專利名稱：無限增殖的前成骨細胞及其生產方法
技術領域：
本發明涉及新的、來自骨的骨膜層的無限增殖化前成骨細胞系，其具有分化成成骨細胞的能力。具體地說，本發明是在試驗中利用這樣的細胞系檢測控制由骨膜衍生的前成骨細胞向成骨細胞分化的物質，以及檢測能夠改善骨形成、保持骨質、進行骨修復和防止引起骨質疏松癥的物質。
在骨組織中、通過分別由成骨細胞和破骨細胞在細胞水平控制的循環加工過程，使骨不斷地被破壞、再吸收和從頭產生。成骨細胞主要參與骨形成過程，而骨物質的破壞和再吸收的過程似乎是由破骨細胞調節的。
骨包含兩個主要的區域，內部區域稱作＂骨松質＂，外部區域稱作＂皮質＂。所述的外部區域中藏有Havers通道和骨膜。所述的骨膜，即所謂骨的外殼通過用于關節的proviso覆蓋著骨的環狀面。所述的骨膜主要是為骨提供包容物，以保證腱的附著和為大多數神經提供庇護。最近發現該骨膜還可能參與骨的生長，并進一步參與個體再生過程，如骨折后的修復。
骨膜本身也包含兩個主要的區域，外部的區域稱作＂纖維層＂，其主要包含連接組織，＂Kambium＂或＂成骨層＂與骨本身接近，其包含許多非分化的細胞，如前成骨細胞。目前推測，這些前成骨細胞或其衍生的細胞似乎參與骨折修復和/或其他的重構過程。但這些前成骨細胞似乎不同于在＂骨松質＂中發現的前成骨細胞，這是因為上述的細胞缺乏分化成脂肪細胞的能力，并且據推測其不支持破骨細胞分化。
隨著年齡的增長，個體傾向于逐漸損失骨質，這包括皮質中Havers通道加寬以及骨松質質量減輕。這一現象主要是由于在細胞水平上，破骨細胞的骨吸收超過了成骨細胞的骨形成，這一情況稱作解偶聯。一旦所述的解偶聯持續較長的時間，就會有越來越多的骨物質自毀/再吸收，最終導致稱作骨質疏松癥的疾病。骨質疏松癥引起骨痛并使骨易碎，最終導致在該處發生骨折，并引起腰背痛。
過去，已有多種療法用于治療骨質疏松癥，包括增加鈣的攝取，光照運動，曬太陽，或施用提高存在于＂骨松質＂中的成骨細胞活性的化合物。在這方面US 5,002,968公開了一種用于使成骨細胞增殖的有機鍺化合物，其激活成骨細胞增殖，由此刺激骨形成并平衡破骨細胞的勝過活性。另外，在EP 0 725 080中公開了一種新的蛋白質，基本成骨細胞生長因素II(bOGF-II)，其可刺激成骨細胞生長。
然而，最近發現成骨細胞不僅僅在骨化過程中起作用，而且似乎在與破骨細胞的分化和活化密切相關的骨重組現象中起控制中心的作用，該細胞介導骨分解作用。鑒于此，單純活化現存的成骨細胞以促進和保持骨質是否有效頗值得懷疑。
同時，已發現在內部骨損失的同時，骨被添加到骨膜表面，但比生長期間慢得多，其表明這一過程不同于由骨分解作用產生的骨不穩定。
由此使人們有興趣評價和研究存在于骨膜中的成骨細胞及其對骨修復和骨形成的作用，以便提供可影響骨膜中的這一過程的物質。
為了提供這種化合物，就需要闡明影響骨代謝中的細胞的作用的有效工具。
如本領域所知，進行此種試驗的最好的工具就是所述過程中所涉及的細胞。然而，直接由供體獲得的細胞，即所謂的原代細胞僅有非常有限的增殖壽命，這使其在體外研究中的使用受到限制。另外，并不是所有類型的細胞都能進行分離培養。特別是對于前體細胞，往往不能分離出使所述實驗能夠進行的足量的前體細胞。
過去，盡管證明了有些細胞能耐受這種操作，還可利用癌基因，如猴病毒40大T抗原(SV40 T抗原)感染原代細胞培養物中的細胞使某些細胞，如腸或角膜細胞的增殖得以延續。已知所述的SV40大T抗原能有效地滅活在細胞周期進程中起關鍵作用的蛋白，特別是p53和成視網膜細胞瘤蛋白(pRb)。但是，盡管這種癌基因在人原代細胞中的過表達可在有限的細胞分裂數量中延續所述細胞的增殖，但所述細胞最終在被稱作＂臨界＂的階段停止分裂。在這一階段中，正常情況下出現在第10代到20代，仍保持活力的細胞處于稱作“衰老”的狀態或簡單死亡。在極少的情況下，一些細胞可逃過這一階段重新開始增殖。據認為這種開始從頭增殖的能力是由于在這些細胞中發生的外來事件所產生的基因組重組造成的。但是，這些重要的基因組修飾通常導致所述的細胞喪失其所源于的原代細胞的最初的特性。
