專利名稱：診斷傳染性海綿狀腦病的方法
技術領域：
本發明涉及診斷傳染性海綿狀腦病(TSE)或朊病毒疾病的新方法。
對TSE的生物學全面綜述可參見發表的綜述形式(Prusiner，S.B.，Proc.Nat’l Acad.Sci USA 95 13363-13383(1998))和/或因特網(http//www.mad-cow.org)。傳染性海綿狀腦病(TSEs)或朊病毒疾病是一組中樞神經系統(CNS)的不變的致命性病癥，它們是通過遺傳、傳染或散發性機制顯現。它們包括綿羊的瘙癢病、牲畜的牛海綿狀腦病(BSE)和庫魯癥、克-雅病(CJD)、新變體(nv)CJD、Gerstmann-Straussler Sheinker綜合癥(GSS)和人的致命性家族失眠癥。TSE疾病也顯現于其他物種中，如駝鹿、鹿、水貂、貓(FSE)和引進的動物園物種如林羚(Nyala)、阿拉伯羊(Arabian Oryx)、印度豹(Cheetah)和大捻角羚(Kudu)。在鹿和駝鹿中也鑒定出了慢性萎縮疾病(CWD)，已提示該疾病也可以傳染給人。
TSE疾病特征在于長的無癥狀潛伏期及隨后相對快的臨床病程，該病程常包括神經變性、液泡化、神經膠質細胞增生和有蛋白酶抗性的朊病毒蛋白質Sc(PrPSc)的積累，其中的朊病毒蛋白質Sc是宿主編碼的糖蛋白PrPC的異常同工型。將正常的對蛋白酶K敏感的PrPC轉變為異常的有蛋白酶K抗性的同工型PrPSc是TSE疾病的經常性的特征標志。
當前，作為BSE流行病及隨后新變體CJD在人中的出現的結果，在英國對TSE疾病有相當大的興趣；認為TSE疾病起因于BSE并作為感染BSE的組織進入人食物鏈的結果而穿過物種屏障而進入人類。大多數英國公民可能已經暴露于BSE感染的介質中了。除了天然的綿羊瘙癢病的問題之外，現認為由于感染BSE的物質已出現于動物飼料中，所以BSE也很可能以亞臨床無癥狀水平存在于綿羊和其他農業物種中。
英國人口中存在的nvCJD的程度和繼續發展為疾病的比例當前仍未知。目前沒有有效的死前診斷方法估計人或動物中TSE潛在的感染。為了從人食物鏈中去除感染TSE的農業物種并估計人類中TSE潛在的感染，需要有適當的診斷方法，且理想為針對容易得到的組織如血液。目前，鑒定的唯一的疾病特異性大分子是PrPSc。然而，實際上僅在死后能在CNS中檢測到PrPSc，盡管在一些TSE疾病中它可在扁桃體活組織檢查中被檢測到(Coghlan，A.，New Scientist，第5頁，(6月15日，1996))。最近已證明PrPSc可在感染TSE的動物血液中檢測到(Schmerr等人Journal of Chromatography 853(1-2)207-214(1999))。然而，這是耗時且在技術上顯著苛求的程序，是對PrPSc的一般檢測。另外，PrPSc通常在明顯地受TSE疾病侵襲的人和動物CNS組織中是不可檢測的。因此，沒有有效的估計TSE感染的死前診斷方法。理想的診斷方法因而應該不基于PrPSc，且可允許在容易得到的組織如血液中對潛在的TSE感染進行估計。這樣的診斷檢驗將理想地允許在早期對活個體的TSE感染進行估計，而可執行治療干涉策略。
幾個在感染TSE的動物的CNS組織中差異表達的基因已有報道。然而，到目前為止，尚未有其他報道關于感染TSE的動物的脾、骨髓或血液中差異表達的基因。盡管來自TSE感染的動物的血液已顯示具有感染性，且已證明PrPSc蛋白質在若干造血細胞中表達，但是在本發明之前尚未認識類紅細胞造血細胞和TSE發病機理之間的聯系。有關當前TSE診斷成果的全面概要可參見因特網(httpwww.mad-cow.org/OO/sci_archive_frame.html)。
當前的TSE研究迄今為止未能在TSE發病機理中包含EDRF或類紅細胞造血細胞生物學，或者在脾、血液或骨髓中鑒定TSE感染的非PrPSc分子標記。該領域的多數研究人員看來集中于旨在檢測PrPSc的方法上。
現在已經發現EDRF，一個正常表達于造血組織類紅細胞中的基因，在感染TSE的動物的造血組織中差異表達。EDRF表達于脾、骨髓和血液中的類紅細胞和巨核細胞/血小板譜系的造血細胞中。因此，看來血細胞生成，特別是紅細胞生成，在受TSE感染的個體中受到令人驚訝的影響。
根據本發明的第一個方面，提供在動物中診斷傳染性海綿狀腦病(TSE)是否存在的方法，該方法包含測定從動物中獲得的樣品以確定樣品中的類紅細胞、巨核細胞或血小板譜系的造血細胞的相對數目。
傳染性海綿狀腦病(TSEs)或朊病毒疾病包括綿羊的瘙癢病、牲畜的牛海綿狀腦病(BSE)和庫魯癥、克-雅病(CJD)、新變體(nv)CJD、Gerstmann-Straussler Sheinker綜合癥(GSS)和人致命性家族失眠癥。TSE疾病特征在于朊病毒蛋白質Sc(PrPSc)，即宿主編碼的糖蛋白PrPC的異常同工型的積累。已認識到正常的對蛋白酶K敏感的PrPC轉變為異常的具有蛋白酶K抗性的同工型PrPSc是TSE疾病的特征。
為本發明的目的，術語TSE感染與術語TSE疾病狀況意義等同。TSE疾病傳染的確切手段仍然是科學爭論的主題。實驗動物可在實驗室中用TSE疾病“感染”。雖然臨床表現足夠明顯，但在實踐中遇到的疾病是否是正常字面意義上的“感染”仍然未知。
受TSE疾病感染的動物包括哺乳動物如綿羊、牛、人、貓、駝鹿、鹿、水貂，和引進的動物園物種如林羚(Nyala)、阿拉伯羊(Arabian Oryx)、印度豹(Cheetah)和大角羚捻(Kudu)，以及鳥類物種如家禽，例如雞、火雞、珍珠雞。因此與本申請一致的方法可擴展為在綿羊、牛、鹿、駝鹿或人中的TSE診斷方法。
根據本發明要測定的樣品一般為生物學樣品，例如來源于造血細胞或基于血液的樣品。該樣品可為全部或分級分離的血液(或部分分級分離的血液)、血漿、造血組織如骨髓或來自脾。該樣品可加入進一步的成分而使樣品分析最優化。例如，在血液樣品中可方便地加入如肝素、EDTA和/或檸檬酸鈉等物質以防止形成血塊方式的凝固。其他的樣品來源包括腦脊液(CSF)、尿、淚、乳、精液、粘液分泌物、組織或器官活組織檢查，如腦、肝、胸腺、胰腺。
類紅細胞譜系的造血細胞包括多能干細胞、髓樣干細胞、CFU-GEMM細胞(粒細胞/紅細胞/單核細胞/巨核細胞集落生成單位)、BFU-E細胞(類紅細胞-血漿生成單位)、CFU-E細胞(類紅細胞原紅細胞-集落生成單位)、網織紅細胞和紅細胞。類紅細胞譜系的造血細胞示意性地表示在
圖11中。
單能造血細胞是指定型為單一細胞譜系的細胞；雙能造血細胞是指定型為兩個可能的細胞譜系之一的細胞，例如E/Meg或紅細胞/巨核細胞，其能夠沿紅細胞或巨核細胞譜系分化；三能造血細胞是指定型為三個可能的細胞譜系之一的細胞。
如Junquiera或Wheater的定義所述，紅細胞從原紅細胞的成熟包括經由下列已識別細胞類型的過程，如下所示
