物得自于HIV-1，(如tat，nef，gp120或gp160，gp40，p24，gag，env，vif，vpr，vpu，rev)，人皰疹病毒如gH，gL gM gB gC gK gE或gD或其衍生物或早期蛋白如來源于HSV1或HSV2的ICP27、ICP 47、ICP 4、ICP36，巨細胞病毒，尤其是人的巨細胞病毒(如Gb或其衍生物)，埃-巴二氏病毒(如gp350或其衍生物)，水痘-帶狀皰疹病毒(如gp1，11，111和IE63)，或者來源于肝炎病毒如乙型肝炎病毒(例如乙型肝炎病毒表面抗原或肝炎核心抗原或pol)，丙型肝炎病毒抗原和丁型肝炎病毒抗原或來源于其它病毒病原體如副粘液病毒呼吸道合胞病毒(如F和G蛋白或其衍生物)，或來源于副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳頭狀瘤病毒(例如HPV6，11，16，18，eg L1，L2，E1，E2，E3，E4，E5，E6，E7)，黃病毒(例如黃熱病病毒、登革熱病毒、蜱傳播的腦炎病毒、日本腦炎病毒)或流感病毒細胞(如HA，NP，NA或M蛋白，或其混合物)的抗原，或得自于以下細菌病原體的抗原如包括淋病奈瑟氏菌和腦膜炎在內的奈瑟氏菌(例如轉鐵-結合蛋白、乳鐵結合蛋白、PilC、粘附素)；釀膿鏈球菌(例如M蛋白或其片段、C5A蛋白酶)，無乳鏈球菌、變異鏈球菌；杜氏嗜血菌；包括粘膜炎莫拉氏菌在內的莫拉氏菌屬，也被稱作粘膜炎布蘭漢氏球菌(例如高分子量和低分子量的粘附素和侵襲素)；包括百日咳博德特氏菌(例如pertactin，百日咳毒素或其衍生物，絲狀血細胞凝集素，腺苷酸環化酶，菌毛)、副百日咳博德特氏菌和支氣管炎博德特氏菌在內的博德特氏菌屬；包括結合分枝桿菌(例如ESAT6，抗原85A，-B或-C，MPT 44，MPT59，MPT45，HSP10，HSP65，HSP70，HSP75，HSP90，PPD 19kDa[Rv3763]，PPD 38kDa[Rv0934])、牛分枝桿菌、麻風分枝桿菌、貪食分枝桿菌、副結核分枝桿菌、恥垢分枝桿菌在內的分枝桿菌屬；包括侵肺軍團菌在內的軍團菌屬；包括腸毒素大腸桿菌(例如定居因子、熱不穩定毒素或其衍生物、熱穩定毒素或其衍生物)、腸出血性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌(例如志賀氏毒素類毒素或其衍生物)在內的埃希氏桿菌屬；包括霍亂弧菌(例如霍亂毒素或其衍生物)在內的弧菌屬；包括宋內志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、弗氏志賀菌在內的志賀氏菌屬；包括小腸結腸炎耶爾森氏菌(例如Yop蛋白)、鼠耶爾森氏菌、假結核耶爾森氏菌在內的耶爾森氏菌屬；包括空腸彎曲桿菌(例如毒素、粘附素和侵襲素)和大腸彎曲桿菌在內的彎曲桿菌屬；包括傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌在內的沙門氏菌屬；包括單核細胞增生利斯特氏菌在內的利斯特氏菌屬；包括幽門螺桿菌(例如脲酶、過氧化氫酶、空泡性毒素)在內的螺桿菌屬；包括銅綠假單胞菌；包括金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌在內的葡萄球菌屬；包括糞腸球菌、屎腸球菌在內的腸球菌；包括破傷風梭菌(例如破傷風毒素及其衍生物)、肉毒梭菌(例如肉毒毒素及其衍生物)、艱難梭菌(例如梭菌毒素A或B及其衍生物)在內的梭菌屬；包括炭疽芽孢桿菌(例如肉毒毒素及其衍生物)在內的芽孢桿菌屬；包括白喉棒狀桿菌(例如白喉毒素及其衍生物)在內的棒狀桿菌屬；包括布氏疏螺旋體(例如OspA，OspC，DbpA，DbpB)、嘎氏氏疏螺旋體(例如OspA，OspC，DbpA，DbpB)、阿氏疏螺旋體(例如OspA，OspC，DbpA，DbpB)、B.Andersonii(例如OspA，OspC，DbpA，DbpB)、赫氏疏螺旋體在內的疏螺旋體屬；包括馬埃里希氏體和人粒細胞埃里希氏癥病原體在內的埃里希氏體屬；包括立氏立克次氏體在內的立克次氏體屬；包括砂眼衣原體(例如MOMP、肝素-結合蛋白)、肺炎衣原體(例如MOMP、肝素-結合蛋白)、鸚鵡熱衣原體在內的衣原體屬；包括問號鉤端螺旋體在內的鉤端螺旋體屬；包括蒼白密螺旋體(例如稀有外膜蛋白)、齒垢密螺旋體、豬痢疾密螺旋體在內的密螺旋體屬；或得自于寄生蟲如包括惡性瘧原蟲在內的瘧原蟲屬；包括鼠弓形體(例如SAG2，SAG3，Tg34)在內的弓形體屬；包括溶組織內變形蟲在內的內變形蟲屬；包括小耳巴貝蟲(B.Microti)在內的巴貝蟲屬；包括克魯斯氏錐蟲在內的錐蟲屬；包括蘭氏鞭毛賈第蟲(G.lamblia)在內的賈第蟲屬；包括L.major在內的Leshmania；包括卡氏肺囊蟲在內的肺囊蟲屬；包括陰道毛滴蟲在內的毛滴蟲屬；包括S.mansoni在內的或得自于酵母菌如包括白色假絲酵母在內的假絲酵母屬的Schisostoma；包括新型隱球菌在內的隱球菌屬。
其它優選的特異性結核分枝桿菌抗原是例如Rv2557，Rv2558，RPFsRv0837c，Rv1884c，Rv2389c，Rv2450，Rv1009，aceA(Rv0467)，PstS1，(Rv0932)，SodA(Rv3846)，Rv2031c 16kDal.，Tb Ra12，Tb H9，Tb Ra35，Tb38-1，Erd 14，DPV，MTI，MSL，mTTC2和hTCC1(WO 99/51748)。結核分枝桿菌的蛋白還包括融合蛋白及其變異體，在所述融合蛋白及其變異體中結核分枝桿菌的至少兩條，優選地是三條多肽被融合到較大的蛋白中。優選的融合體包括Ra12-TbH9-Ra35，Erd14-DPV-MTI，DPV-MTIMSL，Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2，Erd14-DPV-MTI-MSL，DPV-MTI-MSL-mTCC2，TbH9-DPV-MTI(WO99/51748)。
最優選的衣原體抗原包括例如高分子量蛋白(HWMP)(WO 99/17741)，ORF3(EP 366 412)和推定膜蛋白(Pmps)。疫苗制劑中的其它衣原體抗原可以選自WO 99/28475中所記載的一組衣原體抗原。
優選的細菌疫苗含有得自于包括肺炎鏈球菌的在內的鏈球菌屬的抗原(PsaA，PspA，鏈球菌溶血素，膽堿結合蛋白)和肺炎球菌自溶酶蛋白抗原(生物化學生物物理學學報(Biochem Biophys Acta)，1989，67，1007；Rubins等，微生物發病機理(Microbial Pathogenesis)，25，337-342)，及其突變去毒衍生物(WO 90/06951；WO 99/03884)。其它優選的細菌疫苗含有得自于包括乙型流感嗜血桿菌(例如PRP及其偶合物)、非典型流感嗜血桿菌(例如OMP26)在內的嗜血桿菌屬，高分子量粘附素，P5，P6，蛋白D和脂蛋白D，和絲束蛋白和絲束蛋白蛋白衍生肽(US 5,843,464)或其多拷貝變異體或其融合蛋白的抗原。