因此，本發明所基于的問題在于提供一種工具，用于進一步確定影響骨形成的物質及其對骨新陳代謝的多種效果。
這些問題已通過提供新的來源于骨的骨膜層且具有分化成成骨細胞的無限增殖化前成骨細胞系得以解決。
在導致本發明的實驗中，發明人用含有編碼SV40大T抗原DNA序列的構建體轉染由健康的成年人骨膜獲得的原代成骨細胞前體細胞。通過堿性磷酸酶活性，特異標記，如成骨細胞特異性因子-1(OSF 1或Cbfa-1)，骨橋蛋白和骨鈣蛋白，以及形成礦化節結的能力確定，這樣獲得的細胞(稱作hPOB細胞)與和原代成骨細胞基本一致的表型的細胞一樣，能分化成成骨細胞。然而，可以預見，那些細胞僅有有限延續的壽命，然后即進入臨界使細胞周期停滯在G1階段。
用帶有端粒酶反轉錄酶基因的構建體轉染這些細胞(Bodnar，A.G.，et al.，Extension of life-span by introduction oftelomerase into normal human cells.Science，1998.279(5349)p.349-52)。在進一步傳代稱作hPOB-tert的轉染細胞時，發現它們不進入臨界，而是繼續增殖。因此，用帶有端粒酶基因的構建體轉染前無限增殖細胞可獲得真正的無限增殖化細胞系，在其中沒有發生基因組重組。由于所述的細胞基本上沒有改變其基因組結構，基因的轉錄和表達基本上與原代培養物細胞相一致。
本發明的細胞系能能在培養物中培養至少60，優選80，甚至更優選至少100代。具體地說，本發明的細胞系是真正無限增殖的，并在需要時可進行離體培養。它們可從任意來源，特別是從哺乳動物例如，人制備，由此獲得來自骨膜層的前成骨細胞。在優選的實施方案中，所述的細胞系是依照布達佩斯條約于2000年10月25日保藏在巴斯德研究所的細胞系，其登記號為CNCM I-2573。
另外，令人驚訝的是其基本上保持了原代培養細胞的表型，具體說來，由骨膜衍生的本發明的細胞能分化成成骨細胞，所述細胞負責這一區域的骨質形成。這一特征與研究骨形成和骨修復演變非常相關。
與衍生該細胞原代細胞培養物中的細胞相比，本發明的前成骨細胞細胞系也表現出基本上同一的表型。具體說來，它們表現出堿性磷酸酶活性，表達特異標記，例如成骨細胞特異性因子-1(OSF-1或Cbfa-1)、骨橋蛋白和骨鈣蛋白等等，和形成礦化節結的能力，其與在原代培養的細胞中發現的基本上沒有差異。
利用下述分化的試劑，例如地塞米松和維生素D3的混合物刺激本發明的前成骨細胞細胞系，使其分化成成骨細胞，所得的成骨細胞也顯示出與直接從供體獲的成骨細胞基本相同的分化標記。在這方面已表明通過誘導分化，與衍生所述細胞的細胞相比，來自本發明細胞系的成骨細胞的堿性磷酸酶的水平、特異標記，如成骨細胞特異性因子-1(OSF-1或Cbfa-1)，骨橋蛋白和骨鈣蛋白，以及形成礦化節結的能力基本上沒有變化。
總之，與衍生所述細胞的原代培養細胞相比，本發明的細胞系表現出基本上同一的形態學模式，并能夠分化成成骨細胞。因此，可以斷定由于前無限增殖化和端粒酶表達的結合應用，所述細胞的基因組組成得以維持。
本發明的細胞系可按照下述方法獲得，該方法包括下述步驟(a)從適當的來源中分離前成骨細胞，(b)用帶有解偶聯(uncoupling)正常細胞周期的基因的構建體轉染該細胞(c)選擇性地從培養物中分離轉染細胞，(d)用使得端粒酶反轉錄酶基因表達的構建體轉染由步驟(b)或(c)獲得的細胞；和(e)篩選步驟(d)的細胞以獲得其中整合了兩個基因的細胞。
