表達系統的制作方法

專利名稱：表達系統的制作方法
技術領域：
本發明涉及引起抵抗炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)感染的保護性免疫應答的多肽，涉及生產這些多肽的方法、可用于所述方法的重組大腸桿菌(Escherischia coli)細胞以及采用的核酸和轉化載體。
用于表達供疫苗系統用的PA的本發明系統，用蛋白酶缺陷型枯草桿菌(Bacillus subtilis)作為表達宿主。盡管這類系統就產物的量和純度而論是可接受的，但仍有顯著缺陷。首先，管理機構一般不熟悉這種宿主，批準決定可能因此而延遲。更重要的是，目前使用的枯草桿菌菌株產生熱穩定孢子，因而需要使用專用的生產工廠。
WO00/02522具體描述了表達PA或某些免疫原性片段的VEE病毒復制子。
眾所周知大腸桿菌是多種人用疫苗的表達系統。雖然容易使大腸桿菌發酵至非常高的細胞密度的能力，使得這種細菌成為表達許多蛋白質的理想宿主，但先前為用表達和從大腸桿菌細胞溶膠中純化重組PA所作的嘗試由于蛋白質收率低和蛋白酶降解而受到阻礙(Singh等，J.Biol.Chem.(1989)264；11099-11102，Vodkin等，Cell(1993)34；693-697以及Sharma等，Protein Expr.Purif(1996)，7，33-38)。
在大腸桿菌細胞溶膠中過量表達作為穩定的可溶性蛋白的PA的策略最近已有描述(Willhite等，Protein and Peptide Letters，(1998)，5；273-278)。所用的策略是將親和標志序列加至PA的N末端的一種策略，這提供了一種簡單的純化系統。
這種系統的一個問題是需要另一個下游的加工步驟，以便在可以使用PA之前除去所述標志。
密碼子優化是現在眾所周知并且用于合成基因設計的一種技術。遺傳密碼有一定程度的豐余性，因此大多數氨基酸由不止一個密碼子序列編碼。不同的生物優先利用這些不同密碼子中的某一個。一般可預期，通過優化密碼子，將提高特定蛋白的表達水平。
這一般是理想的，但PA除外，就PA而論，較高的表達水平會導致蛋白酶降解和/或細胞毒性。在這種情況下，提高表達水平可能是逆生產性的(counter-productive)，并且引起顯著的細胞毒性。
然而意外的是，本申請人已經發現，在大腸桿菌中情況不是這樣，在該系統中，無論在該菌株中是否存在蛋白酶，密碼子優化均導致意想不到的高水平重組PA的表達。
此外，似乎PA保護性結構域的表達并不抑制大腸桿菌中的表達。
天然PA的晶體結構已經闡明(Petosa C.等Nature 385833-838，1997)，表明PA由4個不同的功能獨立的結構域組成結構域1，分為1a(1-167號氨基酸)和1b(168-258號氨基酸)；結構域2，259-487號氨基酸；結構域3，488-595號氨基酸；和結構域4，596-735號氨基酸。
本申請人已經確定，某些結構域當以分離形式、融合蛋白形式或者相互組合形式使用時，看來產生意想不到的良好保護性效應。
按照本發明，提供一種引起抗炭疽芽孢桿菌的保護性免疫應答的免疫原性試劑，所述試劑包含結合在一起代表炭疽芽孢桿菌全長保護性抗原(PA)的至多3個結構域或這些結構域的變異體的一種或多種多肽，并且所述結構域中的至少一個包含PA的結構域1或結構域4或其變異體。
具體地說，所述試劑將包含多肽的混合物或融合肽，其中所述各個多肽包含PA多個個別結構域中的一個。
具體地說，所述試劑包括非全長PA形式的包含PA結構域1或結構域4或其變異體的多肽。當存在時，結構域適為完整的，特別是結構域1全部存在。
本文使用的術語“多肽”包括蛋白質和肽。
用于本文時，表述“變異體”是指由于基礎序列中一個或多個氨基酸缺失或取代為其它氨基酸而不同于所述序列、但仍引起抗炭疽芽孢桿菌的保護性免疫應答的氨基酸序列。當一種氨基酸被一種不同的、其性質大致相似的氨基酸取代時，所述氨基酸取代可以被稱為“保守的”。當氨基酸被不同類型的氨基酸取代時，為非保守取代。廣義上講，較少的非保守取代在不影響所述多肽的生物活性的情況下是可行的。合適的變異體與所述PA序列將有至少60％相同，優選至少75％相同，更優選至少90％相同。