巨核細胞(mekaryocyte)和血小板譜系造血細胞包括E/Meg前體細胞、原巨核細胞和分化的巨核細胞或血小板細胞。
因此與本發明一致的方法可為對一或多種上述的造血類紅細胞、巨核細胞或血小板譜系的細胞類型的測定，或對與一或多種造血類紅細胞、巨核細胞或血小板譜系細胞類型相關聯的表達產物的測定。
與造血類紅細胞譜系細胞相關聯的表達產物是類紅細胞分化相關因子(EDRF)。EDRF表達于雙能細胞，該雙能細胞能夠繼續分化為類紅細胞或巨核細胞或E/Meg細胞、血漿生成單位(BFU-E)細胞、集落生成單位(CFU-E)細胞、原紅細胞(前成紅細胞)、早幼紅細胞(嗜堿性成紅細胞或早幼紅細胞)、中成紅血細胞(中幼紅細胞或多染性成紅細胞)、晚幼紅細胞(正成紅細胞或正染性成紅細胞)，包括血紅蛋白陽性的晚幼紅細胞和網織紅細胞，即正在生成紅細胞的細胞，包括紅細胞。
正常表達EDRF的具體目的細胞可用抗-TER-119抗體來鑒定，即TER-119+細胞。TER-119抗體是針對免疫原C57BL/6小鼠14日胎肝細胞而產生(Ikuta等人Cell 62 863-874(1990))，且為大鼠(Wistar)IgG2bκ的同工型(TER-119抗體由BD Pharmingen，SanDiego獲得)。TER-119抗體與生產類紅細胞的器官中的類紅細胞譜系和多數表達EDRF的細胞反應，盡管不與所有這樣類型的細胞反應。TER-119抗原特異表達于從早原紅細胞到成熟紅細胞階段的類紅細胞，但不表達于具有CFU-E或BFU-E活性的細胞。可以用本發明的方法進行這樣測定的細胞包括原紅細胞、嗜堿性成紅細胞、多染性成紅細胞、正染性成紅細胞、網織紅細胞(前紅細胞)和紅細胞。用于檢定這樣的細胞的其他抗體為抗-血型糖蛋白A、抗-EDRF、抗-CD-61、抗-CD-71、抗-運鐵蛋白、抗-鐵蛋白、抗-EDRF和抗-血紅蛋白抗體。抗-CD-61抗體可用于在從前體到成熟的細胞中檢測巨核細胞/血小板譜系的細胞(商品由Miltenyibiotec提供-www.miltenyibiotec.com)。
在本發明這方面的一個優選實施方案中，診斷方法包含測定表達EDRF的類紅細胞、巨核細胞或血小板譜系造血細胞的數目。這樣的細胞可包括但不局限于E/Meg、CFU-GEMM細胞、BFU-E細胞、CFU-E細胞、原紅細胞、嗜堿性成紅細胞、多染性成紅細胞、正染性成紅細胞、網織紅細胞(前紅細胞)。正常表達EDRF的細胞譜系的耗盡可在被試對象中指示TSE感染(或TSE疾病狀況)。細胞譜系的耗盡是相比于非感染個體中存在的所測類型的細胞數目，換句話說，為顯著地偏離特定細胞的正常數目。正常的范圍可通過測定健康的非感染個體的統計相關群體而確定。
另一個表達標記可為血紅蛋白，它在遭受TSE感染或TSE疾病狀況的被試者中也表現為被耗盡。
樣品中細胞數目的測量可利用任何方便的方法來實現。例如，細胞數目可用熒光激活的細胞分類法(FCAS)來測定；以特定細胞染料如Geimsa-wright組織學染料的方式來手工計數。或者，可以用自動血液學分析儀對造血細胞如紅細胞或網織紅細胞計數(Miltenyibiotec-www.miltenyibiotec.com)。也可能用血流比容計來估計樣品中細胞的數目，例如常規用于測量紅細胞數目、收集細胞體積等的血流比容計。估計祖先細胞數目的另一個方法是在半固體培養基如甲基纖維素上培養血液/骨髓并對群體計數。
用抗體鑒定目的造血細胞可使用修飾型抗體，如綴合生物素或用熒光標記物標記的抗體。對目的抗體陽性的細胞可以方便地用熒光激活細胞分類法(FCAS)、流式細胞儀或磁珠分離方法進行分離。例如類紅細胞譜系的細胞可以用如TER-119抗體的抗體進行鑒定，該抗體可與適當的報告分子部分偶聯。
可用樣品收集和分析的標準技術，如血液學和/或細胞學技術，來建立對照或正常群體值。可使用標準的統計技術定義有意義的群體平均值，這可能需要考慮如年齡、性別和/或基因型的因素，且可基于非感染個體或非感染個體的群體。
新近對在靜脈、指血和動脈血液的血液計數比較(Yang，等人，Clin.Lab.Haem.23 155-159(2001))確立了在給定人群中正常的血細胞群體計數，如下
在本發明這方面的一個優選實施方案中，診斷方法包含測定包括表達EDRF的造血類紅細胞、巨核細胞或血小板譜系細胞的樣品中EDRF的相對濃度。這樣的細胞可包括但不局限于E/Meg、CFU-GEMM細胞、BFU-E細胞、CFU-E細胞、原紅細胞、嗜堿性成紅細胞、多染性成紅細胞、正染性成紅細胞、網織紅細胞(前紅細胞)、巨核細胞或血小板。鼠、人和牛EDRF的核苷酸序列如圖3所示且預測的氨基酸序列如圖4所示。EDRF的相對濃度可通過在樣品中測量EDRF蛋白質水平而直接測定，或用EDRF cDNA來測量編碼EDRF的mRNA水平而間接測定，其中mRNA的水平可指示樣品中的細胞EDRF表達水平。樣品中EDRF水平的降低可在被試對象中指示TSE感染(或TSE疾病狀況)。表達水平的降低是相對于非感染個體中存在的表達水平。正常范圍可通過測定健康的非感染個體的統計相關群體而確定。
進一步的診斷測定可涉及抗EDRF抗體的使用，該抗體可為多克隆抗體或單克隆抗體。多克隆抗體可當將本發明的物質注射動物時通過刺激它們在適當的動物宿主(如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、綿羊、雞、山羊或猴子)中的生產而得到。如果需要，可與本發明的物質一起施用佐劑。于是抗體可通過它們結合EDRF的便利或如進一步在下文中描述的那樣而純化。單克隆抗體可從雜交瘤生產。這可以通過使骨髓瘤細胞和生產所需抗體的脾細胞融合形成無限增殖細胞系而形成。這是眾所周知的Kohler&Milstein技術(Nature 256 52-55(1975))。
生產結合具體蛋白的單克隆和多克隆抗體的技術目前在本領域中很發達。在標準免疫學教科書中都有討論，如在Roitt等人，Immunology第二版(1989)，Churchill Livingstone，London中。
除全抗體之外，本發明包括其能結合EDRF的衍生物。因而本發明包括抗體片段和合成的構建體。抗體片段和合成的構建體的實施例由Dougall等人在Tibtech 12 372-379(1994年9月)中給出。抗體片段包括如Fab、F(ab’)2和Fv片段(參見Roitt等人)。可以修飾Fv片段來生產已知為單鏈Fv(scFv)分子的合成構建體。這包括共價連接Vh和V1區域并有助于分子穩定性的肽連接體。
