含游離半胱氨酸殘基的蛋白重折疊的方法

專利名稱：含游離半胱氨酸殘基的蛋白重折疊的方法
技術領域：
本發明一般涉及制備至少含有一個“游離”半胱氨酸殘基，即不參與二硫鍵的半胱氨酸的蛋白，更特別地涉及重組蛋白的方法。
背景技術：
蛋白治療劑通常應該通過注射給予患者。多數蛋白治療劑從體內被快速清除，迫使頻繁地注射，常常是每日注射。人們對發展延長蛋白治療劑在體內的循環半衰期使得不必頻繁注射蛋白的方法有很大的興趣。已證明用聚乙二醇(PEG)共價修飾蛋白是延長蛋白在體內循環半衰期的有效方法(Abuchowski等1984；Hershfield，1987；Meyers等1991)。PEG與蛋白共價連接可增加蛋白的有效大小并降低其從體內的排除速率。商業上可得到幾種大小的PEGs，允許在使用不同大小PEGs過程中根據個體征象制定PEG修飾蛋白的循環半衰期。其它引證的PEG修飾的體內益處是蛋白溶解度和穩定性增加，和蛋白免疫原性降低(Katre等1987；Katre，1990)。
一個已知的PEG化蛋白的方法是使用半胱氨酸反應性PEGs將PEG與半胱氨酸殘基共價連接。商業上可獲得大量帶有不同反應基團(如馬來酰亞胺、乙烯砜)高度特異、半胱氨酸反應性PEGs和不同大小PEGs(2-40kDa，單鏈或支鏈)。在中性pH下，這些PEG試劑選擇性連接“游離”半胱氨酸殘基，即不參與二硫鍵的半胱氨酸殘基。大多數蛋白中的半胱氨酸殘基參與二硫鍵，不能使用半胱氨酸反應性PEGs進行PEG化。通過使用重組DNA技術體外誘變，另外的半胱氨酸殘基可引入蛋白的任何位置。新添加的“游離”或“非天然”半胱氨酸殘基可用作采用半胱氨酸反應性PEG的PEG分子的特異性結合的位點。新添加的“游離”或“非天然”半胱氨酸殘基可置換蛋白中現存的氨基酸，添加到成熟蛋白氨基末端之前或成熟蛋白羧基末端之后，或插入到蛋白中兩個正常相鄰的氨基酸之間。可供選擇地，參與天然二硫鍵的兩個半胱氨酸之一可以缺失或被另一個氨基酸置換，留下一個天然半胱氨酸(蛋白中正常將與被缺失或置換的半胱氨酸殘基形成二硫鍵的半胱氨酸殘基)游離并可利用進行化學修飾。優選置換半胱氨酸的氨基酸是中性氨基酸如絲氨酸或丙氨酸。例如，人生長激素(hGH)具有兩個可用碘乙酰胺還原和烷基化而不影響生物活性的二硫鍵(Bewley等(1969))。四個半胱氨酸的每一個將是缺失或被另一個氨基酸置換的合理目標。
已知幾個天然產生蛋白含有一個或多個“游離”半胱氨酸殘基。這種天然產生蛋白的實例包括人白介素(IL)-2(Wang等1984)，β干擾素(Mark等1984；1985)，G-CSF(Lu等1989)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF，Thompson，1992)。IL-2，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)和β干擾素(IFN-α)含奇數量半胱氨酸殘基，而堿性成纖維細胞生長因子含有偶數量半胱氨酸殘基。
由于游離巰基在生理條件下的反應性，含游離半胱氨酸殘基的重組蛋白的表達已經成為問題。含游離半胱氨酸的幾個重組蛋白已經在細胞質表達，即，如細胞內蛋白，在細菌如大腸桿菌中表達。實例包括天然蛋白如IL-2，β-干擾素，G-CSF和IL-2的工程化半胱氨酸突變蛋白(mutein)(Goodson and Katre，1990)，IL-3(Shaw等1992)，腫瘤壞死因子結合蛋白(Tuma等1995)，胰島素樣生長因子-I(IGF-I，Cox andMcDermott，1994)，胰島素樣生長因子結合蛋白-1(IGFBP-1，Van Den Berg等1997)和蛋白酶連接蛋白和相關蛋白(Braxton，1998)的半胱氨酸突變蛋白。所有這些蛋白在大腸桿菌中細胞內表達時大多不溶解。不溶蛋白很多無活性，為了恢復有效的生物活性需要重折疊(refolding)。在有些情況下，還原劑二硫蘇糖醇(DTT)用于輔助溶解和/或不溶蛋白的重折疊。純化的重折疊的IL-2，G-CSF和β干擾素蛋白不穩定且在生理pH下失去活性，明顯是由于涉及游離半胱氨酸殘基的二硫鍵重排(Wang等1984；Mark等1984；1985；Oh-eda等1990；Arakawa等1992)。絲氨酸取代這些蛋白中的游離半胱氨酸殘基產生在生理pH下更穩定的蛋白(Wang等1984；Mark等1984；1985；Arakawa等1993)。
第二個已知的在細菌中表達重組蛋白方法是將它們分泌到周質間隙(periplasmic space)或培養基中。已知某些重組蛋白如GH當分泌到大腸桿菌周質時，以可溶活性形式表達，而它們在大腸桿菌中細胞內表達時是不溶的。通過將編碼GH或其它目的蛋白的DNA序列與編碼細菌信號序列如來自stII(Fujimoto等1988)和ompA蛋白(Ghrayeb等1984)的DNA序列融合達到分泌。需要重組蛋白在細菌中分泌，因為可以保留重組蛋白的天然N末端。重組蛋白的細胞內表達需要重組蛋白的氨基末端存在N末端甲硫氨酸。許多成熟形式的人蛋白的氨基末端正常不存在甲硫氨酸。例如，成熟形式人GH的氨基末端氨基酸是苯丙氨酸。為了所述蛋白在細菌中有效表達，氨基末端甲硫氨酸應該添加到重組蛋白的氨基末端，如果這個位置不存在甲硫氨酸的話。典型添加氨基末端甲硫氨酸是通過在編碼重組蛋白的DNA序列前添加ATG甲硫氨酸密碼子完成的。添加的N末端甲硫氨酸常常不從重組蛋白中去除，特別是如果重組蛋白不溶的話。hGH是這種情況，其中當蛋白在大腸桿菌中細胞內表達時不去除N末端甲硫氨酸。添加的N末端甲硫氨酸產生在人中可潛在刺激免疫反應的“非天然”蛋白。相比之下，使用stII(Chang等1987)或ompA(Cheah等1994)信號序列分泌到周質間隙的hGH沒有添加的甲硫氨酸；重組蛋白始于天然的氨基末端氨基酸苯丙氨酸。天然hGH蛋白序列被保留，因為細菌酶在stII(或ompA)信號序列和成熟hGH蛋白的起始點之間切割stII-hGH蛋白(或ompA-hGH蛋白)。
hGH具有形成二硫鍵的四個半胱氨酸。hGH可用stII或ompA信號序列分泌到大腸桿菌周質中。分泌的蛋白可溶且具有生物活性(Hsiung等1986)。主要分泌形式的hGH是十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定表觀分子量為22kDa的單體。可使用滲透壓休克(osmoticshock)方法從周質間隙分離重組hGH(Koshland and Botstein，1980)，優選將周質而不是細胞內蛋白釋放到滲透壓休克緩沖液中。然后用柱層析純化釋放的hGH蛋白(Hsiung等1986)。大量GH突變體已經分泌到大腸桿菌周質中。分泌的突變蛋白可溶且可使用類似用于純化野生型GH的步驟純化(Cunningham and Wells，1989；Fuh等1992)。出乎意料的是，當用類似的步驟用于分泌含游離半胱氨酸殘基的GH變體(五個半胱氨酸；2N+1)時，發現當使用標準滲透壓休克分離和發展用于GH的純化步驟時，某些重組GH變體不溶或形成多聚體或聚集。在滲透壓休克裂解產物中，非還原型SDS-PAGE可檢測到極少量的單體GH變體蛋白。不溶或聚集的GH變體與可溶的正確折疊的hGH相比，生物活性降低。沒有描述含游離半胱氨酸殘基的不溶的分泌的生長激素變異體重折疊為生物活性形式的方法。
α干擾素(IFN-α2)也含有形成兩個二硫鍵的四個半胱氨酸殘基。用stII信號序列，IFN-α2可分泌到大腸桿菌周質中(Voss等1994)。分泌蛋白的一部分可溶且具有生物活性(Voss等1994)。可用柱層析純化分泌的可溶重組IFN-α2(Voss等1994)。當試圖用相似步驟分泌含游離半胱氨酸殘基的IFN-α2變異體(五個半胱氨酸；2N+1)時，發現當使用發展用于IFN-α2的標準純化步驟分離時，某些重組IFN-α2變異體大多不溶或形成多聚體或聚集。不溶或聚集的IFN-α2變異體與可溶的正確折疊的IFN-α2相比，生物活性降低。沒有描述含游離半胱氨酸殘基的不溶分泌的IFN-α2變異體重折疊為生物活性形式的方法。
人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)含有形成兩個二硫鍵的五個半胱氨酸殘基。成熟蛋白序列的17位的半胱氨酸殘基是游離的。Perez-Perez等(1995)報道了使用變異形式的ompA信號序列，G-CSF可分泌到大腸桿菌周質中。然而，極少量ompA-G-CSF融合蛋白被正確加工而產生成熟G-CSF。在表達ompA-G-CSF融合蛋白的宿主細胞中共表達大腸桿菌dnaK和dnaJ蛋白可提高正確加工的G-CSF的百分比(Perez-Perez等1995)。在所有檢測的大腸桿菌株中，正確加工的分泌的G-CSF大多不溶(Perez-Perez等1995)。不溶G-CSF與可溶的正確折疊的G-CSF相比，生物活性降低。當嘗試用stII信號序列用相似步驟分泌野生型G-CSF，用絲氨酸[G-CSF(C17S)]取代游離半胱氨酸殘基的G-CSF變異體，和含游離半胱氨酸殘基(五個半胱氨酸；2N+1)的G-CSF(C17S)時，發現重組G-CSF蛋白大多也不溶。沒有描述不溶分泌的G-CSF蛋白重折疊為生物活性形式的方法。
人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)含有形成兩個二硫鍵的四個半胱氨酸殘基。Libbey等(1987)和Greenberg等(1988)報道了用ompA信號序列，GM-CSF可分泌到大腸桿菌周質中。正確加工的分泌的GM-CSF不溶(Libbey等1987；Greenberg等1988)。不溶GM-CSF與可溶正確折疊GM-CSF相比，生物活性降低。當嘗試用stII信號序列用相似步驟分泌含游離半胱氨酸殘基(五個半胱氨酸；2N+1)的GM-CSF變異體時，發現重組GM-CSF蛋白大多也不溶。沒有描述不溶分泌的GM-CSF蛋白重折疊為生物活性形式的方法。
美國專利號5,206,344和Goodson和Katre(1990)描述了IL-2半胱氨酸置換突變蛋白的表達和純化。IL-2半胱氨酸突變蛋白在大腸桿菌中細胞內表達時不溶。用變性試劑[10％十二烷基磺酸鈉(SDS)或8M尿素]和還原劑[100mM二硫蘇糖醇(DTT)]處理，重折疊和用大小排阻層析和反相HPLC純化后，蛋白可溶。美國專利號5,166,322描述了IL-3半胱氨酸突變蛋白的表達和純化。IL-3半胱氨酸突變蛋白在大腸桿菌中細胞內表達時也不溶。用變性試劑(胍)和還原劑(DTT)，重折疊和用反相HPLC純化后，蛋白可溶。純化的IL-3半胱氨酸突變蛋白在含DTT的保存緩沖液中保持部分還原狀態。當發明人僅使用變性試劑和還原劑(DTT)變性和重折疊不溶GH和G-CSF的半胱氨酸突變蛋白時，發現重折疊蛋白是異源的，包含多個分子量種類。類似地，當發明人僅用變性試劑和還原劑(DTT)來變性和重折疊不溶的，分泌的IFN-α2半胱氨酸突變蛋白時，沒有獲得可檢測水平的正確折疊的IFN-α2半胱氨酸突變蛋白。
Malik等(1992)和Knusli等(1992)描述了野生型GM-CSF與胺反應性PEG試劑的結合。胺-PEG化GM-CSF包含在多個氨基酸殘基進行了修飾的不同分子量PEG-GM-CSF種的異源混合物(Malik等1992；Knusli等1992)。用常規層析方法不能將各種胺-PEG化GM-CSF種類(amine-PEGylatedGM-CSF species)彼此分開而純化，或從非PEG化GM-CSF中純化，常規層析方法妨礙被測的各種同工形式的特殊活性測定。Clark等(1996)描述了GH與胺反應性PEGs的結合。胺PEG化GH也是異源的，包含在多個氨基酸殘基修飾的多個分子量種類的混合物。胺PEG化GH蛋白顯示出明顯降低的生物活性(Clark等1996)。Monkarsh等(1997)描述了胺PEG化α干擾素，它也包含在不同氨基酸殘基修飾的多個分子量種類。胺PEG化α干擾素也顯示出降低的生物活性。Tanaka等(1991)描述了胺PEG化G-CSF，它也包含在不同氨基酸殘基修飾的不同分子量種類的異源混合物。胺PEG化G-CSF顯示出降低的生物活性Tanaka等(1991)。Kinstler等(1996)描述了優選在非天然N末端甲硫氨酸殘基修飾的PEG化G-CSF蛋白。這個蛋白也顯示出降低的生物活性Kinstler等(1996)。
因此，盡管作了大量的努力，仍存在高產量地使含一個或多個游離半胱氨酸殘基的不溶或聚集蛋白重折疊為允許可溶生物活性形式的需要。本發明滿足了這個需要而且也提供了相關優點。類似地，也存在通過增長蛋白分子量如PEG化而產生長期作用重組蛋白的同源制劑的方法的需要。
發明概述本發明一般涉及獲得具有一個或多個游離半胱氨酸殘基和以不溶或聚集形式被宿主細胞表達的重折疊可溶形式的蛋白的方法。這種蛋白包括但不限于，生長激素超基因(supergene)家族成員，如GH、IFN-α2、G-CSF和GM-CSF蛋白，和抗血管生成因子，如endostatin和制管張素。這方法通常通過(a)使宿主細胞表達不溶或聚集形式的具有游離半胱氨酸殘基的蛋白；(b)裂解該細胞；(c)在變性試劑、還原劑和半胱氨酸阻斷劑存在下，溶解不溶或聚集的蛋白；和(d)通過使變性試劑和還原劑濃度降低到足以允許蛋白復性為生物活性形式的水平而重折疊蛋白來完成。可選擇地，溶解的重折疊蛋白與重折疊混合物中的其它蛋白分離。
合適的宿主細胞包括細菌、酵母、昆蟲或哺乳動物細胞。優選，宿主細胞是細菌細胞，尤其是大腸桿菌。
優選，由本發明的方法產生的可溶重折疊蛋白是重組蛋白，特別是蛋白的半胱氨酸變異體或半胱氨酸突變蛋白。這里使用的術語“半胱氨酸變異體”和“半胱氨酸突變蛋白”是指包括蛋白氨基酸序列中的任何下列改變在成熟蛋白氨基末端前或成熟蛋白羧基末端后添加半胱氨酸殘基；非天然半胱氨酸殘基置換蛋白中現存氨基酸；在蛋白的正常相鄰氨基酸之間引入非天然半胱氨酸殘基；或另一個氨基酸置換蛋白中正常形成二硫鍵的天然產生半胱氨酸殘基。所述方法有效產生的蛋白包括但不限于GH、G-CSF、GM-CSF和干擾素，特別是α干擾素，這些蛋白的半胱氨酸變異體，它們的衍生物或拮抗劑。該方法有效的其它蛋白包括GH超基因家族的其它成員，轉化生長因子(TGF)-β超家族，血小板衍化生長因子B，神經生長因子，腦衍化神經營養因子、神經營養蛋白-3，神經營養蛋白-4，血管內皮生長因子，趨化因子、激素、endostatin，制管張素，這些蛋白的半胱氨酸突變蛋白，或其衍生物或拮抗劑。也包含免疫球蛋白重鏈或輕鏈的半胱氨酸突變蛋白或其衍生物。
這里使用的術語“半胱氨酸阻斷劑”是指任何導致蛋白中可逆阻斷游離半胱氨酸殘基形成的試劑或試劑的組合。有效的半胱氨酸阻斷劑的實例包括但不限于，二硫酚如胱氨酸、胱胺、氧化谷胱苷肽、乙二硫醇酸(dithioglycolic acid)等，或硫醇如半胱氨酸、半胱胺、巰基乙酸(thioglycolic acid)和還原型谷胱苷肽。優選，硫醇應該在氧化劑存在下使用。有效的氧化劑包括氧、碘、鐵氰化物、過氧化氫、二氫抗壞血酸、連四硫酸鹽和O-碘氧苯甲酸鹽(O-iodosobenzoate)。可選擇地，可加入金屬離子如銅(Cu++)或鈷(Co++)催化氧化反應。盡管不希望受任何特定理論的限制，發明人推測半胱氨酸阻斷劑與蛋白中游離半胱氨酸殘基形成混合二硫化物，從而限制半胱氨酸殘基參與可發生的可能的二硫化物重排。混合二硫化物穩定了游離半胱氨酸殘基，明顯增加了正確折疊的有生物活性的可溶蛋白的產量。認為這里使用的還原劑如DTT和2-巰基乙醇不是半胱氨酸阻斷劑，因為它們不能與蛋白中游離半胱氨酸殘基形成可逆阻斷混合的二硫化物。DTT典型地不與蛋白中半胱氨酸殘基形成混合二硫化物，由于氧化時熱力學優選形成分子內鍵。
兩個或更多重折疊蛋白通過它們的游離半胱氨酸殘基共價連接形成的高度有序二聚體和多聚體蛋白也在本發明之內。
本方法進一步包括半胱氨酸反應部分(moiety)與重折疊蛋白連接形成修飾蛋白的各種方法，其中半胱氨酸反應部分與重折疊蛋白通過游離半胱氨酸殘基連接。可與重折疊蛋白連接的有效半胱氨酸反應部分的實例是半胱氨酸反應性PEG，它可用于形成PEG化蛋白。這種方法包括(a)將具有游離半胱氨酸殘基的重折疊蛋白與重折疊混合物中的其它蛋白分離；(b)用二硫化物還原劑還原，至少部分還原，分離，重折疊蛋白和(c)使所述蛋白接觸半胱氨酸反應部分如半胱氨酸反應性PEG。可選擇地，修飾蛋白可與未修飾蛋白分離。其它有效的半胱氨酸反應部分的實例是半胱氨酸反應性右旋糖苷，半胱氨酸反應性碳水化合物，半胱氨酸反應性聚(N-乙烯吡咯烷酮)，半胱氨酸反應性肽，半胱氨酸反應性脂類和半胱氨酸反應性多糖。
本發明進一步包括這里公開的方法制備的可溶重折疊蛋白及其衍生物，包括PEG化蛋白。這種PEG化蛋白包括GH，G-CSF，GM-CSF和α干擾素蛋白的單PEG化(monopegylated)半胱氨酸變異體。這種PEG化蛋白還包括兩個或更多PEG分子修飾的GH，G-CSF，GM-CSF和α干擾素蛋白的半胱氨酸變異體，其中至少一個PEG分子通過游離半胱氨酸殘基與所述蛋白連接。
發明詳述本發明提供了制備具有至少一個游離半胱氨酸殘基并且以不溶或聚集形式被宿主細胞表達的重折疊可溶形式GH、IFN-α2、G-CSF和GM-CSF蛋白的新方法。本發明可用于制備具有至少一個游離半胱氨酸殘基并且以不溶或聚集形式被宿主細胞表達的重折疊可溶形式的GH超基因家族的其它成員。本發明也可用于制備具有至少一個游離半胱氨酸殘基并且以不溶或聚集形式被宿主細胞表達的重折疊可溶形式的其它類型蛋白，包括但不限于，抗血管生成蛋白如endostatin和制管張素。本發明進一步提供了用這些新方法制備的新的蛋白，尤其是重組蛋白，以及這種重組蛋白的衍生物。制備這種蛋白的新方法通常通過下列完成(a)使宿主細胞表達不溶或聚集形式的具有游離半胱氨酸的蛋白；(b)用化學方法、酶學或物理方法裂解該細胞；(c)蛋白接觸變性試劑、還原劑和半胱氨酸阻斷劑，溶解不溶或聚集的蛋白；和(d)通過使溶解混合物中變性試劑和還原劑的濃度降低到足以允許蛋白復性為可溶的生物活性形式的水平而重折疊蛋白。
可供選擇地，重折疊可溶蛋白可與重折疊混合物中其它蛋白分離。本發明的方法和其它實施方案在2000年5月16日申請的美國臨時申請系列號60/204,617中詳細描述。美國臨時申請系列號60/204,617以其完整形式引入這里作為參考。
如上鑒定，這些方法中的第一步是使宿主細胞表達不溶或聚集形式的具有游離半胱氨酸殘基的蛋白。合適的宿主細胞可以是原核或真核。可用于表達重組蛋白的適當宿主細胞的實例包括細菌、酵母、昆蟲和哺乳動物細胞。細菌細胞特別有效，尤其是大腸桿菌。使宿主細胞表達蛋白的方法是本領域熟知的，這里提供了實施例。
這里使用的術語“具有游離半胱氨酸殘基的蛋白”是指含有2N+1半胱氨酸殘基的任何天然或重組蛋白或肽，其中N可以是0或任何整數，和含有2N半胱氨酸的任何天然或重組蛋白或肽，其中兩個或更多半胱氨酸不正常參與二硫鍵形成。因此，本發明的方法在增強表達、回收和純化具有游離半胱氨酸的任何蛋白或肽中有效，尤其是具有一個或更多游離半胱氨酸的添加半胱氨酸的變異重組蛋白(這里稱作“半胱氨酸突變蛋白”或“半胱氨酸變異體”)。盡管被其天然宿主細胞表達的具有一個游離半胱氨酸的天然蛋白的表達、回收和純化可用本發明的方法來增強，這里的說明書主要涉及重組蛋白，僅僅是為了說明目的。此外，蛋白可以源自任何動物種，包括人、companion動物和畜牧動物。蛋白也可源自任何植物種或微生物。
因此，本發明包含廣范圍的重組蛋白和這些蛋白的半胱氨酸變異體。這些蛋白包括GH超基因家族的成員和這些蛋白的半胱氨酸變異體。下列蛋白(“集體稱作GH超基因家族”)由GH超基因家族的基因編碼(Bazan(1990；1991；1992)；Mott and Campbell(1995)；Silvennoinen and Ihle(1996)；Martin等(1990)；Hannum等(1994)；Blumberg等2001)GH、催乳素、胎盤催乳素、紅細胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、白介素-2(IL-2)，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12(p35亞單位)，IL-13，IL-15，IL-19，IL-20，IL-TIF，MDA-7，AK-155，制瘤素M、睫毛神經營養因子、白血病抑制因子、α干擾素、β干擾素、γ干擾素、ω干擾素、τ干擾素、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、心肌營養素-1(CT-1)、干細胞因子和flt3/flk2配體。預期將來通過基因克隆和測序會鑒定GH超基因家族的其它成員。GH超基因家族的成員具有相似的二級和三級結構，盡管它們通常具有有限的氨基酸或DNA序列同一性。GH超基因家族的成員共有結構特征，Bazan(1990；1991；1992)，Mott和Campbell(1995)和Silvennoinen和Ihle(1996)描述，允許容易鑒定新的基因家族成員。這些蛋白的變異體如Shanafelt等(2000)描述的IL-2選擇性拮抗劑也包含在本發明中。
本方法也可增強另外的重組蛋白的表達、回收和純化，包括TGFβ超家族成員。TGFβ超家族包括但不限于，源自神經膠質的神經營養因子(GDNF)，轉化生長因子β1(TGF-β1)，TGF-β2，TGF-β3，抑制素A，抑制素B，骨形態形成蛋白-2(BMP-2)，BMP-4，抑制素α，Mullerian抑制物(MIS)，和OP-1(成骨蛋白1)。TGF-β超家族單體亞單位共有允許這個家族其它成員容易鑒定的某些結構特性它們通過含有形成4個分子內二硫鍵的8個高度保守的半胱氨酸殘基。典型地，第九個保守半胱氨酸是蛋白的游離單體形式，但參與單體亞單位同源二聚化(homodimerization)或異源二聚化(heterodimerication)過程中分子內二硫鍵的形成。Massague(1990)，Daopin等(1992)，Kingsley(1994)，Kutty等(1998)和Lawton等(1997)描述了TGF-β超家族其它成員，這里引入作為參考。
免疫球蛋白(Ig)重鏈和輕鏈單體也含有參與分子內二硫鍵的半胱氨酸殘基以及游離半胱氨酸(Roitt等1989 and Paul，1989)。這些游離半胱氨酸正常僅參與作為多聚化事件結果的二硫鍵的形成如重鏈同源二聚化，重鏈-輕鏈異源二聚化，(重鏈-輕鏈)異源二聚體同源二聚化和其它高度有序裝配如IgM的情況下，(重鏈-輕鏈)異源二聚體的五聚化。因此，可利用本發明的方法增強人免疫球蛋白重和/或輕鏈(或其各種結構域)的表達、回收和純化，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM IgA1，IgA2，分泌型IgA，IgD和IgE，及這些蛋白的半胱氨酸變異體或其片段。來自其它物種的免疫球蛋白也可以類似地表達、回收和純化。與免疫球蛋白或免疫球蛋白結構域融合的蛋白，如Chamow & Ashkenazi(1996)所述，也可以類似地表達、回收和純化。
基于術語稱作“胱氨酸結(knot)”的共有結構基元，一組蛋白分為結構超家族。胱氨酸結定義是形成拓撲“打結”的三個分子內二硫鍵的六個保守半胱氨酸殘基(McDonald and Hendrickson，1993)。這些蛋白也形成同源或異源二聚體，且在有些情況不是所有情況下，二聚化包括分子內二硫鍵形成。這個家族的成員包括TGF-β超家族成員和其它蛋白如血小板化生長因子A(PDGF-A)、PDGF-B，神經生長因子(NGF)，腦衍化神經營養因子(BDNF)，神經營養蛋白-3，神經營養蛋白-4，血管內皮生長因子(VEGF)。半胱氨酸阻斷劑也可增強具有這個結構基元的蛋白和這些蛋白的添加半胱氨酸變異體的表達、回收和純化。
本方法也可增強其它重組蛋白和/或這些蛋白的添加半胱氨酸變異體的表達、回收和純化。本方法有效的蛋白類別包括蛋白酶和其它酶、蛋白酶抑制劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、細胞因子“選擇性激動劑”、變應原、趨化因子、促性腺激素、趨化素、脂質結合蛋白、垂體激素、生長因子、生長肽激素、免疫球蛋白、白介素、干擾素、可溶受體、細胞表面受體的細胞外結構域、疫苗、單鏈抗體和血紅蛋白。蛋白的具體實例包括，例如，leptin、胰島素、胰島素樣生長因子I和II(IGF-I和IGF-II)、過氧化物歧化酶、過氧化氫酶、天冬酰胺酶、尿酸酶、成纖維細胞生長因子、精氨酸酶、制管張素、endostatin、因子VIII、因子IX、白介素1受體拮抗劑、甲狀旁腺激素、生長激素釋放因子、降鈣素、VEGF受體細胞外結構域、蛋白酶連接蛋白和抗凝血酶III。
將從PEG化受益和因此將成為半胱氨酸添加修飾的合理候選者的其它蛋白變異體包括溶解度低或聚集傾向的蛋白或肽，容易蛋白水解的蛋白或肽，需要提高機械穩定性的蛋白或肽，快速從體內清除的蛋白或肽，或具有不期望的免疫原性或抗原特性的蛋白或肽。
如果希望，一般使用如下面實施例和PCT/US98/14497和PCT/US00/0093所述的基于PCR定點誘變來構建這些蛋白的半胱氨酸和其它氨基酸突變蛋白，每篇以其完整形式引入作為參考。Methods in MolecularBiology，Vol.15PCR ProtocolsCurrent Methods and Applicationsedited by White，B.A.(1993)Humana Press，Inc.，Totowa，NJ and PCRProtocolsA Guide to Methods and Applications edited by Innis，M.A.等(1990)Academic Press，Inc.San Diego，CA也一般描述了使用基于PCR的PCR步驟構建突變蛋白的方法。
本領域已知的方法可用于誘導蛋白在細胞質的表達或指導蛋白分泌，根據細胞起源，例如，下面的實施例中描述的方法。廣泛的信號肽已經成功用于將蛋白轉運到大腸桿菌的周質間隙。這些信號肽的實例包括原核信號序列如ompA，stII，PhoA signal(Denefle等1989)，OmpT(Johnson等1996)，LamB和OmpF(Hoffman and Wright，1985)，β-內酰胺酶(Kadonaga等1984)，腸毒素LT-A，LT-B(Morioka-Fujimoto等1991)，和來自S.aureus的蛋白A(Abrahmsen等1986)。利于某些蛋白分泌的大量非天然、合成的信號序列也是本領域技術人員已知的。
下一步，裂解宿主細胞。可在下面描述的溶解步驟之前或同時進行細胞裂解。細胞裂解可通過例如機械剪切如法式壓迫細胞(French pressurecell)、酶消化、超聲處理、勻漿化、玻璃珠渦流、洗滌劑處理、有機溶劑、凍融、氧化鋁或沙研磨、下面定義的變性試劑處理等等來完成(Bollag等1996)。可選擇地，可在變性試劑、二硫鍵還原劑或半胱氨酸阻斷劑存在下裂解細胞。可選擇地，可用各種方法如離心、過濾(包括超濾法)、沉淀、絮凝或固定使不溶或聚集物質與可溶蛋白分離。
接下來，不溶或聚集物質(或沒有裂解前的整個細胞)接觸變性試劑和也是半胱氨酸阻斷劑的二硫鍵還原劑，使不溶或聚集物質(或沒有裂解前的整個細胞)可溶或成為單體。有效的變性試劑包括尿素、胍、精氨酸、硫氰酸鈉、極端pH(稀釋酸或堿)、洗滌劑(SDS，sarkosyl)、鹽(鹽酸鹽，硝酸鹽，硫氰酸鹽，十六烷基甲基銨鹽，三氯乙酸鹽)，化學衍化(亞硫酸鹽解，與檸康酸反應)、溶劑(2-氨基-2-甲基-1-丙醇或其它醇，DMSO，DMF)或強陰離子交換樹脂如Q-Sepharose。尿素的有效濃度是1-8M，5-8M是優選的濃度。胍的有效濃度是1-8M，4-8M是優選的濃度。也是半胱氨酸阻斷劑的有效的二硫鍵還原劑包括但不限于，硫醇如半胱氨酸、巰基乙酸、還原型谷胱苷肽和半胱胺。這些化合物可用0.5至200mM的范圍，1-50mM是優選的濃度。半胱氨酸、還原型谷胱苷肽、巰基乙酸和半胱胺是優選的還原劑，因為它們也是半胱氨酸阻斷劑，即它們與蛋白中游離半胱氨酸殘基反應形成可逆阻斷游離半胱氨酸殘基。溶解步驟過程中使用也是半胱氨酸阻斷劑的二硫鍵還原劑可減少不溶或聚集蛋白重折疊為可溶活性形式的這個過程所需化合物和步驟的數量。而且，使用半胱氨酸阻斷劑產生下述的用各種半胱氨酸反應部分和程序適合在游離半胱氨酸殘基衍化的重折疊蛋白的形式。優選，變性/還原混合物的pH在pH6和pH10之間。
程序的下一步是重折疊蛋白獲得蛋白的天然構象和天然二硫鍵。重折疊通過使變性試劑和還原劑的濃度降至足以允許蛋白復性為可溶生物活性形式的水平而完成。這可以通過透析、稀釋、凝膠過濾、蛋白沉淀或通過固定在樹脂上后緩沖液洗滌而達到。選擇這個步驟的條件允許蛋白天然二硫鍵重建。這可通過添加氧化劑，或氧化劑和還原劑的氧化還原混合物而裂解二硫鍵交換反應而完成。優選，選擇試劑或試劑混合物可導致天然二硫鍵形成和可逆阻斷游離半胱氨酸殘基，即試劑或試劑混合物起半胱氨酸阻斷劑的作用。有效氧化劑的實例包括氧、胱氨酸、氧化型谷胱苷肽、胱胺和乙二硫醇酸。有效的氧化還原混合物包括半胱氨酸/氧、半胱氨酸/胱氨酸、半胱氨酸/胱胺、半胱胺/胱胺、還原型谷胱苷肽/氧化型谷胱苷肽等等。可選擇地，還原劑如DTT或2-巰基乙醇可加入重折疊混合物中以促進二硫鍵交換。可選擇地，金屬離子如銅(Cu++)或鈷(Co++)可加入重折疊混合物中以促進蛋白氧化。混合物中金屬離子的有效濃度是1 ìM至1mM，40ìM是優選的濃度。優選，重折疊混合物的pH在pH6和pH10之間。
