腫瘤特異性啟動子的制作方法

專利名稱：腫瘤特異性啟動子的制作方法
技術領域：
本發明涉及腫瘤特異性啟動子，其能使外源基因以腫瘤特異性的方式在腫瘤細胞或腫瘤組織中表達。更具體而言，本發明涉及腫瘤特異性啟動子，其以腫瘤特異性的方式在腫瘤細胞或腫瘤組織中有較高的轉錄活性，并且其可以廣泛應用于癌癥的基因治療，例如包含藥物代謝酶的編碼基因和癌癥治療前藥的自殺基因治療、通過將細胞因子基因引入到癌癥細胞并因此通過加強身體的免疫學功能而治療癌癥的免疫基因治療、以及利用只殺死腫瘤細胞的溶瘤病毒的癌癥基因治療等。
背景技術：
關于癌癥治療，近幾年的許多注意力都放在癌癥的基因治療上，其中將外源基因引入到細胞以治療癌癥。癌癥的基因治療包括靶向癌基因和/或腫瘤抑制基因的基因治療(其中癌基因的作用被抑制或變性的腫瘤抑制基因被重新激活)；自殺基因治療(其中將人類細胞中本來不存在的藥物代謝酶基因引入到腫瘤細胞中，然后給予該酶激活的癌癥治療的前藥來只殺死引入藥物代謝酶基因的細胞)；免疫學基因治療(其中將細胞因子基因等引入到細胞以增強人體的免疫學功能并因此來治療癌癥)；將腫瘤特異性啟動子插入到腺病毒E1A或E1B基因(其為病毒早期基因并且是腺病毒增殖所必須的)的上游以構建溶瘤病毒(其特異性在整合的腫瘤細胞中增殖，腫瘤細胞被該病毒特異性的殺死)的基因治療等。
在此類基因治療中，目的基因在腫瘤細胞或腫瘤組織中的特異性表達對基因治療的效率和安全性有著重要的意義，也是目前基因治療所遇到的挑戰之一。為了能進行該腫瘤特異性基因表達，開發能調節引入的基因以腫瘤特異性方式表達的啟動子非常重要。
作為腫瘤特異性啟動子，已知的有α-胎蛋白啟動子、癌胚抗原(CEA)啟動子、前列腺特異性抗原啟動子等。但是，這些啟動子由于其能應用的范圍有限和啟動子的活性不高而缺乏適應性。因此用這些啟動子的基因治療的應用范圍非常有限。
另一方面，從畸胎瘤細胞中發現了新的視黃酸效應生長/分化因子腎細胞因子(midkine)(一種肝素結合蛋白質)，其基因已經被克隆(Kodomatsu，K.等，Biochem.Biophys.Res.Commun，1511312-1318，1988)。盡管該蛋白質的生物學功能還未完全闡明，但是其在多種人胃腸癌癥(結腸癌、胰腺癌、肝癌等)、肺癌、乳腺癌、成神經細胞瘤、腦瘤等中表達頻率和表達水平較高(Tsutui，J.等，Cancer Res.，531281-1285，1993；Aridome，K.等，Jpn.J.CancerRes.，86655-661，1995；Muramatsu，H.等，J.Biochem.，1191171-1175，1996；O’Brien，T.等，Cancer Res.，562515-2518，1996)。
c-erbB-2(HER2/neu)屬于EGF受體家族并具有酪氨酸激酶活性。盡管該基因在正常上皮細胞中表達較少，但其在乳腺癌和其它癌癥例如食管癌、胃癌和卵巢癌中高度表達(Slamon，DJ等，Science，244707-712，1989；Hynes，NE等，Biochim.Biophys.Acta，1198165-184，1994)。另外，據報道其在乳腺癌中的高表達與對抗癌劑的抗性有關，并且因此是導致預后不良的因素(Hynes，NE等，Biochim.Biophys.Acta，1198165-184，1994)。
也對腎細胞因子基因和c-erbB-2基因的啟動子區進行了廣泛的研究。
因此，已經證明腎細胞因子基因的5’末端上游區的2.3kb可用作在腫瘤細胞中誘導基因的轉錄活性的啟動子，并可用作自殺基因治療的啟動子，其中聯合使用了單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)(藥物代謝酶基因)以及丙氧鳥苷(gancyclovir)(癌癥治療的前藥)(Miyauchi，M.等，Jpn，J.Cancer Res.，90469-475，1999；Adachi，Y.等，Mol.Ther.，1s238，2000)。但是，腎細胞因子基因的5’末端上游區的2.3kb的腫瘤特異性和啟動子活性不夠高。
盡管也已經分析了c-erbB-2基因的啟動子區，但是以前的研究所用的動物種類不是人，腫瘤細胞不是乳腺癌，因此，最小啟動子區的鑒定不同的報道(Ishii，S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，844374-4378，1987；Hudson，LG等，J.Biol.Chem.，2654389-4393，1990；Hollywood，DP等，EMBO J.，122369-2375，1993；Scott，GK等，J.Biol.Chem.，26919848-19858，1994；Benz，CC等，Oncogene，151513-1525，1997；Grooteclaes，M等，Cancer Res.，592527-2531，1999)是不同的。但是也有許多報道描述到當將NCBIGeneBank登記的c-erbB-2啟動子基因(登錄No.J 05264)的1259位的堿基作為轉錄起始點+1時，啟動子活性定位在-700bp(-662/+38)區或-553bp(-495/+38)區，并且確定活性基本位于該范圍。也有報道描述啟動子活性位于-213/+38區或-87/+38區，但是沒有研究其腫瘤特異性，通常的c-erbB-2基因的啟動子區(而不是腫瘤特異區)只在腫瘤細胞上進行了測試。事實上，所有以前的使用c-erbB-2啟動子來表達自殺基因的報道使用的都是533bp(-465/+38)或含有533bp的更長的區(Harris，JD等，Gene，Ther.，1170-175，1994；Ring，CTA等，Gene，Ther.，31094-1103，1996；Takakuwa，K.等，Jpn.J.Cancer Res.，88166-175，1997；Pandha，HS等，J.Clin.Oncol.，172180-2189，1999)。另外，也有報道說c-erbB-2基因的257bp(-256/+1)區具有特異性針對癌癥的啟動子活性(Japan Societyof Gene Therapy，Abstract，issued on July 18，1999，Page 98；Japan Society of Gene Therapy，Abstract，issued on July 28，2000，Page65)。但是，該區也不具有充分高的腫瘤特異性或高啟動子活性。