可用于本發明的抗原可以進一步含有得自于導致瘧疾的寄生蟲的抗原。例如，得自于惡性瘧原蟲的優選抗原包括RTS，S和TRAP。RTS是一種含有惡性瘧原蟲的環子孢子蛋白(CS)的幾乎全部C-端部分的雜合蛋白，其中所述C-端部分通過乙型肝炎表面抗原preS2部分的四個氨基酸與乙型肝炎病毒的表面(S)抗原進行連接。其完整結構被公開在國際專利申請PCT/EP92/02591中，該國際專利申請的公開號為WO 93/10152，同時要求了申請號為9124390.7的UK專利申請的優先權。當在酵母菌中進行表達時，RTS的產生形式為脂蛋白顆粒，當與HBV的S抗原進行共表達時，其產生一種被稱作RTS，S的混合顆粒。TRAP抗原被記載在國際專利申請PCT/GB89/00895中，該申請的公開號為WO 90/01496。本發明的優選實施方案是一種瘧疾疫苗，該疫苗中的抗原制劑含有RTS，S和TRAP抗原的混合物。可以作為多價瘧疾疫苗的候選成分的其它瘧原蟲抗原是惡性瘧原蟲MSP1，AMA1，MSP3，EBA，GLURP，RAP1，RAP2，鉗合蛋白，PfEMP1，Pf332，LSA1，LSA3，STARP，SALSA，PfEXP1，Pfs25，Pfs28，PFS27/25，Pfs16，Pfs48/45，Pfs230及其瘧原蟲屬中的類似物。
本發明涉及抗腫瘤抗原的用途以及用于免疫療法治療癌癥的用途。例如，腫瘤排斥抗原如用于前列腺、乳腺、結腸、肺、胰腺、腎或黑色素瘤癌癥的那些腫瘤排斥抗原。范例性的抗原包括MAGE 1，3和MAGE 4或被公開在WO99/40188中的其它MAGE抗原，PRAME，BAGE，Lage(也被稱作NYEos 1)SAGE和HAGE(WO 99/53061)或GAGE(Robbins和Kawakami，1996，免疫學中的最新觀點(Current Opinions in Immunology)8，628-636頁；Van denEynde等，國際臨床和實驗室研究雜志(International Journal of Clinical &Laboratory Research)(1997提交的)；Correale等.(1997)，國家癌癥研究學院雜志(Journal of the National Cancer Institute)89，p293)。實際上，這些抗原在許多類型的腫瘤如黑色素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌中進行了表達。
用于本發明的MAGE抗原可以以與一種表達增強子或一種免疫融合配對體形成融合蛋白的形式來進行表達。特別是，所述Mage蛋白可以被融合到乙型流感嗜血桿菌的蛋白D上。特別是，所述融合配對體可以含有蛋白D的前1/3部分。這種構成物被公開在Wo 99/40188中。其它可能含有癌癥特異性表位的融合蛋白實例包括bcr/abl融合蛋白。
在一個優選的實施方案中，利用了前列腺抗原如前列腺特異性抗原(PSA)，PAP，PSCA(PNAS 95(4)1735-1740 1998)，PSMA或被稱作前列腺酶(Prostase)的抗原。
前列腺酶(Prostase)是一種前列腺-特異性絲氨酸蛋白酶(胰蛋白酶類)，254個氨基酸的長度，具有一個保守的絲氨酸蛋白酶酶促三聯體H-D-S和一個氨基端的前肽序列，表明具有潛在的分泌功能(P.Nelson，Lu Gan，C.Ferguson，P.Moss，R.Gelinas，L Hood & K.Wand，″前列腺酶的分子克隆和定性，一種由雄性激素調節的在前列腺中進行限制性表達的絲氨酸蛋白酶(Molecular cloning and characterisation of prostase，an androgen-regulated serineprotease with prostate restricted expression)，被記載在美國國家科學院院報(InProc.Natl.Acad.Sci.USA)中，(1999)96，3114-3119)。已經記載了一個推定糖基化位點。預測結構與其它已知絲氨酸蛋白酶的結構非常相似，表明成熟多肽折疊成單結構域。所述成熟蛋白是224個氨基酸長度，具有一個已被進行了天然加工的A2表位。
前列腺酶核苷酸序列和推定多肽序列以及同系物已在Ferguson等人撰寫的文章(美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)1999，96，3114-3119)和國際專利申請WO 98/12302(以及相應的被授權專利US 5,955,306)，WO 98/20117(以及被授權專利US 5,840,871和US 5,786,148)(前列腺特異性血管舒緩素)和WO 00/04149(P703P)中被公開。
本發明提供了含有基于前列腺蛋白及其片段和同系物(“衍生物”)的前列腺酶蛋白融合體的抗原。這類衍生物適用于疫苗治療劑，該治療劑適于治療前列腺腫瘤。典型地，所述片段含有至少20個，優選地50個，更優選地100個在上文引用的專利和專利申請中公開的連續氨基酸。
進一步優選的前列腺抗原被認為是W0 98/37814中記載的P501S，SEQID NO 113。設計出了由其基因編碼的含有至少20個，優選地50個，更優選地100個在上文引用的專利申請中公開的連續氨基酸的免疫原片段和蛋白。一個特定片段是PS108(WO 98/50567)。
從WO 98/37418和WO/004149中了解到了其它的前列腺特異性抗原。另一種是STEAP PNAS 96 14523 145287-12 1999。
本發明的上下文中使用的其它的腫瘤相關抗原包括Plu-1(生物化學雜志(J Biol.Chem)274(22)15633-15645，1999)，HASH-1，HasH-2，Cripto(Salomon等，生物測定(Bioessays)199，2161-70，美國專利US 5654140)Criptin美國專利US 5981215。另外，與癌癥治療中使用的疫苗特別相關的抗原還含有酪氨酸酶和存活素(survivin)。
本發明還結合使用了乳腺癌抗原如Muc-1，Muc-2，EpCAM，her 2/Neu，乳珠蛋白(美國專利US5668267)或在WO/00 52165，W0 99/33869，W0 99/19479，WO 98/45328中公開的那些抗原。美國專利US5801005中公開了Her 2 neu抗原。優選地Her 2 neu含有全部的胞外區域(含有約1-645位的氨基酸)或其片段和至少胞內區域約580個C端氨基酸的免疫原部分或全部胞內區域。特別是，所述胞內部分應當含有磷酸化區域或其片段。這類構成物被公開在WO00/44899中。一個特別優選的構成物被認為是ECD PD，第二個被認為是ECD□DPD(參見WO/00/44899)。