備選地，通過使用變性試劑和可以是也可以不是半胱氨酸阻斷劑的二硫鍵還原劑，使不溶或聚集物質(或沒有裂解前的整個細胞)可溶或成為單體。有效的變性試劑包括但不限于如上所述的那些。有效的二硫鍵還原劑包括但不限于，DTT、2-巰基乙醇、氫硼鈉、三膦、硫醇如半胱氨酸、還原型谷胱苷肽、巰基乙酸和半胱胺。DTT和2-巰基乙醇可使用0.5-200mM的濃度，1-50mM是優選的濃度。然后，變性和還原的蛋白與當還原時可起半胱氨酸阻斷劑作用的摩爾過量(相對于還原劑的濃度)的二巰酚試劑。當還原時可起半胱氨酸阻斷劑作用的有效的二硫酚試劑的實例包括含有二硫鍵的化合物如胱氨酸、半胱氨酸、氧化型谷胱苷肽、二硫乙醇酸、5，5’-二硫基雙(2-硝基苯酸(Ellman′s試劑))、二硫吡啶、R-S-S-CO-OCH3型化合物，其中R是有機化合物，胱氨酸的其它衍生物如二甲酰胱氨酸、二乙酰胱氨酸、二氨基乙酰基胱氨酸、二丙氨酰胱氨酸、二谷氨酰胱氨酸、胱氨酰二甘氨酸、胱氨酰二谷酰胺、二丙氨酰胱氨酸二酐、胱氨酸苯基乙內酰脲、高胱氨酸、二硫二丙酸、二甲基胱氨酸，或任何硫醇或能夠經歷二硫鍵交換反應的化學藥品。蛋白的重折疊由降低變性試劑(使用上述方法)和添加還原劑如半胱氨酸、二硫蘇糖醇、2-巰基乙醇、還原性谷胱苷肽、巰基乙酸或其它硫醇來促進二硫鍵交換而啟動。優選，選擇試劑或試劑組合可引起天然二硫鍵形成和可逆阻斷游離半胱氨酸殘基。可選擇地，金屬離子如銅(Cu++)或鈷(Co++)可加入重折疊混合物中以促進蛋白氧化。可選擇地，甘油可加入重折疊混合物中以增加重折疊蛋白產量。重折疊混合物中甘油的有效濃度是1-50％(體積/體積)，10-20％是優選范圍。優選，重折疊混合物的pH是6-10。
盡管不希望受任何特殊理論的限制，據信用于本方法的半胱氨酸阻斷劑共價連接“游離”半胱氨酸殘基，形成混合二硫化物，因此穩定游離半胱氨酸殘基并防止蛋白多聚化和聚集。大量硫醇反應化合物可用作半胱氨酸阻斷劑來穩定含游離半胱氨酸的蛋白。除了半胱氨酸、半胱胺、巰基乙酸和還原型谷胱苷肽外，半胱氨酸阻斷劑也可以包括含二硫鍵的試劑如胱氨酸、胱胺、二巰基乙酸、氧化型谷胱苷肽、5，5’-二硫基雙(2-硝基苯酸(Ellman′s試劑))、二硫吡啶、R-S-S-CO-OCH3型化合物，胱氨酸的其它衍生物如二甲酰胱氨酸、二乙酰胱氨酸、二氨基乙酰基胱氨酸、二丙氨酰胱氨酸、二谷氨酰胱氨酸、胱氨酰二甘氨酸、胱氨酰二谷酰胺、二丙氨酰胱氨酸二酐、胱氨酸苯基乙內酰脲、高胱氨酸、二硫二丙酸、二甲基胱氨酸，或任何硫醇或能夠經歷二硫鍵交換反應的化學藥品。亞磺酰鹵化物也可以用于制備混合二硫化物。發現可用于穩定含游離半胱氨酸殘基蛋白的其它硫醇阻斷劑包括能夠可逆與游離硫醇反應的化合物。這些試劑包括鋅、汞和銀的某些重金屬鹽或有機衍生物。Cecil和McPhee(1959)和Torchinskii(1971)描述了其它硫醇化物形成試劑或可逆硫醇反應化合物。
可選擇地，從重折疊混合物可溶片段中其它蛋白中回收和分離含游離半胱氨酸殘基的可溶蛋白。周質回收和純化方法是本領域技術人員已知或容易確定的，包括，例如離心、過濾、透析、層析，包括大小排阻、離子交換、疏水交互作用和親和層析程序等等。合適的回收和純化期望蛋白的方法將部分依賴于蛋白特性和意欲的用途。
本發明也提供了制備生物活性G-CSF蛋白的新方法，尤其是野生型G-CSF，G-CSF(C17S)，和G-CSF和G-CSF(C17S)變異體，包括半胱氨酸變異體，(集體稱作“G-CSF蛋白”)，它引起已正確加工和具有生物活性的回收G-CSF蛋白的百分比明顯增加。這些新方法包括利用stII信號序列使G-CSF蛋白分泌到大腸桿菌周質中，變性和重折疊不溶或聚集G-CSF蛋白，并從復性/重折疊混合物的可溶片段中其它蛋白中純化可溶重折疊G-CSF蛋白。回收的G-CSF蛋白，當G-CSF蛋白在大腸桿菌細胞內表達時，缺乏非天然N末端甲硫氨酸殘基。出版的報道(Perez-Perez等1995)描述了使用修飾的ompA引導序列，G-CSF分泌到大腸桿菌周質中。然而，極少量的表達ompA-G-CSF融合蛋白被正確加工產生成熟G-CSF。通過大腸桿菌dnaJ和dnaK蛋白共表達，正確加工G-CSF蛋白的百分比可增加到總表達G-CSF蛋白的10-30％。在所有情況下，分泌的G-CSF蛋白大多不溶和無生物活性。本發明的方法產生了至少80-100％正確加工的G-CSF蛋白且不需要dnaJ和dnaK蛋白共表達。本發明也首次提供了不溶分泌G-CSF變性和重折疊為生物活性形式的方法。
如果期望，可進一步加工根據這些方法獲得的純化蛋白。例如，可用各種半胱氨酸反應部分在游離半胱氨酸殘基修飾分離的蛋白。例如，可用各種半胱氨酸反應性PEG試劑在游離半胱氨酸殘基PEG化蛋白，隨后如單PEG化蛋白純化。術語“單PEG化”定義是指單一PEG分子與蛋白共價連接修飾的蛋白。本領域技術人員已知的任何方法可用于從未修飾蛋白和未反應PEG試劑中純化PEG化蛋白，包括，例如，下面實施例中所述的方法，和PCT/US98/14497和PCT/US00/00931。其它有效的半胱氨酸反應部分的實例是半胱氨酸反應性右旋糖苷、半胱氨酸反應性碳水化合物和半胱氨酸反應性聚(N-乙烯吡咯烷酮)。
本發明也提供了GH，G-CSF，GM-CSF，α干擾素和其它含2N+1半胱氨酸殘基的蛋白，和其它含2N半胱氨酸殘基的蛋白，其中兩個或更多半胱氨酸殘基是游離的半胱氨酸突變蛋白的PEG化方法，尤其是混合二硫化物阻斷游離半胱氨酸殘基的那些突變蛋白和蛋白的PEG化方法。
本發明進一步涉及這里公開的方法制備的純化、單PEG化的蛋白變異體，它們不僅具有生物活性，而且在蛋白依賴性哺乳動物細胞增殖試驗中保持高度特異活性。這種蛋白變異體包括，例如，G-CSF，GH，GM-CSF，IFN-α2的純化、單PEG化半胱氨酸變異體。例如，這里描述的某些單PEG化G-CSF變異體的體外生物活性比用胺反應性NHS-PEG試劑PEG化的G-CSF的生物活性高3至50倍。
有25個以上不同的IFN-α基因(Pestka等1987)。IFN-α家族成員具有不同程度的氨基酸同源性并顯示出重疊的生物活性。通過不同IFN-α蛋白區域連接在一起產生的非天然重組IFN-α處于臨床發展的各個階段(Horisberger and DiMarco，1995)。也描述了非天然“一致(consensus)”干擾素(Blatt等1996)，它在IFN-α每個位置具有最普通的氨基酸。本發明的方法也對重折疊含游離半胱氨酸殘基的其它α干擾素種和非天然α干擾素蛋白有效。PEG化IFN-α2的半胱氨酸突變蛋白的有效的位點和區域可直接適用于IFN-α基因家族的其它成員和非天然IFN-α。Kinstler等(1996)描述了單PEG化一致干擾素，其中優選在N末端，非天然甲硫氨酸殘基通過胺或酰胺鍵單PEG化蛋白。PEG化蛋白的生物活性相對于未修飾一致干擾素降低大約5倍(Kinstler等1996)。
在單PEG化G-CSF的一個實施方案中，聚乙二醇與靠近G-CSF的螺旋A(Helix A)的區域連接，所得單PEG化G-CSF的EC50小于大約1000pg/ml(大約50pM)，優選小于大約100pg/ml(大約5pM)，更優選小于大約20pg/ml(大約1pM)和最優選小于大約15pg/ml(大約0.7pM)。可供選擇地，聚乙二醇部分(moiety)可與G-CSF的C-D環連接，所得單PEG化G-CSF的EC50小于大約1000pg/ml(大約50pM)，優選小于大約100pg/ml(大約5pM)，更優選小于大約20pg/ml(大約1pM)和最優選小于大約15pg/ml(大約0.7pM)。可供選擇地，聚乙二醇部分與遠離G-CSF的螺旋D的區域連接，所得單PEG化G-CSF的EC50小于大約1000pg/ml(大約50pM)，優選小于大約100pg/ml(大約5pM)，更優選小于大約20pg/ml(大約1pM)和最優選大約15pg/ml(大約0.7pM)。Kinstler等(1996)描述了單PEG化野生型G-CSF，其中優選在N末端，非天然甲硫氨酸殘基通過胺或胺鍵單PEG化蛋白。報道了單PEG化G-CSF蛋白的生物活性相對于未修飾G-CSF降低大約30％，盡管未提供EC50(Kinstler等1996)。Kinstler等(1996)沒有確定pEG修飾G-CSF的螺旋A最近區域的其它氨基酸是否產生生物活性的G-CSF蛋白。本發明的一個目的是公開了螺旋A靠近區域(the region proximal to HelixA)的其它氨基酸位點，和G-CSF的其它區域，其中可連接PEG，產生有生物活性的單PEG G-CSF蛋白。
在單PEG化GM-CSF的一個實施方案中，聚乙二醇與GM-CSF螺旋A靠近區域連接，所得單PEG化GM-CSF的EC50小于大約14000pg/ml(大約1000pM)，優選小于大約1400pg/ml(大約100pM)，更優選小于大約280pg/ml(大約20pM)和最優選小于大約140pg/ml(大約10pM)。可供選擇地，聚乙二醇部分與GM-CSF螺旋B-C環連接，所得單PEG化GM-CSF的EC50小于大約14000pg/ml(大約1000pM)，優選小于大約1400pg/ml(大約100pM)，更優選小于大約280pg/ml(大約20pM)和最優選小于大約140pg/ml(大約10pM)。可供選擇地，聚乙二醇部分與GM-CSF螺旋C-D環連接，所得單PEG化GM-CSF的EC50于大約14000pg/ml(大約1000pM)，優選小于大約1400pg/ml(大約100pM)，更優選小于大約280pg/ml(大約20pM)和最優選小于大約140pg/ml(大約10pM)。
在單PEG化GH的一個實施方案中，聚乙二醇與GH螺旋A靠近區域連接，所得單PEG化GH的EC50小于大約2000ng/ml(大約100nM)，優選小于大約200ng/ml(大約10nM)，更優選小于大約20ng/ml(大約1nM)和最優選小于大約2ng/ml(大約0.1nM)。
本發明進一步提供了可彼此共價連接或彼此結合或與化學基團結合的蛋白變異體而產生高度有序多聚體，如二聚體、三聚體和四聚體。這種高度有序多聚體(higher order multimer)可根據本領域技術人員已知的方法或如實施例2和20所述的方法制備。例如，這種結合物可產生比相應天然蛋白分子量更高的GH，G-CSF，GM-CSF或αIFN加合物。適合耦聯的化學基團優選無毒和無免疫原性的。這些化學基團將包括碳水化合物或聚合物如多元醇。
有效用于連接本發明的半胱氨酸變異體形成“PEG化”蛋白的“PEG部分”包括任何合適的聚合物，例如，線性或支鏈多元醇。優選的多元醇是聚乙二醇，它是包含乙烯氧化單位的合成聚合物。乙烯氧化單位可變化使得可得到大小排阻層析測定表觀分子量從大約10,000到大于500,000kDa的PEG化蛋白變異體。PEG部分的大小直接影響其循環半衰期(Yamaoka等1994)。因此，人們可通過改變PEG部分的大小和結構改造具有不同循環半衰期的蛋白變異體用于特殊治療應用或優選的劑量方案。因此，本發明包含大小排阻層析測定表觀分子量大于大約30kDa，更優選大于大約70kDa，EC50小于大約400ng/ml(18nM)，優選小于100ng/ml(5nM)，更優選小于大約10ng/ml(0.5nM)和甚至更優選小于大約2.2ng/ml(大約0.1nM)的GH蛋白變異體。本發明進一步包含大小排阻層析測定表觀分子量大于大約30kDa，更優選大于大約70kDa，EC50小于大約100ng/ml(5nM)，優選小于1000pg/ml(50pM)，更優選小于100pg/ml(6pM)和甚至更優選小于大約15pg/ml(0.7pM)的G-CSF蛋白變異體。本發明進一步包含大小排阻層析測定表觀分子量大于大約30kDa，更優選大于大約70kDa，EC50小于大約1900pg/ml(100pM)，優選小于400pg/ml(210pM)，更優選小于100pg/ml(5pM)和甚至更優選小于大約38pg/ml(2pM)的αIFN(IFN-α)蛋白變異體。本發明進一步包含大小排阻層析測定表觀分子量大于大約30kDa，更優選大于大約70kDa，EC50小于大約14,000pg/ml(ˉ1000pM)，優選小于1400pg/ml(～100pM)，更優選小于280pg/ml(20pM)和甚至更優選小于大約140pg/ml(～1pM)的GM-CSF蛋白變異體。
用于半胱氨酸修飾的反應性PEG末端基團包括但不限于乙烯砜、馬來酰亞胺和吲哚乙酰部分(moiety)。PEG末端基團應該是硫醇特異性的，反應在對蛋白無害的條件下進行。
如PCT/US98/14497和PCT/US/00/00931描述用添加半胱氨酸變異體GH可制備拮抗劑hGH變異體。將從給予GH拮抗劑中受益的情況包括肢端肥大癥、vascular eye diseases、糖尿病腎病、血管成形術后再狹窄和生長激素反應性惡性腫瘤。
這里使用的術語“衍生物”是指本方法表達和回收的任何蛋白變異體。這種變異體包括但不限于，PEG化類型(version)、二聚體和其它高度有序變異體、氨基酸變異體、截短變異體、融合蛋白、碳水化合物、磷酸化的改變或其它天然蛋白中發現的連接基團，和這里公開的任何變異體。
本方法制備的化合物可用于各種體外和體內應用。本發明的蛋白及其衍生物可用于已知的它們的野生型、天然或以前所知的修飾副本(counterpart)的研究、診斷或治療目的。體外應用包括，例如，蛋白用于篩選、檢測和/或純化其它蛋白的用途。
對于治療的目的，本領域技術人員容易確定合適的劑量、劑量頻率和給藥途徑。做這種決定的因素包括但不限于，待給予的蛋白的性質、待治療的情況、潛在患者適應性、患者的年齡和體重等等。本發明的化合物也可用作增加連接的治療物循環半衰期或指導傳遞到體內特異目標的傳遞載體。
下列實施例不旨在限制本發明，只是本發明具體實施方案的示例。
實施例不溶GH T3C突變蛋白(3位蘇氨酸改變半胱氨酸；PCT/US98/14497和PCT/US/00/00931描述)在大腸桿菌中作為用如PCT/US/00/00931所述的stII引導序列而分泌到周質間隙的蛋白表達。用下列兩個步驟溶解和重折疊T3C蛋白，其中兩個都使用半胱氨酸作為還原劑和作為半胱氨酸阻斷劑來穩定游離半胱氨酸殘基。表達T3C突變蛋白的大腸桿菌株培養物(200ml)生長和T3C表達誘導如PCT/US/00/00931所述。細胞裂解和不溶部分離心分離如實施例14所述。含T3C的不溶物質溶于20mL 8M尿素、20mM半胱氨酸、20mM Tris pH9中并在室溫振蕩混合1小時。溶解混合物接下來分為兩份，一半稀釋于50mL 10％甘油，20mM Tris，pH8，另一半稀釋于50mL 0.5％ TWEEN 20，20mM Tris，pH8。重折疊物離心澄清前在4℃保存24小時并填入預先在20mM Tris，0.5％ Tween 20，pH7.6中平衡的5mLQ-Sepharose Hi Trap柱中。在含0-300mM NaCl的0.5％ Tween 20，20mMTris pH7.6的20柱體積梯度中從柱中洗脫重折疊可溶的T3C。用非還原型SDS-PAGE分析回收的柱級分。單體T3C在大約160mM NaCl洗脫。從復性緩沖液中含甘油重折疊物中回收大約790μg單體T3C。當復性緩沖液中存在Tween 20時，從重折疊物中回收大約284μg單體T3C。結果表明使用重折疊/復性步驟可得到可溶單體T3C蛋白。基于單體T3C蛋白較高的回收量，甘油在隨后重折疊實驗中用作穩定劑。
根據實施例1和2所述的步驟制備的可溶重折疊GH半胱氨酸突變蛋白可通過本領域技術人員所知的各種層析步驟來純化。這些層析步驟包括離子交換，大小排阻、疏水相互作用(HIC)，金屬螯合親和層析(IMAC)，大小排阻層析(SEC)，反相層析或這些技術的組合。作為一個實例，可使用在20mM Tris-HCl，pH8.0中平衡的Q-Sepharose快速流動樹脂(Pharmacia)從重折疊混合物的可溶片段中捕獲GH突變蛋白。用20mM Tris-HCI，pH8.0洗滌柱，用線性10-20體積含鹽濃度從0至250mM NaCl不斷增加的20mMTris-HCl，pH8.0洗脫結合蛋白。可選擇地，甘油(10％終濃度)可加入到柱緩沖液中。可用SDS-PAGE和Western印跡鑒定含hGH突變蛋白的級分。可用于從重折疊/復性混合物的可溶片段中捕獲hGH突變蛋白的可供選擇的樹脂包括HIC，其它離子交換樹脂或親和樹脂。
可用疏水相互作用層析可進一步純化半胱氨酸突變蛋白。可匯合含GH突變蛋白的Q-Sepharose柱級分，加入NaCl至終濃度為2M。匯合物可填入在2M NaCI，20mM硫酸鈉pH7.5中預先平衡的丁基Sepharose快速流動樹脂。可使用含從2M至0M NaCl逆向鹽梯度的20mM磷酸鹽(phosphate)pH7.5從樹脂中洗脫GH突變蛋白。可用SDS-PAGE和Western印跡鑒定含GH突變蛋白的級分。可供選擇地，可匯合含GH突變蛋白的Q-Sepharose柱級分，并在加載到苯基Sepharose柱前，加入硫酸銨至終濃度為2M。可用含從2M至0M NaCl逆向鹽梯度的20mM磷酸鈉pH7.5從樹脂中洗脫GH突變蛋白。可用SDS-PAGE和Western印跡鑒定含GH突變蛋白的級分，并匯合。
如果需要進一步純化，含GH突變蛋白的HIC匯合物可直接填入在10mM磷酸鈉，0.5fM NaCI，pH7.5中平衡的鎳螯合樹脂(Qiagen)。洗滌步驟后，可使用含0-30mM imidizole梯度的10mM磷酸鈉，0.5M NaCI，pH7.5回收GH突變蛋白。GH對鎳有高親和力，推測通過H18，H21和E174形成的二價金屬結合位點。結果，可使用金屬螯合柱得到高純度形式的GH(Maisano等1989)。GH突變蛋白將與鎳柱緊密結合并在相似的imidazole濃度(大約15mM)下以野生型GH洗脫。可供選擇地，銅螯合柱可用于替換鎳螯合柱。
可使用PCT/US00/00931描述的細胞增殖實驗測定純化GH半胱氨酸突變蛋白的生物活性。可使用Bradford染料結合實驗(Bio-Rad Laboratories)確定蛋白濃度。
T3C突變蛋白純化如下。600mL大腸桿菌培養物生長和誘導T3C蛋白表達如上所述。如實施例5和14所述用洗滌劑/溶菌酶混合物(B-PerPerTM，Pierce)處理細胞以分離不溶T3C。不溶物質懸浮于40mL 8M尿素，20mMTris，20mM半胱氨酸，pH9中。室溫混合一個小時后，溶解混合物稀釋至200mL 15％甘油，20mM Tris，pH8，40μM硫酸銅。重折疊物在4℃保存過夜。第二天，離心澄清重折疊物并填入在10％甘油，20mM Tris，pH8中平衡的5mL Q-Sepharose Hi Trap柱。用20柱體積含梯度從0-250mM NaCl的20mM Tris，pH8，10％甘油洗脫回收T3C。用非還原型SDS-PAGE分析回收的級分。匯合主要含正確表觀分子量T3C蛋白的級分。混合的級分產生4.6mg純化T3C蛋白。這種物質用于實施例3中所述的PEG化研究。如實施例1和2和PCT/US98/14497和PCT/US00/00931所述在GH-R4細胞增殖試驗中測定純化的T3C蛋白的生物活性。T3C蛋白刺激GH-R4細胞增殖，EC50為1.35ng/ml。
用這個方法制備的其它GH半胱氨酸突變蛋白包括*-1C，P2C，P5C，K38C，Q40C，K41C，S55C，S57C，T60C，Q69C，N72C，N99C，L101C，V102C，Y103C，D130C，S132C，P133C，R134C，T135C，Q137C，K140C，Q141C，T142C，Y143C，K145C，D147C，N149C，S150C，H151C，N152C，D153C，E186C和G187C。用PCT/US00/00931所述的GH-R4細胞增殖試驗測定某些純化的GH半胱氨酸突變蛋白的生物活性。觀察到的突變蛋白*-1C，P2C，P5C，K38C，Q40C，S55C，N99C，L101C，V102C，Y103C，P133C，Q137C，K140C，Y143C，D147C，N149C，E186C，和G187C的EC50從0.7ng/ml至2.2ng/ml。這些值都接近等同于在這些試驗中野生型GH對照觀察到的EC50，它從0.3ng/ml至1.5ng/ml。
下列條件用于PEG化GH突變蛋白T3C和純化PEG化T3C蛋白。用如實施例2(使用半胱氨酸作為還原劑和半胱氨酸阻斷劑以穩定重折疊蛋白)所述的等分重折疊T3C蛋白，TCEP[Tris(2-羧乙基)膦]-HCI作為還原劑和來自Shearwater Polymers(Huntsville，Alabama)的5kDa半胱氨酸反應性PEGs確定起始PEG化反應條件。在100mM Tris，pH8.5中，不同量過量5kDa馬來酰亞胺-PEG或5kDa乙烯砜-PEG存在下，室溫下，2μg等分純化T3C與濃度不斷增加的TCEP共同溫育。120分鐘后，立即用非還原型SDS-PAGE分析等分反應物。在pH8.5，5倍摩爾過量TCEP和15倍過量摩爾的5kDa馬來酰亞胺或5kDa乙烯砜PEG可產生相當量的單PEG化T3C蛋白，兩個小時后沒有可檢測到的二或三PEG化蛋白。為了PEG化，需要用還原劑如TCEP處理使T3C突變蛋白部分還原。在相同部分還原條件下，野生型GH不PEG化，表明PEG部分與引入突變蛋白中的半胱氨酸殘基連接。這些條件用于按比例放大純化和估計生物活性的PEG化反應。在室溫進行2小時更大PEG化反應(300μg)，使用5倍過量TCEP和15倍10kDa馬來酰亞胺PEG。反應時間末，PEG化混合物用冰冷20mM Tris，15％甘油，pH8.0稀釋2X并立即填入Q-Sepharose柱(1mL，HiTrap)。通過在20mL含梯度從0-0.2M NaCl的20mM Tris，15％甘油，pH8中進行，從柱中洗脫PEG化T3C。PEG部分的存在降低蛋白對樹脂的親和力，允許PEG蛋白化與非PEG化蛋白分離。用SDS-PAGE鑒定富含單PEG化T3C(連接T3C單體的單一PEG分子)的級分，匯合并冰凍。在大約80mM NaCl洗脫單PEG化T3C蛋白，用SDS-PAGE測定其表觀分子量大約30kDa。
也用上述方法制備10K PEG-T3C，20K PEG-T3C和40 K PEG-T3C。實施例1和2和PCT/US98/14497和PCT/US/00/00931所述的細胞增殖試驗中測定純化PEG-T3C蛋白生物活性以確定其特異活性。類似于野生型GH和非PEG化T3C蛋白，PEG-T3C蛋白刺激GH-R4細胞。5K PEG-T3C蛋白的EC50是1.2ng/ml，10K PEG T3C的EC50是1.2ng/ml，20K PEG T3C的EC50是3-4ng/ml。可使用實施例1和2和PCT/US98/14497和PCT/US/00/00931所述的細胞增殖試驗確定40K PEG-T3C的EC50。可如PCT/US98/14497和PCT/US/00/00931和實施例4所述確定PEG-T3C和其它PEG化GH半胱氨酸突變蛋白的體內功效。
根據上面略述的的步驟PEG化和純化的GH其它半胱氨酸突變蛋白包括P2C，P5C，S132C，P133C和R134C。使用實施例1和2和PCT/US98/14497和PCT/US/00/00931所述的細胞增殖試驗確定用20kDaPEG部分修飾的這些突變蛋白的生物活性。觀察到這些PEG化突變蛋白的EC50從1.7ng/ml至6.0ng/ml。這些值都相似于，但略高于并列進行的野生型GH對照試驗觀察到的EC50。這些野生型GH對照的EC50從0.6ng/ml至1.2ng/ml。
A. PEG-T3C刺激體細胞生長的能力在垂體切除(HYPOX)的大鼠中確定，由于其垂體被去除，它不能合成生長激素。HYPOX雄性Sprague-Dawley大鼠購自商業賣主，重量大約90g。大鼠適應環境13天。在適應環境期間增長4g的動物從研究中挑除。每天同一時間(930AM)測定體重。按體重將大鼠隨機分為各個檢測組。每組5只大鼠，除了每天接受20kDa-PEG-T3C的組僅有四只大鼠。每天稱重大鼠，每天或每隔一天皮下注射安慰劑(含200μg/ml大鼠血清白蛋白(Sigma化學藥品公司)的磷酸緩沖鹽(PBS))，商業重組人生長激素，Nutropin，或如實施例3中所述制備的各種劑量的20kDa-PEG-T3C。所有蛋白溶液在含200μg/ml大鼠血清白蛋白的PBS中制備。動物連續處理9天。在第10天，殺死動物并收集它們的脛骨。脛骨固定于10％中性緩沖福爾馬林中。在5％甲酸中去除固定的脛骨中的石灰質，在額狀面的近末端切開。用石蠟包埋加工脛骨并以8微米切片和甲苯胺藍染色。在左側脛骨上測定脛骨骨垢寬度(每個脛骨5個測定值)。不同檢測組的累積獲得體重和脛骨骨垢測定值在表2中顯示。結果表明20kDa-PEG-T3C刺激生長激素不足大鼠的體重增加和骨生長。表2每天或每隔一天給予安慰劑、Nutropin或20kDa-PEG-T3C對垂體切除大鼠的體重增加和脛骨骨垢寬度的作用


a使用雙側T檢驗p＜0.05每天安慰劑b使用雙側T檢驗p＜0.05每隔一天安慰劑c使用雙側T檢驗p＜0.05每隔一天NutropinB. 如實施例4.A.所述進行第二個實驗，除了檢測化合物每天或每三天皮下注射給予。此外，檢測一個劑量的用40kDa-PEG修飾的T3C。HYPOX雄性Sprague-Dawley大鼠購自商業賣主，體重大約100g。每天同一時間測定體重。按體重將大鼠隨機分為各個檢測組。每組5只大鼠，除了每天接受40kDa-PEG-T3C的組。每天稱重大鼠，每天或每三天皮下注射安慰劑(含200μg/ml大鼠血清白蛋白(Sigma化學藥品公司)的磷酸緩沖鹽(PBS))，商業重組人生長激素，Nutropin，各種劑量的20kDa-PEG-T3C或40kDa-PEG-T3C。如實施例3所述制備PEG-T3C蛋白。所有蛋白溶液在含200μg/ml大鼠血清白蛋白的PBS中制備。動物連續處理9天。在第10天，殺死動物并收集它們的脛骨并如實施例4.A.所述準備切片。不同檢測組的累積獲得體重和脛骨骨垢測定值在表3中顯示。結果表明20kDa-PEG-T3C和40kDa-PEG-T3C刺激生長激素不足大鼠的體重增加和骨生長。表3每天或每三天給予安慰劑、Nutropin、20kDa-PEG-T3C或40kDa-PEG-T3C對垂體切除大鼠的體重增加和脛骨骨垢寬度的作用


實施例5重折疊和純化IFN-α2半胱氨酸突變蛋白PCT/US00/00931描述了表達、純化和確定重組人α干擾素(IFN-α2)和IFN-α2半胱氨酸突變蛋白的體外和體內生物活性的方法。PCT/US98/14497和PCT/US00/00931中也描述了構建IFN-α2半胱氨酸突變蛋白的方法和IFN-α2蛋白內放置添加的半胱氨酸殘基的優選位點。使用那些方法已經在大腸桿菌中構建了下列突變蛋白C1S，Q5C，43C44，N45C，Q46C，F47C，Q48C，A50C，D77C，C98S，Q101C，T106C，E107C，T108C，S163C，E165C，*166C，D2C，L3C，T6C，S8C，T52C，G102C，V103C，G104C，V105C，P109C，L110C，M111C，S160C，L161C，R162C和K164C。在大腸桿菌中表達IFN-α2的一個優選方法是用STII引導序列將蛋白分泌到周質中。分泌的IFN-α2片段可溶且可用柱層析純化如PCT/US00/00931所述。使用STII引導序列，某些IFN-α2半胱氨酸突變蛋白當分泌到大腸桿菌周質時，保持不溶。SDS-PAGE分析突變蛋白的滲透壓休克上清顯示多數已經降到(與野生型相比)19kDa rIFN-α2帶的水平。整個細胞溶解產物和滲透壓休克的不溶物質的SDS-PAGE分析揭示這些突變蛋白以相對高水平表達，但主要以不溶形式蓄積，推測在周質中。在還原條件下，這些蛋白與野生型rIFN-α2標準共同遷移(comigrated)，表明STII引導子已經去除。表4中總結了突變蛋白相對表達水平的定性評價。重折疊不溶分泌的IFN-α2蛋白的步驟以前沒有描述。實施下列方案(這里稱作“方案I”)表達和重折疊IFN-α2半胱氨酸突變蛋白為生物活性形式。
對于IFN-α2半胱氨酸突變蛋白和IFN-α2的表達，325ml培養物置于2升振蕩瓶中，或500ml培養物置于2升有擋板振蕩瓶中，在旋轉式搖床振蕩儀水浴中以ˉ170-220rpm在37℃生長。培養物生長、誘導、收獲和接受滲透壓休克如PCT/US00/00931所述。所得上清和沉淀立即處理或保存在-80℃。