因此，有必要開發腫瘤特異的啟動子，其具有充分高的腫瘤特異性和高啟動子活性，并能夠有效的用于基因治療。

發明內容
在為了獲得具有充分高的腫瘤特異性和啟動子活性的腫瘤特異的啟動子的透徹和廣泛的研究之后，本發明人發現使用位于腎細胞因子基因的5’末端上游區的2.3kb內的特異部分序列作為啟動子或使用c-erbB-2基因的調節區的特異部分序列作為啟動子可以獲得具有充分高的腫瘤特異性和啟動子活性的腫瘤特異的啟動子，其能夠有效的用于基因治療，并因此完成本發明。
因此，本發明是腫瘤特異性啟動子，其具有序列表中SEQ ID NO1所示的堿基序列中從1-539位的任何堿基至609位堿基的堿基序列或者SEQ ID NO9所示的堿基序列中從1-127位的任何堿基至251位堿基的堿基序列。
另外本發明是腫瘤特異性啟動子，其可在嚴謹條件下與序列表中SEQ ID NO1所示的堿基序列中從1-539位的任何堿基至609位堿基的堿基序列或者SEQ ID NO9所示的堿基序列中從1-127位的任何堿基至251位堿基的堿基序列雜交，并具有與所述的堿基序列相似的啟動子功能。
另外本發明是上述腫瘤特異性啟動子通過表達腫瘤特異基因用于癌癥基因治療。
另外本發明是上述腫瘤特異性啟動子用于自殺基因治療，其聯合使用了其中編碼藥物代謝酶的基因已經被連接在腫瘤特異性啟動子的下游的載體和可被所述的藥物代謝酶轉化為活性形式的癌癥治療的前藥。
另外本發明是上述腫瘤特異性啟動子通過各種溶瘤病毒用于癌癥基因治療，其中使用腫瘤特異性啟動子改變了病毒基因的表達，所以病毒可特異性地在腫瘤細胞或腫瘤組織中增殖。
附圖簡述

圖1是基于CAT分析確定從腎細胞因子基因獲得的啟動子的啟動子活性的測量結果圖。
圖2A是正常人成纖維細胞MRC-5(其中含有從腎細胞因子基因獲得的啟動子的基因與TK基因連接并被引入)和其親系細胞對丙氧鳥苷的體外敏感性的測量結果圖。
圖2B是永生化人成纖維細胞MRC-5(其中含有從腎細胞因子基因獲得的啟動子的基因與TK基因連接并被引入)和其親系細胞對丙氧鳥苷的體外敏感性的測量結果圖。
圖3A是肺癌細胞QG-56(其中含有從腎細胞因子基因獲得的啟動子的基因與TK基因連接并被引入)和其親系細胞對丙氧鳥苷的體外敏感性的測量結果圖。
圖3B是成神經細胞瘤NGP細胞(其中含有從腎細胞因子基因獲得的啟動子的基因與TK基因連接并被引入)和其親系細胞對丙氧鳥苷的體外敏感性的測量結果圖。
圖3C是正常成纖維細胞HEF(其中含有從腎細胞因子基因獲得的啟動子的基因與TK基因連接并被引入)和其親系細胞對丙氧鳥苷的體外敏感性的測量結果圖。
圖4A是肺癌細胞QG-56(其中含有從腎細胞因子基因獲得的啟動子的基因與TK基因連接并被引入)和其親系細胞對丙氧鳥苷的體內敏感性的測量結果圖。
圖4B是肺癌細胞QG-56(其中含有從腎細胞因子基因獲得的啟動子的基因與TK基因連接并被引入)和其親系細胞對生理鹽水注射的體內敏感性的測量結果圖。
圖5是測試p53腫瘤抑制基因對從腎細胞因子基因獲得的0.6kb的基因組片段的啟動子活性的影響測量結果圖。
圖6是基于螢光素酶分析確定從腎細胞因子基因獲得的啟動子的啟動子活性的測量結果圖(其中SV40啟動子(pGL-Control)的啟動子活性定為100％)。
圖7A是基于螢光素酶分析確定從人c-erbB-2基因獲得的啟動子的啟動子活性的測量結果圖。所用的細胞都是人乳腺癌細胞，SV40啟動子(pGL-Control)的啟動子活性定為100％。
圖7B是基于螢光素酶分析確定從人c-erbB-2基因獲得的啟動子的啟動子活性的測量結果圖。所用的細胞都是人正常成纖維細胞，SV40啟動子(pGL-Control)的啟動子活性定為100％。
圖7C是基于螢光素酶分析確定從人c-erbB-2基因獲得的啟動子的啟動子活性的測量結果圖。所用的細胞是人惡性黑色素瘤細胞和人肺癌細胞，SV40啟動子(pGL-Control)的啟動子活性定為100％。
圖8A是人乳腺癌細胞MCF-7(其中含有從人c-erbB-2基因獲得的啟動子的基因或巨細胞病毒啟動子與或未與TK基因連接并被引入)和其親系細胞對丙氧鳥苷的體外敏感性的測量結果圖。在丙氧鳥苷濃度為0時的存活率設為100％。
圖8B是人惡性黑色素瘤細胞A875(其中含有從人c-erbB-2基因獲得的啟動子的基因或巨細胞病毒啟動子與或未與TK基因連接并被引入)和其親系細胞對丙氧鳥苷的體外敏感性的測量結果圖。在丙氧鳥苷濃度為0時的存活率設為100％。
圖9是人乳腺癌細胞MCF-7(其中引入了含有從人c-erbB-2基因獲得的啟動子的基因)和其親系細胞對丙氧鳥苷或對生理鹽水的體內敏感性的測量結果圖。