在第一步驟(步驟(a))中從個體的骨膜中分離前成骨細胞。將這些細胞轉移到培養物中，然后用帶有一種或多種能解偶聯正常細胞周期的基因的構建體轉染，由此延長原代細胞的壽命，所述的基因，如那些其產物能結合或滅活p53蛋白產物和成視網膜細胞瘤基因的基因。這可通過用重組載體穩定轉染細胞來實現，所述的載體如，重組質粒，或其末端的DNA序列與細胞基因組內源DNA序列同源的線性DNA片段。這一技術允許含有所述構建體的線性DNA整合到宿主的染色體中，同時有利于其轉染祖細胞。另外，也可以用重組病毒，如帶有SV40病毒(猿猴病毒)大T抗原基因或HPV病毒(人乳頭狀瘤病毒)E6/E7基因的病毒感染所述的細胞。
從經過上述處理的細胞中篩選帶有所述構建體的細胞，這可通過對細胞培養物進行幾次傳代培養來進行。在其中已引入了所述構建體的細胞，將表現出壽命延長并繼續在培養物中增殖，而非感染細胞則停止生長。另外，也可在構建體中包含選擇標記，根據所述標記的存在來篩選被轉染的細胞。
經選擇的細胞再用一種構建體感染，在這一構建體中所包含的端粒酶基因可以表達。這可通過與上述相同的方法實現，即利用重組體載體，依賴于同源重組現象的線性DNA片段或通過重組的反轉錄病毒感染所述細胞，上述的各種DNA片段中均帶有所述的端粒酶基因。除編碼端粒酶的基因外，所述構建體中還包含控制基因轉錄的調節序列，所述基因與所述的調節序列可操作地連接。作為這樣一種調節序列，可設想使用控制鄰近DNA序列轉錄的啟動子序列。
從所獲得的細胞中篩選包含通過前述的方法步驟引入的兩種基因的無限增殖化細胞，例如，可通過稀釋所述的細胞評估在不同的細胞培養物中是否出現了臨界。此外，也可以通過分析細胞自身的基因組物質來判斷其中是否存在不同的構建體，即從所述細胞中分離DNA確定是否存在被引入的基因，這可通過如，PCR技術等實現。
因此，依照本發明的一個優選實施方案涉及用這樣的細胞系進行實驗尋找可用于影響從前成骨細胞到成骨細胞的衍化的物質。在更多的優選實施方案中，本發明的細胞系用于尋找直接指導由前成骨細胞向成骨細胞分化的物質的實驗中。這在下述的情況下特別有用，即當個體的骨中需要更多的成骨細胞存在以改善自身的骨形成或輔助骨質形成或骨修復的情況。另外，由于前成骨細胞和分別地存在于骨膜中參與骨結構化事件，例如，在內層的骨質分解的過程中，在該骨的外圍同時有潛在的骨形成，本發明的細胞系還非常適合于尋找能通過在骨膜中特異地活化骨形成從而延長乃至防止骨質疏松癥發作的物質。
在附圖中，
圖1顯示用直接針對人SV40T抗原的單克隆抗體對hPOB細胞進行免疫染色；用特異于人SV40T抗原的一級抗體通過免疫熒光法對融合細胞進行染色；圖2顯示在hPOB和hPOB-tert細胞中的端粒酶活性；道1是在對照條件下的端粒酶活性，即沒有細胞存在的條件下；道2和道3在兩不同代數的hPOB細胞中的端粒酶活性；道4到10是在不同代數的hPOB-tert細胞中的端粒酶活性。
圖3顯示在hPOB和hPOB tert細胞分化期間堿性磷酸酶活性的調節作用；在融合前(第1天)，和在融合到hPOB細胞(A)和hPOB-tert細胞(B)后的第2、4、6和第9天，無效應物存在下(○)、在10nM地塞米松(DELTA)、10nM維生素D(●)存在下，或兩效應物均存在下(■)分別測定堿性磷酸酶活性。所示數據為至少三次實驗的平均±標準誤差(SEM)。不同于未處理的細胞統計數值用*(p＜0.05)；**(p＜0.01)表示。
圖4顯示在hPOB和hPOB tert細胞中Cbfa-1表達的調節；從無效應物存在、或有10nM地塞米松、或10nM維生素D，或兩效應物均存在的條件下培養了6天的hPOB(A)和hPOB-tert細胞(B)制備RNA。并行地通過半定量RT-PCR分析Cbfa-1和肌動蛋白RNA表達。對獲得的信號進行定量，以肌動蛋白作為內在的標準。所示數據為至少三次實驗的平均±標準誤差(SEM)。不同于未處理細胞的統計數值用*(p＜0.05)表示。