其他的合成構建體包括CDR肽。這些是包含抗原結合決定簇的合成肽。也可以用肽模擬物。這些分子通常為構象受限制的有機環，它模擬CDR環結構并包括同抗原相互作用的側鏈。合成的構建物也包括嵌合分子。因而，例如人源化(或靈長類源化)的抗體或其衍生物屬于本發明的范圍。人源化抗體的一個實例是具有人的構架區而具有嚙齒類動物的高變區的抗體。合成構建體也包括含有共價連接的部分的分子，這給分子提供除抗原結合之外的其他所需性質。例如該部分可能是標記(如檢測性標記，如熒光或放射性標記)或藥物活性劑。
對EDRF特異的抗體或其衍生物具有多種其他的用途。它們可用于EDRF本身或表達EDRF的細胞的純化和/或鑒定。結果它們可用于根據本發明的診斷方法中。
在制備對EDRF的適當抗體之后，可以用幾種一般可用的技術之一進行分離或純化(例如描述于《抗體實驗室手冊(AntibodiesA Laboratory Manual)》，Harlow和Lane，eds.Cold SpringHarbor Laboratory Press(1988))。通常適當的技術包括肽或蛋白質親和柱、HPLC或RP-HPLC、在蛋白質A或蛋白質G柱上的純化或這些技術的組合。對EDRF的重組抗體可根據標準方法來制備，并用通常可用的程序包括ELISA、ABC、點印跡測定等來測定對EDRF的特異性。
測定樣品中表達的EDRF蛋白質的方法的實例是蛋白質印跡法。來自樣品的蛋白質提取物可通過變性SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分級分離。然后通過電印跡可將混合物轉移并固定到固體硝酸纖維素膜或尼龍膜上。將有負載物的膜與抗-EDRF抗體進行溫育。結果所得的抗原-抗體復合物可通過任何適當的程序來檢測。例如，可以加入對抗抗-EDRF抗體的第二抗體，該抗體上連接了報告分子部分(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶)。然后由酶作用生成的反應產物可被用來顯示目的蛋白質在膜上的位置。對酶反應水平的測量可指示樣品中目的蛋白質存在的水平。該檢測系統的靈敏度可通過使用生物素-鏈霉抗生物素系統或通過化學發光檢測而改善。
或者，EDRF蛋白質的水平可通過放射免疫測定法(RIA)或酶聯免疫吸附測定(ELISA)的標準技術來測定。將抗體連接到報告酶上，然后固定在微量滴定板上。然后加入要測量的樣品裂解液以允許抗體-抗原復合物形成。洗滌并提供底物后，產物形成的水平與存在于樣品中的抗原即目的蛋白質的水平成比例。另一個方法是基于時間分辨熒光測定法的DELFIA系統。Delfia Research System(Wallac)測量鑭系金屬包括銪、釤和鋱當cheated to可發熒光的分子時的熒光。將抗體標記并固定于微量滴定板上。加入要測量的樣品裂解液以允許抗體-抗原復合物的形成。洗滌后，確定信號。
編碼EDRF準備表達的RNA轉錄物的存在可以用RNA印跡法進行測定(Thomas，P.S.，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 77 5201-5205(1980))。簡要地，將來自樣品細胞的變性的RNA轉移到硝酸纖維素膜或尼龍濾膜上以便隨后用于雜交測定。在由毛細管作用或在電場作用下將RNA轉移到膜上之前，在變性的瓊脂糖凝膠中進行電泳。使對EDRF RNA特異的放射性標記的DNA或RNA探針與結合濾膜的RNA進行雜交以使其能夠檢測。或者，RNA水平可以用“taqmanTM”進行測量，這是實時定量的RT-PCR程序，其特異性得自熒光能量轉移(FRET)探針的使用，或通過基于發現的唯一一類結構特異的內切核酸酶(切割酶(cleavases))的“入侵者(invader)”技術。入侵者和信號探針設計為能與目的DNA/RNA上重迭位點雜交以使得入侵者探針可取代信號探針的一部分。這樣形成一個切割酶可以識別并切割的結構，因而生成了可檢測的產物。
本發明的這個方面可另外被定義為在動物中診斷傳染性海綿狀腦病(TSE)是否存在的方法，該方法包含測定從動物獲得的樣品以確定樣品中類紅細胞、巨核細胞或血小板譜系造血細胞相對于對照或正常群體值的數目。
根據本發明的第二個方面，提供在動物中診斷傳染性海綿狀腦病(TSE)是否存在的方法，該方法包含測定從動物樣品以確定樣品中類紅細胞、巨核細胞或血小板譜系造血細胞的表達產物的相對量。要測定的類紅細胞、巨核細胞或血小板譜系造血細胞的表達產物可如上文所述。樣品分析和表達產物檢測的方法可如上文所述。
個體中TSE的存在可以通過這種測定而不參考樣品中造血細胞的實際數目來確定，其中表達產物的量與由測定健康的非感染個體的統計相關群體而確定的正常范圍進行比較。
根據本發明的第三個方面，提供在動物中診斷傳染性海綿狀腦病(TSE)是否存在的試劑盒，該試劑盒包含造血的類紅細胞、巨核細胞或血小板譜系細胞的抗體或EDRF的抗體。在本發明該方面的另一實施方案中，試劑盒可包含針對造血的類紅細胞、巨核細胞或血小板譜系細胞和EDRF兩者的抗體。這樣的二元抗體試劑盒可允許更高靈敏度的診斷方法。
造血的類紅細胞、巨核細胞或血小板譜系細胞特異的抗體如上文所述。EDRF的抗體可如上文所述而制備。
對抗體結合目標的測定可以用一般可用的標準技術如ELISA、ABC、點印跡測定來進行。也可以使用額外的檢測標記如熒光或放射性標記。
如在上文所討論，從中取樣品進行測定的組織來源可包括血液或其組分，或其他組織和/或器官。因而本申請的方法可用于血液(或其組分)、組織和/或器官進行轉輸或移植入受體之前對其進行前篩選。血液或其組分，或其他組織和/或器官的來源對于受體而言可能為異源或異種。如果樣品用根據本發明第一個方面的方法顯示TSE感染存在的陽性結果，這將能夠做出決定以避免在隨后向受體的轉輸或移植中使用來自該被分析個體的捐獻血液(或其組分)、組織和/或器官。通過這樣的方法，可能避免TSE感染進入一般群體的潛在途徑。
或者，在基于血液或組織或器官的產物制備之前，可在血液(或其組分)、組織和/或器官樣品中進行篩選。這樣的產物可包括從全血或其他組織來源制備的血漿或凝血因子富集物，例如因子IX、因子XI、因子VII、因子XII、因子V、因子XIII、因子VIIIC、因子VIIIvWFAg，或激素如生長激素、促紅細胞生成素、T4甲狀腺素或胰島素。
根據本發明的第四個方面，因此提供制備血液產物的方法，該方法包括測定血液樣品以確定獲得該樣品的動物中是否存在傳染性海綿狀腦病(TSE)，其中測定包含確定樣品中類紅細胞、巨核細胞或血小板譜系造血細胞的相對數目。
在本發明的優選實施方案中，診斷動物中是否存在傳染性海綿狀腦病(TSE)的方法可進行如下。
-樣品收集，包括可選的樣品制備步驟(例如加入血凝塊形成抑制劑；防腐劑等)-確定樣品中類紅細胞、巨核細胞或血小板譜系的造血細胞的相對數目，通過(a)樣品中的細胞群體的直接測量，或(b)參考這些細胞譜系的表達產物的間接測量(例如，EDRF蛋白質或編碼EDRF蛋白的RNA)。