具體地說，特定變異體序列與所述PA序列的同一性可以采用Lipman和Pearson描述的多重比對法(Lipman D.J.和Pearson，W.R.(1985)Rapid and Sensitive Protein Similiarity Searches，Science，vol 227，pp1435-1441)來評價。“優化”百分比分值可以用Lipman-Pearson算法的以下參數來計算ktup＝1，gap penalty(空位罰分)＝4，和gap penaltylength(空位罰分長度)＝12。待評價相似性的序列應該用作“試驗序列”，這意指用于比較的堿基序列(SEQ ID NO1)應該首先進入該算法。
最好是，本發明的試劑包括具有野生型PA的結構域1序列和/或結構域4序列的多肽。
本發明的一個特別優選的實施方案包括炭疽芽孢桿菌PA的結構域4。
這些結構域包含以下表1中所示的以下序列。
表1結構域 全長PA的氨基酸*4596-73511-258這些氨基酸編號是指在Welkos等Gene69(1988)287-300中所示的序列，在下文中分別描述為SEQ ID NO15(圖4)和SEQ ID NO3(圖3)。
結構域1包括兩個區，名為1a和1b。區1a包括氨基酸1-167，而區1b從氨基酸168至氨基酸258。看來區1a對于良好的保護性應答的產生是重要的，可能最好是全長的結構域。
在一個特別優選的實施方案中，用結構域1和結構域4或其保護性區的組合作為免疫原性試劑，該試劑引起抗炭疽芽孢桿菌的保護性免疫應答。這種組合例如可作為融合肽，可以用下文概述的本發明的表達系統來表達。
當使用結構域1時，適宜將其與所述PA序列的結構域2融合，可能最好將其與結構域2和結構域3融合。
這類組合及其在預防或治療中的應用，構成了本發明的另一方面。
上述結構域適宜作為融合蛋白的部分，最好具有N末端谷胱甘肽-s-轉移酶蛋白(GST)。GST不僅有助于所述蛋白的純化，它也可以提供佐劑效應，可能是由于大小增加了。
本發明的多肽適宜用常規方法制備。例如，可以合成它們，或者可以用重組DNA技術制備它們。特別是，將編碼所述結構域的核酸包括在表達載體中，用所述載體轉化宿主細胞。然后可以采用常規方法進行宿主細胞的培養以及隨后所需多肽的分離。這些方法中所用的核酸、載體和轉化細胞構成了本發明的再一方面。
一般而言，所用的宿主細胞是常規用來制備PA的宿主細胞，例如枯草桿菌。
本申請人意外的發現，或者分離的或者組合的所述結構域可以在一定條件下在大腸桿菌中成功地表達。
因此，本發明還提供一種用于生產引起抗炭疽芽孢桿菌的保護性免疫應答的免疫原性多肽的方法，所述方法包括用或者(a)編碼炭疽芽孢桿菌保護性抗原(PA)或可以引起保護性免疫應答的其變異體的核酸，或者(b)編碼如上所述的炭疽芽孢桿菌保護性抗原(PA)的至少一個保護性結構域或可以引起保護性免疫應答的其變異體的核酸，轉化大腸桿菌宿主；培養所述轉化宿主，并且從中回收所述多肽，前提是當所述多肽是炭疽芽孢桿菌保護性抗原(PA)或可以引起保護性免疫應答的其變異體時，所述核酸中胍和胞嘧啶殘基的百分比超過35％。
應用這些選項，可以用優選的表達宿主獲得高收率的產物。
在

圖1中顯示了一個表，該表顯示了在大腸桿菌和炭疽芽孢桿菌基因組中出現的密碼子及其頻率。顯然，胍和胞嘧啶在大腸桿菌中出現的頻率比在炭疽芽孢桿菌中出現的頻率高得多。密碼子選擇含量的分析顯示出以下結果
因此，看來大腸桿菌偏好的密碼子是可能時包括胍或胞嘧啶的那些密碼子。
通過在用來編碼所述免疫原性蛋白的序列中將胍和胞嘧啶核苷酸的百分比提高至野生型炭疽芽孢桿菌基因中正常存在的百分比，密碼子選擇將使得在大腸桿菌中的表達得以改善。
在本發明中使用的編碼核酸中胍和胞嘧啶殘基的百分比至少在所述多肽為炭疽芽孢桿菌保護性抗原(PA)或可以引起保護性免疫應答的其變異體時，適宜超過40％，優選超過45％，最優選為50-52％。
保護性結構域的高水平表達可以采用編碼這些單位的野生型炭疽芽孢桿菌序列來達到。然而，如上所述，通過提高所述核酸的GC％可以進一步提高收率。
在一個具體實施方案中，所述方法包括表達炭疽芽孢桿菌的PA。
此外，按照本發明，提供一種已經用編碼炭疽芽孢桿菌保護性抗原(PA)或可以引起保護性免疫應答的其變異體的核酸轉化的重組大腸桿菌細胞，其中所述核酸中胍和胞嘧啶殘基的百分比超過35％。
如上所述，所述編碼核酸中胍和胞嘧啶殘基的百分比適宜超過40％，優選超過45％，最優選為50-52％。