使用重折疊步驟對在滲透壓休克沉淀中以不溶蛋白回收的IFN-α2半胱氨酸突變蛋白進行變性、降低和重折疊為其正確構象。首先用制造商(Pierce)描述的B-PERTM細菌蛋白提取試劑處理來自滲透壓休克裂解液的沉淀。B-PER是破裂大腸桿菌膜并釋放細胞的細胞質內容的溫和洗滌劑混合物。離心回收不溶物質，重懸于水中，再次離心。所得沉淀溶于5mL含6M胍，50mM半胱氨酸的20mM Tris堿中。允許混合物攪拌30分鐘后在4℃用400mL的40mM磷酸鈉，150mM NaCl，pH8.0透析過夜。第二天，將重折疊混合物的pH調到3.0，混合物離心后填入S-Sepharose柱，隨后是Cu++IMAC柱，如PCT/US00/00931所述的用于從滲透壓休克上清中純化IFN-α2。用這些步驟重折疊和純化了六個IFN-α2半胱氨酸突變蛋白Q5C，C98S，Q101C，T106C，E107C和*166C。相似的步驟可用于重折疊和純化不溶野生型IFN-α2。
純化的Q5C，C98S，Q101C，T106C，E107C和*166C半胱氨酸突變蛋白的非還原型SDS-PAGE分析表明突變蛋白主要以單體回收，在期望的～19kDa分子量遷移。由于缺乏天然Cysl-Cys-98二硫鍵，C98S比其它rIFN-α2突變蛋白遷移的分子量稍高。有些純化突變蛋白含有少量二硫鍵連接的rIFN-α2二聚體。二聚體種的分子量大約37-38kDa。
當加工大量IFN-α2半胱氨酸突變蛋白時，發現某些半胱氨酸突變蛋白在細胞裂解后看來存在于可溶和不溶部分中。可溶與不可溶IFN-α2蛋白的比率在不同突變體之間變化。因此，進行包含整個細胞溶解步驟的可供選擇的溶解/重折疊步驟(這里稱作“步驟II”)來增加IFN-α2半胱氨酸突變蛋白回收。發現培養方法的改進可提高加工STII引導序列的效率并利用之來表達重折疊和純化的IFN-α2半胱氨酸突變蛋白，如下詳述。在改進方法中，325-400ml培養物在含100mM MES，pH5.0和100μg/ml氨芐西林的LB培養基中生長，37℃有力振蕩，如在New Brunswick C25KC環境振蕩器中220-250rpm，至細胞密度在600nm下為0.5-0.7OD。然后，添加IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至終濃度為0.5mM誘導培養物，誘導時溫度降至28℃，振蕩器速度降至140rpm。誘導的培養物培養過夜(14-18小時)并離心收集。細胞沉淀立即處理或保存在-20℃或-80℃直到處理前。325-400ml誘導培養物得到的細胞沉淀首先懸浮于10ml的8 M胍，20mM半胱氨酸，20mM Mes，2％Tween 20，pH3并混合直到出現均質懸液。然后pH增加到pH8-9之間，溶解混合物攪拌3小時。下一步，用冰冷復性緩沖液(20mM Tris，pH0.3M胍，1M尿素，40μm硫酸銅，pH8)稀釋細胞裂解液。允許云絮狀懸液在4℃放置1-2天。離心澄清重折疊，隨后pH調整到3并進行第二輪離心。上清用冷水1∶4稀釋并填入5mL S-Seph Hi Trap。用100mL 0-70％梯度的緩沖液B和20mM Mes，pH5的緩沖液A洗脫離子交換柱，緩沖液B是10％乙二醇500mM NaCI，20mM Mes pH5。可供選擇地，可使用HIC柱，如苯基-Sepharose柱從重折疊混合物中捕獲重折疊IFN-a半胱氨酸突變蛋白。重折疊混合物首先離心，硫酸銨加入上清中至終濃度10％，混合物再次離心，上清填入在10％硫酸銨、20mM Tris，pH8中平衡的10mL苯基-Sepharose柱中。用100mL從10％硫酸銨、20mM Tris pH8至30％乙二醇、20mM Tris，pH8的線性梯度從柱中洗脫IFN-a半胱氨酸突變蛋白。可進一步用銅螯合柱，S-Sepharose柱或二者皆有進一步純化來自苯基-Sepharose柱的干擾素匯合物。
也可以用也起半胱氨酸阻斷劑作用的其它還原劑溶解和重折疊干擾素半胱氨酸突變蛋白。還原型谷胱苷肽、巰基乙酸或半胱胺置換溶解/重折疊混合物中的半胱氨酸產生可在實施例7所述步驟后純化和PEG化的重折疊、可溶IFN半胱氨酸變異體。當沒有還原劑或20mM DTT置換溶解/重折疊混合物中的半胱氨酸時，重折疊可溶IFN半胱氨酸突變蛋白產物降低到用逆向HPLC分析重折疊混合物時不可檢測的水平。另外，當沒有還原劑或20mMDTT置換溶解/重折疊混合物中的半胱氨酸時，重折疊混合物S-Sepharose層析后沒有回收到重折疊可溶IFN半胱氨酸突變蛋白。
用方案II使下列突變蛋白在大腸桿菌中表達、重折疊和純化C1S，Q5C，43C44，N45C，F47C，Q48C，A50C，C98S，Q101C，T106C，E107C，S163C，E165C，*166C，D2C，L3C，T6C，S8C，T52C，G102C，V103C，G104C，V105C，P109C，L110C，M111C，S160C，L161C，R162C和K164C。這些重折疊物在pH8或有些情況下在pH7.5下進行。
4商業上的野生型rIFN-α2(Endogen，Inc.)5Bolder BioTechnology，Inc.制備的野生型rIFN-α2
6C螺旋產生游離半胱氨酸(C98)突變7N末端區產生游離半胱氨酸(C1)突變如PCT/US00/00931描述的Daudi生長抑制試驗測定用實施例5的方案II純化的下列突變蛋白的生物活性CIS，D2C，L3C，S8C，N45C，F47C，C98S，V103C，V105C，E107C，M111C，R162C，S163C，K164C，E165C和*166C。觀察的IC50s在表5中列出，在相同的實驗中使用野生型rIFN-α2蛋白對照。表5.由方案II帶和不帶PEG化而純化的IFN-α2半胱氨酸突變蛋白的體外生物活性


1各個實驗得到的IC50值。當N＞5時，顯示范圍。
2商業上的野生型rIFN-α2(Endogen，Inc.)3Bolder BioTechnology，Inc.制備的野生型rIFN-α24突變在C螺旋產生游離半胱氨酸(C98)5突變在N末端區產生游離半胱氨酸(C1)
大量IFN-α2半胱氨酸突變蛋白可用各種大小的半胱氨酸反應性PEGs修飾并純化得到進行生物活性測定的足夠物質。對于PEG化蛋白的純化，應該如上述在室溫下進行1小時的較大PEG化反應，用20mM MES，pH5.0稀釋10X，調節到pH3.0，然后快速填入S-Sepharose柱，使用與最初純化rIFN-α2突變蛋白所述的那些條件相似的條件。PEG部分的存在降低了蛋白對樹脂的親和力，允許PEG化蛋白與未PEG化蛋白分離。S-Sepharose柱的層析圖譜應該顯示兩個蛋白主峰。早期的洗脫主峰(在NaCl濃度低于230mM時洗脫)應該是單PEG化IFN-α2蛋白，非還原型SDS-PAGE分析可證實。SDS-PAGE測定已經用5kDa半胱氨酸反應性PEG修飾的單PEG化IFN-α2的表觀分子量大約28kDa。隨后的洗脫主峰(在大約230mM NaCl洗脫)應該是未反應的IFN-α2蛋白。主要含PEG-IFN-α2的早期洗脫峰的級分可以混合并用于生物活性測定。可如PCT/US00/00931所述Daudi細胞試驗測定純化的PEG-IFN-α2蛋白的生物活性。可用Bradford染料結合試驗確定蛋白的濃度。可如PCT/US98/14497和PCT/US/US00/00931所述確定PEG化IFN-α2半胱氨酸突變蛋白的體內生物活性。
對于Q5C突變蛋白的PEG化，用100mM Tris，pH8將純化蛋白稀釋為100μg/ml的蛋白。加入15倍過量的5Kda馬來酰亞胺PEG，隨后加入10-15倍摩爾過量TCEP。一旦蛋白被部分還原，也加入EDTA(0.5mM終濃度)抑制二硫化物形成。混合物在室溫下保持2小時。也得到好的PEG效率的可供選擇的方法包括重復添加PEG和TCEP試劑。我們已經發現添加3輪10×摩爾過量PEG試劑和10×摩爾過量TCEP超過2小時得到大于80％PEG化效率。重復添加PEG和TCEP試劑的這個隨后步驟用于成功制備10kDa，20kDa和40kDa-PEGs的修飾的Q5C。用離子交換層析，使用實施例5所述的S-Sepharose使PEG化蛋白和未反應Q5C起始材料和PEG化試劑分離。可以使用可供選擇的方法如其它離子交換儀(Q，DEAE，CM)，HIC樹脂(苯基、丁基)，親和柱，大小排阻柱或螯合樹脂純化PEG化蛋白。
如PCT/US00/00931所述的Daudi細胞試驗測定純化的10kDa，20kDa和40kDa-PEG-Q5C蛋白的生物活性。用Bradford染料結合試驗確定蛋白濃度。確定10kDa，20kDa和40kDa-PEG-Q5C蛋白的平均IC50s分別是70pg/ml(N＝2試驗)，100pg/ml(N＝8試驗)，和108pg/ml(N＝8試驗)。
用PCR修飾這個G-CSF克隆用于野生型G-CSF(野生型)和絲氨酸取代17位天然產生游離半胱氨酸的變異體(C17S)在大腸桿菌中周質和細胞質中的表達。野生型G-CSF蛋白含有5個半胱氨酸，其中兩個參與關鍵的二硫鍵，一個游離半胱氨酸(C17)被部分遮掩，不是活性所需(Ishikawa等1992，Kuga等1989，Lu等1992，Wingfield等1988)。為了避免未配對半胱氨酸引起的潛在困難，我們構建了含17位Cys置換為Ser(C17S)的變異體作為我們的平臺分子(platform molecule)。制備存在C17S置換的所有后來的半胱氨酸突變蛋白。已經報道G-CSF(C17S)具有與野生型G-CSF等同的生物活性(Ishikawa等1992，Lu等1992)。
分泌的G-CSF不含有添加的N末端甲硫氨酸且具有與天然產生G-CSF等同的氨基酸序列(Souza等1986)。為了表達分泌形式的G-CSF，用PCR將大腸桿菌熱穩定腸毒素(STII)基因的引導序列(Picken等1983)與成熟G-CSF的編碼序列融合，TAA終止密碼子加到羧基末端殘基P174后。同時，也修飾G-CSF編碼序列氨基末端。脯氨酸2，5和10位的密碼子全部變為CCG，為了利于后續誘變步驟，將L18密碼子由TTA變為CTC引入Xho I限制性位點。
野生型和C17S基因并列進行這些構建并利用三個后續PCR反應。對于C17S構建體，第一個反應使用正向引物BB116(5＞GGCCCGGCCAGCTCCCTGCCGCAGAGCTTCCTGCTGAAGAGCCTCGAGCAAGTGCGTAAGATCCAG＞3；SEQ ID NO3)和反向引物BB114(5＞CGCGAATTCTTAGGGCTGGGCAAGGTGGCG＞3；SEQ ID NO4)和克隆G-CSF cDNA作為模板。BB116與成熟G-CSF編碼序列5’末端退火并引入在P2，P5，P10上標記的密碼子改變，不改變編碼的氨基酸的L18。也引入C17S突變(TGC＝＞AGC)并將15位亮氨酸變為優選的CTG三聯體。BB114與G-CSF編碼序列3’末端(18bp)退火并就在羧基末端殘基P174后引入TAA翻譯終止密碼子。BB114也含有為克隆目的的Eco RI位點。對于野生型構建體，第一個反應使用正向引物BB117(5＞GGCCCGGCCAGCTCCCTGCCGCAGAGCTTCCTGCTTAAGTGCCTCGAGCAAGTGCGTAAGATCCAG＞3；SEQ ID NO5)和反向引物BB114(上述序列)，克隆G-CSF cDNA作為模板。BB117除了兩個例外，與BB116等同；存在天然產生的C17密碼子，TGC和使用L15密碼子是CTT。為了提供區別野生型C17克隆和C17S變異體的快速和方便方法，這個CTT產生Af1 II限制性位點。C17S克隆在15位攜帶CTG密碼子，因此缺乏Af1 II限制性位點。凝膠純化每個反應得到的～530bp PCR產物并用作第二個PCR反應的模板。
對于第二個反應，使用正向引物BB115(5＞ATGTTCGTTTTCTCTATCGCTACCAACGCGTACGCAACCCCGCTGGGCCCGGCCAGCTCCCTG＞3；SEQ ID NO6)和反向引物BB114(上述)擴增每個～530bp凝膠純化產物。BB115的3’部分(27個核苷酸)與在野生型和C17S PCR產物等同的修飾的成熟G-CSF編碼序列的5’末端退火。BB115的5’片段(36個核苷酸)編碼STII引導肽的一部分。凝膠純化每個這些第二級反應的～550bp PCR產物并用作第三個和最后一輪PCR的模板。
在第三個反應中，用正向引物BB11(5＞CCCCCTCTAGACATATGAAGAAGAACATCGCATTCCTGCTGGCATCTATGTTCGTTTTCTCTATCG＞3；SEQ ID NO7)和反向引物BB114(上述)擴增每個～550bp凝膠純化產物。BB11添加STII引導肽的剩余物并含有用于克隆目的覆蓋STII引導肽起始ATG的Nde I位點以及Xba I位點。用Eco RI和Xba I消化這些反應的～620bp產物并克隆到類似消化的質粒載體pBC-SK(+)(Stratagene)中進行測序。
對于野生型構建體，發現一個克隆，消化的pBBT187，含有620bp的含STII-G-CSF編碼序列的NdeI-EcoRI片段的正確序列。然后，這個片段亞克隆到(Nde I+Eco RI)切割表達載體pCYB 1(New England BioLabs)。所得質粒術語稱作pBBT188。對于C17S構建體，發現測序的三個克隆無一含有正確序列；全部都有一個或多個錯誤。一個克隆在STII引導肽A10位含單一錯義突變；620bpNdeI-EcoRi片段的剩余序列是正確的。這個克隆和質粒pBBT188之間的體外重組用于產生pCYB1中序列正確STII-G-CSF(C17S)構建體。在STII引導肽A10位含單一錯義突變的pBBT188和C17S都用BsiWI和EcoRI消化。兩個質粒任何一個存在的唯一EcoRI位點位于G-CSF翻譯終止密碼子。Bsi WI也僅在STII引導肽編碼序列內的位點中切割一次，從成熟G-CSF編碼序列開始的7bp。因此，用具有正確C17S構建序列的～535bp Bsi WI-Eco RI片段取代pBBT188的～535bp BsiWI-Eco RI片段，我們得到了表達STII-G-CSF(C17S)編碼序列的pCYB1衍生物。這個質粒記做pBBT223。
對于在大腸桿菌細胞質中的表達，用PCR修飾克隆的STII-G-CSF野生型和STII-G-CSF(C17S)基因以消除STII引導序列并就在成熟G-CSF氨基末端氨基酸(T1)密碼子之前添加起始甲硫氨酸密碼子(ATG)。用引物BB166(5＞CGCCATATGACCCCGCTGGGCCCGGCCAG＞3；SEQ ID NO8)和BB114(上述)擴增序列證實的STII-G-CSF野生型和STII-G-CSF(C17S)克隆。BB166與成熟G-CSF的編碼序列5’末端退火且編碼成熟G-CSF第一個氨基酸前的起始甲硫氨酸。為了克隆目的，包含一個覆蓋ATG的Nde I位點。用Nde I加在Nde I位點上游～400bp切割的Aat II消化這些PCR反應的～540bp產物。凝膠純化這些～400bp片段并克隆進入已經用Nde I加Aat II切割的上述pBC-SK(+)STII-G-CSF，pBBT187，用堿性磷酸酶處理并凝膠純化。一個Met-G-CSF野生型和一個Met-G-CSF(C17S)克隆進行測序，發現都含有正確序列。這些Met-G-CSF野生型和Met-G-CSF(C17S)基因以NdeI-Eco RI片段亞克隆進入上述的Nde I-Eco RI切割表達載體pCYB1。所得質粒消化pBBT225＝pCYB1Met-G-CSF和pBBT226＝pCYB1Met-G-CSF(C17S)。
B.野生型G-CSF和G-CSF(C17S)在大腸桿菌中的表達。編碼Met-G-CSF野生型的pBBT225，編碼Met-G-CSF(C17S)的pBBT226和pCYB1親本載體轉化大腸桿菌JM109。這些株的實驗引起G-CSF蛋白表達。優選分泌的G-CSF，野生型和C17S形式的，因為它們在細胞質中表達的Met-G-CSF蛋白的N末端缺乏非天然甲硫氨酸殘基。
對于分泌的G-CSF表達，pBBT188[pCYB1STII-G-CSF]，pBBT223[pCYB1STII-G-CSF(C17S)]和親本載體pCYB1轉化大腸桿菌W3110。所得株記做BOB130W3110(pCYB1)，BOB213W3110(pBBT188)和BOB268W3110(pBBT223)。在初步篩選實驗中，菌株在滾動管(roll tube)中，含100μg/ml氨芐西林的Luria肉湯培養基(LB培養基)中37℃過夜生長。飽和的過夜培養物在含100μg/ml氨芐西林的LB培養基稀釋到在A600為0.025O.D.，并在振蕩瓶中28，37或42℃培養。典型地，25ml培養物在250ml振蕩瓶中生長。當培養物的O.D.達到～0.3-0.5時，加入IPTG使終濃度為0.5mM，以誘導G-CSF表達。對于最初實驗，0，1，3，5和～16h誘導后，抽樣檢查培養物。用預制的14％ Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和考馬斯蘭染色分析誘導和未誘導培養物的樣品。BOB213(野生型)和BOB268(C17S)的誘導培養物在大約19kDa出現條帶，與成熟G-CSF分子量一致。在BOB213和BOB268的未誘導培養物或僅是對照載體的BOB130的誘導或未誘導培養物中沒有檢測到這條帶。Western印跡分析表明在BOB213和BOB268溶菌產物中的這個～19kDa條帶與抗人G-CSF抗血清(R & D Systems)強烈反應。這個抗體不識別BOB213和BOB268未誘導培養物或僅是對照載體的BOB130的誘導或未誘導培養物中的蛋白。這些Western印跡也顯示這個～19kDa條帶與購自R & D Systems的商業上的人G-CSF標準共同遷移。這個結果提示STII引導肽已經被去除，與已經分泌到周質中的蛋白一致。實施例10提出的N末端測序研究表明STII信號序列被正確加工。
來自28℃和37℃誘導后16小時的培養物也接受基于Koshland和Botstein(1980)步驟的滲透壓休克。這個步驟破裂大腸桿菌外膜并將周質內容釋放到周圍培養基中。隨后離心將可溶周質成分(上清中回收)與細胞質的不溶周質和細胞相關成分(沉淀中回收)分離。在兩種溫度下，對兩個野生型，合成的一些G-CSF蛋白，BOB213合成的和BOB268合成的C17S在上清中回收，但大量G-CSF蛋白保持與沉淀相連。這表明盡管蛋白看來被加工和分泌到周質，它以不溶形式蓄積在那里。
G-CSF野生型和C17S變異體表達條件的最初篩選表明兩種蛋白在各種條件下相對較好地表達。對于大規模表達和純化培養物在28℃生長并誘導～16小時。
C. 野生型G-CSF和G-CSF(C17S)的純化。用相同方案大規模表達和純化野生型和G-CSF(C17S)。新鮮飽和BOB213(野生型)和BOB268(C17S)培養物在含100μg/ml氨芐西林的LB中在～0.05 OD @ A600接種。典型地，400ml培養物培養在2L有擋板振蕩瓶中，在旋轉式搖床振蕩儀水浴中以250rpm 28℃培養。當培養物達到～0.5-0.7OD的密度，加入IPTG至終濃度0.5mM。然后，誘導培養物過夜培養～16小時。離心沉淀細胞并在-80℃冰凍。消融細胞沉淀并根據制造商(Pierce)方案用5mL B PERTM細菌蛋白提取試劑處理。離心回收含大量G-CSF蛋白的不溶物質并重懸于B-PER。這個混合物用溶菌酶(200μg/ml)處理10分鐘以進一步破壞細胞壁，加入MgCl2(終濃度10mM)和無蛋白酶DNAse(2μg/ml)。離心收集不溶G-CSF，并重懸于水中洗滌和再次離心，以去除大部分溶解的細胞雜質。所得含不溶G-CSF的沉淀溶于含20m l8M尿素、25mM半胱氨酸的20mM Tris堿(Tris Base)中。這個混合物在室溫攪拌30分鐘，然后稀釋到100ml 40mM磷酸鈉，40μM硫酸銅，15％甘油，pH8.0。這個重折疊混合物4℃保存2天。然后用稀釋HCl將重折疊混合物的pH調節到4.0，混合物離心后填入在40mM磷酸鈉pH4.0(緩沖液A)中平衡的5ml S-Sepharose柱(Pharmacia HiTrap)中。用從0-100％緩沖液B(500mM NaCl，40mM磷酸鈉，pH4.0)的線性鹽梯度洗脫結合蛋白。從S-Sepharose柱洗脫的野生型G-CSF和G-CSF(C17S)在大約300-325mM NaCl的鹽濃度下洗脫到單一主峰。非還原型SDS-PAGE分析柱級分。含G-CSF的級分和無可見的雜質混合。Bradford分析確定，在400ml培養物中G-CSF野生型和G-CSF(C17S)的最終產物分別是大約1.1mg和3.3mg。純化野生型G-CSF和G-CSF(C17S)在還原型和非還原型SDS-PAGE條件下共同遷移。還原型和非還原型G-CSF和G-CSF(C17S)的表觀分子量分別是大約19和17kDa。
D. 野生型G-CSF和G-CSF(C17S)的體外生物活性。使用鼠NFS60細胞系的細胞增殖試驗測定野生型G-CSF和G-CSF(C17S)的生物活性。NFS60細胞系得自田納西州孟菲斯的田納西州醫科大學的J.Ihle博士。這個細胞系對人或小鼠G-CSF或IL-3產生增殖應答(Weinstein等1986)。細胞保存在補充10％FBS，50單位/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素和17-170單位/ml小鼠IL-3(R & D Systems)的RPMI 1640培養基中。在不含IL-3的細胞維持培養基中進行生物試驗。通常，生物試驗的建立是通過用RPMI培養基(無添加劑)洗滌NFS60細胞三次并將細胞以0.5-1×105個/ml的濃度重懸于不含IL-3的細胞維持培養基中。50μl(2.5-5×103個細胞)細胞懸液均分到平底96孔組織培養板的每個檢測孔中。在不含IL-3的細胞維持培養基中制備待檢測蛋白樣品的系列稀釋物。并列分析重組人G-CSF(大腸桿菌表達的；R & D Systems)的系列稀釋物。50μl稀釋蛋白樣品加入到檢測孔中，板在37℃潮濕的5％CO2組織培養溫箱中溫育。在一式三份的三個孔中檢測蛋白樣品。大約48-72小時后，每孔中加入20μl Cell Titer 96 AQueous One溶液(Promega公司)，板在組織培養溫箱中37℃溫育1-4小時。用微板閱讀器在490nm讀出孔的吸光度。對照孔含培養基但不含細胞。從檢測孔得到的平均值減去三個對照孔的平均吸光度值。計算每個樣品的半數最大刺激濃度EC50s。
NFS60細胞系對G-CSF顯示強烈增殖反應，如細胞數量和吸光度值劑量依賴性增加所證明。在生物試驗中，商業上的G-CSF和我們制備的G-CSF的平均EC50s分別是19和10pg/ml(表6)。意外的是，在生物試驗中，G-CSF(C17S)的平均EC50是7pg/ml且可再生到比我們野生型G-CSF標準強1.5至2.0倍和比商業上野生型G-CSF標準強～3倍(表3)。G-CSF(C17S)的超級活性是驚人的，因為其他人報道了野生型G-CSF和G-CSF(C17S)具有等同活性(Lu等1992)。
用類似于PCT/US00/00931和Innis等(1990)和White(1993)所述的基于PCR的定點誘變構建十五個突變G-CSF基因。我們構建立在螺旋A最近的氨基末端區的五個突變蛋白[*-1C(將半胱氨酸殘基添加到天然氨基末端)，TIC，L3C，A6C和S7C]；B-C環的兩個突變蛋白[E93C和S96C]；C-D環的六個突變蛋白[A129C，T133C，A136，A139C，A141C和S142C]；和螺旋D遠端的羧基末端區的兩個突變蛋白[Q173C和*175C(將半胱氨酸殘基添加到天然羧基末端)]。為了避免正常存在于野生型G-CSF17位的未配對半胱氨酸引起的潛在困難和/或不確定，均在C17S背景下構建G-CSF半胱氨酸突變蛋白。以前已經報道G-CSF(C17S)具有完全生物活性(Ishikawa等1992；Lu等1992)，和在我們的大腸桿菌分泌系統中，我們發現純化C17S產量高于純化野生型G-CSF。此外，在體外試驗中，我們的重組C17S比我們制備的野生型G-CSF和得自商業賣主(R & D Systems，Inc.)的第二個大腸桿菌產生的重組野生型G-CSF更有活力。
用于誘變PCR反應的模板是pBBT223的STII-G-CSF(C17S)基因(實施例8中描述)以Nde I-Eco RI片段克隆到Nde I-Eco RI切割的pUC18的質粒pBBT227。用適當的限制性內切酶消化PCR產物，凝膠純化并與已經用那些相同的限制性酶切割的pBBT227載體DNA連接，堿性磷酸酶處理并凝膠純化。這些連接物的轉化體生長并分離質粒DNAs和測序。確定完整克隆誘變PCR片段的序列以證實存在感興趣的突變，和不存在PCR反應或合成寡核苷酸引物潛在可能引入的任何另外突變。
半胱氨酸置換突變L3C構建如下。設計誘變正向寡核苷酸BB172(5＞ACCAACGCGTACGCAACCCCGTGTGGCCCGGCCAGC＞3；SEQ ID NO9)以將成熟G-CSF3位的亮氨酸密碼子CTG改變為編碼半胱氨酸的TGT并跨越M1u I位點附近。這個寡核苷酸用于PCR，使用與pBBT227中編碼成熟G-CSF氨基酸殘基21-27的DNA序列退火的反向非誘變的引物BB188(5＞GCCATCGCCCTGGATCTTACG＞3；SEQ ID NO10)。在含1.5mM mM MgCl2，每種引物0.4μM，每種dATP，dGTP，dTTP和dCTP 200μM，3ng模板質粒pBBT227(上述)，2.5單位Taq聚合酶(Promega)，和0.5單位Pfu聚合酶(Stratagene)的1×Promega PCR緩沖液中進行100μl PCR發應。反應在Perkin-Elmer GeneAmpPCR System 2400熱力循環儀中進行。反應程序需要96℃3分鐘，25個循環的『95℃60秒，60℃30秒，72℃45秒』和4℃保持。瓊脂糖凝膠電泳分析PCR反應的10μl等分，發現產生期望大小～100bp的單一片段。用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)根據賣主方案“清除”反應剩余物，并根據賣主方案用Mlu I和Xho I(New EnglandBioLabs)消化。用QIAquick PCR純化試劑盒另外的清除步驟后，消化產物與已用Mlu I和Xho I消化的pBBT227連接，牛小腸堿性磷酸酶(New EnglandBioLabs)處理并凝膠純化。連接反應用于轉化大腸桿菌并對所得轉化體的質粒進行測序。鑒定了具有L3C突變和全部～70bp Mlu I-Xho I片段的正確序列的克隆。
使用有下列不同的用于L3C的上述詳細方案構建置換突變T1C并證實序列。將T1的ACC密碼子改變為半胱氨酸的密碼子TGC并跨越附近的Mlu I位點誘變寡核苷酸BB171(5＞ACCAACGCG TACGCATGCCCGCTGGGCCCGGCCAGC＞3；SEQ ID NO11)用于PCR反應取代BB172。
使用有下列不同的用于L3C的上述詳細方案構建置換突變Q173C并證實序列。將Q173的密碼子CAG改變為半胱氨酸的密碼子TGT并跨越Eco RI位點附近的誘變反向寡核苷酸BB185(5＞CGCGAATTCTTAGGGACAGGCAAGGTGGCG＞3；SEQ ID NO12)用于PCR反應取代BB172。使用與pBBT227中編碼成熟G-CSF的氨基酸殘基78-84的DNA序列退火的非誘變引物BB187(5＞GCCATCGCCCTGGATCTTACG＞3；SEQ ID NO13)取代BB188。瓊脂糖凝膠電泳分析PCR反應的10μl等分，發現產生期望大小～300bp的單一片段。用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)根據賣主方案“清除”反應剩余物，并根據賣主方案用Sty I和Eco RI(New EnglandBioLabs)消化。用QIAquick PCR純化試劑盒另外的清除步驟后，消化產物在1.5％瓊脂糖凝膠中泳動并用QIA快速凝膠提取試劑盒(Qiagen)根據賣主方案凝膠純化感興趣的～220bp Sty I和Eco RI片段。凝膠純化片段與已用Sty I和Eco RI消化的pBBT227連接，牛小腸堿性磷酸酶(New EnglandBioLabs)處理并凝膠純化。連接反應用于轉化大腸桿菌并對所得轉化體的質粒進行測序。鑒定了具有Q173C突變和全部～220bp Sty I-Eco RI片段的正確序列的克隆。
構建在G-CSF編碼序列羧基末端氨基酸序列后添加半胱氨酸的突變。使用具有下列不同的上述構建Q173C突變體的方案構建這個突變體，術語稱作*175C。在P174的CCC密碼子和終止密碼子TAA之間插入半胱氨酸密碼子TGT并跨越附近的Eco RI位點誘變寡核苷酸BB186(5＞CGCGAATTCTTAACAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAG＞3；SEQ ID NO14)用于PCR反應取代BB185。