這樣的優選方法的實例可包括步驟(1)從組織來源收集和/或制備樣品；(2)在計算細胞數目之前可選地標記細胞；(3)確定樣品中類紅細胞、巨核細胞或血小板譜系的造血細胞的相對數目，通過下面任一方式(i)人工計數確定；或(ii)自動計數確定；以及(4)將結果與來自正常非感染個體的對照參考樣品進行比較。
另外的方法可包括步驟(1)從組織來源收集和/或制備樣品；(2)類紅細胞、巨核細胞或血小板譜系的造血細胞的細胞樣品分離；(3)測定細胞中表達產物的水平，例如測定EDRF表達水平，以下面任一方式
(i)確定EDRF蛋白質水平(如通過蛋白質印跡法、放射免疫測定法(RIA)或ELISA)；或(ii)用cDNA探針確定mRNA的水平(如通過RNA印跡法或RT-PCR)(4)將結果與來自正常非感染個體的對照參考樣品進行比較。
來自正常非感染個體的對照參考樣品可包括來自正常非感染個體群體的混合樣品的樣品集合，該群體足以在統計分析中確立正常范圍或正常值。
在根據本發明的方法中，類紅細胞、巨核細胞或血小板譜系的造血細胞的數目可參考這些細胞的表達產物而估計。該表達產物可為蛋白質或多肽，或者它可以為編碼蛋白質或多肽的mRNA分子。
在根據本發明的方法中，當測定結果顯示類紅細胞、巨核細胞或血小板譜系的造血細胞的細胞數目相對于對照或正常群體值有降低時，可以做出對該被測個體受TSE感染的診斷。
對照或正常群體值可如上文所述而確立，并可基于非感染個體或非感染個體的群體。
本發明的第二個和其后方面的優選性質如同第一個方面已作必要的修正。
現將本發明進一步描述，參考下面的圖和實施例，其用于闡明發明目的，而不應該解釋為限制。參考下圖圖1表示來自DDRT-PGR凝膠的一組圖，其在疾病發病機理的各個階段比較了年齡和性別匹配的對照和瘙癢病感染的小鼠(腦內途徑)的脾中表達的基因亞群。感染后1、10天(dpi)；2、20 dpi；3、30 dpi；4、40 dpi；5、60 dpi；6，80 dpi；7、100 dpi；8、162 dpi(末期)。
圖2表示從圖1所示的DDRT-PGR凝膠中分離的cDNA的序列特性。
圖3表示鼠和人全長EDRF cDNA的核酸序列和牛的部分EDRF序列。全長的(a)鼠和(b) EST cDNA克隆經由IMAGE協會從人類基因組圖譜計劃獲得(分別為IMAGE IDs 466407和220221)。cDNAEST克隆以正向和反向測序。(c)牛EDRF的部分167 bp序列是用在實驗背景中陳述的簡并寡核苷酸利用嵌套式PCR合成。
圖4表示小鼠和人EDRF的氨基酸序列和部分牛EDRF蛋白質序列。
圖5表示將小鼠EDRF和TEL分配到相同的基因組座位和轉錄物方向的分析。(a)用多種限制性內切核酸酶消化小鼠基因組DNA的Southern印跡，并用放射性標記的全長小鼠EDRF cDNA進行探查；(b)多種小鼠組織RNA用放射性標記的單鏈體外轉錄的核糖核酸探針進行探查的RNA印跡分析。
圖6表示小鼠和人EDRF mRNA表達的組織分布。多種小鼠(a)和人(b，c)組織的RNA印跡分析用小鼠和人放射性標記的cDNA探針進行。
圖7表示在對照和感染瘙癢病的脾、骨髓和全血中EDRF表達的RNA印跡分析。(a)從疾病發病機理的各個階段的對照和瘙癢病感染的(Me7株)小鼠(C57B1品系)的脾中分離的RNA；(b)來自多種對照和感染瘙癢病的近交小鼠品系(VM和SV)和倉鼠(LVG)的脾。瘙癢病株系為Me7、87V、79A和263K，且顯示了這些模型的溫育周期；(c)來自對照和感染瘙癢病的小鼠的骨髓和全血(骨髓；VM小鼠/87V瘙癢病品系，全血；C57B1小鼠/Me7瘙癢病品系)。
圖8表示天然野生TSE病例的血液和骨髓中EDRF表達的RNA印跡分析。(a)綿羊是年齡、品種和性別匹配的且具有相同的PrP基因型(ARQ雜合子)。同時取對照和瘙癢病綿羊的血液樣品；(b)以BSE的最初明顯跡象精選病理上確實的BSE-感染牲畜和健康的對照的胸骨骨髓中EDRF的表達。
圖9表示表達EDRF的小鼠造血細胞譜系的確定。
圖10表示表達EDRF的造血細胞的進一步表征。縮寫如下E，血紅蛋白陽性的晚幼紅細胞和網織紅細胞；Meg，巨核細胞；Mac，巨噬細胞；Neut，嗜中性粒細胞；Mast，肥大細胞；BFU-E，含紅細胞的前體生產集落；CFU-E，在原紅細胞/CFU-E階段的血紅蛋白陰性的細胞。
圖11表示定型為類紅細胞譜系的造血細胞中的EDRF表達分配。(a)在耗盡了特定細胞譜系的骨髓懸浮液中的EDRF RNA表達。泳道A；未處理的全骨髓。泳道B到G分別代表耗盡了CD3e+、CD11b+、CD45R/B220+、Ly-6G+、TER-119+的骨髓懸浮液和非譜系(干)細胞；(b)&(c)為造血細胞序位的示意性表示。縮寫Meg，巨核細胞；E，類紅細胞；Mast，肥大細胞；Mac，巨噬細胞；Neut，嗜中性粒細胞；B，B-細胞；T，T-細胞；p，祖先；BFU-E/CFU-E，血漿和集落生成單位，類紅細胞祖先。
圖12表示血細胞生成的圖解。
圖13表示類紅細胞譜系的造血細胞的圖解。
材料與方法來自感染TSE的小鼠的所有組織從神經發病機理單位(Neuropathogenesis Unit，NPU)，Edinburgh獲得。對照和天然綿羊瘙癢病例的血獲自NPU。來自野生BSE病例的組織獲自MAFFCentral Veternary Laboratory(CVL)，Weybridge。人RNA購自Clontech，英國。對小鼠造血細胞反應的抗體購自BecktonDickinson，英國。聯系德國的Davids Biotechnologie合成小鼠和人的類紅細胞分化相關因子(EDRF)肽并生產抗這些肽的抗血清。人和小鼠全長的EDRF cDNA經由IMAGE協會從人類基因組圖譜計劃(英國)而免費獲得。造血細胞cDNA的點印跡由來自Norman Iscove(加拿大)捐獻。