本文中使用的her 2 neu可得自于大鼠、小鼠或人。
所述疫苗還可含有與腫瘤-支持機制(例如血管生成，腫瘤侵襲)相關的抗原如tie 2，VEGF。
本發明的疫苗還可被用于預防或治療除變態反應、癌癥或傳染性疾病以外的其它慢性疾病。這類慢性疾病例如是哮喘、動脈粥樣硬化和阿爾茨海默氏疾病和其它自身免疫疾病。還考慮了作為避孕藥使用的疫苗。
與易患和患有阿爾茨害默氏神經變性疾病的患者的預防和治療有關的抗原具體地是N-端39-43位氨基酸片段(AB淀粉樣前體蛋白)和更小的片段。該抗原被公開在國際專利申請WO 99/27944-(雅典娜神經科學(AthenaNeurosciences)中。
可以作為自身免疫疾病的疫苗或避孕疫苗的潛在的自身抗原包括細胞因子、激素、生長因子或胞外蛋白，更優選地4-螺旋細胞因子，最優選地IL13。細胞因子包括，例如IL1，IL2，IL3，IL4，IL5，IL6，IL7，IL8，IL9，IL10，IL11，IL12，IL13，IL14，IL15，IL16，IL17，IL18，IL20，IL21，TNF，TGF，GMCSF，MCSF和OSM。4-螺旋細胞因子包括IL2，IL3，IL4，IL5，IL13，GMCSF和MCSF。激素包括，例如黃體化基素(LH)，促卵泡成熟激素(FSH)，絨毛促性腺激素(CG)，VGF，Grelin，agouti，agouti相關蛋白和神經肽Y。生長因子包括，例如VEGF。
本發明的疫苗特別適用于免疫治療例如慢性病征和癌癥這類疾病，但也適用于治療持續感染。因此，本發明的疫苗特別適用于傳染性疾病，例如結核病(TB)、HIV感染如AIDS和乙型肝炎(HepB)病毒感染的免疫治療。
在一個特別優選的實施方案中，所述核酸編碼一種或多種下列抗原HBV-PreS1 PreS2和表面包膜蛋白、核心蛋白和pol；HIV-gp120 gp40，gp160，p24，gag，pol，env，vif，vpr，vpu，tat，rev，nef；乳頭狀瘤-E1，E2，E3，E4，E5，E6，E7，E8，L1，L2；HSV-gL，gH，gM，gB，gC，gK，gE，gD，ICP47，ICP36，ICP4；
流感-血細胞凝集素，核蛋白；TB-分支桿菌超氧化物歧化酶，85A，85B，MPT44，MPT59，MPT45，HSP10，HSP65，HSP70，HSP90，PPD 19kDa Ag，PPD 38kDa Ag。
所述核苷酸序列可以是RNA或包括基因組DNA在內的DNA，合成DNA或cDNA。優選地，所述核苷酸序列是DNA序列以及最優選地是cDNA序列。為了獲得哺乳動物細胞內的抗原肽的表達，需要將編碼抗原肽的核苷酸序列引入適當的載體系統中。本文使用的“適當的載體”是指能夠使抗原肽在哺乳動物體內進行大量的表達從而足以激發免疫應答的任何載體。
例如，所選擇的載體可以含有按正確順序排列的質粒、啟動子和聚腺苷酸化/轉錄終止序列從而使抗原肽獲得表達。含有這些組分以及任選地其它組分如增強子、限制酶切位點和選擇基因如抗生素抗性基因的載體構成對于本技術領域的技術人員來說是熟知的而且在Maniatis等人所著的＂分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningA Laboratory Manual)″，冷泉港實驗室(ColdSpring Harbour Laboratory)，冷泉港出版社(Cold Spring Harbour Press)，1-3卷，第2版，1989中得到了詳細的描述。
為了有利地防止質粒在哺乳動物宿主體內進行復制從而整合到所述動物的染色體DNA中，所述質粒優選地被制備成不含有在真核細胞中起作用的復制原點。
本發明的方法和組合物可以被用于例如包括家畜、實驗室動物、農場動物、捕獲的野生動物以及最優選地人在內的所有哺乳動物的疾病防治過程中。
本發明人已經證明了當1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4胺衍生物在DNA疫苗接種過程中被用作佐劑時，其能夠增強Th1和Th2細胞因子的作用。本文中所使用的術語佐劑或佐劑成分用于傳送能夠以所需方式增強和/或改變針對免疫原的體內應答的衍生物或含有該衍生物的組分。因此，佐劑例如可以被用來將免疫應答轉換成優勢Th1應答，或者同時增強兩種應答。
TH1型的免疫應答的優選誘導物能夠導致細胞介導的應答。高濃度的Th1-型細胞因子有利于誘導針對給定抗原的由細胞介導的免疫應答，而高濃度的Th2-型細胞因子有利于誘導針對給定抗原的體液免疫應答。
重要的是應當記住Th1和Th2-型免疫應答的差別不是絕對的。實際上，個體能夠支持被記載為優勢Th1或優勢Th2的免疫應答。然而，通常容易想到由Mosmann和Coffman在小鼠CD4+ve T細胞克隆中所描述的細胞因子家族(Mosmann，T.R.和Coffman，R.L.(1989)TH1和TH2細胞導致不同功能特性的淋巴因子的不同分泌模式(different patterns of lymphokine secretion lead todifferent functional properties).免疫學年報(Annual Review of Immunology)，7，p145-173)。通常，Th1-型應答與T-淋巴細胞產生INF-γ和IL-2細胞因子有關。通常與Th-1型免疫應答的誘導直接有關的其它細胞因子不是由T-細胞產生的，諸如IL-12。相反，Th2-型細胞應答與II-4，IL-5，IL-6，IL-10分泌有關。
含有載體的免疫原成分能夠以多種方式進行給藥，其中所述載體含有編碼一種抗原肽的核苷酸序列。所述載體能夠以被懸浮在適當介質例如緩沖鹽水溶液如PBS中的裸露形式(即不與脂質體制劑、病毒載體或促轉染蛋白結合的裸核苷酸序列)進行肌內、皮下或靜脈內注射來給藥，盡管某些早期數據已經表明肌內或皮下注射是優選的(Brohm等，疫苗(Vaccine)16 No.9/10 949-954頁(1998)，其公開的全部內容被本文引入作為參考)。所述載體還能夠利用例如脂質體進行包封或者被包封在聚交酯乙交酯(PLG)顆粒(25)中以后，通過除上述途徑以外的經口腔、鼻腔或肺部途徑來進行給藥。
根據本發明的優選實施方案，所述免疫原成分還可以通過皮內給藥，優選地通過利用基因槍給藥技術(特別是粒子轟擊)來進行給藥。這類技術涉及將免疫原成分包衣在金珠子上后在高壓下給藥到表皮內的過程，例如就象Haynes等人在生物技術雜志(J.Biotehnology)4437-42(1996)中所描述的那樣。