使用如Horton等(1993)和PCT/US00/00931所述的“重疊延伸(overlap extension)誘變”技術構建A6C置換突變。在含1.5mM MgCl2，每種引物0.4μM，dATP，dGTP，dTTP和dCTP每種200μM，1ng模板質粒pBBT227，1.5單位Taq聚合酶(Promega)，和0.25單位Pfu聚合酶(Stratagene)的1×Promega PCR緩沖液的50μl反應體積中進行構建A6C的原始或“最初”PCR反應。在Perkin-Elmer GeneAmpPCR System 2400熱力循環儀中進行反應。反應程序需要96℃3分鐘，25個循環的[95℃60秒，60℃30秒，72℃45秒]和4℃保持。使用的引物對是[BB173xBB188]和[BB174xBB125]。BB188(5＞GCCATCGCCCTGGATCTT ACG＞3；SEQ ID NO10)與pBBT227中編碼成熟G-CSF的氨基酸殘基21-27的DNA序列退火。BB125(5＞CTATGCGGCATCAGAGCAGATA＞3；SEQ ID NO17)與pUC18載體序列克隆的G-CSF序列上游～20bp退火。BB173和BB174是A6的GCC密碼子變為半胱氨酸TGC密碼子的互補突變寡核苷酸。BB173的序列是(5＞CCGCTGGGCCCGTGCAGCTCCCTGCCG＞3；SEQ ID NO15)和BB174的序列是(5＞CGGCAGGGAGCTGCACGGGCCCAGCGG＞3；SEQ ID NO16)。PCR產物在2％瓊脂糖凝膠中泳動，表明[BB173xBB188]和[BB174xBB125]PCR反應給出期望大小的產物對于[BB173xBB188]，～80bp和對于[BB174xBB125]，～140bp。從凝膠中切下這些片段，匯合并用QIA快速凝膠提取試劑盒(Qiagen)，根據賣主方案一起從瓊脂糖凝膠片中洗脫并回收于30μl10mM TrisHCl(pH8.5)。然后，這兩個突變片段隨后或“第二次”PCR反應中“接合(splice)”在一起。在這個反應中，3μl最初反應的凝膠純化PCR產物用作模板，BB125和BB188用作引物。反應體積是100μl，使用2.5單位Taq聚合酶和0.5單位Pfu聚合酶。否則，反應條件與在最初反應中使用的那些等同。瓊脂糖凝膠電泳分析等分第二次PCR且觀察到期望的～190bp片段。使用QIA快速PCR純化(Qiagen)“清除”大量二級PCR反應，根據賣主方案用Nde I和Xho I(New England BioLabs)消化。使用QIA快速PCR純化試劑盒另外清除后，消化產物與已經用Nde I和Xho I切割的pBBT227連接，牛小腸堿性磷酸酶(New England BioLabs)處理并凝膠純化。連接反應用于轉化大腸桿菌并對所得轉化體的質粒測序以鑒定含A6C突變和全部～130bp Nde I-Xho I片段的正確序列的克隆。
使用具有下列不同的用于A6C的上面詳述方案構建S7C置換突變并證實序列互補誘變引物BB175(5＞CTGGGCCCGGCCTGCTCCCTGCCGCAG＞3；SEQID NO18)和BB176(5＞CTGCGGCAGGGAGCAGGCCGGGCCCAG＞3；SEQ ID NO19)，其中S7的AGC密碼子變為半胱氨酸TGC密碼子，分別取代最初PCR反應中的BB173和BB174。
構建成熟G-CSF的氨基末端殘基密碼子前添加半胱氨酸密碼子的突變T1并證實序列。使用具有下列不同的上述用于構建A6C的方案構建這個突變，術語稱作*-1C。互補誘變引物BB206(5＞AACCCGTACGCATGTACCCCGCTGGGC＞3；SEQ ID NO20)和BB207(5＞GCC CAGCGGGGTACATGCGTACGCGTT＞3；SEQ ID NO21)，在pBBT227中的STII引導序列羧基末端殘基的GCA密碼子和成熟G-CSF氨基末端殘基的ACC密碼子之間插入半胱氨酸的TGC密碼子，分別取代最初PCR反應中BB173和BB174。最初PCR反應以20ìl反應體積進行。每種引物以0.5μM存持。反應包括0.5ng模板質粒pBBT227，2單位Taq聚合酶和0.25單位Pfu聚合酶。反應程序需要95℃3分鐘，25個循環的[94℃60秒，60℃30秒，72℃45秒]和4℃保持。最初反應產物直接加樣到制備型2％瓊脂糖凝膠。最初反應得到期望大小的產物對于[BB206xBB188]，～100bp和對于[BB207xBB125]，～125bp。第二次PCR反應中，反應體積是100μl，5μl最初反應的凝膠純化PCR產物用作模板，BB187和BB126用作引物，和利用4單位Taq聚合酶和0.25單位Pfu聚合酶。否則，反應條件與最初反應使用的那些相同。
使用具有下列不同的上面詳述用于A6C的方案構建置換突變A129C并證實序列。最初PCR反應利用引物對[BB177xBB126]和[BB178xBB187]。反向非誘變引物BB126(5＞TGTGGAATTGTGAGCGGATAAC＞3；SEQ ID NO22)與pUC18載體序列克隆G-CSF序列下游～40bp退火。正向非誘變引物BB187(5＞GCCATCGCCCTGGATCTTACG＞3；SEQ ID NO13)與pBBT227中的編碼成熟G-CSF的氨基酸殘基78-84的DNA序列退火。BB177和BB178是將A129C的GCC密碼子變為半胱氨酸的TGC密碼子的互補誘變寡核苷酸。BB177是(5＞GGAATGGCCCCTTGCCTGCAGCCCACC＞3；SEQ ID NO23)和BB178的序列是(5＞GGTGGGCTGCAGGCAAGGGGCCATTCC＞3；SEQ ID NO24)。最初反應產物得到期望大小的產物對于[BB177xBB126]，～220bp，和對于[BB178xBB187]，～170bp。第二次PCR利用BB187和BB126作為引物并產生期望大小的產物～360bp。根據賣主方案，用Sty I和Eco RI(New EnglandBioLabs)消化這個產物。另外用QIAquick PCR純化試劑盒清除后，消化產物與已經被Sty I和Eco RI消化的pBBT227連接，用牛小腸堿性磷酸酶(NewEngland BioLabs)處理并凝膠純化。連接反應用于轉化大腸桿菌，并且對得自轉化體的質粒進行測序證實含有A129C突變并具有～230bp Sty I-EcoRI部分的正確序列的克隆。
使用具有下列不同的上面詳述用于A129C的方案構建置換突變T133C并證實序列。互補誘變引物BB179(5＞GCCCTGCAGCCCTGCCAGGGTGCCATG＞3；SEQ ID NO25)和BB180(5＞CATGGCACCCTGGCAGGGCTGCAG GGC＞3；SEQID NO26)，它將T133的ACC密碼子變為半胱氨酸的TGC密碼子，分別取代最初PCR反應中的BB173和BB174。最初反應的產物得到期望大小的片段對于[BB179xBB126]，～205bp和對于[BB180xBB187]，～180bp。
使用具有下列不同的上面詳述用于A129C的方案構建置換突變A139C并證實序列。互補誘變引物BB181(5＞GGTGCCATGCCGTGCTTCGCCTCTGCT＞3；SEQ ID NO27)和BB182(5＞AGCAGAGGCGAAGCACGGCATGGCACC＞3；SEQ IDNO28)，它將A139的GCC密碼子變為半胱氨酸的TGC密碼子，分別取代最初PCR反應中的BB173和BB174。最初反應的產物得到期望大小的片段對于[BB181xBB126]，～185bp和對于[BB182xBB187]，～200bp。
使用具有下列不同的上面詳述用于A129C的方案構建置換突變S142C并證實序列。互補誘變引物BB183(5＞CCGGCCTTCGCCTGTGCTTTCCAGCGC＞3；SEQ ID NO29)和BB184(5＞GCGCTGGAAAGCACAGGCGAAGGCCGG＞3；SEQID NO30)，它將S142的TCT密碼子變為半胱氨酸的TGT密碼子，分別取代最初PCR反應中的BB173和BB174。最初反應的產物得到期望大小的片段對于[BB183xBB126]，～180bp和對于[BB184xBB187]，～210bp。
使用具有下列不同的上面詳述用于A129C的方案構建置換突變A136C并證實序列。互補誘變引物BB224(5＞CCCACCCAGGGTTGCATGCCGGCCTTC＞3；SEQ ID NO31)和BB225(5＞GAAGGCCGGCATGCAACCCTGGGTGGG＞3；SEQID NO32)，它將A136的GCC密碼子變為半胱氨酸的TGC密碼子，分別取代最初PCR反應中BB173和BB174。最初PCR反應以20μl反應體積進行。每種引物以0.5ìM存在。反應包括0.5ng模板質粒pBBT227，2單位Taq聚合酶和0.25單位Pfu聚合酶。反應在Perkin-Elmer GeneAmpPCR System2400熱力循環儀中進行。反應程序需要95℃3分鐘，25個循環的[94℃60秒，60℃30秒，72℃45秒]和4℃保持。最初反應產物直接加樣到制備型2％瓊脂糖凝膠中。最初反應得到期望大小的產物對于[BB224xBB126]，～195bp和對于[BB225xBB187]，～190bp。第二次PCR反應中，反應體積是100μl，5μl最初反應的凝膠純化PCR產物用作模板，BB187和BB126用作引物，和利用4單位Taq聚合酶和0.25單位Pfu聚合酶。否則，反應條件與最初反應使用的那些等同。
使用具有下列不同的上面詳述用于A136C的方案構建置換突變A141C并證實序列。互補誘變引物BB226(5＞ATGCCGGCCTTCTGCTCTGCTTTCCAG＞3；SEQ ID NO33)和BB227(5＞CTGGAAAGCAGAGCAGAAGGCCGGCAT＞3；SEQID NO34)，它將A141的GCC密碼子變為半胱氨酸的TGC密碼子，分別取代最初PCR反應中的BB224和BB225。最初反應的產物得到期望大小的片段對于[BB226xBB126]，～180bp和對于[BB227xBB187]，～205bp。
使用“重疊延伸誘變”技術構建E93C置換突變。在含1.5mM MgCl2，每種引物0.4μM，dATP，dGTP，dTTP和dCTP每種200μM，0.5ng模板質粒pBBT227，2單位Taq聚合酶(Promega)，和0.25單位Pfu聚合酶(Stratagene)的1×Promega PCR緩沖液的20μl反應體積中進行構建E93C的最初PCR反應。在Perkin-Elmer GeneAmpPCR System 2400熱力循環儀中進行反應。反應程序需要95℃3分鐘，25個循環的[94℃60秒，60℃30秒，72℃45秒]和4℃保持。使用的引物對是[BB218xBB211]和[BB219xBB210]。反向非誘變引物BB211(5＞GGCCATTCCCAGTTCTTCCAT＞3；SEQ IDNO35)與pBBT227中編碼成熟G-CSF的氨基酸殘基121-127的DNA序列退火。正向非誘變引物BB210(5＞TTC GTTTTCTCTATCGCTACCAAC＞3；SEQ IDNO36)與pBBT227中編碼STII引導肽的氨基酸殘基13-20的DNA序列退火。BB218和BB219是將E93的GAA密碼子變為半胱氨酸TGT密碼子的互補突變寡核苷酸。BB218的序列是(5＞CTGCAGGCCCTGTGTGGGATCTCCCCC＞3；SEQ ID NO37)和BB219的序列是(5＞GGGGGAGATCCCACACAGGGCCTGCAG＞3；SEQ ID NO38)。最初反應產物直接加樣到制備型2％瓊脂糖凝膠中，顯示PCR反應得到期望大小的產物對于[BB218xBB211]，～115bp和對于[BB219xBB210]，～325bp。從凝膠中切下這些片段，混合并用QIA快速凝膠提取試劑盒(Qiagen)，根據賣主方案一起從瓊脂糖凝膠片中洗脫并回收于30μl 10mM TrisHCl(pH8.5)。在第二次PCR反應中，5μl最初反應的凝膠純化PCR產物混合物用作模板，BB211和BB210用作引物。反應體積是100μl，使用4單位Taq聚合酶和0.25單位Pfu聚合酶。否則，反應條件與在最初反應中使用的那些等同。瓊脂糖凝膠電泳分析等份的第二次PCR且觀察到期望的～415bp條帶。使用QIA快速PCR純化(Qiagen)“清除”大量第二次PCR反應，根據賣主方案用StyI和Xho I(New England BioLabs)消化。使用QIA快速PCR純化試劑盒另外清除后，消化產物與已經用Sty I和Xho I切割的pBBT227連接，牛小腸堿性磷酸酶(New England BioLabs)處理并凝膠純化。連接反應用于轉化大腸桿菌并對所得轉化體的質粒測序以鑒定含A6C突變和全部～260bp Sty I-Xho I片段的正確序列的克隆。
使用具有下列不同的上面詳述用于E93C的方案構建置換突變S96C并證實序列。互補誘變引物BB220(5＞CTG GAAGGG ATC TGC CCC GAG TTG GGT＞3；SEQ ID NO39)和BB221(5＞ACC CAA CTC GGG GCAGAT CCC TTC CAG＞3；SEQ ID NO40)，它將S96的TCC密碼子變為半胱氨酸的TGC密碼子，分別取代最初PCR反應中的BB218和BB219。最初反應的產物得到期望大小的片段對于[BB220xBB211]，～110bp和對于[BB221xBB210]，～330bp。
對于大腸桿菌中蛋白分泌到周質間隙的表達，從基于pUC18的pBBT227衍生物中切除作為～600bp的Nde I-Eco RI片段的編碼突變蛋白的STII-G-CSF(C17S)基因，亞克隆進入pCYB1表達載體并轉化大腸桿菌W3110。
使用與這里描述的那些類似的步驟，人們可構建其它G-CSF和G-CSF(C17S)半胱氨酸突變蛋白。半胱氨酸突變蛋白可以是半胱氨酸置換G-CSF編碼序列中天然氨基酸殘基的置換突變，在G-CSF編碼序列的兩個天然發生的氨基酸之間插入半胱氨酸殘基的插入突變，或在G-CSF編碼序列的第一個氨基酸前添加半胱氨酸殘基的添加突變T1，或在G-CSF編碼序列的末端氨基酸殘基后添加半胱氨酸殘基的添加突變P174。半胱氨酸殘基可以置換G-CSF編碼序列任何位置中的任何氨基酸，或插入在任何兩個氨基酸之間。在G-CSF中置換或插入半胱氨酸殘基的優選位點是螺旋A、A-B環、B-C環、C-D環前區域和螺旋D遠端區。其它優選位點是A，B，C和D螺旋的最先和最后三個氨基酸。除了上述突變，在這些區域其它優選殘基產生半胱氨酸置換的是P2，G4，P5，S8，L9，P10，Q11，S12，T38，K40，S53，G55，I56，W58，A59，P60，L61，S62，S63，P6 5，S66，Q67，A68，Q70，A72，Q90，A91，L92，G94，I95，S96，E98，G100，G125，M126，A127，Q131，Q134，G135，S142，A143，Q145和P174。這個實施例中描述的所有變異體在天然蛋白或天然產生“游離”半胱氨酸殘基(半胱氨酸-17)已經變為另一個氨基酸優選絲氨酸或丙氨酸的突變蛋白序列內容中提供。
人們也可以通過另一個氨基酸置換G-CSF中天然產生的正常形成二硫鍵的半胱氨酸殘基之一，構建含有游離半胱氨酸的G-CSF和G-CSF(C17S)。正常與被置換的半胱氨酸殘基形成二硫鍵的天然產生的半胱氨酸殘基現在游離了。半胱氨酸殘基可以被任何其它19個氨基酸取代，但優選絲氨酸或丙氨酸殘基。天然蛋白序列或天然產生的“游離”半胱氨酸殘基(半胱氨酸-17)已經變為另一個氨基酸，優選絲氨酸或丙氨酸的變異蛋白的內容中提供了這些變異體。也可以用如Sytkowdki等(1998)所述的步驟化學修飾天然產生的氨基酸，將游離半胱氨酸殘基引入G-CSF。
使用類似實施例8，9，10，11和13所述的步驟，人們可在大腸桿菌中表達蛋白、純化蛋白、PEG化蛋白和測定它們在體外和體內生物試驗中的生物活性。蛋白可在大腸桿菌細胞質中表達或以分泌到周質間隙的蛋白而表達。使用類似PCT/US00/00931中所述的步驟，或本領域技術人員熟知的相關步驟，突變蛋白也可在真核細胞如昆蟲或哺乳動物細胞中表達。如果希望從真核細胞分泌，也可以用天然G-CSF信號序列或另一個信號序列從真核細胞在分泌蛋白。
B. G-CSF(C17S)半胱氨酸突變蛋白的表達和純化。用實施例8所述的用于BOB213(野生型)和BOB268(C17S)的方案，培養、誘導和收集表達13G-CSF(C17S)突變蛋白(*-1C，T1C，L3C，A6C，S7C，E93C，A129C，T133C，A136C，A139C，A141C，Q173C和*175C)的大腸桿菌株。所有突變蛋白大多不可溶。用上述實施例8所述的用于G-CSF野生型和G-CSF(C17S)的方案，重折疊和純化突變蛋白。非還原型SDS-PAGE分析顯示13個純化半胱氨酸突變蛋白主要以單體形式回收，遷移在大約17kDa。純化突變蛋白與野生型G-CSF和G-CSF(C17S)共同遷移，除了*-1C突變蛋白，它比野生型G-CSF遷移稍慢。除了一個突變蛋白，所有突變蛋白在類似于野生型G-CSF和G-CSF(C17S)的鹽濃度下從離子交換柱中洗脫。一個例外E93C，在梯度(NaCl濃度大約400mM)較晚洗脫，可能由于半胱氨酸置換帶電荷氨基酸谷氨酸。
C. G-CSF(C17S)半胱氨酸突變蛋白的生物活性。如實施例8所述的NFS60細胞增殖試驗檢測13個純化G-CSF(C17S)半胱氨酸突變蛋白。用Bradford蛋白檢測試劑盒(Bio-Rad Laboratories)確定蛋白濃度。在同一天并列分析商業上的野生型G-CSF和我們制備的野生型G-CSF和G-CSF(C17S)，以對照試驗中一天內的變異。在試驗誤差內，所有13個突變蛋白刺激NFS60細胞增殖的程度與野生型G-CSF對照蛋白相同。13個突變蛋白的平均EC50s范圍5-9pg/ml。半胱氨酸突變蛋白的平均EC50s與G-CSF(C17S)對照蛋白相似，比我們的野生型G-CSF對照蛋白的平均EC50s低1.5至2倍和商業上的野生型G-CSF蛋白的平均EC50s低3倍，即更有效力。表6總結了這些數據。表6野生型G-CSF、G-CSF(C17S)和G-CSF(C17S)半胱氨酸突變蛋白的生物活性

1各個實驗的EC50值；當N＞5時，顯示范圍
2商業上的野生型G-CSF(R & D Systems)3Bolder BioTechnology，Inc.制備的野生型G-CSFD.G-CSF雙半胱氨酸突變體的構建用實施例9，14和15所述的步驟循序誘變循環，或可供選擇地通過將各個突變體體外重組以構建編碼含兩個或更多游離半胱氨酸殘基的突變蛋白的重組表達質粒，可以構建含兩個或更多添加的游離半胱氨酸殘基的多變異體。優選的多變異體將是兩個或更多半胱氨酸突變蛋白組合的那些，其中每個在PEG化時保持高活性。實施例將是L3C加T133C，L3C加*175C，和T133C加*175C。其它優選多變異體可以基于表3和表4的數據推出，將包括含兩個和更多選自組L3C，T133C，A141C和*175C的突變的組合。
我們構建了下列G-CSF雙半胱氨酸突變體L3C/T133C，L3C/*175C，和T133C/*175C。為了制備L3C/T133C，用Xho I和Eco RI消化pBBT227的L3C衍生物(G-CSF C17S在pUC18中)，牛小腸堿性磷酸酶處理。用QiagenPCR清除試劑盒提取DNA，稱作G-CSF L3C X-R1-Cip載體。接下來，用XhoI和Eco RI消化pBBT227的L3C衍生物，凝膠純化～480bp片段并與G-CSFL3C X-R1-Cip載體連接。連接反應轉化大腸桿菌JM109并鑒定具有正確序列的克隆。
為了制備L3C/*175C，用Xho I和Eco RI消化pBBT227的*175C衍生物，凝膠純化～480bp片段并與G-CSF L3C X-R1-Cip載體(見上)連接。連接反應轉化大腸桿菌JM109并鑒定具有正確序列的克隆。
為了制備T133C/*175C，pBBT227的L3C衍生物用作PCR反應中的模板，使用反向誘變寡核苷酸引物BB186(5＞CGC GAA TTC TTA ACA GGGCTG GGCAAG GTG GCG TAG＞3；SEQ ID NO14)和正向非誘變寡核苷酸引物BB125，它與G-CSF插入體上游pUC18載體序列退火連接。PCR是50μl反應，在含1.5mM MgCl2，每種引物0.4μM，dATP，dGTP，dTTP和dCTP每種200μM，0.5ng模板片段，1單位Taq聚合酶(Promega)，和0.1單位Pfu聚合酶(Stratagene)的1×Promega PCR緩沖液中進行。在Perkin-ElmerGeneAmpPCR System 2400熱力循環儀中進行反應。反應程序需要95℃5分鐘，22個循環的[94℃30秒，55℃30秒，72℃45秒]，72℃保持7分鐘和4℃保持。瓊脂糖凝膠電泳分析20μl PCR，從凝膠中分離～630bp片段。用Xho I和EcoR I消化這個片段，用Qiagen PCR清除試劑盒(cleanup kit)提取。這個DNA與用Xho I和EcoR I消化的pBBT227的T133C衍生物制備的載體連接，牛小腸堿性磷酸酶處理并用Qiagen PCR清除試劑盒提取。連接反應轉化大腸桿菌JM109并鑒定具有正確序列的克隆。
B. PEG化G-CSF半胱氨酸突變蛋白的制備和純化用5kDa馬來酰亞胺PEG，PEG化等份200至300μg 13個純化的G-CSF半胱氨酸突變蛋白，以提供純化和特性描述足夠的原料。較大PEG化反應也在室溫進行1小時，使用上述條件。這些反應條件產生所有突變蛋白的單PEG蛋白。用下述步驟已經純化了11個單PEG化突變蛋白。在反應時間末，用40mM磷酸鈉(單堿基)10×稀釋PEG化混合物，pH調節至4.0后快速填入S-Sepharose柱(1mL，HiTrap)，使用類似于上述用于G-CSF突變蛋白初次純化條件(20mL梯度，0-0.5M NaCI的40mM磷酸鈉pH4)。PEG部分的存在降低了蛋白對樹脂的親和力，允許PEG化蛋白與非PEG化蛋白分離。S-Sepharose柱的層析圖譜顯示對于大多數突變蛋白，在大約275mM NaCl和300-325mM NaCl洗脫兩個主蛋白峰。SDS-PAGE確定較早的洗脫主峰是單PEG化G-CSF(C17S)突變蛋白。確定較晚洗脫主峰是未反應的G-CSF(C17S)突變蛋白。PEG-E93C突變蛋白在大約325mM NaCl對未反應E93C蛋白在大約400mM NaCl洗脫。匯合主要含單PEG化G-CSF(C17S)突變蛋白的較早洗脫峰的級分并用于生物活性測定。也用20kDaPEG-馬來酰亞胺PEG化五個半胱氨酸突變蛋白(L3C，T133C，A141C，Q173C和*175C)，PEG化和純化步驟如上所述。20kDaPEG化蛋白在S-Sepharose柱大約250mM NaCl洗脫。SDS-PAGE分析表明純化PEG化蛋白含有低于10％，可能低于5％的未PEG化蛋白。為了PEG化，半胱氨酸突變蛋白需要用還原劑如TCEP處理而部分還原。在等同部分還原條件下，野生型G-CSF和G-CSF(C17S)不PEG化，表明PEG部分與引入突變蛋白中的半胱氨酸殘基連接。
C. L3C G-CSF半胱氨酸突變蛋白的純化和PEG化對L3C實施重折疊和PEG化反應的時間過程。發現4個小時完成這個特定突變蛋白的重折疊。反相HPLC(C4柱)檢測重折疊反應進展。產物是如實施例8所述生長的～10mg/400mL的培養物。用10kDa，20kDa和40kDa PEGs對L3C突變蛋白進行PEG化的時間過程。PEG化條件如實施例10所述，除了PEG化緩沖液中包含0.5mM EDTA。對于0.5-1mg反應，在室溫2-4小時的更長時間反應產生更大量PEG化產物。延長時間PEG化的效率是～80％。相等效率進行更大(達到5mg)PEG化反應。用前述實施例10的純化方法，在5mL S-Sepharose柱中從非PEG化蛋白中純化PEG化蛋白。20kDa PEG化蛋白在～200mM NaCl洗脫，而40kDa PEG蛋白和10kDa PEG蛋白分別在～150mM和～200mM洗脫。未PEG化G-CSF L3C突變蛋白在～260mM洗脫。EDTA的存在顯著降低了PEG化反應中蛋白二聚體的形成。
D. 20kDa-PEG-L3C的N末端測序。天然G-CSF的N末端是蘇氨酸(Souza等1986)。用自動Edman降解化學法測序純化的20kDa-PEG-L3C的N末端，得到序列TPXGPAS，表明N末端被正確加工和與PEG化的第三個殘基一致；PEG化氨基酸在序列中以空白顯示，如X.指出。
E. 圓二色性(CD)分析確定PEG化G-CSF半胱氨酸突變蛋白的結構在Jasco 720 CD分光偏振計上1cm通路長度300ul細胞中室溫進行CD分析。從260nm-200nm以50m°靈敏度和32積聚(accumulations)收集數據。對L3C突變蛋白和10K PEG-L3C蛋白進行最初實驗。兩者具有與野生型G-CSF的文獻中發現的非常類似的CD光譜。可對其它G-CSF半胱氨酸突變蛋白和它們的PEG化衍生物進行類似分析。
F. PEG化G-CSF(C17S)半胱氨酸突變蛋白的生物活性如實施例8所述的NFS60細胞增殖試驗測定11個純化的5kDa-PEG-G-CSF(C17S)半胱氨酸突變蛋白和5個純化的20kDa-PEG-G-CSF(C17S)半胱氨酸突變蛋白的生物活性。用Bradford染料結合試驗確定蛋白濃度。在試驗誤差內，所有PEG化G-CSF(C17S)半胱氨酸突變蛋白顯示與G-CSF(C17S)類似的劑量反應曲線(dose-response curves)并達到相同水平的最大生長刺激。5kDa-PEG修飾的半胱氨酸突變蛋白的平均EC50s范圍2-11pg/ml。在生物試驗中，這些PEG化突變蛋白比我們的野生型G-CSF效力強1.5至2倍，比商業上野生型G-CSF的效力強3倍。20kDa修飾的半胱氨酸突變蛋白的EC50S范圍9至14pg/ml。PEG化G-CSF(C17S)半胱氨酸突變蛋白的生物活性等于或超過野生型G-CSF。單克隆抗體中和G-CSF(R & D Systems，Inc.)可消除5kDa-PEG-L3C的全部NFS60細胞刺激活性，表明促進生長活性是由于PEG-L3C G-CSF蛋白而不是蛋白制劑中的污染物。表7總結了生物活性數據。用NFS60細胞增殖試驗確定40kDa-PEG修飾的L3C的EC50S是30-50pg/ml。
這里描述的PEG化G-CSF(C17S)半胱氨酸突變蛋白的生物活性高于以前描述的PEG化G-CSF蛋白的活性，以前描述的全部相對于野生型G-CSF生物活性降低(Tanaka等1991；Kinstler等1996a；Bowen等1999)。Tanaka等(1991)報道了多個分子量種組成的胺反應性(amine-reactive)10kDa NHS-PEG修飾的G-CSF和在不同賴氨酸基團或N末端氨基酸修飾的多個同工型。確定這個NHS-PEG混合物的生物活性相對于未修飾G-CSF降低大約3倍(Tanaka等1991；Satake-Ishikawa等1992)。Bowen等(1999)報道了5kDa-，10kDa-和20kDa-胺-反應性PEGs修飾的G-CSF變異體相對于未修飾的G-CSF，降低大約6倍、10倍和20倍。Bowen等(1999)純化了20kDa-胺-反應性PEGs修飾的G-CSF變異體的單一分子量種，發現其生物活性相對于未修飾G-CSF降低大約4倍。盡管Bowen等(1999)分離的單一分子量種相當于單一PEG分子修飾的G-CSF變異體，由于PEG分子在多個位點連接蛋白，PEG蛋白制劑是異種的。Kinstler等(1996)純化了優選在大腸桿菌表達的Met-G-CSF(細胞質中表達)的非天然氨基末端甲硫氨酸殘基通過胺或酰胺鍵修飾的PEG化Met-G-CSF種。這個PEG化Met-G-CSF蛋白僅具有野生型Met-G-CSF(Kinstler等1996)體外生物活性的68％。表7PEG化G-CSF半胱氨酸突變蛋白的生物活性

a各個實驗的EC50值如實施例8所述使大腸桿菌培養物(400mL)生長并誘導每一G-CSF蛋白表達。如實施例8所述裂解細胞并離心分離不溶部分。含大部分不溶G-CSF蛋白的不溶物質懸浮于20mL 8M urea，20mM Tris，pH8中并攪拌直到均質。混合物等分到6個管中。如表6所述向某些管中加入5mM DTT或25mM半胱氨酸。一小時后，溶解混合物稀釋于25mL 40mM磷酸鈉，15％甘油，pH8，含或不含40μM硫酸銅中。允許重折疊物在4℃放置兩天。此時，每管的pH調至4。如實施例8所述離心重折疊物，上清填入S-Sepharose柱以及純化G-CSF野生型和Q173C蛋白。基于非還原型SDS-PAGE分析，混合柱級分，如實施例8所述。表5顯示了層析后回收的每種蛋白的量。表8在不同還原劑存在和不存在下，重折疊/復性G-CSF蛋白的回收