圖5顯示在hPOB和hPOB-tert細胞中骨粘連蛋白表達的調節；從無效應物存在、或有10nM地塞米松、或10nM維生素D，或兩效應物均存在的條件下培養了6天的hPOB(A)和hPOB-tert細胞(B)制備RNA。并行地通過半定量RT-PCR分析骨粘連蛋白和肌動蛋白RNA表達。對獲得的信號進行定量，以肌動蛋白作為內在的標準。所示數據為至少三次實驗的平均±標準誤差(SEM)。不同于未處理細胞的統計數值用*(p＜0.05)；**(p＜0.01)表示。
圖6顯示在hPOB和hPOB-tert細胞中骨鈣蛋白表達的調節；從無效應物存在、或有10nM地塞米松、或10nM維生素D，或兩效應物均存在的條件下培養了6天的hPOB(A)和hPOB-tert細胞(B)制備RNA。并行地通過半定量RT-PCR分析骨鈣蛋白和肌動蛋白RNA表達。對獲得的信號進行定量，以肌動蛋白作為內在的標準。所示數據為至少三次實驗的平均±標準誤差(SEM)。不同于未處理細胞的統計數值用*(p＜0.05)；**(p＜0.01)表示。
圖7顯示hPOB和hPOB-tert細胞對細胞外基質的礦化；在10nM地塞米松和10nM維生素D存在下培養hPOB(A)和hPOB-tert(B)細胞；在第21天，如材料和方法部分所述，將細胞固定并用Alzarin-紅染色。
下述給出的實施例是本著示意性的目的，而非試圖對本發明做任何形式的限制。
材料和方法材料細胞培養物質、培養基和胎牛(FBS)血清購自Gibco BRL(Basel；Switzerland)。Alizarin Red S和維生素D3、1α，25-二羥基(1α，25-dihydroxy)分別購自Sigma(Buchs；Switzerland)和Calbiochem(Lucerne；Switzerland)。抗壞血酸和β-甘油磷酸鹽購自Merk(Switzerland)。
實施例1逆轉錄病毒載體的制備和擴增以標準重組DNA技術，通過插入帶有組氨醇基因作為選擇標記的pLHXSD反轉錄病毒載體(Stockschlaeder等Hum Gene Ther.2(1991)，33-39)的BamHI位點，構建帶有猿猴病毒(SV40-T抗原)大T抗原基因、或人端粒酶反轉錄酶(hTERT；有由CAMBIA，Canberra，Autralia提供)的重組反轉錄病毒載體。
感染重組病毒顆粒是通過下述方式產生的，即將重組反轉錄病毒載體轉染到兼性包裝細胞系Phoenix(Clontech)中，然后與由ATCC獲得的親嗜性包裝細胞系、Psi2共培養進行“乒乓”感染以產生高滴度的病毒(Lynch C，Miller D.1991).將帶有不同宿主范圍外殼的包裝細胞混合培養以產生高輔助病毒-游離逆轉錄病毒載體(J.Virol.653887-3890)。
實施例2制備和感染人成骨細胞前體通過下述方式制備來自13歲的女性患者股骨骨膜的細胞，在添加了10％FBS的Opti MEM(Gibco BRL；Basel；Switzerland)中，在95％空氣/5％CO2、37℃下將preriosteal組織碎片培養物培養3星期。在融合中使細胞胰蛋白酶化并將其置于25cm2燒瓶中。在70-80％融合度，在20μg/ml DEAE右旋糖酐存在下使所述細胞在37℃(90％濕度)條件下與如實施例1所述制備的含SV40T抗原重組病毒共同溫育3小時。感染后，用添加了10％FBS和青霉素/鏈霉抗生物素蛋白的α-MEM替換所述的培養基。3到4代后非感染的原代細胞停止生長，而來自感染庫的細胞繼續生長直到第12-15代。將這些表達SV40T抗原的細胞命名為hPOB。