含有編碼抗原肽的核苷酸序列的載體是以能夠進行有效預防和治療的量進行給藥的。所給藥的每個劑量中核苷酸量對于由顆粒介導的給藥過程通常在1皮克至1毫克的范圍內，優選地是在1皮克至10微克的范圍內，以及對于其它途徑在10微克至1毫克的范圍內。精確的量可以根據待被免疫的哺乳動物的種類和體重、給藥途徑、1H-咪唑并-[4，5-c]喹啉衍生物的效力和劑量、待治療或預防的病癥的性質、受體免疫系統產生免疫應答的能力和所期望的預防和治療效果的程度來進行大幅度的調整。在這些變量參數的基礎上，醫師或獸醫能夠容易地確定出合適的劑量水平。
對含有編碼抗原肽的核苷酸序列的免疫原成分可以進行單次給藥或重復給藥，例如在約1天至約18個月期間內給藥1至7次，優選地給藥1至4次。然而，這種治療方案也可以根據所涉及到的動物的大小和種類、待治療/預防的疾病、核苷酸序列的量、給藥途徑、所選用的1H咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物的效力和劑量以及其它對于熟練獸醫或醫師來說是顯而易見的因素來進行大幅度的調整。
本文指定的佐劑成分可通過多種不同的給藥途徑，例如通過口腔、鼻腔、肺部、肌內、皮下、皮內或局部給藥途徑來進行類似給藥。優選地，所述成分通過皮內或局部給藥途徑來進行給藥。這種給藥方式可以在給藥核苷酸序列前約14天至給藥核苷酸序列后約14天內進行，優選地在給藥核苷酸序列前1天至給藥核苷酸序列后約3天內進行。最優選的是佐劑成分與核苷酸序列基本上同時進行給藥。“基本上同時”是指在給藥核苷酸序列的同時優選地給藥佐劑，或者，如果不完全同時，至少在給藥核苷酸序列的前后幾個小時內給藥佐劑。在最優選的治療方案中，所述佐劑成分基本上與核苷酸序列同時給藥。顯然，如果根據需要可以按照上述的變量類型對該方案進行調整。
而且，根據這些變量，所述衍生物的用藥劑量也可以進行調整，例如調整范圍是約0.1mg/kg至約100mg/kg，其中“每kg”指的是所涉及到的哺乳動物的體重。優選地重復進行1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4胺衍生物的用藥和核苷酸序列的相繼或加強用藥。最優選地，用藥劑量的范圍為約1mg/kg至約50mg/kg。
然而，所述佐劑成分可能只含有以原始化學狀態進行給藥的1H-咪唑并[4，5c]喹啉-4-胺衍生物，優選地是以藥學制劑的形式進行給藥。也就是說，所述佐劑成分優選地含有1H-咪唑并[4，5c]喹啉-4-胺和一種或多種藥用載體或獸醫學可接受載體，以及任選地含有其它治療成分。所述載體必須在與制劑中的其它成分能夠相容的意義上是“可接受的”，而且對其接受者無害。制劑的性質可以根據所要采用的給藥途徑來自然調整，并且所述制劑可以通過藥學領域中的已知方法來制備。
所有方法都包括將1H-咪唑并[4，5c]喹啉-4-胺衍生物與一種或多種適當載體進行混合的步驟。所述制劑一般通過以下步驟來制備將所述衍生物與液體載體和/或細分的固體載體進行均勻的和緊密的混合，如果需要，還可以將產品制成所需的劑型。本發明適于口服的劑型可以是離散單位的形式如各自含有預定量的活性成分的膠囊劑、扁囊劑或片劑；粉劑或粒劑；在水液體或非水液體中的溶液或混懸液；或水包油液體乳濁液或油包水乳濁液。所述活性成分可以制成丸劑、藥糖劑或糊劑。
片劑可以通過壓片或模壓來進行制備，任選地含有一種或多種輔助成分。可以通過在一種合適的機器中擠壓處于自由流動形式如粉狀或粒狀的活性成分來制備壓縮藥片，任選地混合了結合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、潤滑劑、表面活性劑或分散劑。模壓的片劑可以通過在一種合適的機器中模壓被惰性液體稀釋劑濕潤的粉狀化合物來進行制備。
片劑可以任選地進行包衣或刻痕并且可以被配制成使得所述活性成分得到緩釋或控釋的形式。
通過例如肌內、腹膜內或皮下給藥途徑進行注射的制劑包括含水或不含水的無菌注射液，該注射液可含有抗氧化劑、緩沖劑、制菌劑和使制劑與接受者的血液達到等滲的溶質；和含水或不含水的無菌懸液，該懸液可含有懸浮劑和增稠劑。所述制劑可以是單劑型或多劑型的容器形式，例如密封的安瓿和小瓶，而且可以在冷凍干燥(凍干)的狀態下進行保存，只需要在使用前加入無菌液體載體，例如注射用水，就能立刻進行使用。臨時注射液和混懸液可以由上述無菌粉劑、粒劑和片劑來制備。適于通過頰或鼻腔進行肺部給藥的制劑是以使含有活性成分的顆粒被輸送到接受者的支氣管樹中的形式來提供的，所述顆粒的理想直徑范圍為0.5至7微米。這類制劑可能是細粉碎的粉劑，該粉劑或者可以適當地以適用于吸入裝置的穿透膠囊的形式來提供，所述膠囊合適地是例如明膠，或者以自體推進制劑的形式來提供，所述自體推進制劑含有活性成分、合適的液體推進劑以及任選地含有其它成分如表面活性劑和/或固體稀釋劑。還可以在活性成分以滴狀溶液或混懸液的形式進行配藥的時候使用自體推進制劑。這種自體推進制劑與本領域的已知自體推進制劑相類似并且可以通過已經建立起來的方法來制備。采用具備理想噴霧特性的手操作閥門或自動功能閥來適當地提供所述自體推進制劑；有利地是，所述閥門是一種計量型的輸送固定體積的閥門，例如每對其操作一次，則輸送例如50至100uL的體積。
所述佐劑還可以是適于霧化器使用的溶液形式，以便通過采用加速氣流或超聲攪拌來產生適于吸入的細小霧滴。
適合于鼻內給藥的制劑通常包括與上述肺部給藥相類似的成分，然而優選的是這類制劑的粒徑范圍為約10至約200微米，從而能夠使制劑停留在鼻腔內。適當地通過利用大小合適的顆粒或選擇合適的閥來達到這一目的。其它合適的制劑包括粒徑范圍為約20至約500微米的粗粉，這類制劑適于通過鼻道從靠近鼻子的容器中快速吸入來進行給藥，并且鼻用滴劑含有約0.2至5％w/w的于含水溶液或含油溶液中的活性成分。在本發明的一個實施方案中，含有編碼抗原肽的載體可以在與1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物的制劑相同的制劑中進行給藥。
因此在該實施方案中，免疫原性和佐劑成分被包含在同一制劑中。
在一個優選的實施方案中，所述佐劑成分被制備成適于基因槍給藥的形式，并且通過基本上與核苷酸序列同時給藥的途徑進行給藥。為了制備適于以這種方式使用的制劑，需要將1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物凍干并且附著在例如適于基因槍給藥的金珠子上。
在另一個實施方案中，所述佐劑成分可以以干粉的形式通過高壓氣體推進來進行給藥。該給藥方式優選地是基本上與核苷酸序列的給藥同時進行。
即使不一起配制，佐劑成分與核苷酸序列同時或幾乎同時給藥也是合適的。
關于藥物制劑的其它詳細描述可以參見Remington′s PharmaceuticalSciences，Mack出版公司，Easton，Pennysylvania(1985)，其全部公開內容被本文引入作為參考。