a從67ml大腸桿菌培養物中回收的蛋白如表8所示，溶解步驟中，半胱氨酸用作還原劑時，G-CSF野生型和G-CSF半胱氨酸突變蛋白的產量達到最大。當與還原劑聯合使用時，硫酸銅(40μM)的存在看來少量增加回收率。非還原型SDS-PAGE分析使用重折疊步驟A-F回收的野生型G-CSF蛋白，顯示每種主要含期望大小(非還原條件下，大約17kDa)單體G-CSF的單一分子量種。相比之下，當非還原型SDS-PAGE分析來自G-CSF(C17S/Q173C)重折疊A-D的S-Sepharose柱匯合物，最終產物條帶寬且在單體范圍內含有大量不同表觀分子量的種。推測不同的分子量單體種代表不同的G-CSF(C17S/Q173C)蛋白的二硫化物同工型。重折疊E和F回收的G-CSF(C17S/Q173C)蛋白以與野生型G-CSF共同遷移的單一銳利條帶遷移，表明已經回收了單一的大部分重疊的種類。數據顯示在溶解和重折疊步驟中添加半胱氨酸顯著增加正確重疊G-CSF(C17S/Q173C)蛋白的產量。盡管不希望受任何理論的限制，我們推測添加的半胱氨酸與突變蛋白中游離半胱氨酸殘基形成混合二硫化物。混合的二硫化物限制了含游離半胱氨酸可發生的可能的二硫化物重排。半胱氨酸可能比DTT更有效，因為典型的DTT不形成混合二硫化物，由于氧化時形成的熱力學優選分子內鍵。
進行另外的研究比較G-CSF半胱氨酸突變蛋白與野生型G-CSF的穩定性。例如，使蛋白暴露在各種pH、溫度和血清濃度下，進行多種(a matrixof)實驗。在各個時間點，可使用試驗例如，但不限于實施例8所述的體外細胞增殖生物活性試驗、大小排阻層析、圓二色性、ELISA試驗和Western印跡分析，來監測蛋白的完整性。
aBolder BioTechnology，Inc.制備的野生型G-CSFb對0小時白細胞水平的P＜0.05c在同一時間點，對G-CSF和Neupogen的P＜0.05可使用商業可得到的G-CSF ELISA試劑盒(R & D Systems，Inc.)定量血漿G-CSF和PEG化G-CSF半胱氨酸突變蛋白水平。可進行滴定實驗確定ELISA檢測野生型G-CSF，未修飾G-CSF半胱氨酸突變蛋白和PEG化G-CSF半胱氨酸突變蛋白的相對敏感性。也可以皮下途徑給予蛋白進行類似的研究。
上面實施例13總結的功效實驗得到的血漿蛋白濃度是用購自R & DSystems，Inc.的人G-CSF ELISA試劑盒測定的。結果在表12中顯示。結果表明蛋白靜脈內給予大鼠后，20kDa-PEG-L3C的循環半衰期明顯高于野生型G-CSF或Neupogen。表12一次靜脈內給予蛋白(100μg/ml)后，G-CSF、Neupogen和20kDa-PEG-L3C的血漿濃度


aBolder BioTechnology，Inc.制備的野生型G-CSF可測定正常或中性白細胞缺乏(neutropenic)嚙齒動物如小鼠或大鼠中，證明蛋白刺激循環中性白細胞水平和中性白細胞生成相對于載體處理動物發生增加，從而測定PEG化G-CSF半胱氨酸突變蛋白(C17或C17S型)的體內功效。G-CSF在100μg/kg時，刺激正常和中性白細胞缺乏嚙齒動物的中性白細胞水平(Kubota等1990；Kang等1995)。為證明在正常小鼠中的功效，5只小鼠的組(每只體重～20g)接受皮下注射G-CSF、PEG-G-CSF半胱氨酸突變蛋白或安慰劑(載體溶液)，以特定的間隔給予5天。正常小鼠如ICR小鼠可購自商業賣主。在第6天，殺死動物并收集血液樣品進行全部血細胞計數(CBC)分析。可收集造血組織(肝和脾)，稱重并用福爾馬林固定用于組織病理學分析，尋找中性白細胞生成增加的證據。可從各種長骨和胸骨中取出骨髓進行單位微粒制備和組織病理學分析，尋找中性白細胞生成增加的證據。組間的比較應該用Students T檢驗進行單一比較和用單因素方差分析(one-way analysis of variance)進行多個比較。P＜0.05應該認為具有顯著性。PEG化G-CSF半胱氨酸突變蛋白應該刺激這種小鼠循環中性白細胞水平和中性白細胞生成的增加比載體處理小鼠更高。可檢測給予一次、每天一次、隔天一次或每三天一次時，用5kDa，10kDa，20kDa或40kDa PEGs修飾的PEG化G-CSF半胱氨酸突變蛋白的功效。在最初的實驗中，不同組的小鼠可接受每次注射0.0032，0.016，0.08，0.4和2μg的PEG化G-CSF半胱氨酸突變蛋白的皮下注射。對照小鼠可僅接受載體溶液。另外的對照組可接受野生型G-CSF(2μg/每天(ED)，5天)和2μg野生型G-CSF，使用與PEG化G-CSF半胱氨酸突變蛋白相同的劑量方案。
也可證明中性白細胞缺乏小鼠中PEG化G-CSF半胱氨酸突變蛋白的功效。用環磷酰胺(CPA；100mg/kg)處理誘導中性白細胞減少癥，環磷酰胺通常用作骨髓抑制化療制劑和涉及人臨床處置。G-CSF可加速環磷酰胺處理動物正常中性白細胞水平恢復(Kubota等1990；Kang等1995；Matsuzaki等1996)。小鼠(～20g)可在0天接受腹膜內注射環磷酰胺以誘導中性白細胞減少癥。動物應該分為不同的組，應該以特定間隔接受皮下注射G-CSF、PEG化G-CSF半胱氨酸突變蛋白或安慰劑，達到5天。一個對照組不應該接受環磷酰胺，但應該接受安慰劑注射。可檢測給予一次、隔天一次或每三天一次時，用5kDa，10kDa，20kDa或40kDa PEGs修飾的PEG化G-CSF半胱氨酸突變蛋白的功效。在最初實驗中，不同組的小鼠可接受每次注射0.0032，0.016，0.08，0.4和2μg的PEG化G-CSF半胱氨酸突變蛋白的皮下注射。對照小鼠可僅接受載體溶液。另外的對照組可接受野生型G-CSF(2μg/每天(ED)，5天)和2μg/注射的野生型G-CSF，使用與PEG化G-CSF半胱氨酸突變蛋白相同的劑量體制。在第0-10天，可殺死每組五只小鼠，血液和組織樣品分析如上面實驗所述的正常小鼠。與載體注射、CPA注射對照組相比，PEG化G-CSF半胱氨酸突變蛋白應該加速這種小鼠循環中性白細胞水平和中性白細胞生成增加。
可供選擇地，可以使用大鼠模型，中性白細胞減少癥研究證明PEG化G-CSF半胱氨酸突變蛋白的功效。G-CSF加速骨髓抑制化療制劑處理的大鼠中性白細胞水平正常恢復。在這種情況下，在0天，Spague Dawley大鼠組(每只體重～300g)可接受腹膜內CPA劑量(100mg/kg)以誘導中性白細胞減少癥。然后，動物可分為三組，它們以特定間隔接受皮下注射G-CSF、PEG化G-CSF半胱氨酸突變蛋白或安慰劑，達到10天。一個對照組可接受安慰劑注射而不是環磷酰胺。在最初實驗中，通過實施皮下劑量～0.1μg-500μg/kg(優選范圍是1-100μg/kg)，一次、每天、每隔一天或每三天給予劑量，測定用10kDa，20kDa和40kDa PEGs修飾的PEG化G-CSF半胱氨酸突變蛋白的功效。一個另外的對照組可每天接受商業上可獲得的野生型G-CSF(100μg/kg)，共5天，另一個對照組可接受與PEG化G-CSF半胱氨酸突變體相同的劑量和劑量體制的野生型G-CSF。對照大鼠可僅接受載體溶液。在第0-6，8，10，12和14天，收集血液樣品進行CBC分析。在時間過程完成時，可殺死大鼠收集造血組織和骨髓以調查中性白細胞生成增加的證據。與載體注射、CPA注射對照組相比，PEG化G-CSF半胱氨酸突變蛋白應該刺激這種小鼠循環中性白細胞水平和中性白細胞生成增加加速。
質粒pBBT257源自表達載體pCYB1(New England BioLabs)，通過刪除pCYB1的抗氨芐西林基因和在pBBT257和pCYB1中用來自經典克隆載體pBR322(Bolivar et al，1977)的抗四環素基因取代，克隆基因的表達在tac啟動子的控制之下，它由質粒攜帶(plasmid-borne)lacIq基因產物調節。這些載體允許基因以非融合蛋白表達或以與幾丁質結合域融合而表達；我們的構建體如此構建使得蛋白以非融合蛋白表達。質粒pBBT257構建如下。使用引物BB228(5＞CGC GCT GCA GTT CTC ATG TTT GAC AGC TTA TCA TC＞3；SEQ ID NO41)和BB229(5＞CGC GCT GCA G AT TTA AAT TAG CGA GGTGCC GCC GGC TTC CAT＞3；SEQ ID NO42)，用PCR擴增質粒pBR322(購自New England bioLabs)的抗四環素基因(TcR基因)。正向引物BB228與pBR322序列(GenBank登記號#J01749)的核苷酸1至25退火，其位于TcR基因上游且包括TcR基因啟動子的“-35”部分。寡核苷酸BB228含有添加克隆目的的Pst I位點。反向引物BB229與核苷酸1277至1300退火，其緊接TcR基因編碼序列后的翻譯終止密碼子下游。BB229含有克隆目的添加的Dra I位點。40μlPCR反應在50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH9.0 @25℃)，0.1％ TritonX-100，1.5mM MgCl2并包括dNTPs每種200μM，每種引物20pmole，0.5ng pBR322 DNA，2.5單位Taq聚合酶(Promega)，和0.5單位PFU聚合酶(Stratagene)中進行。PCR反應組成95℃3分鐘，25個循環[94℃30秒，60℃30秒，72℃90秒]后，4℃保持。所得～1300bp的產物凝膠純化，用Pst I和Dra I消化并用于如下所述的連接反應。用Pst I和Swa I消化純化的pCYB1 DNA并根據賣主(New England BioLabs)方案用牛小腸堿性磷酸酶處理。Pst I和Swa I每種切割載體一次并與抗氨芐西林(ApR)基因側接。用Qiaquick PCR cleanup kit(Qiagen)根據賣主方案清除消化的產物，隨后在1％瓊脂糖凝膠中泳動。～5.3kb載體片段，缺失ApR基因，凝膠純化并與含TcR基因的Pst I-Dra I切割PCR產物連接。Dra I和Swa I都產生可連接在一起的鈍末端消化產物。連接反應用于轉化大腸桿菌DH5α并選擇抗四環素的轉化體。隨后分析三分離株，發現全部對氨芐西林敏感。這些株得到的限制性內切酶消化產物與缺失含ApR基因的～1500bpPst I和Swa I片段和被攜帶TcR基因的～1300bp Pst I-Dra I片段取代相一致。選擇一個分離株，記做pBBT257，用于重組蛋白的表達。
B.野生型GM-CSF在大腸桿菌中表達。為了分泌型GM-CSF表達，pBBT271[pBBT 257STII-GM-CSF]和pBBT257親本載體轉化大腸桿菌W3110。所得株記做BOB340W3110(pBBT257)和BOB350W3110(pBBT271)。新鮮飽和的過夜培養物在含10μg/ml四環素的LB培養基在A600為0.025O.D.中接種。這些100ml培養物生長在500ml有擋板振蕩瓶中28℃，在旋轉式振蕩器水浴中以～250rpm。當培養物密度達到～0.6O.D.，加入IPTG使終濃度為0.5mM，誘導的培養物接著過夜培養～16小時。用預制的(precast)14％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和考馬斯蘭染色分析誘導和未誘導培養物的樣品。BOB350(GM-CSF)的誘導培養物在大約14kDa出現條帶，與成熟GM-CSF分子量一致。在BOB350的未誘導培養物或僅是對照載體的BOB340的誘導或未誘導培養物中沒有檢測到這條帶。Western印跡分析表明這個～14kDa條帶與抗人G-CSF抗血清(R & D Systems)強烈反應。這個抗血清不識別BOB340和BOB350的未誘導培養物或僅是對照載體的BOB340的誘導培養物中的蛋白。這些Western印跡也顯示這個～14kDa條帶與購自R & D Systems的商業上來源于大腸桿菌的人GM-CSF標準共同遷移。這個結果提示STII引導肽已經被去除，與已經分泌到周質中的蛋白一致。下面提供的N末端測序研究表明STII信號序列被正確加工。
這些培養物誘導16小時后也接受基于Koshland和Botstein(1980)步驟的滲透壓休克。這個步驟破裂大腸桿菌外膜并將周質內容釋放到周圍培養基中。隨后離心將可溶周質成分(上清中回收)與細胞質的不溶周質和細胞相關成分(沉淀中回收)分離。少量合成的GM-CSF蛋白從上清中回收。大量GM-CSF保持與沉淀相連。這表明盡管蛋白看來被加工和分泌到周質，它主要以不溶形式蓄積在那里。其他人已經報道了分泌到大腸桿菌周質的GM-CSF的類似結果(Libby等1987；Greenberg等1988)。
C.野生型GM-CSF的純化。用下列方案大規模表達和純化野生型GM-CSF。新鮮飽和BOB350(野生型)過夜培養物在含10μg/ml四環素的LB中在～0.05OD @ A600中接種。400ml培養物在2L有擋板振蕩瓶中，28℃，在旋轉式搖床振蕩儀水浴中以250rpm生長。當培養物達到～0.6OD的密度，加入IPTG至終濃度0.5mM。然后，誘導培養物過夜培養～16小時。離心沉淀細胞并在-80℃冰凍。消融細胞沉淀并根據制造商(Pierce)方案用5mL B-PERTM細菌蛋白提取試劑處理。離心回收不溶物質，大量GM-CSF蛋白，并重懸于B-PER。這個混合物用溶菌酶(200μg/ml)處理10分鐘以進一步破壞細胞壁，加入MgCl2(終濃度10mM)和無蛋白酶DNAse(2μg/ml)。離心收集不溶GM-CSF，并重懸于水中洗滌和再次離心，以去除大部分溶解的細胞雜質。為了重折疊，所得含不溶GM-CSF的沉淀溶于含10ml 8M尿素、25mM半胱氨酸的20mM Tris堿中。這個混合物在室溫攪拌30分鐘，然后稀釋到100ml 20mM Tris，40μM硫酸銅，15％甘油，pH8.0。這個重折疊混合物4℃保存2天。然后離心后填入在20mMTris，pH8.0(緩沖液A)中平衡的5ml Q-Sepharose柱(Pharmacia HiTrap)中。用從0-35％緩沖液B(1M NaCl，20mMTris，pH8)的線性鹽梯度洗脫結合蛋白。非還原型SDS-PAGE分析柱級分。GM-CSF在大約230mM NaCl洗脫。匯合主要含GM-CSF的級分。
用等體積30％硫酸銨稀釋Q-Sepharose匯合物并加溫至室溫后填入預先用含15％硫酸銨的20mM磷酸鈉，pH7.5中平衡的1mL苯基HP柱(PharmaciaHiTrap)。用逆向鹽梯度(含15％硫酸銨至0％硫酸銨的20mM磷酸鈉，pH7.5)從柱中洗脫純化的GM-CSF。GM-CSF的苯基HP柱洗脫圖譜顯示單一主峰，在大約6.5％硫酸銨處洗脫。非還原型SDS-PAGE分析所述峰的柱級分。匯合含GM-CSF的級分和未見污染物。Bradford分析確定野生型GM-CSF的最終產量是400ml培養物中大約2.6mg。使用自動Edman降解化學法的野生型GM-CSF的N末端測序得到序列APARSPS，它與成熟人GM-CSF前七個氨基酸同一匹配，表明N末端被正確加工(Lee等1985)。在還原型和非還原型條件下，純化的野生型GM-CSF和商業上可獲得GM-CSF(大腸桿菌表達的；R&DSystems)共同遷移，如Western印跡分析顯示。在還原條件下，兩種蛋白均顯示所期望的遷移率轉換到更高表觀分子量，因為分子內二硫鍵的破壞。
D.野生型GM-CSF的體外生物活性。使用人TF-1真核細胞系(Kitamura等1989)的細胞增殖試驗測定野生型GM-CSF的生物活性。人TF-1細胞系得自美國典型培養物保藏中心。細胞保存在補充10％FBS，50單位/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素和2ng/ml重組人GM-CSF(得自大腸桿菌；R&D Systems)的RPMI 1640培養基中。通常，生物試驗的建立是通過用RPMI 1640培養基(無添加劑)洗滌TF-1細胞三次并將細胞以1×105個/ml的濃度重懸于含10％FBS，50單位/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素(試驗培養基)的RPMI 1640培養基中。50μl(5×103個細胞)細胞懸液均分到平底96孔組織培養板的每個檢測孔中。在試驗培養基中制備待檢測蛋白樣品的系列稀釋物。并列分析商業上重組人GM-CSF(大腸桿菌表達的；R & D Systems)的系列稀釋物。50μl稀釋蛋白樣品加入到檢測孔中，板在37℃潮濕的5％CO2組織培養溫箱中溫育。在一式三份的三個孔中檢測蛋白樣品。～3天后，每孔中加入20ìlMTS/PMS混合物(細胞滴定96 AQueous One Solution，Promega)，板在組織培養溫箱中37℃溫育1-4小時。用微板閱讀器在490nm讀出孔的吸光度。對照孔含培養基但不含細胞。從檢測孔得到的平均值減去三個對照孔的平均吸光度值。計算每個樣品的半數最大刺激濃度EC50s以比較蛋白的生物活性。
TF-1細胞系對GM-CSF顯示強烈增殖反應，如細胞數量和吸光度值劑量依賴性增加所證明。在生物試驗中，商業上的GM-CSF和我們制備的GM-CSF的平均EC50s分別是97和105pg/ml(表13)。
對于在大腸桿菌中，蛋白分泌倒周質間隙的表達，從基于pUC18的pBBT268衍生物中～450bp的Nde I-Eco RI片段切割編碼13個突變蛋白的STII-GM-CSF基因，亞克隆進入pBBT257表達載體并轉化大腸桿菌W3110。
使用類似這里所述的那些步驟，人們可構建GM-CSF的其它半胱氨酸突變蛋白。半胱氨酸突變蛋白可以是半胱氨酸置換GM-CSF編碼序列中的天然氨基殘基的置換突變，在GM-CSF編碼序列的兩個天然發生的氨基酸之間插入半胱氨酸殘基的插入突變，或在GM-CSF編碼序列的第一個氨基酸A1前添加半胱氨酸殘基的添加突變，或在GM-CSF編碼序列的末端氨基酸殘基E127后添加半胱氨酸殘基的添加突變。半胱氨酸殘基可以置換GM-CSF編碼序列任何位置中的任何氨基酸，或插入在任何兩個氨基酸之間。在GM-CSF中置換或插入半胱氨酸殘基的優選位點是螺旋A前區域、A-B環、B-C環、C-D環和螺旋D遠端區。其它優選位點是A，B，C和D螺旋的最先和最后三個氨基酸。一些優選的半胱氨酸突變位點在表13中描述。其它優選的位點包括R67C，G68C，L70C，R30C，T32C，A33C，E35C，N37C，T39C，E45C，D48C，Q50C，E51C，Q99C，T98C，E113C和E127C。除了上述突變外，在這些區域產生半胱氨酸置換的其它優選殘基在PCT/US98/14497中描述。
人們也可以通過另一個氨基酸置換GM-CSF中天然產生的正常形成二硫鍵的半胱氨酸殘基之一，構建含有游離半胱氨酸的GM-CSF。正常與被置換的半胱氨酸殘基形成二硫鍵的天然產生的半胱氨酸殘基現在游離了。半胱氨酸殘基可以被任何其它19個氨基酸取代，但優選絲氨酸或丙氨酸殘基。也可以用如Sytkowdki等(1998)所述的步驟化學修飾天然產生的氨基酸，將游離半胱氨酸殘基引入GM-CSF。
也可以使用實施例8，9，14和15的步驟通過循序誘變循環(sequentialrounds of mutagenesis)或可供選擇地通過將各個突變體體外重組以構建編碼含兩個或更多游離半胱氨酸殘基的突變蛋白的重組表達質粒，構建含兩個或更多添加的游離半胱氨酸殘基的多變異體。優選的多變異體將是組合兩個或更多半胱氨酸突變蛋白的那些，其中每個在PEG化時保持高活性，如A3C加S69C，S69C加E93C，和A3C加E93C。其它優選多突變體可以基于表9和表10的數據推出，將包括含兩個和更多選自組*-1C，A1C，A3C，S5C，S7C，S69C和E93C的突變的組合。
使用類似實施例14-16描述的步驟，人們可在大腸桿菌中表達蛋白、純化蛋白、PEG化蛋白和測定它們在體外生物試驗中的生物活性。蛋白可在大腸桿菌細胞質中表達或以分泌到周質間隙的蛋白表達。使用類似PCT/US00/00931中所述的步驟，或本領域技術人員熟知的相關步驟，突變蛋白也可在真核細胞如昆蟲或哺乳動物細胞中表達。如果希望從真核細胞分泌，也可以用天然GM-CSF信號序列或另一個信號序列從真核細胞中分泌蛋白。
B. GM-CSF半胱氨酸突變蛋白的表達和純化。用實施例14所述的用于野生型GM-CSF的方案，生長、誘導和收集表達13 GM-CSF半胱氨酸突變蛋白的大腸桿菌株。用實施例14所述的用于野生型GM-CSF的方案，重折疊和純化突變蛋白。從Q-Sepharose柱在大約200-230mM NaCl和Phenyl HP柱在大約6-8％硫酸銨中洗脫突變蛋白。突變蛋白主要以單體回收，非還原型SDS-PAGE測定表觀分子量～14kDa。
C. GM-CSF半胱氨酸突變蛋白的生物活性。TF-1細胞增殖試驗檢測13個純化GM-CSF半胱氨酸突變蛋白。用Bradford蛋白檢測試劑盒(Bio-RadLaboratories)確定蛋白濃度。在同一天并列分析商業上的野生型GM-CSF和我們制備的野生型GM-CSF，以對照試驗中一天內的變異。所有13個突變蛋白刺激TF-1細胞增殖的程度與野生型GM-CSF對照蛋白相同。13個突變蛋白的平均EC50s范圍80-134pg/ml(表13)。表13GM-CSF半胱氨酸突變蛋白的性能


a觀察到的EC50值范圍；試驗數量在括號中。
b商業上的野生型GM-CSF(R & D Systems)cBolder BioTechnology制備的野生型GM-CSF
B. PEG化GM-CSF半胱氨酸突變蛋白的制備和純化PEG化等分試樣200至300g 10個純化的GM-CSF半胱氨酸突變蛋白，以提供純化和特性描述足夠的原料。較大PEG化反應也在室溫進行1.5小時。對于每個突變體，使用15倍過量TCEP和20倍過量5kDa馬來酰亞胺。唯一的例外是S69C使用5kDa乙烯砜-PEG。這些反應條件產生所有十個突變體的單PEG蛋白。在反應時間末，用冰冷20mMTris，pH8.0稀釋20×PEG化混合物后快速填入Q-Sepharose柱(1mL，HiTrap)，使用類似于上述用于GM-CSF突變蛋白初次純化條件(25mL梯度，0-0.35M NaCI的20mM Tris pH8.0)。PEG部分的存在降低了蛋白對樹脂的親和力，允許PEG化蛋白與非PEG化蛋白分離。非還原型SDS-PAGE分析PEG化反應顯示唯一可檢測到的PEG化種類是PEG-GM-CSF半胱氨酸突變蛋白單體，它與表觀分子量～26kDa遷移。Q-Sepharose柱的層析圖譜顯示兩個主蛋白峰。SDS-PAGE確定較早的洗脫主峰(160-200mM NaCl)是單PEG化GM-CSF蛋白。第二個主峰(200-230mMNaCl)確定是未反應的GM-CSF蛋白。匯合主要含單PEG化GM-CSF突變蛋白的較早洗脫峰的級分并用于生物活性測定。用等同方案PEG化和純化所有GM-CSF突變蛋白。SDS-PAGE分析PEG化蛋白顯示相似的表觀分子量，除了PEG-E93C和PEG-T94C突變蛋白顯示稍小的表觀分子量。使用10和20kDa馬來酰亞胺PEGs，也在N末端區小規模PEG化四個半胱氨酸突變蛋白(*-1C，A1C，A3C和S7C)。使用上述條件，用3μg每種突變蛋白進行這些反應，用SDS-PAGE分析。這些蛋白的每種容易與10kDa和20kDa PEG試劑反應，產生單PEG化蛋白。也用上述方案制備40kDa-PEG-A3C。這個方案按比例放大以提供大量10kDa，20kDa和40kDa-PEG-A3C蛋白。
C. PEG化GM-CSF半胱氨酸突變蛋白的生物活性我們純化了足量的用5kDa PEG修飾的7種突變蛋白(*-1C，A1C，A3C，S5C，S7C，S69C和E93C)進行準確蛋白濃度和特異生物活性測定。TF-1細胞增殖試驗測定7個純化的5kDa-PEG-GM-CSF半胱氨酸突變蛋白。用Bradford染料結合試驗確定蛋白濃度。所有PEG化GM-CSF半胱氨酸突變蛋白顯示與野生型GM-CSF類似的劑量反應曲線并達到相同水平的最大生長刺激。PEG-GM-CSF半胱氨酸突變蛋白的平均EC50s范圍80-123pg/ml(表14)。表14PEG化GM-CSF半胱氨酸突變蛋白的生物活性

a觀察到的EC50范圍，試驗數在括號中。
TF-1細胞增殖試驗測定10kDa，20kDa和40kDa-PEG分子修飾的A3C突變蛋白的生物活性。用Bradford染料結合試驗確定蛋白濃度。每種PEG-A3C蛋白刺激TH-1細胞增殖。10kDa，20kDa和40kDa-PEG A3C半胱氨酸突變蛋白的平均EC50分別是78+/-3pg/ml，113+/-5pg/ml和300+/-50pg/ml(對于每個蛋白，N＝4個試驗)。
D. 10kDa，20kDa和40kDa-PEGs修飾的A3C表觀分子量用大小排阻HPLC(SEC)，使用Biorad Bio-Sil SEC-400-5柱在Beckman System GlodHPLC上確定PEG化GM-CSF A3C蛋白的表觀分子量。磷酸緩沖鹽組成的等梯度(isocratic gradient)用作洗脫劑。基于凝膠過濾蛋白標準(BioRadLaboraories，Richmond，CA)的標準曲線，每個蛋白的停留時間用于計算分子量。PEG化蛋白相對于非PEG化GM-CSF，表觀分子量顯著增加(表15)。較大PEG比較小PEG提高了蛋白的表觀分子量。記錄PEG化GH、IFN-α2和G-CSF半胱氨酸突變蛋白的相似數據。表15大小排阻層析測定的PEG化GM-CSF半胱氨酸突變蛋白的表觀分子量


實施例17野生型鼠GM-CSF和鼠GM-CSF半胱氨酸突變蛋白的克隆、表達、純化和生物活性我們從美國典型培養物保藏中心得到的小鼠EL4.IL-2細胞系(目錄號#TIB-181)分離的總RNA進行RT-PCR，克隆并測序了編碼成熟小鼠GM-CSF的cDNA。所述細胞在補充了10％FBS，50單位/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的DMEM培養基中生長。RNA分離前，用1μg/ml PHA-L(Sigma-AldrichChemical Company，目錄#L-4144)和10ng/mlPMA(Sigma-AldrichChemical Company，目錄#P-1585)，在10％FBS，50單位/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的DMEM培養基中，37℃誘導所述細胞6或24小時。用購自Qiagen，Inc.(Santa Clarita，CA)的RNeasy Mini RNA分離試劑盒根據制造商的指導從細胞中分離RNA。用Boehringer Mannheim Corp的RT-PCR的第一條鏈cDNA合成試劑盒(AMV)和隨機六聚體用作引物，完成單鏈cDNA的第一條鏈合成。用正向引物BB481[5＞GCG AC GCG TAC GCA GCA CCC ACCCGC TCA CCC ATC ACT＞3；SEQ ID NO43]和反向引物BB482進行用第一條鏈合成產物作為模板的后續PCR反應。BB481與編碼成熟小鼠GM-CSF前八個氨基酸的24個核苷酸退火，BB481也就在這個序列的5’端添加重疊編碼上述實施例7和Picken等(1983)所述的大腸桿菌stII信號序列的羧基末端4個氨基酸的核苷酸。這11個核苷酸包括MluI限制性位點。BB482[5＞GCG GAA TTC TTA TTT TTG GAC TGG TTT TTT GCA TTC AAA GGG＞3；SEQ ID NO44]與編碼小鼠GM-CSF羧基末端十個氨基酸的核苷酸退火并緊接在編碼序列后添加TAA翻譯終止密碼子和Eco RI限制性位點。6小時和24小時RNA樣品產生GM-CSF RT-PCR產物。用Mlu I和Eco RI消化6小時RNA樣品所得～400bp PCR產物，凝膠純化并克隆到上面實施例8所述的pBBT227[pUC18stII-G-CSF(C17S)]。用MluI和Eco RI消化pBBT227DNA，堿性磷酸酶處理并在1％瓊脂糖凝膠中泳動。純化～2.4kb載體片段并用于連接。所得重組體攜帶與鼠GM-CSF融合的完整stII引導子，這個“stII-muGM-CSF”構建體可切割為～450bp的Nde I-Eco RI片段。具有正確序列的一個克隆(Gough等，1984)記做pUC18stII-muGM-CSF或pBBT435。對于表達研究，pBBT435的Nde I-Eco RI片段亞克隆到上面實施例14所述的表達載體pBBT257。所得質粒pBBT257stII-muGM-CSF或pBBT456導入大腸桿菌W3110進行表達。使用上面實施例14中所述的用于表達和純化人GM-CSF的方案表達和純化野生型小鼠GM-CSF。