如上所述，在第9代hPOB細胞被帶有hTERT基因的重組病毒感染。這些細胞稱作hPOBtert。
實施例3hPOBtert的培養和分化在添加有10％FCS和青霉素/鏈霉抗生物素蛋白的αMEM中培養經感染的細胞。這一培養基稱作基礎培養基。為進行分化，將細胞以12000細胞/cm2的密度接種到膠原I(30μg/ml；牛皮-I型膠原；RocheBiomedical；Basel；Switzerland)包被的平皿的基礎培養基中。在添加了1mMβ-甘油磷酸鹽和添加了10nM地塞米松或10nM維生素D3(vitD)的50μg/ml抗壞血酸的基礎培養基中將融合細胞培養2到21天。
在感染細胞培養的第0天和在不同的分化條件下融合21天后追蹤礦化基質的形成。在用冰冷的70％乙醇共同溫育固定細胞1小時后，用Alzarin紅色-S比色反應對礦化基質進行染色。
實施例4堿性磷酸酶活性測定在第0，2，4，6和9天收獲在不同分化條件下培養的hPOBtert細胞，在含10mM Tris(pH7.5)，0.5mM MgCl2和0.1％100X Triton的裂解緩沖液中融合和勻漿。用可商購的試劑盒(Sigma)測定細胞勻漿的堿性磷酸酶(ALP)活性，將所得的結果校正為如Bradford測定法所測定的總蛋白含量。
實施例5SV40-T抗原蛋白質在hPOB細胞中的免疫檢測hPOB細胞以90％融合度在八-孔小室載玻片上用Hanks鹽緩沖液(HBSS)浸濕在至少-20℃下與冰冷的甲醇/丙酮混合物(v/v)一起固定30min。固定的細胞在室溫下與直接針對SV40-T抗原(1/30稀釋)的小鼠單克隆抗體一起，在添加了1％牛血清白蛋白(BSA)且含有0.05 M Tris pH8.6，1.8％NaCl和0.2％聚乙二醇的緩沖液(TNP緩沖液)中溫育1小時。用TNP緩沖液洗滌3次后，所述細胞在室溫下、黑暗中與添加了1％BSA的TNP緩沖液和熒光素-結合的抗鼠IgG抗體(1/250稀釋)一起溫育1小時。用熒光顯微鏡(Zeiss)觀察細胞核。
實施例6RNA的制備和RT-PCR表達分析融合后第6天，在分化條件下培養的細胞用HBSS洗，然后貯存于-80℃，直至用RNeasy總RNA純化系統(Qiagen AG，Basle，Switzerland)抽提RNA。
加入10μg總RNA，用RT-PCR(AMV；Roche Biomedical，Basle，CH)第一鏈cDNA合成試劑盒，oligod(T)15作為引物進行反轉錄。用Mycrosynth(Windisch，CH)合成用于擴增有用的cDNA的引物。
正向和反向引物分別是5’-GTTGCTATCCAGGCTGTG-3’和5’-CATAGTCCGCCTAGAAAGC-3’用于肌動蛋白基因5’-ATGAGAGCCCTCACACTCCT-3’和5’-GATGTGGTCAGCCAACTCGT-3’用于骨鈣蛋白基因5’-AGAGGTGGTGGAAGAAACTG-3’和5’-GCTTCTGCTTCTCAGTCAGA-3’用于骨粘連蛋白5’-CAGTGATTTAGGGCGCATTC-3’和5’-GAAATGCGCCTAGGCACATC-3’用于Cbfa-1基因。
所述的PCR反應的頭兩個循環為98℃1min，60℃min和72℃2min，然后是按下述條件的28個循環94℃2下變性1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，以上反應在DNA熱循環儀(Bioconcept，Allschwill，Switzerland)中進行。反應中的肌動蛋白引物作為內部對照。在2％瓊脂糖凝膠上分離PCR產物(10μl)，用溴化乙錠染色觀察結果。用密度計NIH圖像程序量化PCR產物。