完成本發明的最佳方式本發明的腫瘤特異性啟動子具有序列表中SEQ ID NO1所示的堿基序列中從1-539位的任何堿基至609位堿基的序列或者SEQ ID NO9所示的堿基序列中從1-127位的任何堿基至251位堿基的序列。本發明還包括腫瘤特異性啟動子，其可在嚴謹條件下與序列表中SEQ IDNO1所示的堿基序列中從1-539位的任何堿基至609位堿基的序列或者SEQ ID NO9所示的堿基序列中從1-127位的任何堿基至251位堿基的序列雜交、并具有與所述的堿基序列相似的啟動子功能。
SEQ ID NO1所示1-609位的堿基序列是從-559至+50的609bp的堿基序列，其中腎細胞因子基因的5’-框架區序列中的外顯子1的第一個堿基序列設為+1(Uehara，K.等，J Biochem.，111563-567，1992)。本發明腫瘤特異性啟動子包含SEQ ID NO1所示的堿基序列中從1-539位的任何堿基至609位堿基的序列。如下列所述的實施例所示，已闡明為發揮本發明腫瘤特異性啟動子的作用，該堿基序列必須至少包含SEQ ID NO1所示的堿基序列中3’末端區539-609位的堿基。因此，本發明腫瘤特異性啟動子包含SEQ ID NO1所示的堿基序列中從1-539位的任何堿基至609位堿基的堿基序列。當將腎細胞因子基因的5’-框架區的外顯子1的第一個堿基序列設為+1時，此處所用的SEQ ID NO1的位點1、539和609的堿基分別對應于位點-559、-21和+50的堿基。如SEQ ID NO1所示的堿基序列中從1-539位的任何堿基至609位堿基的堿基序列，優選位點1-609的堿基序列(SEQ ID NO1所示的堿基序列)、位點416-609的堿基序列(SEQ ID NO5所示的堿基序列)或位點275-609的堿基序列(SEQ ID NO4所示的堿基序列)。
另外，具有SEQ ID NO9所示的堿基序列中從1-127位的任何堿基至251位堿基的堿基序列也是本發明的腫瘤特異性啟動子。如下列所述的實施例所示，已闡明為發揮本發明腫瘤特異性啟動子的作用，該堿基序列必須至少包含SEQ ID NO9所示的堿基序列中3’末端區127-251位的堿基。當將在NCB I GeneBank登記的c-erbB-2啟動子基因(登錄No.J05264)的1259位堿基定為轉錄起始點+1時，包含1-251位堿基的堿基序列對應于-213至+38位的堿基序列，SEQ ID NO9的127位堿基對應于-87位。
根據本發明，含有能在嚴謹條件下與任何上述堿基序列雜交、并具有與上述的堿基序列相似的啟動子功能的堿基序列也是本發明的腫瘤特異性啟動子。此處所用的能在嚴謹條件下雜交的堿基序列是指能在反應條件(例如在含有6×SSC、2×Denhardt’s溶液、0.5％SDS和0.1mg/ml鮭精DNA溶液中65℃反應12小時)下通過Southern雜交與具有任何上述堿基序列的DNA雜交的堿基序列。本發明的腫瘤特異性啟動子是能在所述條件下雜交以及具有與被雜交的受試者堿基序列相似的啟動子功能(即相似程度的腫瘤特異性和相似程度的啟動子活性的)的堿基序列。對于此類堿基序列可涉及與受試者堿基序列具有65％或更高、優選75％或更高的同源性的堿基序列。
上述本發明的腫瘤特異性啟動子可基于已經報導的腎細胞因子基因或c-erbB-2基因的序列信息利用已知的方法如PCR方法獲得。本領域技術人員可根據基礎教科書如Molecular Cloning 2nd Edt.，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)容易的實現這些方法。上述具有能在上述嚴謹條件下雜交的堿基序列的本發明的腫瘤特異性啟動子可通過定點突變、PCR方法或普通的雜交方法等容易的獲得，并能參考基礎教科書如上述Molecular Cloning明確地實現。
如下列實施例所述，具有SEQ ID NO1所示的堿基序列中從1-539位的任何堿基至609位堿基的堿基序列的本發明的腫瘤特異性啟動子，與位于腎細胞因子基因5’-末端上游區、含有本發明的啟動子的堿基序列的較長的2.3kb和1.0kb的啟動子相比，具有非常高的腫瘤特異性和非常高的啟動子活性。另外，本發明的腫瘤特異性啟動子具有如下特性由于其受到p53腫瘤抑制基因的影響(所述的p53基因在正常細胞中功能正常)，本發明的腫瘤特異性啟動子不起作用，而隨著致瘤性轉化的發展p53基因的功能消失，本發明的腫瘤特異性啟動子起作用。具有SEQ ID NO9所示的上述堿基序列中從1-127位的任何堿基至251位堿基的堿基序列的本發明的腫瘤特異性啟動子，與含有該堿基序列的c-erbB-2基因的較長的啟動子區相比，也具有非常高的腫瘤特異性(特別是對乳腺癌)和非常高的啟動子活性。
本發明的腫瘤特異性啟動子可通過基因的腫瘤特異性表達用于基因治療，例如自殺基因治療(其聯合使用編碼藥物代謝酶的基因和癌癥治療的前藥)、免疫學基因治療(其通過將細胞因子基因等引入腫瘤細胞并由此增強免疫學功能來治療癌癥)等。
對于自殺基因治療，涉及的編碼藥物代謝酶的基因和癌癥治療的前藥的組合情況有單純皰疹病毒的胸苷激酶基因和丙氧鳥苷或無環鳥苷、胞嘧啶脫氨酶基因和5-氟胞嘧啶、水痘-帶狀皰疹病毒的胸苷激酶基因和6-甲氧基嘌呤阿糖苷、E.coli gpt基因和6-噻噸(thioxanthine)、細胞色素P450 2B1基因和環磷酰胺、人脫氧胞苷激酶基因和胞嘧啶阿糖苷、E.coli UPRT基因和5-氟脲嘧啶或E.colideoD基因和6-甲基嘌呤-2’-脫氧核苷等。為了實際進行自殺基因治療，構建表達載體(其中以能夠表達的方式整合了本發明的腫瘤特異性啟動子以及在其下游整合了藥物代謝酶基因)，將該表達載體引入腫瘤細胞，然后給予癌癥基因治療的前藥以產生抗腫瘤效果。對于載體，常用于基因引入的有逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體等。另外，質粒DNA(其中以能夠表達的方式整合了本發明的腫瘤特異性啟動子以及在其下游整合了編碼藥物代謝酶的基因)脂質體或與包被的脂質體或多聚賴氨酸-DNA-蛋白質復合物一起被引入到腫瘤細胞。為了引入基因，可將這些載體，脂質體包被的等靜脈內或動脈內或直接注射到腫瘤細胞內部或周圍。此時，通過結合電穿孔或超聲處理可增加基因引入的效率。基因引入后，通過常用方法例如口服、靜脈內和動脈內注射給予癌癥治療的前藥。