本發明的用來轉化大腸桿菌細胞的核酸適宜為合成基因。特別是，所述核酸為圖2中所示的SEQ ID NO1的核酸或其修飾形式。
表述“修飾形式”是指編碼PA或引起保護性免疫應答但利用某些不同密碼子的片段或其變異體的其它核酸序列，條件是符合對按照本發明的GC百分含量的要求。合適的修飾形式是與SEQ ID NO1至少80％相似，優選90％相似，最優選至少95％相似。特別是，所述核酸包含SEQ ID NO1。
在一個替代實施方案中，本發明提供一種已經用編碼炭疽芽孢桿菌保護性抗原(PA)的保護性結構域或可以引起保護性免疫應答的其變異體的核酸轉化的重組大腸桿菌細胞。
所述核酸最好編碼炭疽芽孢桿菌的結構域1或結構域4。
按照本發明，再提供一種生產免疫原性多肽的方法，所述多肽引起抗炭疽芽孢桿菌的保護性免疫應答，所述方法包括培養如上所述的細胞，并且從培養物中回收所需的多肽。這類方法是本領域眾所周知的。
在再一方面，本發明提供一種大腸桿菌轉化載體，所述載體包含編碼炭疽芽孢桿菌保護性抗原(PA)或可以引起保護性免疫應答的其變異體的核酸，其中所述核酸中的胍和胞嘧啶殘基的百分比超過35％。
本發明的又一方面包括一種大腸桿菌轉化載體，所述載體包含編碼炭疽芽孢桿菌保護性抗原(PA)的保護性結構域或可以引起保護性免疫應答的其變異體的核酸。
可供用于大腸桿菌轉化的合適載體是本領域眾所周知的。例如，T7表達系統提供良好的表達水平。然而，一種特別優選的載體包括可得自Avecia(UK)的pAG163。
SEQ ID NO1的核酸或者編碼PA并且GC含量為35％、優選至少40％、更優選至少45％、最優選為50-52％的其變異體，構成了本發明的另一方面。
如有必要，所述變異體的PA或結構域可以作為與另一蛋白的融合體表達，所述另一蛋白例如為提供一種不同免疫的蛋白、有助于所述產物純化的蛋白或者用以確保翻譯的良好起始的高表達蛋白(例如硫氧還蛋白，GST)。
可任選地加入其它系統例如T7溶菌酶至所述表達系統中，以改善對所述系統的阻抑，盡管就本發明而論，尚未記錄到與細胞毒性相關的問題。
任何合適的大腸桿菌菌株都可以用于本發明的方法中。可得到許多蛋白酶缺陷型的菌株(例如Ion-、ompT-)，預期所述菌株會將蛋白水解減少至最低。然而，本發明人已經發現，不需要應用這類菌株來達到產物的良好收率，其它已知菌株例如K12可產生意想不到的高產物收率。
所述菌株的發酵一般在本領域知道的常規條件下進行。例如，發酵可以作為分批培養物進行，優選在大搖瓶中進行，使用含有抗生素以保持質粒并添加IPTG進行誘導的復合培養基。
適當地收獲培養物，將細胞貯存于-20℃直至需要用于純化。
對于大腸桿菌PA(或變異體或結構域)表達的合適的純化方案可以根據在枯草桿菌表達中所用的方法進行改進。待使用的各個純化步驟將取決于重組PA的物理特性。通常，在允許最大差別結合于所述離子交換柱條件下進行離子交換色譜分離，然后從窄梯度收集流分。在某些情況下，單個色譜分離步驟可能足以獲得所需規格的產物。
可以根據需要用SDS PAGE或蛋白質印跡，分析流分中所述產物的存在。
正如下文說明的，已經達到了代表rPA的完整結構域或部分結構域的一組融合蛋白的成功克隆和表達。在A/J小鼠模型中評價了這些融合蛋白的免疫原性和抗STI孢子攻擊的保護性功效。
所有所述rPA結構域蛋白在A/J小鼠中都有免疫原性，并且與GST對照免疫小鼠相比，至少賦予抗攻擊的部分保護。連接于所述結構域蛋白N末端的載體蛋白GST，通過在免疫動物體內所激發的抗體應答表明，并不損害所述融合蛋白的體內免疫原性，或者不損害所述融合蛋白的體外免疫原性，因為用抗rPA抗血清在蛋白質印跡后可以檢測到所述融合蛋白，這表明GST標志并不干擾rPA表位的識別。用較大的融合蛋白免疫，產生最高效價。具體地說，用全長GST1-4融合蛋白免疫的小鼠，產生的平均血清抗rPA濃度大約是rPA免疫組的8倍(圖5)。用切除所述GST的rPA結構域1-4免疫小鼠，產生的效價大約是用所述融合蛋白免疫所產生的效價的一半。這種融合蛋白的免疫原性高得多的原因尚不清楚。有可能這種蛋白大小的增加可能對免疫效應細胞有佐劑效應。它并未刺激這種應答達到在所述其它融合蛋白中的同一程度，并且GST標志的任何佐劑效應并不增強抗攻擊的保護，因為經切割的蛋白的保護性與其融合蛋白對應物相似。