本發明將通過下列非限制性的實施例進行進一步的說明。
實施例1.咪喹莫特增強細胞毒性T細胞對核酸疫苗的應答強度質粒的構建和DNA的制備所使用的質粒建立在獲自于Micelle Young，Glaxo Wellcome，UK的pVAC1的基礎上，哺乳動物表達載體pCI(Promega)的一種改構體，其中從EcoRl至Bst Zl的多克隆位點被EMCV IRES序列所取代，該序列的5′端側翼具有單一Nhe I，Rsr II和Xho I限制酶切位點以及3′側翼具有單一Pac I，Asc I和Not I限制酶切位點。
流感核蛋白表達質粒pVAC1.PR是通過將PCR擴增的cDNA連接到表達載體pVAC1上而構建的，所述cDNA編碼甲型流感病毒株PR/8/34的核蛋白，該病毒株得自于pAR501(由來自聯合王國，倫敦，NIMR的D.Kiossis博士贈送)。
質粒DNA在大腸桿菌中進行繁殖后利用質粒純化試劑盒(QIAGEN Ltd，Crawle，UK)進行制備，然后在-20℃條件下以約1mg質粒DNA/ml的濃度保存在10mM Tris/EDTA緩沖液中。用于DNA免疫的筒裝制劑用于Accell基因轉移裝置的柱體的制備方法在以前已經被描述過了(Eisenbraun等，DNA和細胞生物學(DNA and Cell Biology)，1993，第12卷，第9期，791-797頁；Pertner等)。主要步驟包括，將質粒DNA包衣在2μm的金顆粒上(DeGussa Corp.，South Plainfield，N.J.，USA)并裝入Tefzel管中，然后將該管切割成1.27cm的長度作為筒裝制劑并在4℃的條件下干燥保存直到使用。在一種典型的免疫接種過程中，每個筒裝制劑含有0.5mg的包衣了～0.05μg pVAC1.PR的金珠子并加入了總共能夠提供0.5μg DNA/筒裝制劑的空載體(pVAC1)。免疫為了檢驗咪喹莫特是否能夠增強通過核酸免疫接種而產生的細胞毒性T細胞的應答，通過粒子介導的基因轉移(0.05g/筒裝制劑)將pVAC1.PR給藥到小鼠的皮內。利用500Ib/in2的Accell基因轉移裝置(McCabe WO 95/19799)將兩個筒裝制劑中的質粒輸送到C57BI/6小鼠(購自于Charles River UnitedKingdom Ltd，Margate，UK)腹部皮膚的剃過毛的靶位點。免疫接種后，通過單次皮下注射(0.05ml/10g體重能夠提供30mg/kg的劑量)在免疫位點立刻給藥咪喹莫特(被配制成在媒介物中的混懸液，該媒介物是含有0.3％(w/v)甲基纖維素和0.1％(v/v)吐溫的無菌水)。質粒和咪喹莫特對照分別是空載體(pVAC1)和媒介物。細胞毒性T細胞應答通過對一周后收集到的脾細胞進行CD8+T細胞限制性IFN-γELISPOT試驗來評估細胞毒性T細胞應答。通過拉頸法處死小鼠并將脾收集到冰冷的PBS中。將脾細胞挑出后放置到磷酸鹽緩沖液(PBS)中，接著使血紅細胞發生溶胞(在由155mM NH4CI，10mM KHCO3，0.1mM EDTA組成的緩沖液中保持1分鐘)。用PBS沖洗兩次去除了微粒物質后，將單細胞懸液等分分配到預先包被了IFN-γ捕捉抗體的ELISPOT平皿中并利用CD8-限制性關連肽進行刺激。過夜培養后，首先利用生物素標記的抗鼠IFN-γ抗體，然后利用結合了鏈霉抗生物素的堿性磷酸酶對IFN-γ-產生細胞(Pharmingen)進行肉眼觀察，并通過圖像分析進行定量。
該實驗的結果(圖1)表明經pVAC1.PR和咪喹莫特的組合物處理的小鼠脾中的細胞毒性T細胞的數目比只經pVAC1.PR+媒介物處理的小鼠脾中的細胞毒性T細胞的數目多三倍。而對照質粒(pVAC1)+咪喹莫特或媒介物之間沒有差別，表明咪喹莫特的效果是受抗原限制的。這些結果清楚表明咪喹莫特是核酸免疫接種的有效佐劑。2.咪喹莫特增強CD4+T細胞針對核酸疫苗的應答強度質粒、DNA和筒裝制劑的制備通過將來源于pUGOVA的編碼雞卵白蛋白的PCR擴增cDNA(由F.Carbone博士饋贈)連接到表達載體pVAC1上來構建雞卵白蛋白表達質粒pVAC1.OVA并制備柱體(按照上述實施例1中描述的方法)。小鼠和免疫在Bury Green農場利用我們特定的不含病原體的動物育種裝置對D0.11.10雄性或雌性轉基因小鼠(6-10周齡)進行繁殖。這些小鼠表達的轉基因產物是對連接于MHC-II分子(I-Ad)的雞卵白蛋白肽殘基(323-339位殘基；OVA肽)具有特異性的T細胞受體(TCR)。能夠特異性識別TCR的單克隆抗體KJ1-26被用于鑒定TCR-轉基因T細胞。對這些小鼠中的一些小鼠進行的檢測試驗表明大部分(40-65％)的CD4+T細胞是KJ1-26+，盡管還存在極小部分的CD4-CD8+KJ1.26+T細胞(Pape等，免疫學綜述(ImmunologicalReviews)(1997)15667-78)。從Charles River United Kingdom Ltd.(Margate，UK)購買的Balb/c小鼠利用能夠提高待測免疫參數的靈敏度的過繼轉移模型來檢測CD4+T細胞應答。在本文中，在進行免疫前將特異識別源自卵白蛋白的肽序列的T細胞從轉基因動物中過繼轉移到幼稚野生小鼠體內。概括地說，在免疫前24小時，將DO.11.10脾細胞過繼轉移到6-8周齡的Balb/c小鼠體內。按照上述實施例1中的方法制備脾細胞。然后通過注射100μl的量(即25×106個脾細胞/小鼠)將細胞過繼轉移到尾側靜脈中。
然后按照實施例1中的描述，利用編碼卵白蛋白的質粒(pVAC1.OVA；0.5μg/筒裝制劑)和咪喹莫特(30mg/kg)，或者利用對照質粒或媒介物通過由顆粒介導的基因轉移對小鼠進行免疫。CD4 T細胞應答通過拉頸法處死小鼠，收集腹骨溝和主動脈周的淋巴結來制備脾細胞(按照實施例1的方法)，只是省去血紅細胞的溶胞步驟。
為了測定免疫后的CD4+T細胞的克隆擴充，采用關連卵白蛋白肽再次進行免疫攻擊，然后對免疫后的第3天所收集到的淋巴結制品中的卵白蛋白-特異性T細胞的增殖情況進行評估。通過測定增殖細胞吸收含氚胸腺嘧啶核苷的量來評估增殖水平，結果表明利用pVAC1.OVA+咪喹莫特的組合物所導致的增殖水平比利用pVAC1.OVA+媒介物的組合物所導致的增殖水平高兩倍(圖2)。而對照質粒(pVAC1)+咪喹莫特或媒介物之間沒有差別，表明咪喹莫特的效果是受抗原限制的。
通過對免疫后第6天收集到的淋巴結細胞進行IL-2 ELISPOT(上述實施例1)來測定CD4 T細胞的活化水平(圖3)，結果發現采用pVAC1.OVA+咪喹莫特的組合物時的CD4 T細胞活化水平比只采用pVAC1.OvAA的CD4 T細胞活化水平有了顯著的提高(提高了70％)。