引入的基因通過本發明的腫瘤特異性啟動子轉錄，由此藥物代謝酶在腫瘤細胞中特異性的表達，在表達的藥物代謝酶的作用下，癌癥治療的前藥被轉化為活性治療劑，針對癌癥的該轉化的治療劑選擇性的殺死癌癥細胞，因此完成了自殺基因治療。
此類自殺性基因治療的基本過程是已知的，單純皰疹病毒的胸苷激酶基因和丙氧鳥苷的組合臨床上已經應用于腦部腫瘤等(Oldfield，E.H.，Hum.Gene Ther.，439-69，1993)，胞嘧啶脫氨酶基因和5-氟胞嘧啶的組合也被建議潛在的臨床應用于結腸癌等(Huber，B.E.等，Cancer Res.，534619-4626，1993)，在進行本發明的基因治療時可參考這些方法。
對于應用本發明的腫瘤特異性啟動子的免疫學基因治療，可以使用的方法是將編碼細胞因子如干擾素、TNF-α和白細胞介素的基因與本發明的腫瘤特異性啟動子一起整合(以與上述自殺基因治療類似的方法)到表達載體中，或者包封在脂質體中，引入到腫瘤細胞中表達細胞因子，由此增強人體生物學保護機制--免疫應答。
對于使用本發明的腫瘤特異性啟動子的通過溶瘤病毒的基因治療，可以使用的方法是將本發明的腫瘤特異性啟動子插入到E1A或E1B(其為腺病毒增殖必需的早期基因之一)的上游或用E1A或E1B啟動子取代，或者將本發明的腫瘤特異性啟動子插入到單純皰疹病毒相應的早期基因的上游或用早期基因啟動子取代來構建在腫瘤細胞或腫瘤組織中特異性增殖的溶瘤病毒，由此來殺死腫瘤細胞，施用該病毒來治療癌癥。對于該基因治療，可參考Heise，C.等，J.Clin.Invest.，105847-851，2000和其它文獻。
另外，使用本發明的腫瘤特異性啟動子可能特異地在腫瘤中表達癌基因的反義基因或未突變形式地腫瘤抑制基因，結果，其可能誘導脫癌作用(decarcinogenesis)(恢復正常)的程序性細胞死亡(凋亡)，并可增強腫瘤細胞對抗癌劑的敏感性和增強對放射的敏感性。
使用本發明的具有SEQ ID NO1所示的堿基序列中從1-539位的任何堿基至609位堿基的堿基序列的腫瘤特異性啟動子的基因治療對于胃腸道癌癥如結腸癌、胰腺癌和肝癌、肺癌、乳腺癌、成神經細胞瘤、腦瘤等的治療特別有效。使用本發明的具有上述SEQ ID NO9所示的堿基序列中從1-127位的任何堿基至251位堿基的堿基序列的腫瘤特異性啟動子的基因治療對于乳腺癌、食管癌、胃癌、卵巢癌等的治療也有效，對乳腺癌的治療特別有效。
將參考實施例對本發明進行詳細的說明，但應注意的是本發明決不受限于這些實施例。
實施例1從腎細胞因子基因中分離腫瘤特異性啟動子以下列方式獲得分析腎細胞因子轉錄控制區的載體系統。
用XhoI和NcoI或XhoI和Eco47III切割質粒phgMK2.3K/CAT(Pedraza，CR等，J.Biochem.，117845-859，1995)分別獲得含有1.0kb的腎細胞因子基因組基因的4.0kb的DNA片段和含有0.6kb的腎細胞因子基因組基因的3.4kb的DNA片段。利用DNA連接酶將這些片段制成環狀DNA。結果獲得分別含有2.3kb(MK2.3)的具有SEQ ID NO3所示的堿基序列的人腎細胞因子基因組基因、1.0kb(MK1.0)的具有SEQ ID NO2所示的堿基序列的人腎細胞因子基因組基因、0.6kb(MK0.6)的具有SEQ ID NO1所示的堿基序列的人腎細胞因子基因組基因并且在它們的下游連接了CAT(氯霉素乙酰轉移酶)基因的質粒。
實施例2測定來自腎細胞因子基因的腫瘤特異性啟動子的轉錄活性利用上述質粒、或具有SV40病毒啟動子的質粒pCAT-Control(Promega制造)以及不含有啟動子的pCAT-Basic質粒(Promega制造)，將基因引入在DMEM(Sigma)(補充10％胎牛血清)中培養的肺癌細胞QG-56、成神經細胞瘤NGP和正常人成纖維細胞MRC-5中。10μg每種質粒與脂質轉染試劑(Life Technologies)混合后，室溫放置30分鐘以形成復合物。然后將該復合物與去除胎牛血清的細胞接觸。8小時后加入補充了胎牛血清的培養基，培養40小時，然后用超聲破碎基因轉化的細胞。離心后，上清用于采取已知的CAT分析方法(Gorman，CM等，Mol.Cell.Biol.，2；1044-1051，1982)利用[14C]-氯霉素和乙酰CoA檢測其轉錄活性。此時，為標準化基因引入的效率，同時引入1μg的β-半乳糖苷酶基因(pCH110，Amersham制造)，并確定β-半乳糖苷酶的活性(Heromel，P.等，Cell，39653-662，1984)。結果如圖1所示。
如圖1所示的結果可以看出，腎細胞因子基因組基因的轉錄活性如下(a)使用MK0.6時，在腫瘤細胞中其轉錄活性比MK1.0或MK2.3強，但在正常細胞中其轉錄活性下降。
(b)使用MK0.6時，在腫瘤細胞中其轉錄活性比SV40病毒啟動子強，但SV40病毒啟動子在正常細胞中非常強。
因此，本研究表明，MK0.6的啟動子活性在腫瘤中特別強，而MK2.3或MK1.0的啟動子活性的腫瘤特異性較弱。