實施例1基因表達分析將表征良好的瘙癢病Me7株腦內注射C57B1小鼠作為TSE感染的模型。年齡和性別匹配的小鼠用20μl的1∶10w/v的正常腦勻漿進行腦內注射。在注射后10、20、30、40、60、80、100和162天時(dpi)從對照和感染TSE的動物中收集腦和脾。162 dpi代表本模型疾病的末期階段。將總RNA從“集合的”組織中分離并用作模板以合成用于隨后的差異顯示逆轉錄酶-聚合酶鏈式反應(DDRT-PCR)的cDNA亞群。DDRT-PCR是有力的分子工具，它可以通過創建RNA指紋而使得任何特定細胞類型或組織的基因表達可視化。在兩或多個研究樣品間差異表達的基因用本技術可很容易地鑒定和回收。DDRT-PCR分析基本如前文所述(Liang等人Science 257 967-971(1992))進行并具有一些更改(Miele等人Biotechniques 25(1)138-144(1998))。利用DDRT-PCR技術，比較TSE疾病發病機理的各個階段的小鼠脾的基因表達與對照脾基因表達。如前文所述，回收和克隆代表差異表達的cDNA條帶(Miele等人In“ExpressionGenetics”，eds McClelland & Pardee，pages 433-444，NatickEaton Publishing(1999)(a))；Miele等人Prep.Biochem.Biotech.29(3)245-255(1999)(b))。將克隆的cDNAs進行測序并在對公共核苷酸和蛋白質數據庫的計算機輔助的同源性搜索后而進行鑒定。根據標準規程將克隆的cDNAs進行放射性標記以用作RNA和DNA雜交研究的探針(Sambrook等人“分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningA Laboratory Manual”，NewYorkCold Spring harbor Laboratory press(1989))。
為了克隆牛EDRF核酸序列的區域來用作牛序列的同源探針，聚合酶鏈反應(PCR)可用下面的簡并寡核苷酸引物和牛基因組DNA作為模板而進行。引物基于小鼠和人的EDRF之間可讀框的同源性而設計。
ED1F；5’-CA(AG)CA(AG)GT(AGCT)TT(CT)(AG)A(CT)GA(CT)CC-3’ED3F；5’-GA(AG)GA(AG)GA(CT)ATGGT(AGCT)A(CT)(AGCT)GT-3’ED2R；5’-AG(AG)AAIIIIC(GT)(AG)TA(CT)TT(AGCT)GC(AGCT)A-3’第一輪PCR用標準試劑濃度和ED1F和ED2R引物進行，在94℃1分鐘，50℃1分鐘和72℃1分鐘循環40次。將1μl PCR產物在與第一輪PCR相同的條件下用于嵌套式PCR，使用ED3F和ED2R引物。將預期大小的168 bp的DNA PCR產物凝膠純化并克隆入T/A克隆載體pGEM-Teasy(Promega)。從幾個克隆中分離的質粒DNA進行正向和反向進行了測序，并編寫牛EDRF可讀框的一致部分。
這個分析的來源材料是從對照和在疾病發病機理的各個限定階段的感染瘙癢病(Me7株)的小鼠(腦內接種途徑)中集合的脾組織。鑒定了一個在疾病發病機理的后面階段TSE感染小鼠的脾中表現為下調的轉錄物(圖1)。將代表該轉錄物的cDNA從DDRT-PCR凝膠中回收、純化、PCR再擴增并克隆入pBluescript II SK II+克隆載體中(Stratagene)。
圖1的結果表示來自DDRT-PCR凝膠的一組圖，它比較了疾病發病機理的各個階段年齡和性別匹配的對照和瘙癢病感染的小鼠(腦內途徑)的脾中表達的基因的亞群。感染后1、10天數(dpi)；2、20dpi；3、30 dpi；4、40 dpi；5、60 dpi；6，80dpi；7、100 dpi；8、162 dpi(末期)。如前文所述將代表這個在瘙癢病感染的脾中下調的轉錄物回收并克隆入pBluescript KS II+(Stratagene)中(Miele等人BioTechniques 25(1)138-144(1998)；Miele等人In“Expression Genetics”，eds McClelland&Pardee，433-444頁，NatickEaton Publishing(1999)(a))；Miele等人Prep.Biochem.Biotech.29(3)245-255(1999)(b))。
標準的DNA測序以及隨后對公共核苷酸和蛋白質數據庫進行的計算機輔助的同源性搜索揭示這個cDNA代表小鼠類紅細胞分化相關因子mRNA(mEDRF，Genbank訪問號AF055085，AF060220)的505個核苷酸的片段。該基因僅在公共核苷酸數據庫有描述。然而，除了與mEDRF有100％的同源性匹配之外，該DDRT-PCR的cDNA片段在核酸水平也與更大的小鼠TEL癌基因(Genbank訪問號NM007961.1)的一個小區域具有100％的匹配。實際上，全長的505核苷酸的mEDRF cDNA序列與小鼠TEL cDNA在反義的方向上100％匹配(參見圖2)。
圖2表示從圖1所示的DDRT-PCR凝膠中分離的cDNA的序列特性。cDNA在核苷酸水平與小鼠(Mus Musculus)類紅細胞分化相關因子mRNA(mEDRF)505個核苷酸的位置263到末端具有100％的匹配。然而，它也在反義方向上與小鼠ets變異基因6(TEL癌基因)的位置796到582具有100％的匹配。DDRT-PCR引物的位置加下劃線表示。(b)對EDRF和TEL轉錄物兩者的詳細計算機輔助分析顯示兩個轉錄物都由相同的基因組座位編碼，但互為反義方向。陰影線塊代表(a)中顯示的序列的示意性位置。Genbank訪問號如下；小鼠EDRF(AF055085，AF060220)，小鼠TEL(NM007961.1)。代表全長人和小鼠的EDRF cDNA的克隆是從人類基因組圖譜計劃獲得，Hinxton，Cambridge(IMAGE克隆分別鑒定了230221和466407)。
實施例2牛EDRF序列的克隆上面提到的DDRT-PCR EDRF的cDNA片段不代表整個EDRF cDNA序列。全長的小鼠和人EDRF cDNA克隆(分別為IMAGE IDs 230221和466407)免費從人類基因組圖譜計劃獲得，Cambridge。將這些全長cDNAs雙向測序，序列信息在圖3中顯示。為了獲得牛EDRF RNA的同源探針以便將來用作研究表達的探針，在牛基因組DNA上進行了簡并PCR(參見材料與方法)。將預期大小的PCR產物純化并克隆入pGEMT-easy載體(Promega)中。這些克隆的核苷酸序列在圖3中顯示。序列分析證實該部分的DNA序列代表小鼠和人EDRF的牛同系物的可讀框區域。
圖3表示小鼠和人全長EDRF cDNAs和牛部分EDRF序列的核酸序列。全長的(a)小鼠和(b)人的EST cDNA克隆經由IMAGE協會從人類基因組圖譜計劃獲得(分別為IMAGE IDs 466407和220221)。cDNA EST克隆以正向和方向進行測序。(c)牛EDRF的部分167 bp的序列在如實驗背景中所陳述用簡并寡核苷酸進行嵌套式PCR后合成。變異的核苷酸(保守的氨基酸替代)加下劃線表示。在核苷酸水平上，小鼠和人EDRF cDNA序列在403個核苷酸上具有72.2％的一致性。牛的EDRF部分DNA序列與小鼠EDRF cDNA的位置153到318及人EDRF cDNA的位置171到337匹配。在核苷酸水平上，牛EDRF在167個核苷酸上與人的EDRF序列具有78.4的一致性，與小鼠的EDRF序列具有75.6％的一致性。