盡管用GST1、經切割的1、GST1b-2、GST1b-3和GST1-3免疫的組的抗rPA效價高，但在這些組中在102MLD的較低攻擊水平下發生保護有一些被突破，并且與GST對照免疫小鼠相比，用這些蛋白質免疫并未延長那些小鼠的存活時間，這些小鼠的確死于攻擊。這提示這些蛋白尚未恰當地引發所述免疫應答，以達到完全抗所述感染。正如小鼠和豚鼠的其它研究(Little S.F.等1986.Infect.Immun.52509-512，Turnbull P.C.B.等，1986.Infect.Immun.52356-363)所表明的，在抗PA的抗體效價與抗攻擊的保護之間沒有明確的關聯。然而，保護需要一定閾值的抗體(Cohen S等，2000 Infect.Immun.684549-4558)，提示也需要免疫應答的細胞介導組分受刺激以提供保護(Williamson 1989)。
SDS Page和蛋白質印跡結果表明，GST1、GST1b-2和GST1-2是所產生的穩定性最低的融合蛋白，可能是由于所述蛋白在無結構域3的情況下對降解更為敏感，這種不穩定性可能導致了保護性表位的喪失。
所述蛋白質的結構構象對于刺激保護性免疫應答也可能是重要的。與其完整的對應物GST1-2和GST1-3相比時，從所述融合蛋白去除結構域1a，導致抗體效價降低和抵抗攻擊的保護減弱。同樣，僅用GST 1免疫的小鼠受到抵抗攻擊的部分保護，但與結構域2聯合時，如GST1-2融合蛋白，在102MLD攻擊水平下觀測到完全的保護。然而，通過用GST1-2融合蛋白免疫激發的免疫應答不足以提供抗較高的103MLD攻擊水平的完全保護，這又可能是由于該蛋白降解所致的保護性表位損失引起的。
用含結構域4的截短物免疫的所有組都受到完全的保護，抵抗103MLD的STI孢子的攻擊(表1)，所述含結構域4的截短物包括單獨的GST4、單獨的經切割的4、以及兩種單獨表達的結構域GST1和GST4的混合物。Brossier等指出，用表達無結構域4的PA的炭疽芽孢桿菌突變型菌株免疫的小鼠的保護減弱(Brossier F.等2000.Infect.Immun.681781-1786)，并且這一點在該項研究中得以證實，在該項研究中，用GST1-3免疫導致保護被突破，盡管有良好的抗體效價。這些數據表明，結構域4是PA的免疫顯性亞單位。結構域4代表所述PA多肽羧基末端的139個氨基酸。它含有宿主細胞受體結合區(Little S.F.等，1996 Microbiology 142707-715)，被鑒定為在位于氨基酸殘基679-693之間的小環中或小環附近(Varughese M.等1999 Infect.Immun.671860-1865)。因此，它對于宿主細胞中毒是必不可少的，因為已經證明，已表達的在結構域4區中含突變(Varughese 1999出處同上)或缺失(Brossier 1999出處同上)的PA形式是無毒的。PA的晶體結構表明，結構域4、特別是該結構域的19個氨基酸的環(703-722)比相互之間緊密連接的其它3個結構域為暴露(Petosa 1997出處同上)。這一結構安排可能使得結構域4是對于免疫效應細胞的識別最為突出的表位，因此含結構域4的融合蛋白能夠引發保護性最強的免疫應答。
這一研究進一步闡明了PA在保護性免疫應答激發中的作用，證明抗炭疽感染的保護作用可能歸因于PA的單個結構域。
現在將通過實施例并參考附圖，具體描述本發明，在附圖中圖1是在大腸桿菌和炭疽芽孢桿菌中發現的密碼子頻率的表；圖2顯示了按照本發明的核酸的序列，該核酸編碼枯草桿菌的PA，如Welkos等(出處同上)所發表的；和圖3顯示了SEQ ID NO3-14，它們是用來編碼PA的各個結構域或結構域組合的氨基酸序列和DNA序列，如下文詳述；圖4顯示了SEQ ID NO15-16，它們分別是PA結構域4的氨基酸序列和DNA序列；和圖5是一個表，顯示了在初次免疫后37天，得自在第1天和第28天用10μg包含PA片段的融合蛋白肌內免疫的A/J小鼠的抗rPA IgG濃度；所示結果為取自每個治療組5只小鼠的樣品的平均數±sem。
實施例1在大腸桿菌中表達的研究已經對rPA表達質粒pAG163∷rPA進行了修飾，以用KmR標記取代原始的TcR基因。將該質粒轉化到表達宿主大腸桿菌BLR(DE3)中，并且評價了表達水平和溶解性。該菌株的胞內蛋白酶La(Ion基因產物)和外膜蛋白酶OmpT有缺陷。