使用如Innis等1990和Horton等(1993)和在上面其它實施例中一般所述的基于PCR的定點誘變可構建突變小鼠GM-CSF基因。在螺旋A最近的氨基末端區構建一個突變蛋白T3C。使用質粒pBBT435(實施例17所述)作為模板和正向引物BB504[5＞GCG AC GCG TAC GCA GCA CCC TGC CGC TCA CCCATC ACT＞3；SEQ ID NO45]和反向引物BB482[5＞GCG GAA TTC TTATTT TTG GAC TGG TTT TTT GCA TTCAAA GGG＞3；SEQ ID NO46]，進行誘變PCR反應。BB504將成熟小鼠GM-CSF的3位蘇氨酸ACC密碼子變為半胱氨酸的TGC密碼子。用Mlu I和Eco RI消化所得～400bp PCR產物，凝膠純化并克隆進入用Mlu I和Eco RI消化的pBBT435，堿性磷酸酶處理并凝膠純化。具有正確序列的一個克隆記做pUC18stII-muGM-CSF(T3C)。對于表達研究，這個質粒的Nde I-Eco RI片段亞克隆到上面實施例14所述的表達載體pBBT257。所得質粒pBBT257stII-muGM-CSF(T3C)或pBBT469導入大腸桿菌JM109進行表達。使用上面實施例14中所述的用于表達和純化人GM-CSF的方案表達和純化小鼠GM-CSF的T3C突變蛋白。
使用類似這里所述的和上面實施例9和15所述的步驟，人們可構建小鼠GM-CSF的其它半胱氨酸突變蛋白。半胱氨酸突變蛋白可以是半胱氨酸置換GM-CSF編碼序列中天然氨基殘基的置換突變，在小鼠GM-CSF編碼序列的兩個天然發生的氨基酸之間插入半胱氨酸殘基的插入突變，或在小鼠GM-CSF編碼序列的第一個氨基酸前添加半胱氨酸殘基的添加突變，或在小鼠GM-CSF編碼序列的末端氨基酸殘基后添加半胱氨酸殘基的添加突變。半胱氨酸殘基可以置換小鼠GM-CSF編碼序列任何位置中的任何氨基酸，或插入在任何兩個氨基酸之間。置換或插入半胱氨酸殘基的優選位點是螺旋A前區域、A-B環、B-C環、C-D環和螺旋D遠端區。其它優選位點是A，B，C和D螺旋的最先和最后三個氨基酸。人們也可以通過另一個氨基酸置換GM-CSF中天然產生的正常形成二硫鍵的半胱氨酸殘基之一，構建含有游離半胱氨酸的GM-CSF。正常與被置換的半胱氨酸殘基形成二硫鍵的天然產生的半胱氨酸殘基現在游離了。半胱氨酸殘基可以被任何其它19個氨基酸取代，但優選絲氨酸或丙氨酸殘基。也可以用如Sytkowdki等(1998)所述的步驟化學修飾天然產生的氨基酸，將游離半胱氨酸殘基引入GM-CSF。
也可以使用實施例9和15所述步驟循序誘變循環或可供選擇地通過將各個突變體體外重組以構建編碼含兩個或更多游離半胱氨酸殘基的突變蛋白的重組表達質粒，可以構建含兩個或更多添加的游離半胱氨酸殘基的多變異體。優選的多變異體將是在PEG化時保持高，或完整，特異活性的兩個或更多半胱氨酸突變蛋白組合。
使用類似實施例12-14，15和16描述的步驟，人們可表達、純化、和PEG化小鼠GM-CSF突變蛋白并測定這些蛋白在體外生物試驗和體內功效模型中的生物活性。蛋白可在大腸桿菌細胞質中表達或以分泌到周質間隙的蛋白表達。使用類似PCT/US00/00931中所述的步驟，或本領域技術人員熟知的相關步驟，突變蛋白也可在真核細胞如昆蟲或哺乳動物細胞中表達。如果希望從真核細胞分泌，也可以用天然GM-CSF信號序列或另一個信號序列從真核細胞中分泌蛋白。
如上面實施例8和9所述可用NFS60細胞系，用細胞增殖試驗檢測純化的小鼠GM-CSF野生型蛋白、半胱氨酸突變蛋白和PEG化形式半胱氨酸突變蛋白的生物活性。
用人WT-GM-CSF(實施例14-16)所述步驟，從大腸桿菌分離小鼠野生型GM-CSF和鼠T3C GM-CSF半胱氨酸突變蛋白，除了用30％硫酸銨使鼠蛋白結合在苯基Sepharose柱，而不是如人GM-CSF所述的15％。用上述用于人GM-CSF A3C半胱氨酸突變蛋白的步驟，小鼠T3C半胱氨酸突變體容易與10kDa，20kDa和40kDa PEG馬來酰亞胺試劑PEG化。可如實施例8和9所述NFS60細胞增殖試驗測定這些PEG化蛋白的生物活性。
使用Horton等(1993)和PCT/US00/00931所述的“重疊延伸誘變”技術引入產生Xho I位點的三個突變。Xho I構建的原始或“最初”PCR反應在含1.5mM MgCl2，每種引物0.4μM，dATP，dGTP，dTTP和dCTP每種200μM，1ng模板質粒pBBT132(野生型Epo-Flag基因克隆作為pUC19的BamHI-EcoR I片段，(PCT/US00/00931所述)，2單位Taq鉑(BRL)，和0.25單位Pfu聚合酶(Stratagene)的1×Promega PCR緩沖液的50μl反應體積中進行Xho I構建的最初PCR反應。在Perkin-Elmer GeneAmpPCR System 2400熱力循環儀中進行反應。反應程序需要95℃5分鐘，25個循環的[94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒]，72℃保持7分鐘和4℃保持。使用的引物對是[BB361xBB125]和[BB362xBB126]。BB361(5＞GTTGGTCAAC TCGAGCCAGCCGTGGGAG＞3；SEQ ID NO79]與編碼成熟Epo的氨基酸殘基81-89的DNA序列退火。BB125(5＞CTATGC GGCATCAGAGCAGATA＞3；SEQ ID NO17)與克隆的Epo序列下游pUC19載體序列～20bp退火。PCR產物在1.5％瓊脂糖凝膠中泳動，從膠中切除，使用QIA快速凝膠提取試劑盒(Qiagen)，根據賣主方案分離。接著，這兩個誘變片段在隨后或在第二次PCR反應中被“連接”在一起。在這個反應中，最初反應的凝膠純化PCR產物每種0.3μl用作模板，BB125和BB126用作引物。反應體積是50μl，使用2.5單位Taq聚合酶和0.5單位Pfu聚合酶。否則，反應條件與在最初反應中使用的那些等同。瓊脂糖凝膠電泳分析等份的第二次PCR且觀察到期望的～190bp條帶。根據賣主方案，使用QIA快速PCR純化(Qiagen)“清除(clean-up)”第二次PCR反應的大部分，用Kpn I和Stu I(New England BioLabs)消化。使用QIA快速PCR純化試劑盒另外清除后，消化產物與已經用Kpn I和StuI切割的pBBT138(野生型Epo-Flag基因作為pBlueBac4.5中的BamH I-EcoRI片段克隆，(PCT/US00/00931))連接，牛小腸堿性磷酸酶(New EnglandBioLabs)處理并凝膠純化。連接反應用于轉化大腸桿菌并對所得轉化體的質粒測序以鑒定含XhoI位點和全部～433bp Kpn I-Stu I片段的正確序列的克隆。這個克隆記做pBBT358。
對于與STII信號肽(指導成熟蛋白分泌到大腸桿菌周質的肽序列)融合的Epo的表達，用于PCR反應的寡核苷酸是BB583(5＞CCAACGCGTACGCAGCCCCA CCACGCCTCATC3＞；SEQ ID NO46)，它與基因N末端編碼區退火。BB585(5＞CCGGAATTCT TAACGGTCAC CTGTGCGGCAGGC＞3；SEQ IDNO47)或BB586(5＞CCGGAATTCT TAGTCACCTG TGCGGCAGGC＞3；SEQ IDNO48)，它與基因C末端編碼區退火。BB585包括Argl66的密碼子，由cDNA序列預測的C末端氨基酸，而BB586刪除了Arg166密碼子，編碼C末端氨基酸Asp165。用MluI和Eco RI消化所得～600bp PCR產物并克隆進入類似消化的pBBT227(實施例9)載體以使得STII引導序列和野生型Epo的氨基末端編碼序列融合。使用BB583和BB585的PCR形成的基因術語稱作全長STII-Epo(STII-Epo-FL)，使用BB583和BB586的PCR形成的基因術語稱作STII-Epo des Arg(STII-Epo-dR)。具有正確序列的STII-Epo-FL和STII-Epo-dR克隆接著以Nde I-Eco RI片段亞克隆進入pBBT257(實施例14中描述)以分別產生pBBT477和pBBT478。
pBBT477和pBBT478轉化JM109以產生株BOB578和BOB579。這些株，連同BOB490(pBBT257/JM109)在含10μg/ml四環素的Luria肉湯培養基(LB培養基)中，37℃在滾動管中過夜生長。飽和的過夜培養物在含10μg/ml四環素的LB培養基在A600稀釋到～0.025O.D.，并在振蕩瓶中37℃培養。典型地，25ml培養物在250ml振蕩瓶中生長。當培養物的O.D.達到～0.3-0.5，加入IPTG使終濃度為0.5mM，以誘導Epo野生型或Epo des Arg166表達。對于最初實驗，4和～19小時誘導后，抽樣檢查培養物。用預制的(precast)14％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和考馬斯蘭染色分析樣品。BOB578和BOB579的誘導培養物在大約20kDa出現條帶，與野生型Epo分子量一致。在僅作為對照載體的BOB490的誘導培養物中沒有檢測到這條帶。
B. Met-紅細胞生成素在大腸桿菌細胞質中表達。如實施例18.A.所述，用PCR從含野生型Epo基因的質粒pBBT358中擴增編碼野生型人紅細胞生成素(Epo)的DNA。對于met-Epo在大腸桿菌周質中的表達，用于PCR反應中的寡核苷酸是BB584(5＞TTCGCT AGCATG CAT GAC CTG CAG GAG GAA ATTTAA ATG GCC CCA CCA CGC CTC ATC 3＞；SEQ ID NO49)，它與基因N末端的編碼區退火，和上述的BB585(5＞CCGGAATTCT TAACGGTCACCTGTGCGGCA GGC＞3；SEQ ID NO47)或BB586(5＞CCGGAATTCT TAGTCACCTGTGCGGCAGGC＞3；SEQ ID NO48)。用Mlu I和Eco RI消化所得～600bpPCR產物并克隆進入類似消化的pBBT227(實施例9)載體以產生編碼甲硫氨酰Epo的基因。使用BB583和BB585的PCR形成的基因術語稱作全長met-Epo(met-Epo-FL)，和使用BB583和BB586的PCR形成的基因術語稱作met-Epodes Arg(met-Epo-dR)。具有正確序列的met-Epo-FL和met-Epo-dR克隆接著以Nde I-Eco RI片段亞克隆進入pBBT257(實施例14中描述)以分別產生pBBT479和pBBT480。
pBBT479和pBBT480轉化JM109以產生株BOB580和BOB581。這些株的表達實驗連同BOB490(pBBT257/JM109)與上述用于STII-Epo構建體的相同。BOB580和BOB581的誘導培養物在大約20kDa出現條帶，與野生型Epo分子量一致。在僅作為對照載體的BOB490的誘導培養物中沒有檢測到這條帶。
使用實施例18中所述的用于野生型EPO的步驟，可在大腸桿菌中表達重組紅細胞生成素和紅細胞生成素半胱氨酸突變蛋白。根據制造商指導，用B-per(Pierce)裂解細胞，離心分離不溶部分。用20mM半胱氨酸，6M胍，20mM Tris溶解沉淀。室溫攪拌混合物1-2小時后用20m Tris，pH8，40μm硫酸銅，2％月桂酰肌氨醇1∶20(v/v)稀釋。在4℃放置復性24-48小時。用在20mM Mes，pH5，0.01％Tween和20％甘油(緩沖液A)中平衡的S-Sepharose柱純化重折疊EPO和EPO半胱氨酸突變蛋白。可用含線性梯度0-1M NaCl的緩沖液A從S-Sepharose柱洗脫EPO。如果需要，進一步純化重組EPO的第二個柱包括SEC、Blue-sepharose、羥磷灰石或HIC樹脂(苯基，丁基)。
可用層析方法如大小排阻層析、離子交換層析、疏水相互作用層析等等隨后純化大小離散(discrete size classes)的某些聚合物。所述的用于GH的類似步驟可用于產生G-CSF、α干擾素、GM-CSF和其它蛋白的二硫鍵連接的二聚體和高度有序的多聚體。
B. 野生型met-Endostatin在大腸桿菌中表達。編碼met-Endostatin野生型的pBBT371和親本載體pBBT257轉化大腸桿菌JM109產生株BOB460和BOB490，和轉化W3110產生株BOB461和BOB340。這些株在含10μg/ml四環素的Luria肉湯培養基(LB培養基)中，37℃在滾動管中過夜生長。飽和的過夜培養物在含10μg/ml四環素的LB培養基稀釋到A600為～0.025O.D.，并在振蕩瓶中37℃培養。典型地，25ml培養物在250ml振蕩瓶中生長。當培養物的O.D.達到～0.3-0.5，加入IPTG使終濃度為0.5mM，以誘導人met-endostatin表達。對于最初實驗，誘導后0，4和～19小時，抽樣檢查培養物。用預制的14％ Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和考馬斯蘭染色分析樣品。BOB460和BOB461的誘導培養物在大約20kDa出現條帶，與成熟人Endostatin的分子量一致。在BOB460和BOB461的未誘導培養物或僅作為對照載體的BOB490和BOB340的未誘導培養物中沒有檢測到這條帶。～20kDa條帶與購自Calbiochem的商業上制備的人Endostatin共同遷移。
用于誘變PCR反應的模板片段來源是質粒pBBT370。用適當的限制性核酸內切酶消化PCR產物，用Qiagen PCR清除試劑盒提取并與已經用那些相同的限制性酶切割的pBBT370載體DNA連接，堿性磷酸酶處理和用QiagenPCR清除試劑盒提取。培養來自這些連接體的轉化體，分離質粒DNAs并測序。確定完整克隆的誘變PCR片段的序列以證實存在目的突變和不存在PCR反應或合成寡核苷酸引物潛在可能引入的任何另外突變。
使用三個PCR擴增如下構建半胱氨酸置換突變*-1C。設計誘變的正向寡核苷酸BB531(5＞GAGGAAATTT AAATGTGCCA CAGCCATCGC GACTTCC＞3；SEQID NO53)在N末端ATG甲硫氨酸密碼子和第一個CAC組氨酸密碼子之間插入TGC半胱氨酸密碼子。這個寡核苷酸用于PCR#1中，還有編碼Endostatin編碼序列上游60bp內的pUC18載體序列退火的反向非誘變引物BB126(5＞TGTGGAATTG TGAGCGGATA AC＞3；SEQ ID NO54)。這個PCR的模板是來自pBBT370的純化的1264bp Nhe I-ApaL I片段。這個片段含有完整Endostatin編碼序列和Endostatin基因上游670bp的pUC18序列，包括與BB126退火的序列。PCR#1是含1.5mM mM MgCl2，每種引物0.4μM，每種dATP，dGTP，dTTP和dCTP 200μM，0.5ng模板片段，1單位Taq聚合酶(Promega)，和0.1單位Pfu聚合酶(Stratagene)的1×Promega PCR緩沖液的50μl PCR反應。反應在Perkin-Elmer GeneAmpPCR System 2400熱力循環儀中進行。反應程序需要95℃5分鐘，22個循環的『94℃30秒，55℃30秒，72℃45秒』，72℃保持7分鐘和4℃保持。
使用與BB531反向互補的誘變反向寡核苷酸BB532(5＞GGAAGTCGCGATGGCTGTGG CACATTTAAA TTTCCTC＞3；SEQ ID NO55)，和與Nde I位點上游40bp的pUC18序列退火的非誘變引物BB125(5＞CTATGCGGCA TCAGAGCAGAT＞3；SEQ ID NO17)進行PCR#2。PCR#2的模板是來自含完整Endostatin編碼序列的pBBT370中純化的990bp Ssp I-EcoRI片段和Endostatin基因片段5’末端Nde I位點上游的pUC18序列的367bp，包括與BB125退火的序列。PCR#2的成分和程序與PCR#1相同。瓊脂糖凝膠電泳分析10μl等分試樣PCR#1和PCR#2，發現每個都產生期望大小的單一片段。
PCR#3是使用非誘變引物BB125和BB126進行的50μl反應。這個PCR的模板是1μl PCR#1和0.3μl PCR#2。PCR#3的成分與反應1和2相同。反應程序需要95℃5分鐘，23個循環的『94℃30秒，56℃30秒，72℃1分鐘』，72℃保持7分鐘和4℃保持。瓊脂糖凝膠電泳分析10μl等份PCR#3，發現產生了期望的740bp片段。用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)根據賣主方案“清除”反應剩余物，并根據賣主方案用Nhe I和BsrG I(New England BioLabs)消化。用QIAquick PCR純化試劑盒另外的清除步驟后，消化產物與已用Nhe I和BsrG I消化的pBBT370連接，牛小腸堿性磷酸酶(New England BioLabs)處理并用QIAquick PCR純化試劑盒“清除”。連接反應用于轉化大腸桿菌JM109并對所得轉化體的質粒進行測序。鑒定具有*-1C突變和全部～205bp Nhe I和BsrG I片段的正確序列的克隆。
使用用于*-1C的上述詳細方案，除了使用不同的誘變寡核苷酸(表16)，構建置換突變H2C，R5C，F7C和R28C(即將2位組氨酸變為半胱氨酸等)并證實序列。正向誘變寡核苷酸一直用于和反向非誘變引物BB126結合，1264bp的Nhe I-ApaL I片段作為模板，和反向誘變寡核苷酸一直用于和正向非誘變引物BB125結合，純化的990bpSsp I-EcoRI片段作為模板。表16用于構建Endostatin半胱氨酸突變蛋白的寡核苷酸突變寡核苷酸方向序列(5’＞3’)；粗體顯示Cys密碼子H2C BB533 正向 GAGGAAATTTAAAT AGCCATCGCGACTTCCAGSEQ ID NO56H2C BB534 反向 CTGGAAGTCGCGATGGCTGCACATTTAAATTTCCTCSEQ ID NO57R5C BB535 正向 ATGCACAGCCAC GACTTCCAGCCGSEQ ID NO58R5C BB536 反向 CGGCTGGAAGTCGCAGTGGCTGTGCATSEQ ID NO59F7C BB537 正向 GCCACCGCGAC CAACCGGTGCTCCACSEQ ID NO60F7C BB538 反向 GTGGAGCACCGGTTGACAGTCGCGGTGGCSEQ ID NO61R28C BB539 正向 CATGCGGGGCATC GGCGCCGACTTCCAGSEQ ID NO62R28C BB540 反向 CTGGAAGTCGGCGCCGCAGATGCCCCGCATGSEQ ID NO63G90C BB543 正向 GGCTCTGTTCTCG TCTGAGGGTCCSEQ ID NO64G90C BB544 反向 GGACCCTCAGAGCACGAGAACAGAGCCSEQ ID NO65G98C BB545 正向 CCGCTGAAGCCC GCACGCATCTTCSEQ ID NO66G98C BB546 反向 GAAGATGCGTGCGCAGGGCTTCAGCGGSEQ ID NO67H112C BB547 正向 GACGTCCTGAGG CCGACCTGGCCCCAGSEQ ID NO68L154C BB548 正向 GGCCAGGCCTCCAGCCTC GGGGGCAGGCTCSEQ ID NO69L154C BB549 反向 GAGCCTGCCCCCGCAGAGGCTGGAGGCCTGGCCSEQ ID NO70R157C BB550 正向CTGCTGGGGGGCTGCCTCCTGGGCCAGAGTGCCGCGSEQ ID NO71R157C BB551 反向 CGCGGCACTCTGGCCCAGGAGGCAGCCCCCCAGCAGSEQ ID NO72S162C BB552 正向 CTCCTGGGGCAG GCAGCGAGCTGCCATCSEQ ID NO73S162C BB553 反向 GATGGCAGCTCGCTGCGCACTGCCCCAGGAGSEQ ID NO74用類似*-1C所述的那些方法構建突變蛋白G90C和G98C，除了誘變寡核苷酸不同(表16)和PCR#3的模板是0.5μl PCR#1和0.5μl PCR#2。此外，“清除”后，用BsrG I和Bsu36 I(New England BioLabs)消化PCR#3，和另外的清除步驟后，消化產物與已經用BsrG I和Bsu36 I切割的pBBT370連接，牛小腸堿性磷酸酶(New England BioLabs)處理并用QIA快速PCR純化試劑盒“清除”。
用類似*-1C所述的那些方法構建突變蛋白L154C，R157C和S162C，除了誘變寡核苷酸不同(表16)和PCR#3的模板是0.3μl PCR#1和lul PCR#2.此外，“清除”后，用Bsu36 I和Eco RI消化PCR#3，和另外的清除步驟后，消化產物與已經用Bsu36 I和Eco RI切割的pBBT370連接，牛小腸堿性磷酸酶(New England BioLabs)處理并用QIA快速PCR純化試劑盒“清除”。
用在幾個方面與*-1C所述不同的方法構建突變蛋白H112C。首先，用于PCR#1的誘變正向寡核苷酸序列不同(表16)且反應體積是50μl而不是25μl。不進行PCR#2和PCR#3，因為它們不是必需的。反而，凝膠電泳分析10μl等份后，用與pCR#3正常處理非常相似的方法處理這個反應。就是說，根據賣主方案，用QIA快速PCR純化“清除”反應剩余物并用Bsu36I和Eco RI(New England BioLabs)消化。用QIA快速PCR純化試劑盒進行另外的“清除”步驟后，消化產物與已經用Bsu36 I和Eco RI切割的pBBT370連接，牛小腸堿性磷酸酶(New England BioLabs)處理并用QIA快速PCR純化試劑盒“清除”。連接反應用于轉化大腸桿菌JM109并對所得轉化體的質粒進行測序。
B. Met-Endostatin的半胱氨酸突變蛋白在大腸桿菌中表達每種具有正確序列的met-Endostatin半胱氨酸突變蛋白克隆以Nde I-EcoRI片段亞克隆進入pBBT257(實施例14所述)產生一組轉化JM109產生用于表達研究株的表達質粒。
這些株在含10μg/ml四環素的Luria肉湯培養基(LB培養基)中，37℃在滾動管中過夜生長。飽和的過夜培養物在含10μg/ml四環素的LB培養基稀釋到A600為～0.025O.D.，并在振蕩瓶中37℃培養。典型地，25ml培養物在250ml振蕩瓶中生長。當培養物的O.D.達到～0.3-0.5，加入IPTG使終濃度為0.5mM，以誘導該株特異性的Endostatin半胱氨酸突變蛋白表達。誘導前，誘導后4小時，和誘導后16小時，收集樣品。用預制的14％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和考馬斯蘭染色分析樣品。每種Endostatin半胱氨酸突變蛋白的誘導培養物在大約20kDa出現條帶，與成熟人Endostatin一致。在未誘導培養物和僅作為對照載體的BOB490的誘導和未誘導培養物中沒有檢測到這條帶。～20kDa條帶與購自Calbiochem的商業上制備的人Endostatin共同遷移。
C.endotatin和endostatin半胱氨酸突變蛋白的表達和純化離心使含表達野生型endostatin和endostatin半胱氨酸突變蛋白R5C的大腸桿菌沉淀并在-80℃冰凍。消融細胞沉淀并根據制造商(Pierce)方案用5mLB-PERTM細菌蛋白提取試劑處理。離心回收含大量endostatin蛋白的不溶物質并重懸于B-PER。用溶菌酶(200μg/ml)處理這個混合物10分鐘以進一步破壞細胞壁，加入MgCl2(終濃度10mM)和無蛋白酶DNAse(2μg/ml)。離心收集不溶endostatin，并重懸于水中洗滌和再次離心，以去除大部分可溶的細胞雜質。為了重折疊，所得含不溶endostatin的沉淀溶于含20ml 8M尿素、10mM半胱氨酸的20mM Tris堿中。這個混合物在室溫攪拌120分鐘。加入半胱氨酸至終濃度10mM后，溶解物稀釋到200ml冰冷3M尿素，40μM硫酸銅，20mM Tris，pH7.5。這個重折疊混合物在4℃緩慢攪拌3天。然后用稀釋HCl將重折疊混合物的pH調至5.0并離心后填入在40mM磷酸鈉pH5.0(緩沖液A)中平衡的5ml S-Sepharose柱(Pharmacia HiTrap)中。用從0-100％緩沖液B(500mM NaCl，20mM磷酸鈉，pH5.0)的線性鹽梯度洗脫結合蛋白。混合主要含endostatin的S-Sepharose柱級分，其pH調至7.4后填入在20mM Tris，pH7.4中先平衡的肝素-Sepharose(Hitrap)柱。用0-1MNaCl鹽梯度洗脫這個柱。混合并冰凍含純endostatin的肝素柱級分。使用上述方案也已經部分純化Endostatin半胱氨酸突變體G90C，G98C，H112C和R157C，省略肝素柱步驟。
用15×過量的5kDa PEG馬來酰亞胺和10-15倍過量TCEP PEG化R5Cendostatin半胱氨酸突變蛋白。反應產生單PEG化R5C蛋白。
D. Endostatin生物活性使用Kim等(2000)所述的MMP-2抑制試驗，重折疊野生型重組endostatin和重折疊R5C endostatin半胱氨酸突變蛋白也顯示出生物活性。
也可用內皮細胞增殖抑制試驗測定蛋白的生物活性。內皮細胞增殖體外抑制可如下實施。五千個HMVEC-L細胞(Clonetics)可鋪在凝膠化96孔培養板中并在100μl含bFGF的HMVEC-L培養基中培養(37℃，5％CO2)24小時。然后用20μl含endostatin、endostatin半胱氨酸突變蛋白或PEG化endostatin半胱氨酸突變蛋白的系列稀釋物的培養基替換培養基，并培養20分鐘。接著向孔中加入80μl含bFGF的新鮮HMVEC-L培養基。72小時后，可確定細胞數量。各種endostatin蛋白將抑制endostatin細胞增殖，如試驗末內皮細胞數量的劑量依賴性降低所證明。
如制造商方案(Poerce)用B-per可裂解表達重組制管張素或制管張素半胱氨酸突變蛋白的細菌細胞。可離心分離不溶部分。沉淀可用20mM半胱氨酸，6M胍，20mM Tρισ堿的混合物溶解。可在室溫攪拌混合物2小時后用20mM Tris稀釋10倍，重折疊物可在4℃保持1-2天。在這段時間末，可離心重折疊物并可使用賴氨酸-sepharose柱純化制管張素蛋白(或半胱氨酸突變蛋白)，重折疊物可直接填入先在20mM Hepes，0.15M NaCl，pH7.4中平衡的柱中。使用0-12mM E-氨基乙酸梯度，制管張素(或制管張素半胱氨酸突變蛋白)可從樹脂中釋放。如果需要，可使用各種離子交換或HIC樹脂完成進一步純化。實施例24PEG化蛋白的肽作圖(mapping)在很多情況下，肽圖可用于證實PEG化位點。典型地，特異性消化PEG化蛋白，使得半胱氨酸突變蛋白以不含其它半胱氨酸殘基的肽存在。PEG與肽共價連接的存在將顯著地改變反相HPLC檢測消化混合物時的截留時間。當使用文獻中的條件(Clark等，1996)，用胰蛋白酶消化GH時，可分離21個可能的胰蛋白酶肽(T1-T21，連續計數)。T1，代表包括突變T3C的殘基1-8，半胱氨酸突變蛋白(61分鐘)對野生型(64分鐘)或垂體生長激素，截留時間稍提前。當用5K PEG PEG化時，T1肽移至層析圖譜末，截留時間超過100分鐘。當用內切蛋白酶Lys-C消化GH時，其代表殘基1-38的10肽(L1-L10，連續計數)L1，對于野生型GH在大約59分鐘和對于突變蛋白T3C在大約61分鐘洗脫。當用20K PEG PEG化時，L1從層析圖譜中消失。這些數據證明如預知的PEG部分確實是與3位半胱氨酸殘基連接，而非天然半胱氨酸。PEG化前后，酶消化和RP HPLC分析IFN(胰蛋白酶和內切蛋白酶Glu-C)，GM-CSF(內切蛋白酶Glu-C)和G-CSF(內切蛋白酶Lys-C)的半胱氨酸突變蛋白，也顯示與在新引入的半胱氨酸殘基PEG化的單一位點一致的數據。