實施例3生產EDRF蛋白質的抗血清利用圖3中所示的人、小鼠和部分牛EDRF cDNA序列推斷這些序列編碼的氨基酸序列(參見圖4)。Davids Biotechnologie(德國)從小鼠和人的概念EDRF蛋白質合成了肽并從對雞的免疫中生產了抗血清。
圖4表示小鼠和人EDRF和部分牛EDRF蛋白質序列的氨基酸序列。這些序列是基于全長的小鼠和人EDRF cDNAs和部分牛可讀框DNA序列的概念翻譯(核苷酸序列在圖3中顯示)。a和b中加下劃線的肽代表那些選擇來與Davids Biotechnologies(德國)訂立合同以合成并對雞免疫來生產對人和小鼠EDRF蛋白質的抗體。在氨基酸水平，人和小鼠EDRF蛋白質具有63.7％的一致性，而牛部分EDRF蛋白質(55個氨基酸)與人的EDRF蛋白質具有72.7％的一致性且與小鼠的EDRF蛋白質具有67.3％的一致性。注意在圖3中顯示的變異的牛EDRF核苷酸導致保守的氨基酸替代，只有密碼子6除外，它可能為異亮氨酸或蘇氨酸。
實施例4TEL和EDRF之間的關系在計算機輔助的序列對比的基礎上，EDRF顯示為由TEL的反義DNA鏈編碼。確定鑒定為在TSE感染的脾中(圖1)差異表達的轉錄物是否代表EDRF或TEL是重要的。用全長mEDRF探針進行預Southern印跡分析顯示EDRF和TEL可能由相同的基因組座位編碼(圖5)。然而，用單鏈核糖核酸探針(riboprobes)的RNA印跡分析揭示該大約500個核苷酸的EDRF轉錄物是在TSE感染的小鼠脾(Me7脾)中表現不足的RNA且TEL在這些條件下不可檢測(EDRF正義核糖核酸探針-與TEL RNA反義)。這些實驗正式證實了由DDRT-PCR鑒定為差異表達的轉錄物是mEDRF。
圖5表示小鼠EDRF和TEL分配到相同的基因組座位上以及轉錄物方向的分析。(a)用多種限制性內切酶消化及用放射性標記的全長小鼠EDRF cDNA作為探針的小鼠基因組DNA的Southern印跡。該約505 bp的EDRF cDNA核酸序列與TEL具100％的一致性。對每個限制性內切酶消化的單鏈檢測顯示EDRF和TEL可能在相同的基因組座位上編碼。小鼠EDRF cDNA包含EcoR I位點，于是如果EDRF和TEL在相同的基因組座位上編碼就應該導致在用mEDRF全長cDNA作探針時檢測到兩個條帶。(b)為了進一步從核酸序列分析的指示中研究關于在相同的基因組座位上編碼的EDRF和TEL互為反義，將多種小鼠組織RNA的RNA印跡用體外轉錄的放射性標記的核糖核酸探針進行檢測。EDRF RNA僅被EDRF反義核糖核酸探針(TEL正義核糖核酸探針)檢測。這顯示EDRF實際上是與TEL反義的轉錄物而不是TEL轉錄物的可變剪接物。TEL RNA在這些條件下用TEL反義核糖核酸探針不能檢測到。因此EDRF和TEL在大小、方向和豐度上有顯著差別。Taqman RT-PCR分析揭示與EDRF不同，TEL RNA在瘙癢病感染的小鼠脾中不差異表達。
實施例5EDRF RNA表達的組織分布對多種小鼠組織的RNA印跡分析證明EDRF僅在小鼠脾、骨髓和全血中表達，其中骨髓代表了具有最高EDRF轉錄物水平的組織(圖6a)。注意EDRF表達在胸腺中檢測不到，這顯示EDRF表達與淋巴細胞沒有關聯。在成年小鼠中，除胸腺例外，這些組織是代表造血活性和紅細胞發生的組織。在人組織中(RNA購自Clontech)，EDRF在骨髓但不在脾中表達(圖6b)。在人類中，骨髓是具有造血活性的主要組織。EDRF也表達于人的全血中(圖6c)。對人血的淺棕黃層(含有淋巴細胞)和非淋巴細胞組分的分析顯示EDRF在血液中的表達是與紅細胞而非淋巴細胞有關聯。
圖6表示小鼠和人EDRF mRNA表達的組織分布。對各種(a)小鼠和(b、c)人組織的RNA印跡分析用小鼠和人的放射性標記的cDNA探針進行。(a)小鼠EDRF僅表達于脾、骨髓和全血。(b、c)人EDRF僅表達于骨髓和全血。這些組織是造血組織(小鼠的脾、骨髓和血液和人的骨髓和血液)。EDRF表達與表達血紅蛋白(僅表達于類紅細胞中)的組織相關。18S rRNA的檢測顯示在所有泳道中加載了相等的RNA。(c)對人血的淺棕黃層和類紅細胞組分的RNA印跡分析顯示EDRF表達與富含類紅細胞的組分有關聯，如由后面的血紅蛋白檢測所示。
實施例6嚙齒動物實驗TSE疾病組織中的EDRF表達研究在TSE疾病發病機理(Me7瘙癢病品系)各個階段的小鼠的脾中EDRF的表達。如在圖7a所示，與模擬的感染對照相比，EDRF在TSE疾病末期階段的小鼠脾中驚人地下調。該下調在脾的疾病發病機理過程的約三分之一中明顯。血紅蛋白β-鏈也在疾病末期階段的小鼠脾中下調。進一步的研究證明EDRF下調在其他實驗TSE疾病的疾病發病機理的末期階段的鼠脾中也明顯，如同血紅蛋白β-鏈(圖7b)。另外，這種作用在感染TSE的倉鼠模型中明顯(LVG倉鼠，263K瘙癢病品系)。因此，EDRF和血紅蛋白β-鏈在脾中的差異表達是這些不同的TSE模型的共同特征。因為EDRF也在小鼠骨髓和全血中表達，所以研究EDRF是否在感染TSE的小鼠的這些組織中差異表達。如圖7c中所示，EDRF在分析的疾病發病機理的末期階段的小鼠的骨髓和血液中也下調。然而，與從小鼠脾中獲得的結果相反，血紅蛋白β-鏈在瘙癢病感染的小鼠的骨髓或血液中不差異表達。
圖7表示在對照和瘙癢病感染的脾、骨髓和全血中EDRF表達的RNA印跡分析。(a)從對照和疾病發病機理各個階段的瘙癢病感染(Me7株)的小鼠(C57B1品系)脾中分離的RNA。與對照相比，EDRF在疾病發病機理末期階段(162 dpi)的瘙癢病感染的小鼠脾中深度下調。該下調在較早階段可檢測。血紅蛋白β-鏈RNA在瘙癢病感染的小鼠脾中也下調。(b)證實EDRF下調在其他的TSE疾病鼠模型中明顯。脾來自各種對照和瘙癢病感染的近交小鼠品系(VM和SV)和倉鼠(LVG)。瘙癢病株為Me7、87V、79A和263K，且顯示了這些模型的溫育周期。EDRF和血紅蛋白β-鏈兩者在來自受多種瘙癢病株感染的多種嚙齒動物基因型的脾中深度地都下調。這也證明EDRF下調的發現不是局限于小鼠的現象。(c)EDRF也在骨髓和全血中表達(參見圖5)，因此研究了對照和感染瘙癢病的小鼠的骨髓和全血(骨髓；VM小鼠/87V瘙癢病株，全血；C57B1小鼠/Me7瘙癢病株)以確定是否EDRF在瘙癢病感染的小鼠的組織中也差異表達。EDRF在疾病發病機理末期階段的瘙癢病感染的小鼠骨髓和全血中下調。與脾相反，血紅蛋白β-鏈RNA在疾病末期階段的瘙癢病感染的小鼠的骨髓和血液中以相似的水平表達。18S rRNA探查證實相似量的RNA加入到所有泳道上。在疾病發病機理的末期階段，EDRF在脾(＞30倍)、骨髓(8倍)和全血(4倍)中下調。所有樣品都獲自經由腦內注射感染的小鼠。