實施例3使用來自腎細胞因子基因的腫瘤特異性啟動子的腫瘤特異性細胞毒性作用(1)為檢測從腎細胞因子基因獲得的啟動子轉錄活性的細胞毒性作用，將單純皰疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)(自殺基因)連接到MK0.6和MK2.3的下游，將質粒引入細胞，在基因轉化的細胞的培養基中加入前藥丙氧鳥苷(GCV)。檢測該體系的細胞毒性作用的方法如Moolten，FL.Cancer Gene Ther.，1279-287，1994中所述。
首先，在NruI和HindIII位點去除pcDNA3(Invitrogen制造)的CMV啟動子，插入MK2.3或MK0.6，然后在EcoRV位點插入用BglI和EcoRI從pMK(Brinster，RL等，Cell，27；223-231，1981)切除的HSV-TK基因。將獲得的每種質粒(MK2.3-TK和MK0.6-TK)如上所述用脂質轉染試劑引入到正常細胞MRC-5或通過失活p53腫瘤抑制基因的功能而被永生化的MRC-5細胞中。為使用pcDNA3中的Neo基因的表達作為藥物抗性標記，將細胞用400μg/ml的G418(LifeTechnologies制造)培養10天以分別建立表達的MK2.3-TK和MK0.6-TK的細胞。然后將細胞以500細胞/孔鋪于96孔培養板上，在不同濃度的GCV(F.Hoffman-La Roche制造)下培養7天。用細胞計數試劑盒-8(Dojin Kagaku制造)檢測細胞的存活率。將在0μg/ml的GCV濃度下的細胞存活定為100％，每個試驗組的存活百分比列于圖2A和圖2B。
從圖2A所示的結果可以看出，在正常MRC-5細胞中，當HSV-TK基因的轉錄由MK2.3啟動子控制時，它們對GCV的敏感性較親代株高500倍，細胞在較低的濃度的GCV時死亡，而當HSV-TK基因的轉錄由MK0.6啟動子控制時，它們對GCV的敏感性與親代株相同。
從圖2B所示的結果可以看出，當用HSV-TK基因轉化的永生化的MRC-5細胞由MK2.3和MK0.6啟動子控制時，其對GCV的敏感性較親代株均增加1000倍。
因此，當用MK2.3啟動子控制HSV-TK基因的表達時，在永生化的細胞和正常細胞中都產生細胞毒性作用，而用MK0.6啟動子時，只在永生化的細胞產生細胞毒性作用，正常細胞中不產生細胞毒性作用。這些數據表明MK0.6啟動子與在圖1的結果中看到的一樣比MK2.3啟動子有更高的腫瘤特異性。
(2)然后，利用人腫瘤細胞和正常成纖維細胞檢測了該MK0.6啟動子的腫瘤特異性。如上所述用脂質轉染試劑將MK0.6-TK引入到各種細胞中，并在400μg/ml的G418下培養10天以獲得MK0.6-TK基因被表達的細胞。隨后將這些引入基因的細胞以500細胞/孔鋪于96孔培養板上，在不同濃度的GCV下培養7天。用細胞計數試劑盒-8檢測細胞的存活率。獲得的結果如圖3A、圖3B和圖3C所示。
從圖3A和圖3B所示的結果可以看出，在腫瘤細胞QG-56和NGP中對GCV的敏感性較其各自的親代株增加1000倍。相反，從圖3C所示的結果可以看出，正常成纖維細胞HEF對對GCV的敏感性與親代株保持相同。因此，這些數據表明MK0.6啟動子能夠腫瘤特異性基因表達，使連接的自殺基因HSV-TK與GCV產生腫瘤特異性的細胞毒性作用。另外，目前用于治療巨細胞病毒感染的GCV的最大血液濃度為1μg/ml，因此，如該試驗所示獲得GCV的細胞毒性作用的濃度0.1μg/ml低于該水平，這表明由MK0.6啟動子控制的TK表達具有非常安全和有效地治療效果。
實施例4來自腎細胞因子基因的腫瘤特異性啟動子的體內抗腫瘤效果如上所述，利用脂質轉染試劑將MK0.6-TK基因引入到QG-56細胞中，在400μg/ml的G418下培養10天以獲得MK0.6-TK基因被表達的細胞。將這些引入基因的細胞和親系細胞(1×106細胞)皮下接種6周齡的雌性BALB/c裸鼠(Nippon SLC提供)以產生皮下腫瘤。當腫瘤體積達到100mm3時，腹膜內注射30mg/kg的GCV或等量的生理鹽水，進行5天。測量QG-56細胞接種后的腫瘤體積的變化，獲得的結果如圖4A和圖4B所示。
從圖4A所示的結果可以看出，其中轉化了MK0.6-TK的全部7個QG-56腫瘤在注射GCV之后都消失了，并沒再復發，而親代株的腫瘤沒有消退，甚至再GCV存在下仍繼續腫瘤的生長。從圖4B所示的結果可以看出，在注射生理鹽水組，MK0.6-TK基因表達的腫瘤和親代株腫瘤的兩種腫瘤的生長速率沒有變化。因此，這些數據表明MK0.6-TK啟動子激活了HSV-TK基因的轉錄，該轉錄活性通過給予GCV使轉染的腫瘤完全消失。
實施例5腎細胞因子啟動子的生物學特性在至少約50％的人實體瘤中觀察到p53基因功能的缺失，在腫瘤中強制表達野生型p53基因在一些情況下可抑制腫瘤的生長。因此，將DNA質粒(其中在MK0.6啟動子下游連接有螢光素酶基因(報告基因))引入通過破壞p53基因功能而被永生化的MRC-5細胞，檢測野生型p53基因的表達下的MK0.6啟動子的轉錄活性。
為此，用HindIII切割實施例1中制備的MK0.6-CAT質粒，將獲得的MK0.6kb基因插入pGL2-Basic(Promega制造)的HindIII位點。另外，構建并使用了在巨細胞病毒啟動子下游連接有野生型p53基因的質粒(Bsker，SJ等，Science，249912-915，1990)(CMV-p53)和用BamHI切割后插入的p53cDNA連接在CMV啟動子的相反方向的對照質粒(CMV-p53R)。因此，用MK0.6-螢光素酶(3μg)和一定量的CMV-p53質粒(0-1μg)或MK0.6-螢光素酶(3μg)和一定量的CMV-p53R質粒(0-1μg)通過如上所述的脂質轉染試劑轉染在10cm培養皿中培養的永生化的MRC-5細胞。培養48小時后，用Dual-luciferase Reporter Assay System(Promega制造)破壞細胞，用同一試劑盒中的試劑確定Firefly螢光素酶活性。為標準化轉染的效率，在每一轉染中包括pRL-TK質粒(Promega制造)，確定TK啟動子的Renilla螢光素酶活性，據此來校正Firefly螢光素酶活性。獲得的結果如圖5所示。
