專利名稱：去除人血清白蛋白多聚體的方法
技術領域：
本發明涉及去除人血清白蛋白多聚體的方法。具體指的是在特定的條件下，通過將含有人血清白蛋白多聚體的人血清白蛋白溶液與陰離子交換體相接觸，去除人血清白蛋白多聚體的方法。
最初，根據低溫乙醇分級法或者以這種方法為基準的方法，從人血漿中得到HSA組分(HSA組分分級為V)后，進一步利用各種純化方法制備HSA。并且，近年來，采用不依賴人血漿為原料的方法，應用基因重組技術開發出在酵母和大腸桿菌、枯草桿菌中生產人血清白蛋白的技術。
參考在酵母中(1)Production of Recombinant Human SerumAlbu min from Saccharomyces cerevisiae； Quirk，R.et.al，Biotechnology and Applied Biochemistry 11，273-287(1989)、(2)Secretory Expression of the Human Serum Albumin Gene in theYeast，Saccharomyces cerevisiae；Ken.Okabayashi et.al，J.Biochemistry，110，103-110(1991)、(3)Yeast Systems for theCommercial Production of Heterologous proteins；Richard G.Buckholz and Martin A.G.Gleeson，Bio/Technology 9，1067-1072(1991)、在大腸桿菌(4)Construction of DNA sequences and their usefor microbial production of proteins，in particular human serumalbumin；Lawn，R.M.，European Patent Appl.73，646(1983)、(5)Synthesis and Purification of mature human serum albumin from E.coli；Latta，L. et.al.Biotechnique 5，1309-1314(1897)、在枯草桿菌(6)Secretion of human serum albumin from Bacillus subtilis；Saunders，C.W.et.al，J.Bacteriol.169，2917-2925(1987)。
人血清白蛋白的純化方法一般使用蛋白質化學中常規使用的純化方法，例如使用鹽析法、超濾法、等電點沉淀法、電泳法、離子交換層析法、凝膠過濾層析法、親和層析方法等。實際上，在純化人血清白蛋白時，由于其中混有來自生物組織、細胞、血液等的多種夾雜物，所以采用上述方法的復雜組合進行純化。
進行人血清白蛋白工業生產時，必須在不同于人的體內環境的各種條件下進行處理，因此生成了人血清白蛋白的多聚體。在臨床應用人血清白蛋白時，盡管尚未見到報告這種多聚體對人體產生的壞影響，但是懷疑這種多聚體能夠表現出新的抗原性。從醫藥的安全性角度出發，在醫藥用 “人血清白蛋白” 檢驗標準中規定了多聚體混入量的限度，因此在制造上，盡可能降低制劑中的多聚體含量是非常重要的課題。
這種人血清白蛋白多聚體是由2個或者2個以上的單體結合而成的，其等電點和化學性質與單體十分相似，按照常規生產中采取的純化方法很難分離。因此，采用以前的技術凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析、等電點分級處理、硫酸銨分級處理、乙醇分級處理等數種純化方法的組合使之除去(特表平11-509525(國際公開WO96/37515)、第2926722號專利(平成11年5月14日注冊)。
如果組合使用多種純化方法，累計相乘各個步驟的回收率，往往導致生產率低下。從工業生產的角度出發，希望能夠盡量減少純化步驟并且有效的除去多聚體，即期待開發出高效回收單體的方法。
此外，本發明的另一個目的是提供安全性高的藥用人血清白蛋白。
本發明提供將含有人血清白蛋白多聚體的人血清白蛋白溶液與用鹽濃度為10～150mM、pH5～9.5的緩沖液平衡化的陰離子交換體相接觸，并且以此為特征的去除人血清白蛋白的方法。本發明還包括通過采用該方法的制造步驟制造的降低人血清白蛋白多聚體含量的高純度的人血清白蛋白。下面針對本發明進行詳細的闡述。
作為供給上述陰離子交換體的人血清白蛋白，使用的是通過基因重組技術得到的重組型的人血清白蛋白(以下稱之為“rHSA”)或者HSA。
進行血漿來源的HSA制造的時候，能夠預測到在制造的各個步驟中生成的多聚體，在任何一個步驟中生產的含有多聚體的水溶液都可以使用。例如低溫乙醇分級分離的組分V的水溶液、將組分V提供用于進一步純化步驟(層析法或者熱處理等)時在隨后的各個純化階段所產生的含有多聚體的水溶液等。
同樣也能夠使用rHSA制造時在各個制造步驟中所產生的含有多聚體的水溶液。例如rHSA產生宿主的培養物、這種培養物用于進一步制造步驟(層析、熱處理等)時生成的含有各純化階段的多聚體的水溶液等。在這里所說的培養物指的是培養上述宿主的培養液以及按照通常使用的方法將宿主破碎得到的含有破碎的宿主破碎液的物質。
生產rHSA所使用的宿主，沒有特殊的限制。例如可以使用酵母、大腸桿菌、枯草桿菌以及動物細胞等，其中較好的是酵母。例如使用糖酵母屬和畢赤氏酵母屬，最好使用啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)AH22株或者它的變異株。