這些結果首次證明了在感染和未感染的動物造血組織之間的分子差異。
實施例7TSE疾病的天然野生病例組織中的EDRF表達進一步檢查觀察到TSE感染在造血組織中對EDRF表達的作用是否為實驗鼠模型所特有，或與其他天然TSE疾病所共有。全血獲自表現天然瘙癢病早期臨床病征的綿羊(在死于疾病前1.5個月)。對照材料是從年齡、品種和性別匹配的相同PrP基因型的綿羊中取的(眾所周知PrP基因型是影響疾病易感性的因素)。用放射性標記的全長人EDRF cDNA對從綿羊全血中分離的RNA進行的RNA印跡分析檢測到大約3.5Kb轉錄物，該轉錄物在天然野生病例的血液中表現不足(圖8a)。用部分牛EDRF cDNA對該RNA印跡的再檢測雜交相同的轉錄物。因此，盡管檢測到的綿羊轉錄物顯著大于小鼠或人EDRF，該轉錄物實際上代表綿羊EDRF RNA。從健康牲畜和懷疑遭受BSE侵染的牲畜(隨后病理證實它們患有BSE)中也獲得了脾和胸骨骨髓。對照和BSE牲畜品種匹配、為非懷孕且約相似年齡的雌性(＞3.5歲)。利用部分牛EDRF cDNA的RNA印跡分析已證明牛EDRF轉錄物與小鼠和人的EDRF的大小大約相同(約500個核苷酸)。已經發現，牲畜類似于人，在脾中不表達EDRF。然而，對胸骨骨髓的分析揭示牛EDRF在表現BSE病征的動物中驚人地下調(圖8a)，如同實驗感染TSE物質的小鼠骨髓。
圖8表示在TSE疾病天然野生病例的血液和骨髓中EDRF表達的RNA印跡分析。(a)綿羊的年齡、品種和性別匹配且具有相同的PrP基因型(ARQ雜合體)。對照和瘙癢病綿羊同時取血樣。瘙癢病綿羊血液是從表現瘙癢病早期臨床病征的綿羊在其死于疾病之前大約一個半月時獲得。對人、牲畜和綿羊基因組DNA的Southern印跡分析顯示人EDRF cDNA是牲畜和綿羊序列的適當探針(未顯示)。因此用放射性標記的人和牛EDRF cDNA檢測RNA印跡。人血液RNA充當實驗的正對照。磷光成像(Phosphorimager)分析揭示推定的綿羊EDRFRNA在天然瘙癢病臨床病征早期階段(在該階段動物相對地健康)的綿羊血液中下調約50％。利用牛部分EDRF cDNA作為探針與該相同轉錄物進行雜交，進一步顯示該3.5Kb的轉錄物是綿羊EDRF真正的同系物。(b)在以BSE的第一明顯病征精選病理學證實為BSE侵襲的牲畜和健康對照的胸骨骨髓中EDRF表達。牲畜品種匹配、為非懷孕且約相似年齡的雌性(＞3.5歲)。RNA印跡用放射性標記的部分牛EDRF cDNA進行檢測。牛EDRF RNA與小鼠和人的EDRF RNA的大小大約相同且在遭受天然BSE侵襲的牲畜骨髓中驚人地下調。這些實驗證明作為朊病毒疾病指示劑的EDRF可用于天然野生的朊病毒疾病病例，而且EDRF的差異表達不是實驗誘導的嚙齒動物朊病毒疾病所特有的現象。
這些實驗清楚地顯示EDRF差異表達以及表達EDRF的造血細胞類型功能異常一些可能的方面是實驗和天然野生TSE疾病病例共有的特征。
實施例8表達EDRF的造血細胞類型的確定很清楚EDRF是TSE感染新的有用的死前標記和指示劑。觀察到的EDRF差異表達可能代表該基因表達的作用，或者它顯示與EDRF表達相關聯的造血細胞類型的進行性喪失/耗盡。作為解決這個問題的第一個步驟，進一步確定表達EDRF的造血細胞類型。獲得一組對不同的小鼠造血細胞譜系反應的抗體(Pharmingen/BecktonDickinson)。將這些抗體用于耗盡全骨髓細胞懸浮液中的各種造血細胞譜系。然后從剩余的細胞中分離RNA并通過RNA印跡分析估計EDRF的表達。在任何特別組分中EDRF表達的喪失將顯示已經去除的細胞是那些表達EDRF的細胞。如可圖9所見，EDRF表達在已經耗盡了TER-119陽性細胞的骨髓中驚人地減少了，如同血紅蛋白β-鏈的表達。除早期BFU-E和CFU-E祖先例外，TER-119抗體與造血細胞在類紅細胞發育的所有階段都進行反應。
圖9表示表達EDRF的小鼠造血細胞譜系的確定。EDRF僅在小鼠脾、骨髓和全血中表達(參見圖5)。在小鼠或人的胸腺中可檢測的信號的缺乏顯示EDRF表達與T-或B-細胞無關聯，在人血液的淺棕黃層組分中可檢測信號的缺乏也如此(參見圖5)。為了確定哪個造血細胞譜系表達EDRF，將小鼠骨髓細胞懸浮液富集以得到非定型的干細胞或者用一組抗體(購自Pharmingen)和CELLection生物素結合動珠(biotin binding dynabeads)(購自Dynal)將特定細胞群體耗盡。隨后分離RNA并用放射性標記的小鼠EDRF cDNA探針進行RNA印跡分析。EDRF信號僅在耗盡了類紅細胞的細胞懸浮液的RNA中大大減少。如所預期的，血紅蛋白β-鏈RNA在這個組分中也減少了。TER-119抗體不與具有BFU或CFU活性(BFUe/CFUe)的已定型的類紅細胞反應。來自富集的非定型造血干細胞組分的RNA中可檢測的EDRF表達可能代表了BFUe和CFUe類紅細胞中的EDRF表達，但目前不能排除EDRF在非定型干細胞中表達的可能。類似地，EDRF表達可以在TER-119陽性選擇的造血細胞中檢測到。然而，該表達也可以較低水平在其他譜系中檢測到(CD3+、CD11b+、CD45R+、B220+、Ly-6G+細胞)。因此EDRF表達主要與類紅細胞譜系的造血細胞有關聯，但也在其他，非-B/非-T細胞的造血細胞中表達。然而，在這個組分中血紅蛋白的表達顯示類紅細胞是與其他譜系共純化的。EDRF可能僅在類紅細胞譜系中表達。對EDRF表達的細胞譜系進一步的表征在圖10中給出。仍然需要確定在瘙癢病感染的脾、骨髓和血液中發現的EDRF表達的下調是否代表特定的基因作用，或者由于脾中血紅蛋白的下調，該下調是否更可能由類紅細胞的耗盡所導致。
這些結果顯示EDRF表達主要與類紅細胞相關聯，且在同樣的耗盡了TER-119細胞的組分中血紅蛋白β-鏈表達的減少證實了這一點。
為了確證，進行了陽性選擇實驗，EDRF表達(和血紅蛋白)清楚地與TER-119富集的組分有關聯。BFU-E和CFU-E細胞殘存在也含有多能，非定型的造血干細胞的細胞組分中。在富集的TER-119陰性和BFU-E/CFU-E陰性細胞中明顯的EDRF表達清楚地是歸因于污染，因為在這些制劑中血紅蛋白也可檢測。EDRF清楚地也存在于從BFU-E/CFU-E和干細胞混合群體中分離的RNA中。然而，尚不清楚這些祖細胞類型中哪些表達EDRF。為了闡明這一點，獲得了含有擴增的cDNA的斑點印跡，其中的cDNA是從確定發育階段的造血細胞中分離的RNA合成而來(由Norman Iscove捐獻，加拿大)。