這些結果表明咪喹莫特在體內的佐劑效應擴展到兩種T細胞種群(即CD8+細胞毒性T細胞和CD4+輔助T細胞)。這些結果還證實了咪喹莫特作為核酸疫苗接種的佐劑的效力。3.咪喹莫特誘導針對核酸疫苗誘導Th1和Th2應答利用過繼轉移模型評估Th CD4+亞群(上述實施例2)。IFN-γ-產生細胞(Th1)和IL-4-產生細胞(Th2)通過ELISPOT來進行測定(上述實施例1)。咪喹莫特能夠誘導兩種細胞因子-產生細胞的增殖，盡管IFN-γ-產生細胞比IL-4-產生細胞的增殖得快(圖4)。在空載體免疫的對照組中，沒有檢測到細胞因子-產生細胞。IFN-γ-產生細胞的傾向表明咪喹莫特不僅起著核酸疫苗接種的佐劑作用而且還優選誘導Th1型的應答，后者已由上述實施例1所證實。4.咪喹莫特對體液免疫應答的作用為了證實咪喹莫特是否能夠增強由核酸免疫接種導致的體液應答，通過PMGT將一種編碼抗原(例如源自流感病毒的核蛋白)的質粒給藥到小鼠的皮膚內。初次免疫后進行一次或多次加強免疫，每次免疫接種之間間隔至少4個星期。每次免疫接種前和/或剛免疫接種后，通過在免疫接種位點進行單次注射來給藥咪喹莫特。質粒和咪喹莫特對照分別是空載體(即不含抗原)和媒介物。免疫接種前的第1至3天以及免疫接種后間歇式地從尾靜脈采集血樣。分離出血清并保存在-20℃下以備以后進行抗體分析。
通過測定初次免疫和加強免疫后采集的血清中的具有抗原特異性的完整IgG抗體的濃度(例如源自流感病毒的核蛋白)來評估體液應答。將微量滴定板(NuncImmunoplate F96 maxisorp，Lifet Technologies)包被上10μg/ml的抗原并在4℃下溫育過夜，然后用洗滌緩沖液(含有5％土溫20和0.1％疊氮化鈉的PBS)沖洗4次。然后在20℃下與用封閉緩沖液連續稀釋的血清樣品一起進行1小時的溫育。進一步沖洗4次(如上所述)從而除去未被結合的抗體后，將微量滴定板與用封閉緩沖液稀釋的連接了過氧化物酶的抗鼠IgG抗體(Southem Biotechnology)一起溫育1小時。在進一步沖洗4次后測定結合抗體的量(按照上述)，然后加入TMB底物溶液(T-8540-Sigma)。在20℃和避光的條件下保持30分鐘后，加入1M的硫酸以使反應終止，然后在450nm下測定吸光度。滴度被定義為OD達到0.2時的最高稀釋度。經咪喹莫特處理的免疫小鼠的體內的抗體濃度比沒經咪喹莫特處理的高，這一結果表明咪喹莫特對體液應答具有增強作用。5.咪喹莫特增強針對HIV抗原的免疫應答質粒、DNA和筒裝制劑表達Gag和Nef抗原的質粒(即WRG7077Gag/Nef)是在WRG7077基礎上構建的。原始質粒WRG7077通過以下步驟來構建用含有卡那霉素抗性基因的pUC4K(Amersham-Pharmacia)的EcoRl片段取代含有pUC19(獲自于Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd.，Amersham Place，Little Chalfont，Bucks，HP7 9NA)的Eam11051-Pstl片段的β-內酰胺酶基因，接著利用T4 DNA聚合酶將兩個片段平端化。人巨細胞病毒IE1啟動子/增強子、內含子A得自于馬薩諸塞大學的Harriet Robinson博士贈送的質粒JW4303，并被插入到pUC19的Sal1位點而成為Xhol-Sal1片段，該片段中引入了牛生長激素聚腺苷酸化信號序列。Gag-Nef融合體通過以下步驟來產生通過PCR將平端化的Nef與除去了頭65個氨基酸的基因的5′端的195個堿基對和p17p24(Gag)進行連接，所述基因來源于HIV-1病毒株248A(Genbank登記號為L15518，由G.Thompson贈送)，以及p17p24(Gag)來源于含有HIV-1分化B病毒株HXB2(Genbank登記號為K03455)的質粒pHXBAPr(Maschera等，1995)。接著將得到的Gag-Nef融合體連接到WRG7077中從而形成Notl-BamH1片段。質粒DNA和筒裝制劑如實施例1中所述。小鼠和免疫按照實施例1中所述的方法，對Balb/c小鼠進行免疫接種，進行咪喹莫特的制備和給藥。在本實驗中，在小鼠獲得初次免疫后的第42天，對其進行加強免疫。在加強免疫的過程中，只給藥咪喹莫特(100mg/kg)。細胞毒性T細胞應答按照實施例1所述的方法進行IFN-γELISPOT測定，在加強免疫后的第5天利用Gag和Nef抗原的CD8限制性關連肽刺激所收集的脾細胞。
共同給藥咪喹莫特后發現細胞毒性T細胞的數目比只給藥了質粒和介質的試驗組的細胞毒性T細胞的數目有了明顯的增加(對于Gag和Nef分別為10倍和100倍)(圖5)。這些發現表明咪喹莫特的佐劑效應不具有抗原特異性而且反映出對病毒抗原的功效，尤其是對HIV的功效。6.咪喹莫特類似物是核酸疫苗接種的有效佐劑利用pVAC1.OVA質粒制備筒裝制劑，免疫接種和T細胞應答如實施例2所述。進行試驗的咪喹莫特的類似物是1-(2-羥基-2-甲基丙基)-2-乙氧基甲基-1-H-咪唑并[4，5-c]喹啉-胺(即resiquimod)，1-(2-羥基-2-甲基丙基)-2-甲基-1H-咪唑并[4，5c]喹啉-4-胺和1-(2-羥基-2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉4-胺。
在一個寬劑量范圍內對Resiquimod進行測試，結果顯然是1mg/kg最合適。在本試驗中，對免疫5天后收集到的淋巴結細胞進行的分析結果表明產生IFN-γ的CD4 T細胞的數目增加了6倍，對產生IL-4的CD4 T細胞只具有適中的作用(圖6)，進一步佐證了實施例3中的Th1邊緣效應。
通過以30mg/kg的劑量單次給藥其它兩種類似物來研究這兩種類似物對免疫5天后對T細胞的作用。通過給藥1-(2-羥基-2-甲基丙基)-2-甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺使得產生IFN-γ和IL-4的CD4 T細胞的數目增加了兩倍。發現1-(2-羥基-2-甲基丙基)-1-H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺也具有相似的作用(圖7)。
總之，該實施例中的這些結果表明不只是咪喹莫特具有佐劑作用，該化學分類中的許多化合物都具有佐劑的作用。7.局部涂敷是在核酸免疫接種過程中給藥咪喹莫特的有效途徑利用所制備的WRG7077Gag/Nef質粒進行筒裝制劑的制備，PMID免疫和T細胞應答如實施例5所述。在本實驗中，以30mg/kg的劑量皮下注射咪喹莫特。對于另外一個試驗組，免疫接種后立刻在PMID部位局部涂敷20μl的5％(w/v)乳膏(即Aldara)來給藥咪喹莫特。加強免疫后的第6天和第11天收集脾以便用于分析。