然而，表達研究并未表明與Ion+K12宿主菌株相比在該菌株內可溶性蛋白的積累有任何改善(即由于過度的蛋白水解，積累受到阻礙)。因此推斷，rPA的任何胞內蛋白水解都不是La蛋白酶的作用所致。實施例2發酵分析使用K12菌株UT5600(DE3)pAG163∷rPA進行的發酵的進一步分析。
發現在該培養物中的rPA被分為可溶性部分不可溶性部分(估計有350mg/L不溶性部分，650mg/L全長可溶性部分)。所用的條件(37℃，1mM IPTG用于誘導)在搖瓶培養物中未產生任何可檢測的可溶性rPA，也未得到以上實施例1中所述的結果，而存在大量的可溶性rPA是出乎意料的。然而，看來發酵的操作、誘導和收獲點可能提供在大腸桿菌K12表達菌株中rPA的穩定積累。實施例3用最初作為不溶性內含體從UT5600(DE3)pAG163∷rPA發酵分離出的物質，制備rPA樣品。內含體用25mM Tris-HCl pH8洗滌2次，用同一緩沖液+2M尿素洗滌1次。然后將它們溶于緩沖液+8M尿素中，沉淀出碎片。通過在25mM Tris-HCl pH8中稀釋并于4℃靜置溫育過夜，而去除尿素。將經稀釋的樣品上樣至Q sepharose柱，用NaCl梯度洗脫蛋白質。合并含有最高純度rPA的流分，將其分為等分樣品并凍存于-70℃。用4-12％MES-SDS NuPAGE凝膠，與已知標準品對比測試該樣品，表明其純度高，并且內毒素污染少。實施例4所述產物的進一步表征該產物的N末端測序表明，N末端序列的組成為MEVKQENRLL(SEQ ID NO2)這證明該產物正如所預期的，且留有起始密碼子甲硫氨酸。
發現該物質在蛋白質印跡中有反應；該樣品的MALDI-MS表明，質量大約為82700(與預期的質量為82915相似)。已知分子量高并且與所用的質量標準(66KDa)有一定的距離，則認為這表明該物質沒有顯著地截短，而并未消除該樣品內的微不均一性。實施例5PA各個結構域的測試使用Pharmacia pGEX-6P-3表達系統，以與載體蛋白谷胱甘肽-s轉移酶(GST)的融合蛋白在大腸桿菌中產生作為重組蛋白的PA的各個結構域。各個結構域的序列以及用來編碼所述結構域的DNA序列如圖3進行連接。相應的氨基酸序列和DNA序列在以下表2中提供。
用這些融合蛋白，以總共100μl體積、吸附于20％v/v鋁膠的10μg相應融合蛋白，肌內免疫A/J小鼠(Harlan Olac)。
動物經兩次免疫，通過用指定劑量水平的炭疽芽孢桿菌(STI菌株)孢子攻擊，測定其保護性免疫的產生。下表顯示了攻擊后14天的存活者。
孢子的攻擊水平/小鼠
所述數據表明，PA所有4個結構域的組合無論是否以與GST的融合蛋白存在，在直至高攻擊水平下都是保護性的。去除結構域4，留下1+2+3，導致在所測試的最高攻擊水平9×105下被突破。在9×104孢子下，結構域1+2的保護性與結構域1+2+3的組合一樣。然而，去除結構域1a而留下GST與結構域1b+2的融合體，導致在所測試最高攻擊水平(9×104)下保護被突破，加入結構域3僅有略微改善。
該數據表明，PA誘導的保護性免疫可以歸因于單個結構域(完整的結構域1和結構域4)或者得自所有4個結構域作為全變物(permutation)的結構域組合。
結構域4的氨基酸序列和DNA編碼序列示于圖4，分別為SEQ IDNO15和SEQ ID NO 16。實施例6結構域作為疫苗的進一步測試從炭疽芽孢桿菌Sterne DNA，通過PCR擴增編碼所述PA結構域-氨基酸1-259、168-488、1-488、168-596、1-596、260-735、489-735、597-735和1-735(分別為截短物GST1、GST1b-2、GST1-2、GST1b-3、GST1-3、GST2-4、GST3-4、GST4和GST1-4)的DNA，將其克隆到表達載體pGEX-6-P3(Amersham-Pharmacia)的XhoI/BamHI位點中，置于lac啟動子下游并且與所述啟動子符合讀框。使用該系統產生的蛋白以具有N末端谷胱甘肽-s-轉移酶蛋白(GST)的融合蛋白表示。然后，將帶有編碼所述PA結構域的DNA的重組質粒DNA轉化到大腸桿菌BL21中，以供蛋白質表達研究用。