實施例7TRAP試驗如前所述用細胞抽提物進行端粒酶重復擴增方案(TRAP)試驗(Kimet al.，Science 266(1994)，2011-2015)。將106個細胞在200μl裂解緩沖液(10mM tris-HCl，pH7.5，1mM MgCl2，1mM EGTA，0.5％CHAPS，10％甘油)中裂解。將所述的細胞裂解物在4℃下14000rpm離心20min。收集上清液，用Bradford蛋白質試驗(Biorad)確定蛋白的數量。將相當于50μg蛋白質的2μl細胞裂解物添加到48μl反應混合物中，該混合物含有下述成分5μlTRAP緩沖液10X(200mMtris-HCl，pH8.3，15mM MgCl2，10mM EGTA，680mm KCl，0.5％Tween)，0.25μl 10mM dNTPs，1.8μl 50ng/μl引物M2，1.8μl50ng/μl引物CX和0.4μl 5U/μl taq聚合酶。引物序列為5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’對于引物M2，和5’-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3’用于引物CX在PCR反應開始前，端粒酶反應在室溫下進行30min，所述的PCR反應為94℃ 2min進行1個循環，然后依下述條件進行30個循環，即在94℃變性10sec，50℃退火25sec和72℃延伸30sec，此后再進行一個附加的循環94℃變性15sec，50℃退火25sec，72℃延伸1min，上述PCR反應均是在DNA熱循環儀中進行的。在10％丙烯酰胺凝膠中分離20μl PCR產物，然后通過SYBR綠色I凝膠染色(Molecular Probes)觀察結果。
實施例8核型分析半融合的培養物送到密歇根兒童醫院的細胞培養實驗室進行核型的分析。為進行染色體研究，將指數生長的培養物用0.04μg/ml的乙酰甲基秋水仙堿處理1-2小時，胰蛋白酶化并用0.0375M KCl處理9min，再用3∶1甲醇∶冰醋酸混合物固定。所述的懸浮液用定影液離心洗滌兩次，最后如前所述滴到冷的濕玻片上(Peterson，W.D.Jr.etal，Methods in Enzymology 58；164-178，1979)。將玻片空氣干燥再用4％ giemsa溶液染色。Giemsa染色后的玻片用于倍性分配、和計數和組成型畸變研究。對于胰蛋白酶化的Giemsa帶(GTG)，用改進的Seabright方法制備核型(Seabright，M.A，Lancet；971-972，1971)(2).將所述的玻片在載物片加溫器上于60℃下老化16-20小時，浸沒于0.025％胰蛋白酶中1-2sec，用Giemsa溶液染色11min，在緩沖液中清洗、干燥后插在permount中。用AKSII圖象分析系統對結合好的中期片進行核型分析。
由這些印片制備7核型最低值并按照標準人核型編排。按照標準命名描述所述的核型(ISCN An international System for HumanCytogenetic Nomenclature，Mitelman F.(ed.)BasleKarger，1995)。
更為詳細地研究了兩個染色體標記。顯示出與hPOB細胞突出相關的染色體11和15，現在顯示出在hPOB-tert細胞中已建立的標記。其同工酶表型模式與h-POB細胞一致。這些發現確定了hPOB-tert細胞確實是由hPOB細胞衍生而來。在培養物中沒有檢測到除hPOB-tert(第39代)細胞系之外的細胞。