無論采用皮下注射還是局部涂敷來給藥咪喹莫特，都發現細胞毒性T細胞數目比只是皮下注射了質粒和媒介物的實驗組的細胞毒性T細胞數目有了明顯的增加(即加強免疫后的第11天約為2倍)(圖8)。這些結果表明局部涂敷的咪喹莫特是PMID的有效佐劑而且還表明在對與PIMD結合的佐劑進行研究的過程中，皮下注射是局部涂敷的一種相關取代途徑。8.咪喹莫特是防止腫瘤生長的一種有效佐劑利用pVAC1.OVA質粒制備筒裝制劑(如實施例2所述)。通過實施例5中所述的PMID對試驗組中的12只小鼠進行免疫接種，不同的是筒裝制劑含有0.1μg的DNA以及以30mg/kg的劑量皮下注射咪喹莫特。腫瘤攻擊加強免疫后的第二個星期，通過在每只小鼠的側腹進行皮下注射來植入EG7-OVA細胞(100,000個細胞/小鼠)，然后監控腫瘤的生長。E.G7-OVA細胞最初是由F.Carbone(Moore，M.W，Carbone，F.R.和Bevan，M.J.，細胞(Cell)，54，777-785，1988)通過轉染小鼠腹水淋巴瘤原淋巴細胞系EL4而制備的，目的是用來穩定表達雞卵白蛋白。
與只給藥了pVAC1.OVA相比，通過利用pVAC1.OVA+咪喹莫特對小鼠進行免疫，在小鼠體內出現可觸知腫瘤的期限被明顯延遲了(圖9)。而對于對照組中的小鼠(即，只用空載體±咪喹莫特免疫的小鼠)來說，體內可觸知腫瘤出現得較早而且生長得最快。通過pVAC1.OVA+咪喹莫特免疫的小鼠的腫瘤發生能力為25％。而所有其它試驗組的腫瘤發生能力大于40％(圖10)。這些結果表明，咪喹莫特可提高PMID的抗腫瘤作用，并且還表明咪喹莫特將會成為一種核酸治療疾病的有效佐劑。
權利要求
1.一種疫苗組合物，其含有(i)一種含有1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物的佐劑成分和(ii)一種含有編碼抗原肽或與疾病相關蛋白的核苷酸序列的免疫原成分。
2.一種試劑盒，其含有(i)一種含有1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物的佐劑成分和(ii)一種含有編碼抗原肽或與疾病相關蛋白的核苷酸序列的免疫原成分。
3.一種如權利要求2所述的組合物，其中所述成分基本上同時進行給藥。
4.一種如權利要求1所述的組合物，其中所述成分處于單獨藥用制劑中。
5.一種如上述任意一項權利要求所述的組合物，其中1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物是由結構式I-VI中的一個結構式所定義的化合物 其中R11選自直鏈或支鏈烷基、羥烷基、酰氧烷基、芐基、(苯基)乙基和苯基，所述芐基、(苯基)乙基或苯基取代基任選地被獨立地選自一個至約四個碳原子的烷基、一個至約四個碳原子的烷氧基和鹵素的一個或兩個基團在苯環上進行了取代，條件是如果所述苯環被所述基團中的兩個所取代，那么所述基團總共含有不超過6個碳原子；R21選自氫、一個至約八個碳原子的烷基、芐基、(苯基)乙基和苯基，所述芐基、(苯基)乙基或苯基取代基任選地被獨立地選自一個至約四個碳原子的烷基、一個至約四個碳原子的烷氧基和鹵素的一個或兩個基團在苯環上進行了取代，條件是如果所述苯環被所述基團中的兩個所取代，那么所述基團總共含有不超過6個碳原子；和每個R1獨立的選自氫、一個至約四個碳原子的烷氧基、鹵素和一個至約四個碳原子的烷基，以及n是0至2的整數，條件是如果n是2，那么所述R11基團總共含有不超過6個碳原子； 其中R12選自含有2至約10個碳原子的直鏈或支鏈烯基和含有2至約10個碳原子的被取代的直鏈或支鏈烯基，其中所述取代基選自含有1至約4個碳原子的直鏈或支鏈烷基和含有3至約6個碳原子的環烷基；和被含有1至約4個碳原子的直鏈或支鏈烷基取代的含有3至約6個碳原子的環烷基；以及R22選自氫、含有一個至約八個碳原子的直鏈或支鏈烷基、芐基、(苯基)乙基和苯基，所述芐基、(苯基)乙基或苯基取代基任選地被獨立地選自含有一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷基、含有一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基和鹵素的一個或兩個基團在苯環上進行了取代，條件是如果所述苯環被兩個這樣的基團所取代，那么所述基團總共含有不超過6個碳原子；和R2獨立的選自含有一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基、鹵素和含有一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷基，以及n是0至2的整數，條件是如果n是2，那么所述R2基團總共含有不超過6個碳原子； 其中R23選自氫、一個至約八個碳原子的直鏈或支鏈烷基、芐基、(苯基)乙基和苯基，所述芐基，(苯基)乙基或苯基取代基任選地被一個或兩個獨立地選自一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷基、一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基和鹵素的基團在苯環上進行了取代，條件是如果所述苯環被兩個這樣的基團所取代，那么所述基團總共含有不超過6個碳原子；和R5獨立地選自一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基、鹵素和一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷基，以及n是0至2的整數，條件是如果n是2，那么所述R3基團總共含有不超過6個碳原子；(貼第42頁的化學結構式IV) 其中R14是-CHRARB，其中RB是氫或碳-碳鍵，條件是當RB是氫時，RA是一個至約四個碳原子的烷氧基、一個至約四個碳原子的羥烷氧基、兩個至約十個碳原子的1-炔基、四氫吡喃基、其中烷氧基部分含有一個至約四個碳原子以及烷基部分含有一個至約四個碳原子的烷氧基烷基、2-、3-或4-吡啶基，以及另外一個條件是當RB是碳-碳鍵時，RB和RA共同形成四氫呋喃基團，該基團任選地被一個或多個獨立地選自羥基和一個至約四個碳原子的羥烷基的取代基所取代；R24選自氫、一個至約四個碳原子的烷基、苯基和其中取代基選自一個至約四個碳原子的烷基、一個至約四個碳原子的烷氧基和鹵素的被取代的苯基；R4選自氫、含有一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基、鹵素和含有一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷基； 