在含有50μg/ml氨芐青霉素、30μg/ml氯霉素和1％w/v葡萄糖的L-肉湯中，培養帶有重組pGEX-6-P3質粒的大腸桿菌BL21。將培養物于30℃振蕩(170rev/min)培養至A600nm為0.4，然后用0.5mM IPTG誘導。將培養物再孵育4小時，然后通過以10000rpm離心15分鐘收獲培養物。
所述PA截短物-融合蛋白的初步提取表明，它們以內含體產生。將細胞沉淀重懸于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，在冰水浴中超聲處理4×20秒。將懸浮液以15000rpm離心15分鐘，然后通過懸浮于8M尿素中于室溫攪拌1小時，用尿素提取細胞沉淀。將懸浮液以15000rpm離心15分鐘，上清液對含有400mM L-精氨酸和0.1mM EDTA的100mMTris pH8透析，然后在PBS中透析。
所述PA截短物-融合蛋白的成功重折疊，使其可以在谷胱甘肽Sepharose CL-4B親和柱上純化。將所有提取物(截短物GST1b-2-氨基酸殘基168-487除外)上樣到先前用PBS平衡的15ml谷胱甘肽Sepharose CL-4B柱(Amersham-Parmacia)，于4℃旋轉溫育過夜。柱子用PBS洗滌，用含150mM NaCl、1mM EDTA和20mM還原型谷胱甘肽的50mM Tris pH7洗脫所述融合蛋白。合并通過SDS-PAGE分析鑒定的含PA截短物的流分，然后對PBS透析。用BCA(Perbio)測定蛋白濃度。
然而，用還原型谷胱甘肽未能從谷胱甘肽sepharose CL-4B親和柱洗脫下截短物GST1b-2，因此用離子交換色譜純化。具體地說，將截短物GST1b-2對20mM Tris pH8透析，然后上樣至用同一緩沖液平衡的HiTrap Q柱(Amersham-Parmacia)。用20mM Tris pH8中的0-1M增加的NaCl梯度洗脫融合蛋白。合并含GST-蛋白的流分，濃縮，然后上樣至先前用PBS平衡的HiLoad 26/60 Superdex 200凝膠過濾柱(Amersham-Parmacia)。合并含融合蛋白的流分，通過BCA(Perbio)測定蛋白濃度。產量在每升培養物1mg和43mg之間。
所述片段的分子量及其被抗PA抗體的識別用SDS PAGE和蛋白質印跡法來證實。通過SDS Page和蛋白質印跡法分析所述rPA截短物，顯示出預期大小的蛋白條帶。在所調查的所有所述rPA截短物中顯然有一些降解，顯示出與在枯草桿菌中表達的重組PA有相似性。rPA截短物GST1、GST1b-2和GST1-2在無結構域3的情況下對降解特別敏感。同樣報道了結構域3中含有突變的rPA構建體不能從炭疽芽孢桿菌培養上清液中純化(Brossier 1999)，表明結構域3可能使結構域1和結構域2穩定化。
在該項研究中使用雌性無特定病原體的A/J小鼠(Harlan UK)，因為它們是炭疽感染的穩定模型(Wellkos 1986)。小鼠在年齡上相當，在該項研究開始時為7周齡。
在該項研究的第1天和第28天，用100μl總體積PBS中吸附于20％1.3％v/v鋁膠(HCI Biosector，Denmark)的10μg融合蛋白為A/J小鼠免疫。也包括用得自枯草桿菌的rPA(Miller 1998)、重組GST對照蛋白或去除了GST標志的編碼結構域1、4以及1-4的融合蛋白免疫的組。在后腿兩個部位肌內給予免疫劑量。初次免疫后37天，取小鼠的血樣，以供通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)進行血清抗體分析。
微量滴定板(Immulon 2，Dynex Technologies)用PBS中從枯草桿菌表達的(Miller 1998)5μg/ml rPA于4℃包被過夜，每塊板的兩列除外，這兩列用5μg/ml抗小鼠Fab(Sigma，Poole，Dorset)包被。用含1％v/vTween 20的PBS(PBS-T)洗滌板，5％w/v脫脂奶粉的PBS溶液(blotto)于37℃封閉2小時。加入在1％blotto中兩倍稀釋的血清至所述rPA包被孔中，與加入至抗fab包被孔的鼠IgG標準(Siema)一起，以雙份重復進行分析，于4℃溫育過夜。