參考文獻Abrahmsen，L.，Moks，T.，Nilsson，B.and Uhlen，M.(1986)NucleicAcids Res.147487-7500.Abuchowski，A.，Kazo，G.M.，Verhoest，C.R.，van Es，T.，Kafkewitz，D.，Nucci，M.L.，Viau，A.T.and Davis，F.F.(1984)Cancer Biochem.Biophys.7175-186.Alt，F.W.，Kellems，R.E.，Bertino，J.R.，and Schimke，R.T.(1978)J.Biol.Chem.2531357-1370.Arakawa，T.，Prestrelski，S. J.，Narhi，L.O.，boone，T.C.and Kenney，W.C.(1993)J.Protein Chem.12525-531.Balkwill，F.R.，Goldstein，L.and Stebbing，N.(1985)Int.J.Cancer35613-617.Balkwill，F.R.(1986)Methods Enzymology 119649-657.Barik，S.(1993) in″Methods in Molecular Biology″，White，B. A.，ed.(Humana Press，Totawa，NJ)，15277-286.Bazan，F.(1990)Immunology Today 11350-354.Bazan，J.F.(1991)Cell 659-10.Bazan，J.F.(1992)Science 257410-411.Becker，G.W.and Hsiung，H.M.(1986)FEBS Lett.204145-150.Bewley et al.，(1969)Biochem.84701-4708.Blatt，L.M.，Davis，J.M.，Klein，S.B.and Taylor，M.W.(1996)J.Interferon and Cytokine Research 16489-499.Blezinger，P.，Wang，J.，Gondo，M.，Quezada，A.，Mehrens，D.，French，M.，Singhal，A.，Sullivan，S.，Rolland，A.，Ralston，R.，and Min，W.(1999)Nature Biotechnology17343Blumberg，H.，Conklin，D.，xu，W.，Grossman，A.，Brender，T.，Carollo，S.，Eagen，M.，foster，D.，Haldeman，B.A.，Hammond，A.，Haugen，H.，Jelinek，L.，Kelley，J.d.，madden，K.，Maurer，M.F.，Parrish-novak，j.，Prunkard，D.，sexson，S.，Sprecher，C.，Waggie，K.，west，J.，Whitmore，T. E.，Yao，L.，Kuechle，M. k.，Dale，B.and chandrasekher，Y.A.(2001)Cell 1049-19.Bolivar，F.，Rodriguez，R. L.，Greene，P.J.，Betlach，M.C.，Heyneker，H.L.，Boyer，H.W.，Crosa，J.H.and Falkow，S.(1977)Gene 295-113.Bollag，D.M.，Rozycki，M..D.and Edelstein，S.J.(1996)ProteinMethods，415 pages，Wiley-Liss，NY，NY.Bowen，S.，Tare，N.，Inoue，T.，Yamasaki，M.，Okabe，M.，Horii，I.And Eliason，J.(1999)Exp.Hematol.27，425-432.Bradley，T.，Hodgson，G.and Rosendaal，M.(1978)J.Cell Physiol.94517Braxton，S.M.(1998)U.S.Patent 5,766,897.Briddell，R.A.，Hartley，C.A.，Smith，K.A.and McNiece，I.K.(1993)Blood 82(6)，1720-1723.Cantrell，M.A.，Anderson，D.and Cerretti，D.P(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 826250-6254.Cao Y.，Ji RW.，Davidson D.，Schaller J.，Marti D.，Solindel S.，McCance SG.，O′Reilly MS.，Llinas M.and Folkman J.(1996)27129461-29467.Cecil，R.and McPhee，J.R.(1959).Advances in Protein Chemistry14，255-389.Chamow & Ashlcenazi(1996)，Trends in Biotech 1452-60.Chang，C. N.，Rey，B.，Bochner，B.，Heyneker，H. and Gray，G.(1987)Gene189-196.Cheah，K-C.，Harrison，S.，King，R.，Crocker，L.，Wells，J. R. E.and Robins，A.(1994)Gene，1389-15.Clark，R.，Olson，K.，Fuh，G.，Marian，M.，Mortensen，D.，Teshima，G.，Chang，S.，Chu，H.，Mukku，V.，Canova-Davis，E.，Somers，T.，Cronin，M.，Winkler，M.and Wells，J.A.(1996)J.Biol.Chem.27121969-21977.Cox，G.N.and McDermott，M.J.(1994)WO 9412219.Cox，G.N.，McDermott，M.J.，Merkel，E.，Stroh，C.A.，Ko，S.C.，Squires，C.H.，Gleason，T.M.and Russell，D.(1994)Endocrinology1351913-1920.Crouse，G.F.，McEwan，R.N.，and Pearson，M.L.(1983)Mol.Cell.Biol.3257-266.Cunningham，B.C.and Wells，J.A.(1989)Science 2441081-1085.Daopin，S.，Piez，K.A.，Ogawa，Y.，and Davies，D.R.(1992)Science257369-373.Denefle，P.，Kovarik，S.，Ciora，T.Gosselet，M.，Benichou，J.-C.，Latta，M.Guinet，F.，Ryter，A.and Mayaux，J.-F.(1989)Gene85，499-510.Donahue，R.E.，Wang E.A.，Stone，D.K.，Kamen，R.，Wong，G.G.，Sehgal，P.K.，Nathan，D.G.and Clark，S.C.(1986a)Nature 321872-5Donahue，R.E.，Wang，E.A.，Kaufaman，R.J.，Foutch，L.，Leary，A.C.and Witek-Giannetti，J.S.(1986b)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51685-692.Evinger，M.and Pestka，S.(1981) Methods Enzymol.79362-368.Fuh，G.，Cunnungham，B.C.，Fukanaga，R.，Nagata，S.，Goeddel，D.V.and Wells，J.A.(1992)Science 256677-1680.Fujimoto，K.，Fukuda.，T.，and Marumoto.，R.(1988)J.Biotechnol.877-86.Gamba-Vitalo，C.，DiGiovanna，M.P.，and Sartorelli，A.C.(1991)Blood Cells 17193-205.Geisse，S.，Gram，H.，Kleuser，B.and Kocher，H.P.(1996)Prot.Express.Purif.8271-282.Goffin，V.，Bernichtein，S.，Carriere，O.，Beimett，W.F.，Kopchick，J.J.and Kelley，P.A.(1999)Endocrinology 1403853-3856.Goodson，R.J.and Katre，N.V.(1990)Biotechnology 8343-346.Gough，N.M.，Metcalf，D.，Gough，J.，Grail，D.andDunn，A.R.(1985)EMBO J.4645-53.Gough，N.M.，Gough，J.，Metcalf，D.，Kelso，A.，Grail，D.，Nicola，N.A.，Burgess，A.W.and Dunn，A.R.(1984)Nature 309763-7.Greenberg，R.，Lundell，D.，Alroy，Y.and Bonitz，S.(1988)Curr.Microbiol.17321-332.Greenspan，F.S.，Li.，C.H.，Simpson，M.E.and Evans，H.M.(1949)Endocrinology 45455-463.Ghrayeb，J.，Kimura，H..，Takahara，M.，Hsiung，H.，Masui，Y.andInouye，M.(1984) EMBO J. 324372442.Hannum，C.，Culpepper，J.，Campbell，D.，McClanahan，T.，Zurawski，S.et al.(1994)Nature 368643648.Henco，K.，Brosius，J.，et al.，(1985)J.Mol.Biol.185227-260.Hershfield，M. S.，Buckley，R.H.，Greenberg，M.L.et al.，(1987)N.Engl.J.Medicine 316589-596.Hoffman，C.S.and Wright，A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 825107-5111.Hohenester，E.，Sasaki，T.，Olsen，B.R.and Timpl，R.(1998)EMBOJ.171656-1664.Horisberger，M.A.and Di Marco，S.(1995)Pharmac.Ther.66507-534.Horoszewicz，J.S.，Leong，S.S.and Carter，W.A.(1979)Science2061091-1093.Horton，R.M.(1993)in″Methods in Molecular Biology″，White，B.A.，ed.(Humana Press，Totawa，NJ)，v.15，214-250.Hsiung，H.M.，Mayne，N.G.and Becker，G.W.(1986)Biotechnology4991-995.Innis，M. A.，Gelfand，D.H，Sninsky，J.J.and White，T.J.eds.(1998)″PCR ProtocolsAGuide to Methods and Applications″(AcademicPress，San Diego，CA).Iscove，N.N.，Sieber，F.and Winterhalter，K.H.(1974)J.CellPhysiol.83309Ishikawa，M.，Iijima，H.，Satake-Ishikawa，R.，Tsumura，H.，et al.，(1992)Cell Struct.Function 17，61 65.Johns，T. G.，Mackay，I.R.，Callister，K.A.，Hertzog，P.J.，Devenish，R.J.and Linnane，A.W.(1992)J.Natl.Cancer Institute 841185-1190.Johnson，D.L.，Middleton，S.A.，McMahon，F.Barbone，F.P.，Kroon，D.，Tsao，E.，Lee，W.H.，Mulcahy，L.S.and Jolliffe，L.K.(1996)Protein Expression Purif.7104-113.Kadonaga，J.，Gautier，A. Straus，D.R.，Charles，A.D.，Edge，M.D.and Knowles，J.R.(1984)J.Biol.Chem.2592149-2154.Kajigaya，S.，Suda，T.，Suda，J.，Saito，M.，Miura，Y.，Iizuka，M.，Kobayashi，S.，Minato，N.and Sudo，T.(1986)J Exp Med 1641102-13Kang，S.-H.，Na，K.-H.，Park，J.-H.Park C-1，Lee，S.-Y.and Lee，Y-1.(1995)Biotech.Lett.17，687692.Katre，N.V.(1990)J.Immunology 144209-213.Katre，N.V.，Knauf，M.J.and Laird，W.J.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 841487-1491.Kaufman，R.J.(1990)Meth.Enzymol.185537-566.Khan，F.R.and Rai，V.R.(1990)Bioprocess Technology 7161-169.Kim，Y.M.，Jang，J.，Lee，O.，Yeon，J.，Choi，E.，Kim，K.，Lee，S.and Kwon，Y.(2000)Cancer Research 60，5410-5413.Kingsley，D.M.(1994)Genes Dev.8133-146.Kinstler，O.B.，Gabriel，N.E.，Farrar，C.E.and DePrince，R. B.(1996)International Patent Application Number WO 96/11953.Kitamura，T.，Tange，T.，Terasawa，T.，Chiba，S.，Kuwaki，T.，Miyagawa，K.，Piao，Y.F.，Miyazono，K.，Urabe，A.and Takaku，F.(1989)J.Cell.Physiol.140323-334.Knusli，C.，Delgado，C.，Malik，F.，Domine，M.，Tejedor，M.C.，Irvine，A.E.，Fisher，D.and Francis，G.E.(1992)Brit.J Haematol.(1992)82654-663.Koshland，D.and Botstein，D.(1980)Cell 20749-760.Kubota，N.，Orita，T.，Hattori，K.，Oh-eda，M.，Ochi，N.and Yamazaki，T.(1990)J.Biochem.107486-492Kuga，T.，Komatsu，Y.，Yamasaki，M.，De4kine，S.，Miyaji，H.，Nishi，T.，Sato，M.，Yokoo，Y.，Asano，M.，Okabe，M.，Morimoto，M. and Itoh，S.(1989)Bioch..Biophys.Res.Comm.159103 111Kutty G.，Kutty，R.K.，Samuel，W.，Duncan，T.，Jaworski，C.，andWiggert，B.(1998)Biochem.Biophys.Res.Commun.246644-649.Lawton，L.N.，Bonaldo，M.F.，Jelenc，P.C.，Qiu，L.，Baumes，S.A.，Marcelino，R.A.，de Jesus，G.M.，Wellington，S.，Knowles，J.A.，Warburton，D.，Brown，S.，and Soares，M.B.(1997)Gene 20317-26.Lee，F.，Yokota，T.，Otsuka，T.，Giemmell，L.，Larson，N.，Luh，J.，Arai，K.-I.And Rennick，D.(985)Proc.Natl.Aead.Sci.USA 824360-64.Libby，R.T.，Braedt，G.，Kronheim，S.R.，March，C.J.，Urdal，D.L.，Chiaverotti，T.A.，Tushinski，R.J.，Mochizuki，D. Y.，Hopp，T.P.，and Cosman，D.(1987)DNA 6221-229.Lindner，D.J.and Borden，E.C.(1997)J.Interferon and CytokineResearch 17681-693.Lu，H.S.，Boone，T.C.，Souza，L.M.，and Lai，P.H.(1989)Arch.Biochem.Biophys.26881-92.Lu，H.S.，Clogston，C.L.，Narhi，L.O.，Merewether，L.A.，Pearl，W.R.and Boone，T.C.(1992)J.Biol.Chem.2678770-8777.Lucas，B.K.，Giere，L.M.，DeMarco，M.A.，Shen，A.，Chisolm，V.，and Crowley，C.W.(1996)Nucleic Acids Res.241774-1779.Lydon，N.B.，Favre，C.，Bove，S.，Neyret，O.，Benureau，S.，Levine，A.M.，Seelig，G.F.，Nagabhushan，T.L.and Trotta，P.P.(1985) Biochemistry 244131-4141.Maisano，F.，Testori，S.A.，and Grandi，G.(1989)J.Chromatograph.472422-427.Malik，F.，Delgado，C.，Knusli，C.，Fisher，D.and Francis，G.E.(1992)Exp.Hematol.201028-1035.Mark，D.F.，Lin，L.S.and Lu，S-D.Y.(1985)U.S.Patent 4,518,584.Mark，D.F.，Lu，S.d.，Creasey，A.a.，Yamamoto，R.and Lin，L.S.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 815662-5666.Martin，F.H.，Suggs，S.V.，Langley，K.E.，Lu，H.S.，Ting，J.，Okino，K.H.，Morris，F. C.，McNiece，I. K.，Jacobsen，F. W.，Mendiaz，E.A.，Birkett，N.C.et al.，(1990)Cell 63203-211.Massague，J.(1990)Annu.Rev.Cell Biol.6597-641.Matsuzaki，G.，Li，X.-Y.，Ohyama，Y.andNomoto，K.(1996)Int.J.Immunopharmac.18363-369.Mayer，P.，Lam，C.，Obenaus，H.，Liehl，E.，and Besemer，J.(1987a)Ann N Y Acad Sci 51117-29.Mayer，P.，Lam，C.，Obenaus，H.，Liehl，E.，and Besemer，J.(1987b)Blood 70206-13.Mayer，P.，Schutz，E.，Lam，C.，Kricek，F.，and Liehl，E.(1991)J.Infect.Dis.163584-590.Mayer，P.，Werner，F.，Lam，C.，and Besemer，J.(1990)Exp. Hematol.181026-1033，McDonald，N.Q.and Hendrickson，W.A.(1993)Cell73421-424.McKay，D.B.(1992)Science 257412.Meyers，F.J.，Paradise，C.，Scudder，S.A.，Goodman，G.and Konrad，M.(1991)Clin.Pharmacol.Ther.49307-313.Monkarsh，S.P.，Ma，Y.，Aglione，A.，Bailon，P.et al.(1997)Anal.Biochem.247434-440.Morehead，H.，Johnson，P.D.and Wetzel，R.(1984)Biochemistry 232500-2507.Morioka-Fujimoto，K.，Marumoto，R.and Fukuda，T.(1991)J.Biol.Chem.2661728-1732.Moschera，J. A.，Woehle，D.，Tsai，K.P.，Chen，C.-H. and Tarnowski，S.J.(1986)Methods in Enzymology 119177-183.Mott，H.R.and Campbell，I.D.(1995)Current Opinion in StructuralBiology 5114-121.Nagata，S.，Tsuchiya，M.，Asano，S.，Kziro，Y.，Yamazaki，T.，Yamamoto，O.，Hirata，Y.，Kubota，N.，Oh-eda，M.，Nomura，H. and Ono，M.(1986a)Nature 319415-418.Nagata，S.，Tsuchiya，M.，Asano，S.，Yamamoto，O.，Hirata，Y.，Kubota，N.，Oh-eda，M.，Nomura，H.and Yamazaki，T.(1986b)EMBO J.5575-581.Oh-eda，M.，Hasegawa，M.，Hattori，K.，Kuboniwa，H.，Kojima，T.，Orita，T.，Tomonou，K.，Yamazaki，T.，and Ochi，N.(1990)J.Biol.Chem.265575-11435.Ostermeier，M.，De Sutter.，K.，Georgiou，G.(1996)J.Biol.Chem.27110616-10622.Paul，W.E.ed.(1989)″Fundamental Immunology″(Raven Press，New York，NY).Perez-Perez，J.，Martinez-Caja，C.，Barbero，J.L.and Gutierrez，J.(1995)Biochem.Biophys.Res.Comm.210524-529.Pestka，S.，Langer，J. A.，Zoon，K.C.and Samuel，C.E.(1987)Ann.Rev.Biochem.56727-777.Picken，R.N.，Mazaitis，A.J.，Maas，W.K.，Rey，M.and Heyneker，H.(1983)Infect.and Immun.42269-275.Roitt，I.M.，Brostoff，J.，and Male，D.K.eds.(1989)″Immumology″(Gower Medical Publishers，New York，NY and London，UK)Rowlinson，S.W.Barnard，R.，Bastiras，S.，Robins，A.J.，Brinkworth，R.and Waters，M.J.(1995)J.Biol.Chem.27016833-16839.Satake-Ishikawa，R.，Ishikawa，W.，Okada，Y.，Kakitani，M.，Kawagishi，M.，Matsuki，S.and Asanao，K.(1992)Cell Structure andFunction 17157-160.Schuening，F.G.，Storb，R.，Goehle，S.，Nash，R.，Graham，T.C.，Appelbaum，F.R.，Hackman，R.，Sandmaier，B.M.，and Urdal，D.L.(1989)Exp. Hematol.17889-894.Shanafelt，A.B.，Lin，Y.，Shanafelt，M.-C.，Forte，C.P.et al.(2000)Nature Biotechnology 181197 1202.Shaw，G.，Veldman.，G.and Wooters，J.L.(1992)U.S.Patent5,166,322.Silvennoinen，O.and Ihle，J.N.(1996)Signalling by theHematopoietic Cytokine Receptors，R.G.Landes，Company，Austin，TX.Souza，L.M.，Boone，T.C.，Gabrilove，J.，Lai，P.H.，Zsebo，K.M.，Murdock，D.C.，Chazin，V.R.，Bruszewski，J.，Lu，H.，Chen，K. K.，Barendt，J.，Platzer，E.，Moore，M.A.S.，Mertelsmann，R.and Welte，K.(1986)Science 23261-65.Sytkowski，A.J.，Lunn，E.D.，Davis，K.L.，Feldman，L.and Siekman，S.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 951184-1188.Tanaka，H.，Satake-Ishikawa，R.，Ishikawa，M.，Matsuki，S.and Asano，K.(1991)Cancer Research 513710-3714.Thompson，S.A.(1992)J.Biol.Chem.2672269-2273.Torchinskii，Y.M.(1971)in″Sulfhydryl and Disulfide Groups ofProteins″in Studies of Soviet Science(1971)Nauka Press，Moscow.Trill，J.J.，Shatzman，A.R.，and Ganguly，S.(1995)Curr.Opin.Biotechnol.6553-560.Trotta，P.B.(1986)Seminars in Oncology XIII Supplement 23-12.Tuma，R.，Rosendahl，M.and Thomas，G.(1995)Biochem.3415150-15156.Urlaub，G.and Chasin，L.A.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774216-4220.Van Den Berg，C.L.，Stroh，C.，Hilsenbeck，S.G.，Weng，C.-N.，McDermott，M.J.，Cox，G.N.and Yee，D.(1997)Eur.J.Cancer 331108-1113.Voss，T.，Falkner，E.，Ahorn，H.Krystek，E.Maurer-Fogy，1.Bodo，G.，Hauptmann，R.(1994)Biochem.J.298，719-725.Wang，A.，Lu，S.-d.and Mark，D.F.(1984)Science 2241431-1433.Weinstein，Y.，Ihle，J.N.，Lavu，S.and Reddy，E.P.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 835010-5014.White，B.A.(1993)in Methods in Molecular Biology，Vol.15PCRProtocolsCurrent Methods and Applications edited by Humana Press，Inc.，Totowa，NJ.Wingfield，P.，Benedict，R.，Turcatti，G.，Allet，B.，Mermod，J.-J.，DeLamarter，J.，Simana，M.and Rose，K.(1988)Biochem.J.256，213-218.Yamaoka，T.，Tabata，Y.and Ikada，Y.(1994)J.Pharm.Sci.83601-606.
盡管已經詳細描述了本發明的各個實施例，很明顯，本領域技術人員可進行那些實施例的變型和改動。然而，可以清楚地理解，這種變型和改動在本發明的范圍內。