其中R15選自氫、含有一個至約十個碳原子的直鏈或支鏈烷基和被取代的含有一個至約十個碳原子的直鏈或支鏈烷基，其中取代基選自含有三個至約六個碳原子的環烷基和被含有一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷基取代的含有三個至約六個碳原子的環烷基；含有兩個至約十個碳原子的直鏈或支鏈烯基和被取代的含有兩個至約十個碳原子的直鏈或支鏈烯基，其中取代基選自含有三個至約六個碳原子的環烷基和被含有一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷基取代的含有三個至約六個碳原子的環烷基；一個至約六個碳原子的羥烷基；其中烷氧基部分含有一個至約四個碳原子以及烷基部分含有一個至約六個碳原子的烷氧基烷基；其中酰氧基部分是兩個至約四個碳原子的鏈烷酰氧基或苯甲酰氧基以及烷基部分含有一個至約六個碳原子的酰氧烷基；芐基；(苯基)乙基；和苯基；所述芐基，(苯基)乙基或苯基取代基任選地被一個或兩個獨立地選自一個至約四個碳原子的烷基、一個至約四個碳原子的烷氧基和鹵素的基團在苯環上進行了取代，條件是當所述苯環被兩個所述基團取代時，所述基團總共含有不超過六個碳原子；R25是 其中Rx和Ry獨立地選自氫、一個至約四個碳原子的烷基、苯基和其中取代基選自一個至約四個碳原子的烷基、一個至約四個碳原子的烷氧基和鹵素的被取代的苯基；X選自含有一個至約四個碳原子的烷氧基、其中烷氧基部分含有一個至約四個碳原子以及烷基部分含有一個至約四個碳原子的烷氧基烷基、一個至約四個碳原子的鹵烷基、其中烷基含有一個至約四個碳原子的烷酰氨基、氨基、其中取代基為一個至約四個碳原子的烷基或羥烷基的被取代的氨基、疊氮基、一個至約四個碳原子的烷硫基；以及R5選自氫、一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基、鹵素、一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷基； 其中Rt選自氫、含有一個至約四個碳原子的直鏈或支聯烷氧基、鹵素和含有一個至約四個碳原子的直鏈或支鏈烷基；Ru是2-甲基丙基或2-羥基-2-甲基丙基；和Rv是氫、一個至約六個碳原子的烷基，或其中烷氧基部分含有一個至約四個碳原子以及烷基部分含有一個至約四個碳原子的烷氧基烷基；或上述任意一種化合物的藥用鹽。
6.一種如權利要求4所述的組合物，其中1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物是結構式VI的化合物。
7.如權利要求5所述的組合物，其中Rt是氫。
8.如權利要求6所述的組合物，其中Ru是2-甲基丙基或2-羥基-2-甲基丙基，以及Rv是氫、甲基或乙氧基甲基。
9.如權利要求7所述的組合物，其中所述化合物選自1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；1-(2-羥基-2-甲基丙基)-2-甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；1-(2-羥基-2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；1-(2-羥基-2-甲基丙基)-2-乙氧基甲基-1-H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺。
10.一種如上述任意一項權利要求所述的疫苗組合物，其中每一成分是一種適于通過口、鼻、局部、肺部、肌內、皮下或皮內的任意途徑進行給藥的形式。
11.如權利要求10所述的疫苗組合物，其中免疫原成分是一種適于利用由顆粒介導的基因轉移技術進行給藥的形式。
12.如權利要求11所述的疫苗組合物，其中佐劑成分是一種適于利用由顆粒介導的基因轉移技術進行給藥的形式。
13.一種增強針對抗原的免疫應答的方法，包括順序或同時給藥一種編碼抗原的核酸和一種咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物。
14.一種增強哺乳動物針對免疫原的免疫應答的方法，包括給所述哺乳動物給藥一種如權利要求1至12種任意一項權利要求所述的疫苗組合物的步驟。
15.如權利要求13或14所述的方法，其中在給藥免疫原成分的前約7天和后約7天之內給藥1至7次的佐劑成分。
16.如權利要求15所述的方法，其中所述佐劑成分的給藥與免疫原成分的給藥基本上同時進行。
17.如權利要求13或14所述的方法，其中1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物以約1mg/kg至50mg/kg的劑量給藥。
18.1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物在制備用于增強由抗原肽誘導的免疫應答的藥物中的用途，所述肽是由于給哺乳動物給藥了編碼所述肽的核苷酸序列而表達。
19.如權利要求18所述的用途，其中1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物如權利要求5中所定義。
20.如權利要求19所述的用途，其中1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物如權利要求6中所定義。
21.如權利要求1 8至20中的任意一項權利要求所述的用途，其中1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物以1mg/kg至50mg/kg的劑量給藥。
22.一種由在DNA疫苗接種過程中單獨、連續或同時進行給藥的成分組成的組合物，含有一種編碼免疫原的核苷酸序列和一種1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物，所述免疫原是一種抗原肽，所述衍生物能夠增強由抗原肽誘導的免疫應答。
23.如權利要求21所述的組合物，其中1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物如權利要求5中所定義。
24.如權利要求23所述的組合物，其中1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物如權利要求6中所定義。
全文摘要
本發明涉及1H－咪唑并[4，5－c]喹啉－4－胺衍生物作為核酸疫苗接種過程中使用的佐劑的用途。
文檔編號C07D215/42GK1473051SQ0181861
公開日2004年2月4日 申請日期2001年9月20日 優先權日2000年9月20日
發明者林迪·L·湯姆森, 約翰·P·泰特, 彼得·托普利, P 泰特, 托普利, 林迪 L 湯姆森 申請人:葛蘭素集團有限公司