從圖5所示的結果可以看出，隨著引入的CMV-p53質粒的量的增加，MK0.6啟動子的活性下降，而在引入CMV-p53R質粒的對照組中MK0.6啟動子的活性沒有變化。因此，該數據表明MK0.6啟動子受p53腫瘤抑制基因的影響。因為在正常細胞中p53基因的功能是完整的，以及致瘤作用與該基因功能的缺失相關，因此，MK0.6啟動子在正常細胞中不起作用，而在轉化的細胞中起作用。
實施例6鑒定最小的腎細胞因子啟動子區1如上述的實施例所示，在人腎細胞因子基因組基因的啟動子區，特別是在從-559至+50(外顯子1的第一個堿基序列定義為+1)的609bp的片段中有腫瘤特異性啟動子區。為進一步縮小該區，以下列方式獲得分析腎細胞因子轉錄控制區的載體DNA。
利用基于腎細胞因子基因組DNA的信息的PCR方法，合成了對應于從-285至+50的335bp區(MK335bp)并具有SEQ ID NO4所示的堿基序列的DNA片段，確定序列后，將其插入pCR2.1(Invitrogen制造)。從該DNA中切除MK335bp后，將其連接到pGL2-Basic(Promega制造)以構建用來檢測啟動子活性的質粒。另外，利用含有SV40病毒啟動子的pGL2-Control(Promega制造)和含有同樣構建的609bp腎細胞因子啟動子(MK0.6)的pGL2-Basic，通過下列方法檢測啟動子活性。
轉染在DMEM(Sigma)(補充10％的胎牛血清)中培養的肺癌細胞QG-56、PC-1和人乳腺癌細胞BT549。將10μg每種質粒和脂質轉染試劑(Life Technologies制造)混合后室溫放置30分鐘以形成復合物。然后將該復合物與去除了胎牛血清的細胞接觸。8小時后加入補充了胎牛血清的培養基。培養48小時后，用Dual-luciferaseReporter Assay System(Promega制造)破壞引入基因的細胞，用同一試劑盒中的試劑確定其中Firefly螢光素酶活性。為標準化基因引入的效率，在每一基因引入組中包括1μg的pRL-TK質粒(Promega制造)，確定TK啟動子的Renilla螢光素酶活性，據此來校正Firefly螢光素酶活性。
獲得的結果示于圖6。結果表明MK335bp的啟動子活性盡管隨著腫瘤細胞的不同而不同，但在腫瘤細胞中與MK0.6具有相同的活性。
實施例7
鑒定最小的腎細胞因子啟動子區2將用EcoRI消化從上述pCR2.1切除的MK335bp片段插入經NruI和HindIII消化去除巨細胞病毒啟動子的pcDNA3(Invitrogen制造)的EcoRI位點。利用在PCR引物上的HindIII位點和pcDNA3的XbaI位點切割上述的DNA。將用HindIII和BamHI消化從pCH110(Pharmacia制造)上去除的β-半乳糖苷酶基因連接到上述消化的DNA的平端。然后，用KpnI和BamHI消化該DNA后，接著用核酸外切酶III消化，用瓊脂糖凝膠電泳確證該DNA的長度后將其用DNA連接酶形成環狀DNA。然后，確定腎細胞因子基因組區的堿基序列，獲得兩種含有β-半乳糖苷酶基因(其或者在具有從-144至+50的區(MK194bp)并具有SEQ ID NO5所示的堿基序列的DNA的下游或者在具有從-20至+50的區(MK70bp)并具有SEQ ID NO6所示的堿基序列的DNA的下游)的DNA片段。
用脂質轉染試劑將這些DNA引入在DMEM(Sigma)(補充了10％胎牛血清)培養的永生化的人成纖維細胞MRC-5中。48小時后，將其在400μg/ml的G418下培養10天以獲得引入基因的MRC-5細胞。用已知的方法(Topf，N等，Gene Ther.，5507-513，1998)染色該細胞，當有β-半乳糖苷酶表達時，細胞變成藍色。結果如表1所示。
表1

如表1所示，當具有MK335bp和MK194bp的DNA作為啟動子被引入時，MRC-5細胞被染成藍色，而當具有MK70bp的DNA作為啟動子被引入時，MRC-5細胞根本不被染色。因此，該數據表明最小的腎細胞因子啟動子的數據區域位于從-144至+50的194bp的片段中，更準確地講，位于比從-20至+50長的片段中。
實施例8
檢測c-erbB-2啟動子的轉錄活性將c-erbB-2基因的轉錄起始位點作為+1，通過PCR方法擴增對應基因組-495至+38區域(p533)及具有SEQ IDNO7所示序列的DNA，然后將該DNA片段整合進pGEM-TEasy(Promega制造)，確定PCR產物的序列。因此，將該PCR產物插入到pGL2-Basic(Promega制造)的SmaI位點后，其通過c-erbB-2基因組基因上的限制性酶位點用BlnI/SmaI、PstI/SmaI和BssHII/SmaI切割來構建質粒，其中c-erbB-2基因組區、p344(-306/+38)(具有SEQ ID NO8所示的堿基序列的DNA)、p251(-213/+38)(具有SEQ ID NO9所示的堿基序列的DNA)和p124(-86/+38)(具有SEQ ID NO10所示的堿基序列的DNA)分別位于Firefly螢光素酶基因的上游。