序列表<110>雀巢制品公司<120>無限增殖化的前成骨細胞<130>80281<140><141><160>8<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>18<212>DNA<21>人<400>1gttgctatcc aggctgtg 18<210>2<211>19<212>DNA<213>人<400>2catagtccgc ctagaaagc 19<210>3<211>20<212>DNA<213>人<400>3atgagagccc tcacactcct 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人<400>4gatgtggtca gccaactcgt 20<210>5<211>20<212>DNA<213>人<400>5agaggtggtg gaagaaactg 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人<400>6gcttctgctt ctcagtcaga 20<210>7<211>20<212>DNA<213>人<400>7cagtgattta gggcgcattc 20<210>8<211>20<212>DNA<213>人<400>8gaaatgcgcc taggcacatc 20
權利要求
1.一種由骨膜(peritoneum of the bone)衍生的無限增殖化前成骨細胞細胞系，其表達至少一種基因，解偶聯正常細胞周期，包含能使端粒酶基因表達的構建體，并能分化為成骨細胞。
2.如權利要求1所述的無限增殖化細胞系，其具有堿性磷酸酶活性，使成骨細胞特異因子-1(OSF-1或Cbfa-1)、骨橋蛋白和骨鈣蛋白表達，并具有與其所衍生自的原代培養物的前-成骨細胞基本一致的形成礦化節結的能力。
3.如權利要求1或2所述的無限增殖化細胞系，其中，所述的解偶聯正常細胞循環的構建體和可使端粒酶基因表達的構建體包含于染色體上。
4.如前述任意一項權利要求所述的無限增殖化細胞系，該細胞系來源于人。
5.如權利要求4所述的無限增殖化細胞系，該細胞系是CNCM I-2573。
6.一種制備無限增殖化細胞系的方法，該方法包括下述步驟(a)從骨膜中分離前成骨細胞，(b)向所述細胞中引入帶有某種基因的構建體，所述的基因的產物解偶聯正常細胞周期，(c)選擇性地從培養物中分離轉染細胞，(d)用指導端粒酶基因表達的構建體轉染由步驟(b)或(c)獲得的細胞；和(e)篩選步驟(d)的細胞以獲得其中整合了兩種構建體的細胞。
7.如權利要求6所述的方法，其中，至少一個構建體在載體上。
8.如權利要求6所述的方法，其中，用于步驟(b)和(d)的至少一個構建體整合到細胞的染色體中。
9.如權利要求6-8中任意一項所述的方法，其中，所述的影響解偶聯正常細胞周期的構建體包含編碼SV40大T抗原的基因。
10.權利要求1到5中任意一項所述的細胞系在檢測控制由前成骨細胞向成骨細胞的分化的物質的分析中的用途。
11.權利要求1到5中任意一項所述的細胞系在檢測能改善骨形成、保持骨質、骨修復和防止引起骨質疏松癥的物質的分析中的用途。
全文摘要
本發明涉及新的骨膜衍生的無限增殖化前成骨細胞細胞系，其能夠分化為成骨細胞。具體地說，本發明是在試驗中利用這樣的細胞系檢測由骨膜衍生的控制前成骨細胞向成骨細胞分化的物質，以及檢測能夠改善骨形成、保持骨質、進行骨修復和防止發生骨質疏松癥的物質。
文檔編號C07K14/47GK1471576SQ01818136
公開日2004年1月28日 申請日期2001年10月26日 優先權日2000年10月27日
發明者E·奧福德卡文, C·德里蒙特-尼科勞, C·梅斯, E 奧福德卡文, 錈商 尼科勞 申請人:雀巢制品公司