洗滌后，向所有孔中加入在PBS以1∶2000稀釋的辣根過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠IgG(SouthemBiotechnology Associates Inc.)，于37℃溫育1小時。再次洗滌板，然后加入底物2，2’-Azinobis(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)(1.09mM ABTS，Sigma)。于室溫溫育20分鐘后，測定414nm下各孔的吸光度(TitertekMultiscan，ICN Flow)。用Titersoft version 3.1c軟件計算標準曲線。效價以每ml血清μgIgG表示，計算組平均數±平均標準誤差(sem)。結果示于圖5。
所產生的所有rPA截短物都是免疫原性的，在A/J小鼠體內激發的平均血清抗rPA IgG濃度范圍從GST1b-2截短物免疫組的6μg/ml至GST1-4截短物免疫組的1488μg/ml(圖5)。GST對照免疫小鼠沒有可檢測的抗rPA抗體。
在免疫方案的第70天，用炭疽芽孢桿菌STI孢子攻擊小鼠。從原液取出足夠的STI孢子用于攻擊，在無菌蒸餾水中洗滌，然后重懸于PBS中至1×107孢子/ml和1×106孢子/ml的濃度。分別以每只小鼠含1×106孢子和1×105孢子的0.1ml體積腹膜內攻擊小鼠，在攻擊后監測14天，以確定其保護狀況。嚴格觀測人道終點，使得表現出綜合指示具有致死感染的大量臨床體征的小鼠被剔除。攻擊后存活14天的免疫小鼠數目示于表3。
表3攻擊水平MLD結構域 存活者/受攻擊的數目(％)102MLD 103MLDGST1 3/5(60) 1/5(20)GST1b-2 1/5(20) ndGST1-2 5/5(100)3/5(60)GST1b-3 3/5(60) ndGST1-3 4/5(80) ndGST1-4 nd 5/5(100)GST2-4 nd 5/5(100)GST3-4 nd 5/5(100)GST4 5/5(100)5/5(100)GST1+GST4nd 5/5(100)經切割的11/5(20) 2/5經切割的45/5(100)5/5經切割的1-4 nd 5/5rPA nd 4/4(100)對照 0/5(0) 0/5(0)1MLD＝約1×103STI孢子nd＝未進行用103MLD的STI孢子攻擊的組都是完全受保護的，除了GST1、GST1-2和經切割的1免疫的組，在這些組中有一些保護被突破，僅用GST免疫的對照組全都死于感染，至死亡時的平均時間(MTTD)為2.4±0.2天。在102MLD的較低攻擊水平下，GST1-2、GST4和經切割的4免疫的組都受到完全的保護，但在其它組中有一些保護被突破。在這些組中死亡小鼠的MTTD為4.5±0.2天，這與GST對照免疫組沒有顯著差異，GST對照免疫組全部死亡，MTTD為4±0.4天。
權利要求
1.一種引起抗炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)的保護性免疫應答的免疫原性試劑，所述試劑包含結合在一起代表炭疽芽孢桿菌全長保護性抗原(PA)的至多3個結構域或這些結構域的變異體的一種或多種多肽，并且所述結構域中的至少一個包含PA的結構域1或結構域4或其變異體。
2.一種權利要求1的免疫原性試劑，所述試劑包含野生型PA的結構域1和/或結構域4的序列。
3.一種權利要求1或權利要求2的免疫原性試劑，所述試劑包含炭疽芽孢桿菌PA的結構域4。
4.一種任一前述權利要求的免疫原性試劑，所述試劑包含結構域1和4或其保護性區的組合。
5.一種權利要求4的免疫原性試劑，其中所述結構域以融合多肽的形式存在。
6.一種權利要求5的免疫原性試劑，所述試劑包含與所述PA序列的結構域2融合的結構域1。
7.一種權利要求6的免疫原性試劑，所述試劑與所述PA序列的結構域3融合。
8.一種權利要求4的免疫原性試劑，所述試劑包含多肽的混合物，其中一種多肽包含所述PA序列的結構域1，而其中一種多肽包含所述PA序列的結構域4。
9.一種任一前述權利要求的免疫原性試劑，其中一種多肽與另一種多肽融合。
10.一種權利要求9的免疫原性試劑，所述另一種肽是谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)。