圖10表示表達EDRF的造血細胞的進一步表征。縮寫如下E，血紅蛋白陽性的晚幼紅細胞和網織紅細胞；Meg，巨核細胞；Mac，巨噬細胞；Neut，嗜中性粒細胞；Mast，肥大細胞；BFU-E，含有紅細胞的前體生產集落；CFU-E，在原紅細胞/CFU-E階段的血紅蛋白陰性的細胞。例如，E/Meg/Mac指能發育到類紅細胞、巨核細胞或巨噬細胞譜系的多能祖細胞。類似的，Mac祖先指定型為向巨噬細胞譜系發育的單能細胞。在(i)能發育為類紅細胞或巨核細胞譜系的雙能細胞，(ii)BFU-E細胞，(iii)CFU-E細胞和(iv)血紅蛋白陽性的晚幼紅細胞和網織紅細胞中檢測到EDRF表達。在血紅蛋白陰性的CFU-E類紅細胞中觀察到最高的EDRF表達。該系統中的T-細胞獲自用伴刀豆凝集素A處理過的脾細胞培養物。這些富集的T-細胞含有污染的血紅蛋白陽性的類紅細胞。T-細胞組分中明顯的EDRF表達(坐標網參數C3)可能代表污染的表達EDRF的類紅細胞的存在。在人“淺棕黃層”EDRF表達的缺乏(圖6)證實了這一點。因此EDRF表達于所有定型發育為類紅細胞譜系并在類紅細胞發育的所有階段(包括TER-119+、BFU-E和CFU-E細胞)的造血細胞中以及能夠沿巨核細胞/血小板譜系分化的細胞中。
如圖10所示，EDRF表達僅與那些定型為類紅細胞譜系的細胞有關聯，包括BFU-E和CFU-E細胞。造血干細胞不表達EDRF。EDRF表達在CFU-E類紅細胞中最高。在本系統中，EDRF以低水平可檢測的最早階段是能夠發展到類紅細胞或巨核細胞譜系的雙能細胞。EDRF清楚地與類紅細胞譜系的造血細胞有關聯。
圖11表示EDRF表達向定型于類紅細胞譜系的造血細胞的分配。(a)在耗盡了特定細胞譜系的骨髓懸浮液中EDRF RNA表達。泳道A；未處理的全骨髓。泳道B到G分別代表耗盡了CD3e+、CD11b+、CD45R/B220+、Ly-6G+、TER-119+和非譜系(干)細胞的骨髓懸浮液。用一組購自BD Pharmingen的單獨的綴合生物素的抗體和鏈霉抗生物素包被的磁珠(Dynal)根據生產商的使用說明耗盡特定的造血細胞譜系。抗體對下列造血細胞譜系反應CD3e(胸腺細胞、T-淋巴細胞)；CD11b(粒細胞、單核細胞/巨噬細胞、樹突細胞、天然殺傷細胞(NK細胞)和B-1細胞)；CD45R/B220(來自前-B到成熟和活化的B-細胞的B-譜系細胞)；Ly-6G(單核細胞、嗜中性粒細胞、分化和成熟的粒細胞)；TER-119(從早期成紅血細胞到成熟紅細胞階段的所有限定型為類紅細胞譜系的細胞)。(b)和(c)示意性地代表造血細胞的層級。縮寫Meg，巨核細胞；E，類紅細胞；Mast，肥大細胞；Mac，巨噬細胞；Neut，嗜中性粒細胞；B，B-細胞；T，T-細胞；p，祖先；BFU-E/CFU-E，類紅細胞祖先，血漿和集落生成單位。(b)EDRF表達限制于類紅細胞發育所有階段的細胞。(c)在造血細胞中PrP RNA的表達。EDRF和PrP轉錄物的共表達發生于雙能的E/Meg細胞(以星號顯示)。表達水平由陰影程度顯示，更深的陰影顯示更高的表達水平。從帶多聚腺苷酸的mRNA合成的cDNA的點印跡由N.Iscove(Universaity of Toronto，加拿大)捐獻，其中的mRNA是從代表造血細胞層級的16個階段的單個細胞中純化。
結果概述本結果鑒定了一個基因，它編碼未知功能的蛋白質，其在患TSE疾病的動物的造血細胞中差異表達。該基因的這種表達特征高度特異性，若非排除性，其也主要表達于類紅細胞譜系的造血細胞中。這因此證明新的，非基于PrPSc的TSE感染的分子標記/特點，其在造血組織中可很容易地檢測。以前未報告過這種情況。
權利要求
1.在動物中診斷傳染性海綿狀腦病(TSE)是否存在的方法，包含測定從動物中獲得的樣品以確定樣品中的類紅細胞、巨核細胞或血小板譜系的造血細胞的相對數目。
2.如權利要求1的在動物中診斷傳染性海綿狀腦病(TSE)是否存在的方法，其中的傳染性海綿狀腦病(TSE)是瘙癢病、牛海綿狀腦病(BSE)、慢性萎縮疾病(CWD)、克-雅病(CJD)或新變體(nv)CJD。
3.如權利要求1或2的在動物中診斷傳染性海綿狀腦病(TSE)是否存在的方法，其中樣品是全部的或分級分離的血液、造血組織如骨髓，或來自脾。
4.如權利要求1到3中任何一項的在動物中診斷傳染性海綿狀腦病(TSE)是否存在的方法，其中測定的類紅細胞、巨核細胞或血小板譜系的造血細胞包括多能干細胞、髓樣干細胞、CFU-GEMM細胞(集落生成單位粒細胞/紅細胞/單核細胞/巨核細胞)、BFU-E細胞(血漿生成單位類紅細胞)、CFU-E細胞(集落生成單位類紅細胞)、原紅細胞、網織紅細胞、紅細胞、巨核細胞或血小板。
5.如任何前述權利要求之一的在動物中診斷傳染性海綿狀腦病(TSE)是否存在的方法，其中類紅細胞、巨核細胞或血小板譜系的造血細胞的數目以參考該細胞的表達產物來估計。
6.如權利要求5的在動物中診斷傳染性海綿狀腦病(TSE)是否存在的方法，其中測定的表達產物為類紅細胞分化相關因子(EDRF)。
7.如權利要求1到4中任何一項的在動物中診斷傳染性海綿狀腦病(TSE)是否存在的方法，其中要測定的造血細胞表征為與抗-TER-119、抗-血型糖蛋白A、抗-CD-71、抗-EDRF或抗血紅蛋白抗體反應。
8.如權利要求7的在動物中診斷傳染性海綿狀腦病(TSE)是否存在的方法，其中要測定的細胞包括原紅細胞、嗜堿性成紅細胞、多染性成紅細胞、正染性成紅細胞、網織紅細胞(前紅細胞)。
9.如權利要求1到4中任何一項的在動物中診斷傳染性海綿狀腦病(TSE)是否存在的方法，其中要測定的造血細胞表征為與抗-CD-61抗體反應。
10.如權利要求9的在動物中診斷傳染性海綿狀腦病(TSE)是否存在的方法，其中要測定的細胞為E/Meg細胞、原巨核細胞、巨核細胞或血小板細胞。
11.在動物中診斷傳染性海綿狀腦病(TSE)是否存在的方法，該方法包含測定從動物中獲得的樣品以確定類紅細胞、巨核細胞或血小板譜系的造血細胞的表達產物的相對量。
12.在動物中診斷傳染性海綿狀腦病(TSE)是否存在的試劑盒，其中該試劑盒包含對類紅細胞、巨核細胞或血小板譜系的造血細胞的抗體。
13.在動物中診斷傳染性海綿狀腦病(TSE)是否存在的試劑盒，其中該試劑盒包含對類紅細胞、巨核細胞或血小板譜系的造血細胞的表達產物的抗體。
14.如權利要求13的試劑盒，其中抗體結合的類紅胞、巨核細胞或血小板譜系的造血細胞的表達產物為EDRF。
全文摘要
本發明提供在動物中診斷傳染性海綿狀腦病(transmissible spongiform encephalopathy)(TSE)或朊病毒疾病的方法，該方法包含測定所述動物的樣品以確定樣品中的類紅細胞、巨核細胞或血小板譜系造血細胞的數目或其表達產物的量。
文檔編號C07K16/18GK1473272SQ0181827
公開日2004年2月4日 申請日期2001年10月29日 優先權日2000年10月31日
發明者M·克林頓, G·米勒, J·C·曼森, M 克林頓, 曼森 申請人:羅斯林學院(愛丁堡)