本發明的方法有望用于將含有血漿或者重組宿主來源的夾雜物的人血清白蛋白溶液通過超濾、加熱處理、離子交換層析、吸附層析、凝膠過濾以及鹽析等處理步驟，進行了一定程度純化(HSA或者rHSA的純度在約85％以上)的基礎之上。
用于調制上述的白蛋白溶液的緩沖液的種類沒有特定的限制，優選使用常規的陰離子交換層析時使用的磷酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液。緩沖液中緩沖成分的濃度一般根據進行陰離子交換層析的條件設定。即優選5～22mM，尤其優選10～100mM。
緩沖液的pH設定在該緩沖液不含有鹽成分的條件下，能夠使人血清白蛋白多聚體吸附到陰離子交換體上的范圍為佳。即，pH5～9.5范圍，優選pH5.5～7.5范圍，尤其優選pH6～7范圍。
向緩沖液中添加的鹽可以使用氯化鈉、氯化鉀等堿金屬的氯化物，優選使用氯化鈉。該鹽的濃度優選能夠吸附多聚體而又不吸附單體的濃度范圍，根據所用的緩沖液的種類、濃度以及pH的組合，適當的進行調整，可以在10～150mM的范圍內使用，優選25～100mM，尤其優選50～75mM的范圍。
溶解在鹽濃度為10～150mM、pH5～9.5的緩沖液中的含有人血清白蛋白的多聚體的人血清白蛋白溶液是通過將溶解在任意溶液中的人血清白蛋白溶液在鹽濃度為10～150mM、pH5～9.5的緩沖液中透析置換的方法、凝膠過濾法、將濃縮后的人血清白蛋白以前述緩沖液反復進行稀釋的置換方法得到的。
只要在該白蛋白的溶解濃度范圍內，不特殊限定人血清白蛋白溶液中的人血清白蛋白的濃度，優選1～30％，尤其優選5～25％。
不特殊限定陰離子交換體的基體載體，優選不對人血清白蛋白非特異性吸附的載體。此外，陰離子交換基團既可以使用強的陰離子交換基團也可以使用弱的陰離子交換基團。優選使用強陰離子交換基團。所說的具有強陰離子交換基團的強陰離子交換體如例所示有Q-Sepharose FF(Amersham-Pharmacia-Biotech公司制)、Cellufine Q(Millipore公司制)，不過沒有特殊限定。
作為使用陰離子交換體去除白蛋白多聚體的方法，是一種采用通過將含有白蛋白多聚體的白蛋白溶液加到層析柱上，使陰離子交換體選擇性的吸附白蛋白多聚體，回收不含有多聚體的直接流通的組分的方法。例如采用分批式方法將該白蛋白溶液與陰離子交換體相接觸，使多聚體被陰離子交換體選擇性的吸附后，將該溶液自然放置或者離心分離陰離子交換體，回收所得到的上清的方法。其他方法也可以。例如進行柱層析時，柱子的尺寸、流速等的層析條件根據試驗材料的濃度、體積進行適當的調整。例如針對10L的10％的人血清白蛋白，采用25L容積的陰離子交換體、柱尺寸(700em2×35cm)、設定流速為1200ml/分鐘。
人血清白蛋白多聚體的去除程度可以采用將回收液的一部分經凝膠高效液相層析(HPLC)分析的方法進行檢測。例如使用TSKgelG300SW(Tosoh公司制)的柱子，以0.1MKH2PO4/0.3M NaCl緩沖液進行洗脫，于280nm進行吸光度測定。
表1
表1所示的是將人血清白蛋白溶液在含有50～75mM氯化鈉的磷酸緩沖液中進行透析后，將該溶液通過用同種緩沖液平衡化的強陰離子交換柱，使強陰離子交換體選擇性的吸附多聚體，以高回收率得到降低了多聚體濃度的人血清白蛋白。
產業上應用的可能性可以根據本發明，用混有人血清白蛋白多聚體的人血清白蛋白溶液調制成選定的緩沖液成分，將此溶液與用同種緩沖液平衡的陰離子交換體進行接觸，進而有效的除去這種多聚體，以高收率回收單體。
此外，根據本發明的方法，能夠提供基本不含有作為可能造成人體用藥時引發過敏反應等的副作用的原因的人血清白蛋白多聚體的高純度的人血清白蛋白。
權利要求
1.去除人血清白蛋白多聚體的方法，其特征在于將含有人血清白蛋白多聚體的人血清白蛋白溶液與用鹽濃度為10～150mM、pH5～9.5的緩沖液平衡化的陰離子交換體相接觸。
2.如權利要求1所述的方法，其中前述緩沖液的鹽濃度為25～100mM、pH5.5～7.5。
3.如權利要求2所述的方法，其中前述緩沖液的鹽濃度為50～75mM、pH6～7。
4.如權利要求1至3中任何1項中的方法，陰離子交換體為強陰離子交換體。
5.如權利要求1所記載的方法，其中將含有人血清白蛋白多聚體的人血清白蛋白溶液通過含有50～75mM氯化鈉的pH6～7的磷酸鈉緩沖液進行溶劑置換后，使之與用同緩沖液平衡化的強陰離子交換體相接觸，吸附多聚體，并且將其除去。
6.如權利要求1所記載的方法，其中將含有人血清白蛋白多聚體的人血清白蛋白溶液通過含有50～75mM氯化鈉的pH6～7的磷酸鈉緩沖液進行溶劑置換后，將其加到用同緩沖液平衡化的強陰離子交換層析柱上，使強陰離子交換體吸附多聚體，回收基本不含有多聚體的直接流出組分。
全文摘要
將含有人血清白蛋白多聚體的人血清白蛋白溶液與用鹽濃度為10～150mM、pH5～9.5的緩沖液平衡的陰離子交換體相接觸，并且以此為特征的去除人血清白蛋白的方法。
文檔編號C07K1/00GK1406245SQ01805629
公開日2003年3月26日 申請日期2001年10月24日 優先權日2000年10月24日
發明者足達聰, 溝上寬, 田嶋義高, 宮津嘉信, 野內俊伸, 牛尾義高 申請人:財團法人化學及血清療法研究所