11.一種核酸，所述核酸編碼任一前述權利要求的免疫原性試劑的多肽。
12.一種表達載體，所述表達載體包含權利要求11的核酸。
13.一種用權利要求12的載體轉化的細胞。
14.一種用于生產引起抗炭疽芽孢桿菌的保護性免疫應答的免疫原性多肽的方法，所述方法包括用或者(a)編碼炭疽芽孢桿菌保護性抗原(PA)或可以引起保護性免疫應答的其變異體的核酸，或者(b)編碼炭疽芽孢桿菌保護性抗原(PA)的一個保護性結構域或可以引起保護性免疫應答的其變異體的核酸，轉化大腸桿菌宿主；培養所述轉化宿主，并且從中回收所述多肽，條件是當所述多肽是炭疽芽孢桿菌保護性抗原(PA)或可以引起保護性免疫應答的其變異體時，所述核酸中胍和胞嘧啶殘基的百分比超過35％。
15.一種權利要求14的方法，其中所述核酸編碼炭疽芽孢桿菌保護性抗原(PA)或可以引起保護性免疫應答的其變異體。
16.一種權利要求15的方法，其中所述核酸中胍和胞嘧啶殘基的百分比超過45％。
17.一種權利要求16的方法，其中所述核酸中胍和胞嘧啶殘基的百分比為50-52％。
18.一種權利要求14的方法，其中所述核酸編碼炭疽芽孢桿菌保護性抗原(PA)的一個保護性結構域或可以引起保護性免疫應答的其變異體。
19.一種權利要求18的方法，其中所述結構域是炭疽芽孢桿菌PA的結構域1和/或結構域4。
20.一種重組大腸桿菌(Escherischia coli)細胞，所述細胞已經用編碼炭疽芽孢桿菌保護性抗原(PA)或可以引起保護性免疫應答的其變異體的核酸轉化，并且其中所述核酸中胍和胞嘧啶殘基的百分比超過35％。
21.一種權利要求20的重組大腸桿菌細胞，其中所述核酸中胍和胞嘧啶殘基的百分比超過45％。
22.一種權利要求21的重組大腸桿菌細胞，其中所述核酸中胍和胞嘧啶殘基的百分比為50-52％。
23.一種權利要求20的重組大腸桿菌細胞，其中所述核酸是圖2所示的SEQ ID NO1的核酸或其修飾形式。
24.一種權利要求23的重組大腸桿菌細胞，其中所述核酸是SEQID NO1的核酸。
25.一種重組大腸桿菌細胞，所述細胞已經用編碼炭疽芽孢桿菌保護性抗原(PA)的一個保護性結構域或可以引起保護性免疫應答的其變異體的核酸轉化。
26.一種權利要求25的重組細胞，其中所述核酸編碼炭疽芽孢桿菌PA的結構域1或結構域4。
27.一種用于生產引起抗炭疽芽孢桿菌的保護性免疫應答的多肽的方法，所述方法包括培養權利要求20-26中任一項的細胞，并且從所述培養物中回收所述保護性多肽。
28.一種大腸桿菌轉化載體，所述載體包含編碼炭疽芽孢桿菌保護性抗原(PA)或可以引起保護性免疫應答的其變異體的核酸，并且其中所述核酸中胍和胞嘧啶殘基的百分比超過35％。
29.一種大腸桿菌轉化載體，所述載體包含編碼炭疽芽孢桿菌保護性抗原(PA)的一個保護性結構域或可以引起保護性免疫應答的其變異體的核酸。
30.一種SEQ ID NO1的核酸或其修飾形式，所述核酸或其修飾形式編碼PA或可以引起保護性免疫應答的其變異體，并且GC含量至少為35％。
31.一種權利要求30的核酸，所述核酸與SEQ ID NO1至少有90％相同。
32.一種權利要求31的核酸，所述核酸包含SEQ ID NO1。
34.一種預防或治療炭疽芽孢桿菌感染的方法，所述方法包括給予需要預防或治療的哺乳動物足量的權利要求1-10中任一項的免疫原性試劑。
35.權利要求1-10中任一項的免疫原性試劑在預防或治療炭疽芽孢桿菌感染的藥物制備方面的應用。
全文摘要
一種引起抗炭疽芽孢桿菌的保護性免疫應答的免疫原性試劑，所述試劑包含結合在一起代表炭疽芽孢桿菌全長保護性抗原(PA)的至多3個結構域或這些結構域的變異體的一種或多種多肽，并且所述結構域中的至少一個包含PA的結構域1或結構域4或其變異體。通過從大腸桿菌表達，生產所述免疫原性試劑的多肽以及全長PA。用該方法獲得高產量的多肽。也描述并要求保護了在該方法中使用的細胞、載體和核酸。
文檔編號C07K14/32GK1440459SQ01812409
公開日2003年9月3日 申請日期2001年7月6日 優先權日2000年7月8日
發明者E·D·威廉森, J·米勒, N·J·瓦爾克, L·W·J·拜利, P·T·霍爾登, H·C·弗利克－史密斯, H·L·布利芬特, R·W·蒂特巴爾, A·W·托平 申請人:英國國防部