利用具有SV40病毒啟動子的質粒pGL2-Control(Promega制造)和不含啟動子的質粒pGL2-Basic(Promega制造)將基因引入到人乳腺癌細胞OCUBM、MCF7、BT549、正常人成纖維細胞HEF、MRC-5、人惡性黑色素瘤細胞A875和人肺癌細胞QG-56，所有的細胞在DMEM(Sigma)(補充了10％的胎牛血清)中培養。首先，將10μg的各質粒與脂質轉染試劑(LifeTechnologies)混合后室溫放置30分鐘以形成DNA和脂質體的復合物。然后將復合物與去除胎牛血清的細胞接觸。8小時后加入補充了胎牛血清的培養基。培養48小時后，用Dual-luciferase Reporter AssaySystem(Promega制造)破壞引入基因的細胞，用同一試劑盒中的試劑確定其中Firefly螢光素酶活性。為標準化基因引入的效率，在每一基因引入組中包括1μg的pRL-TK質粒(Promega制造)，確定TK啟動子的Renilla螢光素酶活性，據此來校正Firefly螢光素酶活性。獲得的結果示于圖7A-7C。
從這些結果可以看出，c-erbB-2啟動子的特性如下(a)在人乳腺癌細胞中，p251啟動子的轉錄活性比通常用于目前基因治療方案的p533啟動子的高，p251啟動子的活性比SV40病毒啟動子的強。另一方面，5’區進一步缺失的p124啟動子的轉錄活性與p251啟動子相比非常低(圖7A)。這表明為具有正常的啟動子功能，必須具有至少比p124啟動子長的序列。
(b)在人成纖維細胞中，在某些情況，p533和p344啟動子活性比SV40啟動子強，但與p344和p533啟動子相比，p251啟動子的轉錄活性較低，比SV40啟動子更低(圖7B)。
(c)在人惡性黑色素瘤細胞和人肺癌細胞中，包括p517、p344、p251和p124的所有啟動子都顯示比SV40啟動子低的轉錄活性。p251啟動子的轉錄活性和p533啟動子的大約相同(圖7C)。因此，該數據表明基于與正常細胞數據的比較，與p533啟動子相比p251啟動子在乳腺癌細胞中具有較高轉錄活性，p251啟動子比常規的p533啟動子更有用。
實施例9c-erbB-2啟動子的乳腺癌特異的細胞毒性作用為檢測p251啟動子的細胞毒性作用，將自殺基因HSV-TK連接在該啟動子區的下游(pro251-TK)，在細胞中表達該質粒，在基因引入的細胞培養物中加入前藥GCV。根據Moolten，FL.Cancer Gene Ther.，1279-287，1994描述的方法進行測量該體系的細胞毒性作用。首先，在NruI和HindIII位點去除pcDNA3(Invitrogen制造)的巨細胞病毒(CMV)啟動子，在其中插入p251啟動子，然后利用EcoRV位點插入用BglI和EcoRI從pMK(Brinster，BL等，Cell，27223-231，1981)切除的HSV-TK基因(pro251-TK)。也使用了不含HSV-TK基因但整合有p251啟動子的pcDNA3衍生的質粒(pro251)和具有HSV-TK基因并可使HSV-TK基因表達的pcDNA3衍生的質粒(CMV-TK)作為對照。用脂質轉染試劑將每一質粒(pro251、pro251-TK、CMV-TK)引入乳腺癌細胞MCF7或非乳腺癌細胞A875。為使用pcDNA3中的Neo基因的表達作為藥物抗性標記，將轉化的細胞用400μg/ml的G418(Life Technologies制造)培養10天以建立表達各自基因的細胞。然后將細胞以500細胞/孔鋪于96孔培養板上，在不同濃度的GCV(F.Hoffman-La Roche制造)下培養7天。用細胞計數試劑盒-8(Dojin Kagaku制造)檢測細胞的存活率。將在0μg/ml的GCV濃度下的細胞存活定為100％，每個試驗組的存活以百分比表示(圖8A和圖8B)。該結果表明(a)當HSV-TK基因在p251啟動子的控制下表達時，MCF-7細胞顯示比其親代株和在CMV啟動子控制下的用HSV-TK基因轉染的細胞更大的對GCV的敏感性(圖8A)。
(b)當使用CMV啟動子時，轉染的A875細胞與親代株比較對GCV更敏感，但是當使用p251啟動子時，轉染的A875細胞的GCV敏感性與親代株比較非常弱(圖8B)。因此，當p251啟動子用于乳腺癌細胞時，產生的細胞毒性作用大于使用CMV啟動子所產生的細胞毒性作用，而p251啟動子的作用在非乳腺癌細胞中非常低。
實施例10c-erbB-2啟動子的體內抗癌效果以上述實施例類似的方式將1×106的用pro251或pro251-TK轉染的基因引入的MCF7細胞接種BALB/c裸鼠以形成皮下腫瘤。當腫瘤體積達到150mm3，腹膜內注射30mg/kg的GCV或等量的生理鹽水，持續5天。結果表明(a)在GCV給藥組中，表達pro251-TK基因的全部7個腫瘤都消失了，并且該小鼠在其后沒有復發，而作為對照的表達pro251的腫瘤沒有退化，腫瘤的生長繼續(圖9)。
(b)表達pro251-TK基因并接受生理鹽水的腫瘤生長率與用GCV給藥處理的表達pro251的腫瘤的生長率相同。因此，該數據表明pro251啟動子介導HSV-TK基因的轉錄活化并且具有經GCV給藥使腫瘤完全消失的轉錄活性。
工業應用性如上詳述，本發明的腫瘤特異性啟動子(其具有來自腎細胞因子基因5’上游區的609bp片段或c-erbB-2基因的啟動子區的251bp片段)具有較高的腫瘤特異性和大的啟動子活性。因此，利用本發明的腫瘤特異性啟動子可實現非常安全和有效的基因治療。