序列表序列表<110> 瑪麗.羅森達爾(Rosendahl，Mary)喬治.考克斯(Cox，George)丹尼爾.多爾蒂(Doherty，Daniel)<120> 含游離半胱氨酸殘基的蛋白重折疊的方法<130> 4152-4-PCT<150> 60/204,617<151> 2000-05-16<160> 79<170> PatentIn version 3.0<210> 1<211> 36<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 1cgcaagcttg ccaccatggc tggacctgcc acccag 36<210> 2<211> 36<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 2cgcggatcct ccggagggct gggcaaggtg gcgtag 36<210> 3<211> 66<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 3ggcccggcca gctccctgcc gcagagcttc ctgctgaaga gcctcgagca agtgcgtaag60atccag 66<210> 4<211> 30<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 4cgcgaattct tagggctggg caaggtggcg 30<210> 5<211> 66<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 5ggcccggcca gctccctgcc gcagagcttc ctgcttaagt gcctcgagca agtgcgtaag60atccag 66<210> 6<211> 63<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 6atgttcgttt tctctatcgc taccaacgcg tacgcaaccc cgctgggccc ggccagctcc60ctg 63<210> 7<211> 66<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 7ccccctctag acatatgaag aagaacatcg cattcctgct ggcatctatg ttcgttttct60ctatcg 66<210> 8<211> 29<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 8cgccatatga ccccgctggg cccggccag 29<210> 9<211> 36<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 9accaacgcgt acgcaacccc gtgtggcccg gccagc 36<210> 10<211> 21<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 10gccatcgccc tggatcttac g 21<210> 11<211> 36<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 11accaacgcgt acgcatgccc gctgggcccg gccagc 36<210> 12<211> 30<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 12cgcgaattct tagggacagg caaggtggcg 30<210> 13<211> 21<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 13gccatcgccc tggatcttac g 21<210> 14<211> 36<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 14cgcgaattct taacagggct gggcaaggtg gcgtag 36<210> 15<211> 27<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 15ccgctgggcc cgtgcagctc cctgccg27<210> 16<211> 27<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 16cggcagggag ctgcacgggc ccagcgg27<210> 17<211> 22<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 17ctatgcggca tcagagcaga ta 22<210> 18<211> 27<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 18ctgggcccgg cctgctccct gccgcag27<210> 19<211> 27<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 19ctgcggcagg gagcaggccg ggcccag27<210> 20<211> 27<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 20aacccgtacg catgtacccc gctgggc27<210> 21<211> 27<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 21gcccagcggg gtacatgcgt acgcgtt27<210> 22<211> 22<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 22tgtggaattg tgagcggata ac 22<210> 23<211> 27<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 23ggaatggccc cttgcctgca gcccacc27<210> 24<211> 27<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 24ggtgggctgc aggcaagggg ccattcc27<210> 25<211> 27<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 25gccctgcagc cctgccaggg tgccatg27<210> 26<211> 27<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 26catggcaccc tggcagggct gcagggc27<210> 27<211> 27<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 27ggtgccatgc cgtgct tcgc ctctgct 27<210> 28<211> 27<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 28agcagaggcg aagcacggca tggcacc27<210> 29<211> 27<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 29ccggccttcg cctgtgcttt ccagcgc27<210> 30<211> 27<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 30gcgctggaaa gcacaggcga aggccgg27<210> 31<211> 27<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 31cccacccagg gttgcatgcc ggccttc27<210> 32<211> 27<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 32gaaggccggc atgcaaccct gggtggg27<210> 33<211> 27<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 33atgccggcct tctgctctgc tttccag27<210> 34<211> 27<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 34ctggaaagca gagcagaagg ccggcat27<210> 35<211> 21<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 35ggccattccc agttcttcca t 21<210> 36<211> 24<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 36ttcgttttct ctatcgctac caac 24<210> 37<211> 27<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 37ctgcaggccc tgtgtgggat ctccccc27<210> 38<211> 27<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 38gggggagatc ccacacaggg cctgcag27<210> 39<211> 27<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 39ctggaaggga tctgccccga gttgggt27<210> 40<211> 27<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 40acccaactcg gggcagatcc cttccag27<210> 41<211> 35<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 41cgcgctgcag ttctcatgtt tgacagctta tcatc 35<210> 42<211> 42<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 42cgcgctgcag atttaaatta gcgaggtgcc gccggcttcc at 42<210> 43<211> 38<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 43gcgacgcgta cgcagcaccc acccgctcac ccatcact38<210> 44<211> 42<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 44gcggaattct tatttttgga ctggtttttt gcattcaaag gg 42<210> 45<211> 38<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 45gcgacgcgta cgcagcaccc tgccgctcac ccatcact38<210> 46<211> 32<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 46ccaacgcgta cgcagcccca ccacgcctca tc 32<210> 47<211> 33<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 47ccggaattct taacggtcac ctgtgcggca ggc 33<210> 48<211> 30<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 48ccggaattct tagtcacctg tgcggcaggc 30<210> 49<211> 57<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 49ttcgctagca tgcatgacct gcaggaggaa atttaaatgg ccccaccacg cctcatc 57<210> 50<211> 39<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 50gctaacgcgt acgcacacag ccaccgcgac ttccagccg 39<210> 51<211> 38<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 51cggaattcct cgagctactt ggaggcagtc atgaagct38<210> 52<211> 90<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 52gtgcaccata tgaagaagaa catcgcattc ctgctggcta gcatgcatga cctgcaggag60gaaatttaaa tgcacagcca ccgcgacttc 90<210> 53<211> 37<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 53gaggaaattt aaatgtgcca cagccatcgc gacttcc 37<210> 54<211> 22<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 54tgtggaattg tgagcggata ac 22<210> 55<211> 37<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 55ggaagtcgcg atggctgtgg cacatttaaa tttcctc 37<210> 56<211> 35<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 56gaggaaattt aaattgcagc catcgcgact tccag 35<210> 57<211> 36<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 57ctggaagtcg cgatggctgc acatttaaat ttcctc 36<210> 58<211> 27<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 58atgcacagcc actgcgactt ccagccg27<210> 59<211> 27<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 59cggctggaag tcgcagtggc tgtgcat27<210> 60<211> 29<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 60gccaccgcga ctgtcaaccg gtgctccac 29<210> 61<211> 29<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 61gtggagcacc ggttgacagt cgcggtggc29<210> 62<211> 31<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 62catgcggggc atctgcggcg ccgacttcca g 31<210> 63<211> 31<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 63ctggaagtcg gcgccgcaga tgccccgcat g 31<210> 64<211> 27<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 64ggctctgttc tcgtgctctg agggtcc27<210> 65<211> 27<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 65ggaccctcag agcacgagaa cagagcc27<210> 66<211> 27<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 66ccgctgaagc cctgcgcacg catcttc27<210> 67<211> 27<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 67gaagatgcgt gcgcagggct tcagcgg27<210> 68<211> 30<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 68gacgtcctga ggtgcccgac ctggccccag 30<210> 69<211> 33<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 69ggccaggcct ccagcctctg cgggggcagg ctc 33<210> 70<211> 33<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 70gagcctgccc ccgcagaggc tggaggcctg gcc 33<210> 71<211> 36<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 71ctgctggggg gctgcctcct gggccagagt gccgcg 36<210> 72<211> 36<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 72cgcggcactc tggcccagga ggcagccccc cagcag 36<210> 73<211> 31<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 73ctcctggggc agtgcgcagc gagctgccat c 31<210> 74<211> 31<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 74gatggcagct cgctgcgcac tgccccagga g 31<210> 75<211> 21<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 75gacactgctg ctgagatgaa t 21<210> 76<211> 22<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 76cttgtagtgg ctggccatca tg 22<210> 77<211> 57<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 77cgcaacgcgt acgcagcacc ggcccgctcg ccgagcccga gcacgcagcc gtgggag 57<210> 78<211> 57<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 78cgcgaattct tactcctgga ccggctccca gcagtcaaac gggatgacca gcagaaa 57<210> 79<211> 28<212> DNA<213> 人工的<220><223> 引物<400> 79gttggtcaac tcgagccagc cgtgggag 28
權利要求
1.制備重折疊可溶形式的不溶或聚集蛋白的方法，其中所述蛋白是生長激素超基因家族成員且含一個或多個游離半胱氨酸殘基，所述方法包括步驟a.使宿主細胞表達蛋白，所述蛋白是不溶或聚集形式的生長激素超基因家族成員；b.用化學方法、酶學或物理方法裂解細胞；c.使不溶或聚集的蛋白接觸變性試劑、還原劑和半胱氨酸阻斷劑而溶解不溶或聚集的蛋白；和d.通過使變性試劑和還原劑的濃度降低到足以允許蛋白復性為可溶的生物活性形式的水平而重折疊蛋白。
2.權利要求1的方法，其中所述的生長激素超基因家族的成員由所述宿主細胞分泌。
3.權利要求1的方法，其中所述的生長激素超基因家族的成員由所述宿主細胞以細胞內蛋白表達。
4.權利要求1的方法，其中所述的裂解步驟(b)包括在半胱氨酸阻斷劑存在下裂解所述宿主細胞。
5.權利要求1的方法，其中所述的裂解步驟(b)包括在變性試劑存在下裂解所述宿主細胞。
6.權利要求1的方法，其中所述的裂解步驟(b)包括在變性試劑和還原劑存在下裂解宿主細胞。
7.權利要求1的方法，其中所述的裂解步驟(b)包括(1)裂解宿主細胞(2)將可溶蛋白與不溶或聚集蛋白分離。
8.權利要求1的方法，其中所述的半胱氨酸阻斷劑選自半胱氨酸、半胱胺、還原型谷胱苷肽或巰基乙酸。
9.權利要求1的方法，其中所述的半胱氨酸阻斷劑是半胱氨酸。
10.權利要求1的方法，其中所述步驟(c)中所述的還原劑和所述的半胱氨酸阻斷劑是同一種化合物。
11.權利要求10的方法，其中所述的半胱氨酸阻斷劑選自半胱氨酸、半胱胺、還原型谷胱苷肽或巰基乙酸。
12.權利要求1的方法，其中步驟(c)中所述的半胱氨酸阻斷劑是當還原時作為半胱氨酸阻斷劑的二硫酚。
13.權利要求12的方法，其中所述的二硫酚選自胱氨酸、胱胺、氧化型谷胱苷肽或乙二硫醇酸。
14.權利要求1的方法，其中還原劑是二硫蘇糖醇(DTT)或2-巰基乙醇。
15.權利要求1的方法，其中所述步驟(d)中的重折疊包括在甘油存在下重折疊蛋白。
16.權利要求1的方法，其中重折疊的所述步驟(d)中包括在選自氧、二硫酚、碘、過氧化氫、二氫抗壞血酸、連四硫酸鹽或O-氧碘苯甲酸鹽的氧化劑存在下重折疊蛋白。
17.權利要求1的方法，其中步驟(d)中的重折疊包括在金屬離子存在下重折疊蛋白。
18.權利要求17的方法，其中所述的金屬離子是Cu++或Co++。
19.權利要求1的方法，其中重折疊的所述步驟(d)中包括在半胱氨酸阻斷劑存在下重折疊蛋白。
20.權利要求1的方法，其中重折疊的所述步驟(d)中包括在變性試劑存在下重折疊蛋白。
21.權利要求1的方法，其中重折疊的所述步驟(d)中包括在二硫酚存在下重折疊蛋白。
22.權利要求21的方法，其中所述的二硫酚選自組胱氨酸、胱胺、乙二硫醇酸或氧化型谷胱苷肽。
23.權利要求1的方法，其中所述步驟(d)中的重折疊發生在還原劑存在下。
24.權利要求23的方法，其中所述的還原劑選自半胱氨酸、DTT、2-巰基乙醇、還原型谷胱苷肽、半胱氨酸、半胱胺、乙二硫醇酸或其它硫醇。
25.權利要求1的方法，其中所述的不溶或聚集蛋白是重組蛋白。
26.權利要求1的方法，其中所述的不溶或聚集蛋白是生長激素超基因家族成員的半胱氨酸變異體，或其衍生物或拮抗劑。
27.權利要求1的方法，其中生長激素超基因家族的成員選自生長激素、催乳素、胎盤催乳素、紅細胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素-5、白介素-6、白介素-7、白介素-9、白介素-10、白介素-11、白介素-12(p35亞單位)，白介素-13、白介素-15、IL-19、IL-20、制瘤素M、睫毛神經營養因子、白血病抑制因子、α干擾素、β干擾素、γ干擾素、ω干擾素、τ干擾素、粒細胞集落刺激因子、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、心肌營養素-1、巨噬細胞集落刺激因子、干細胞因子和flt-3配體。
28.權利要求1的方法，進一步包括將半胱氨酸反應部分與所述分離的蛋白連接形成半胱氨酸修飾的蛋白。
29.權利要求28的方法，其中半胱氨酸反應部分選自聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、碳水化合物或右旋糖苷。
30.權利要求1的方法，進一步包括將半胱氨酸發應性聚乙二醇部分與所述分離蛋白中的半胱氨酸殘基連接形成peg化蛋白。
31.權利要求1的方法，進一步包括步驟(e)將重折疊可溶蛋白與步驟(d)中的重折疊混合物中的其它蛋白分離。
32.共價修飾所述的根據權利要求1制備的分離的重折疊可溶蛋白的方法，進一步包括步驟(f)使分離的蛋白接觸二硫化物還原劑；和(g)使所述蛋白接觸半胱氨酸反應部分以得到半胱氨酸修飾的蛋白。
33.權利要求32的方法，其中所述的半胱氨酸反應部分選自聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、右旋糖苷或碳水化合物。
34.權利要求32的方法，進一步包括將半胱氨酸修飾的蛋白與未修飾蛋白分離。
35.權利要求1的方法，其中所述的生長激素超基因家族的成員是生長激素。
36.權利要求1的方法，其中所述的生長激素超基因家族的成員是生長激素的半胱氨酸變異體。
37.權利要求1的方法，其中所述的生長激素超基因家族的成員是α干擾素。
38.權利要求1的方法，其中所述的生長激素超基因家族的成員是α干擾素的半胱氨酸變異體。
39.權利要求37或38任一項的方法，其中α干擾素蛋白是α干擾素α2。
40.權利要求1的方法，其中所述的生長激素超基因家族的成員是粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。
41.權利要求1的方法，其中所述的生長激素超基因家族的成員是GM-CSF的半胱氨酸變異體。
42.權利要求1的方法，其中所述的生長激素超基因家族的成員是粒細胞集落刺激因子(G-CSF)。
43.權利要求1的方法，其中所述的生長激素超基因家族的成員是G-CSF的半胱氨酸變異體。
44.權利要求43的方法，其中所述的G-CSF半胱氨酸變異體含有置換半胱氨酸-17的非半胱氨酸的氨基酸。
45.權利要求44的方法，其中在所述G-CSF半胱氨酸變異體中置換半胱氨酸-17的氨基酸是絲氨酸或丙氨酸。
46.權利要求1的方法，其中所述的生長激素超基因家族的成員是紅細胞生成素。
47.權利要求1的方法，其中所述的生長激素超基因家族的成員是紅細胞生成素的半胱氨酸變異體。
48.根據權利要求1制備的多聚體蛋白，包括至少兩個蛋白，每個都具有游離半胱氨酸且其中所述蛋白中至少兩個通過所述游離半胱氨酸彼此連接。
49.制備不溶或聚集蛋白的重折疊可溶形式的方法，所述蛋白是抗血管生成因子且含有一個或多個游離半胱氨酸殘基，所述方法包括步驟a.使宿主細胞表達不溶或聚集形式的抗血管生成因子的蛋白；b.用化學、酶學或物理方法裂解細胞；c.使不溶或聚集的蛋白接觸變性試劑、還原劑和半胱氨酸阻斷劑而溶解不溶或聚集的蛋白；和d.通過使變性試劑和還原劑的濃度降低到足以允許蛋白復性為可溶的生物活性形式的水平而重折疊蛋白。
50.權利要求49的方法，進一步包括步驟e.將重折疊可溶蛋白與步驟(d)中的重折疊混合物中的其它蛋白分離。
51.權利要求49的方法，其中所述的抗血管生成因子是endostatin。
52.權利要求49的方法，其中所述的抗血管生成因子是endostatin的半胱氨酸突變體。
53.權利要求49的方法，其中所述的抗血管生成因子是制管張素。
54.權利要求49的方法，其中所述的抗血管生成因子是制管張素的半胱氨酸突變體。
55.權利要求49的方法，其中所述步驟(c)中所述的還原劑和所述的半胱氨酸阻斷劑是同一種化合物。
全文摘要
本發明涉及制備具有游離半胱氨酸的重折疊不溶或聚集蛋白的新方法，其中宿主細胞表達的蛋白接觸半胱氨酸阻斷劑。然后，可修飾該新方法制備的可溶重折疊蛋白以增加它們的效力。這種修飾包括連接PEG部分以形成PEG化蛋白。
文檔編號C07K14/52GK1443194SQ01812855
公開日2003年9月17日 申請日期2001年5月16日 優先權日2000年5月16日
發明者瑪麗·S·羅森達爾, 喬治·N·考克斯, 丹尼爾·H·多爾蒂 申請人:博爾德生物技術公司