序列表序列表<110>Primmune Corporation and Chiba Prefecture<120>腫瘤特異性啟動子<130>E6039-00<1 50>JP 2000-220504<151>2000-7-21<160>10<210>1<211>609<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1gcttccctgc ccacccgcgg aaaccgcccc aggtggccgc gccccctccc cagcagccag60cagggcgcca gggctgagcc ggccgtggag gggagcgggt cccgggggtt atacaggcgc 120cgggcgtccg cggcaggcaa gagaagctga ggcctgagaa cggcccgggc cttggcgtac 180ggcaggggac gacctgggat gggggcagcg ggcggcggcg cagggagtgg gccggggccg 240gtgtgcgcgg gcgggacggg gccggggtcg ggagaccacc gctcggaaga tggggccggg 300agaggccgcc gtcgcagcgc agagggcacc ggcggggaga cgcgaggacg cggggccggg 360aacacggacg ccggagtaga agcgcggggg gggcgggctg gagcgggggc ggggacgccg 420gggtcggggg cggtgcgggt ttgaggggag ggggcggggc gggtccttcc ctgggggggt 480ggggagaggg ggcgggggcc catgtgaccg gctcagaccg gttctggaga caaaaggggc 540cgcggcggcc ggagcgggac gggcccggcg cgggagggag cgaagcagcg cgggcagcga 600gcgagtgag 609<210>2<211>1041<212>DNA<213>人<400>2ggccgcgctc gtcggggccg ggcgggggcc gatccctccg gcttcccttc ccgcggagaa 60caacaatgaa agtgaaagag 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1.腫瘤特異性啟動子，其具有序列表中SEQ ID NO1所示的堿基序列中從1-539位的任何堿基至609位堿基的堿基序列或者SEQ IDNO9所示的堿基序列中從1-127位的任何堿基至251位堿基的堿基序列。
2.腫瘤特異性啟動子，其可在嚴謹條件下與序列表中SEQ ID NO1所示的堿基序列中從1-539位的任何堿基至609位堿基的堿基序列或者SEQ ID NO9所示的堿基序列中從1-127位的任何堿基至251位堿基的堿基序列雜交、并具有與所述的堿基序列相似的啟動子功能。
3.權利要求1或2的腫瘤特異性啟動子，其中序列表中SEQ ID NO1所示的堿基序列中從1-539位的任何堿基至609位堿基的堿基序列是位點1-609的堿基序列(SEQ ID NO1所示的堿基序列)、位點416-609的堿基序列(SEQ ID NO5所示的堿基序列)或位點275-609的堿基序列(SEQ ID NO4所示的堿基序列)。
4.乳腺癌、卵巢癌、胃癌或食管癌特異的權利要求1或2的腫瘤特異性啟動子，其中所述的啟動子具有SEQ ID NO9所示的堿基序列中從1-127位的任何堿基至251位堿基的堿基序列或者可在嚴謹條件下與它們雜交并具有與其相似的啟動子活性。
5.權利要求1、2或4的腫瘤特異性啟動子，其中SEQ ID NO9所示的堿基序列中從1-127位的任何堿基至251位堿基的堿基序列是位點1-251的堿基序列(SEQ ID NO9所示的堿基序列)。
6.權利要求1-5的任一項中的腫瘤特異性啟動子，其通過腫瘤特異性基因表達用于癌癥基因治療。
7.權利要求1-5的任一項中的腫瘤特異性啟動子，其用于自殺基因治療，其聯合使用其中編碼藥物代謝酶的基因連接在權利要求1-5的任一項中的腫瘤特異性啟動子下游的載體和可被所述的藥物代謝酶轉化為活性形式的癌癥治療的前藥。
8.權利要求7的腫瘤特異性啟動子，其中藥物代謝酶的基因與癌癥治療的前藥的組和為單純皰疹病毒的胸苷激酶基因和丙氧鳥苷或無環鳥苷、胞嘧啶脫氨酶基因和5-氟胞嘧啶、水痘-帶狀皰疹病毒的胸苷激酶基因和6-甲氧基嘌呤阿糖苷、E.coli gpt基因和6-噻噸、細胞色素P450 2B1基因和環磷酰胺、人脫氧胞苷激酶基因和胞嘧啶阿糖苷、E.coli UPRT基因和5-氟脲嘧啶或E.coli deoD基因和6-甲基嘌呤-2’-脫氧核苷。
9.權利要求1-5的任一項中的腫瘤特異性啟動子，其通過溶瘤病毒用于癌癥基因治療，其中利用權利要求1-5的任一項中的腫瘤特異性啟動子改變病毒基因使病毒在腫瘤細胞或腫瘤組織中特異性增殖。
全文摘要
包含腎細胞因子基因(其為人視黃酸效應的生長/分化因子)的－559至+50的609bp堿基序列的DNA(外顯子1的第一個堿基序列設為+1)；包含c－erbB－2基因(其屬于EGF受體家族并具有酪氨酸激酶活性)的－213至+38的251bp堿基序列的DNA(轉錄起始點設為+1)。因為具有腫瘤特異性轉綠活性和高啟動子活性，因此這些DNA是非常有用的腫瘤特異性啟動子，其用于聯合使用藥物代謝酶基因和癌癥治療的前藥(其可通過上述酶活化)的自殺基因治療、利用包含細胞因子編碼基因的表達載體的癌癥基因治療和利用只對腫瘤細胞產生細胞毒性作用的溶瘤病毒的癌癥基因治療。
文檔編號C07K14/475GK1443238SQ01813157
公開日2003年9月17日 申請日期2001年7月18日 優先權日2000年7月21日
發明者田川雅敏 申請人:千葉縣, 普萊銘株式會社