專利名稱：一種新型鮭魚降鈣素類似物及其在植物油體中表達的方法
技術領域：
本發明涉及一種新型鮭魚降鈣素類似物msCT(31aa)及其在植物油體中表達的方法，具體地說涉及利用植物油體蛋白-目的蛋白組成融合蛋白基因表達體系生產鮭魚降鈣素類似物msCT(31aa)及其它目的蛋白的方法。
用轉基因植物生產醫用蛋白或工業用酶，近年來受到人們的廣泛關注。在植物油體中表達外源蛋白，目的基因插在油體蛋白(Oleosin)基因的C末端或N端，構成融合蛋白基因。由于Oleosin蛋白鑲嵌在油體表面，融合蛋白基因在受體植物種子的油體中特異表達后，利用油體親脂疏水的特性，將種子粉碎→液體抽提→離心，回收上層油相，即可將融合蛋白或目的蛋白與細胞內的其它組份分開，從而可明顯簡化目的蛋白的分離純化過程。
為完成本發明所涉及的油體表達系統的構建，本發明人首先分離、克隆了油菜油體蛋白基因的啟動子、芝麻油體蛋白的結構基因以及鮭魚降鈣素的突變基因msCT[Trp1，Ser6，Phe7，del-Leu19]，然后將msCT基因插在芝麻油體蛋白基因的C端，構建了由油菜油體蛋白基因的啟動子驅動的融合蛋白基因植物表達載體，轉化油菜和棉花，分別獲得了轉基因植株及株系。
轉基因油菜經PCR檢測，證明降鈣素基因已整合到油菜基因組中。轉基因棉花經PCR-Southem和Western檢測，證明msCT基因在棉花中整合并在油體中表達，目前已得到T2代轉基因棉花株系44個。由于在田間對T1、T2代植株的葉片用高濃度(5000ppm)的卡那霉素(Kan)溶液涂抹，故篩選出的卡那霉素抗性(KanR)株理論上應為高表達的個體。
天然鮭魚降鈣素的氨基酸序列如下Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2本發明人經廣泛深入的研究，現已發明一種新型的鮭魚降鈣素類似物msCT，其氨基酸序列為Trp-Ser-Asn-Leu-Ser-Ser-Phe-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2，即將天然鮭魚降鈣素的第1位氨基酸Cys突變為Trp，第6位的Thr突變為Ser，第7位的Cys突變為Phe，第19位的Leu缺失(其核苷酸序列見序列表序列標識符號3)。發明效果msCT與天然鮭魚降鈣素相比，第1、第6、第7、第19位的氨基酸均進行了改造，使其生物活性明顯提高(6,000～8,000U/mg)，天然鮭魚降鈣素和人降鈣素的生物活性分別為4,500和150U/mg。
利用轉基因植物在植物油體中表達鮭魚降鈣素類似物等外源目的蛋白，可以大大簡化目的蛋白的分離純化過程，降低生產成本；轉基因植物的種子易于貯運，有利于工業化生產，并明顯提高農副產品的附加值。
附圖簡介
圖1是植物表達載體pNOC121的結構示意圖。
圖2是pNOP載體的構建圖。
圖3是pNOP的酶切鑒定圖，其中1pNOP/HindIII+PstI雙酶切；2λDNA/EcoRI+HindIII marker。
圖4是pSO載體的構建圖。
圖5是pSO的酶切鑒定圖，其中1λDNA/EcoRI+HindIIImarker；2pSO/PstI+BamHI雙酶切。
圖6是pCT載體的構建圖。
圖7是pCT的酶切鑒定圖，其中1pBR322 DNA/BstNI marker；2pCT/BamHI+XhoI雙酶切。
圖8是中間載體pNOPM的構建圖。
圖9是pNOPM的酶切鑒定圖，其中1pNOPM/HindIII+PstI雙酶切；2λDNA/EcoRI+HindIII marker。
圖10是中間載體pNsOM的構建圖。
圖11是pNsOM的酶切鑒定圖，其中1λDNA/EcoRI+HindIIImarker；2pNsOM/PstI+BamHI雙酶切。
圖12是中間載體pNOCM的構建圖。
圖13是pNOCM的酶切鑒定圖，其中1pNOCM/BamHI+XhoI雙酶切；2λDNA/EcoRI+HindIII marker。
圖14是植物表達載體pNOC121的構建圖。
圖15是pNOC121的酶切鑒定圖，其中1λDNA/EcoRI+HindIIImarker2pNOC121/HindIII+EcoRI雙酶切。
圖16是轉基因油菜nptII的PCR檢測，其中1λDNA/EcoRI+HindIII marker；2～5750bp PCR擴增的目的片段。
圖17是轉基因油菜sOle/msCT的PCR檢測，其中1～4577bpPCR擴增的目的片段；5λDNA/EcoRI+HindIII marker。
圖18是轉基因棉花T1代的PCR-Southem雜交(nptII)，其中1～11、13～23、25～34為轉基因棉花；12、24、36為λDNA/EcoRI+HindIIImarker；35為非轉基因棉花對照。
圖19是轉基因棉籽油體中油體蛋白-msCT融合蛋白的Western檢測，其中1蛋白質分子量maker；2非轉基因棉花對照；3轉基因棉花株系351。
圖20是pEA結構圖。圖21是pMV結構圖。
下面是實現本發明的具體實施方式
本研究中我們將鮭魚降鈣素基因msCT插入芝麻油體蛋白基因(sOle)的3’端，構建以油菜油體蛋白基因的啟動子(NOP)驅動的sOle/msCT融合蛋白基因的植物表達載體pNOC121。pNOC121結構示意圖見圖1。
實施例1油菜油體蛋白基因啟動子的PCR擴增和克隆由于油菜是我國重要的大宗油料作物，含油量高(42～45％)，而且油菜油體中20kD油體蛋白的量為24kD油體蛋白量的10倍，所以我們根據20kD油體蛋白基因啟動子的序列設計了引物NP5、NP3，其序列如下
NP5ATTCAAGCTTGTCGGATCATGACGTTTCCAGNP3GCTTCTGCAGAATTGAGAGAGATCGAAGAG以白菜型油菜(B.campestris)青油14品種的總DNA為模板，PCR擴增了896bp的20KD oleosin基因的啟動子(PCR反應條件為94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分鐘，35個循環結束后72℃延伸10分鐘)，用HindIII+PstI雙酶切將其連接到pUC19上，得到pNOP。pNOP載體的構建過程和酶切鑒定分別見圖2、3。pNOP測序結果表明，克隆產物為896bp油菜油體蛋白基因的啟動子(見序列表序列標識符號1)。
實施例2芝麻油體蛋白基因的擴增和克隆以帶有芝麻油體蛋白基因的質粒pEA(圖20)DNA為模板，設計引物Ole5、Ole3，其序列如下Ole5GTGCTGCAGACAACAATGGCGGACGAACCCCACGOle3AAAGGATCCCGGTCTTATTACATCTTGGCTTCPCR擴增獲得440 bp不含終止子序列的芝麻油體蛋白基因。PCR反應條件為94℃ 30秒，52℃ 30秒，72℃ 1分鐘，35個循環結束后72℃延伸10分鐘。PCR產物用PstI/BamHI雙酶切，連接到載體pUC19上，獲得克隆載體pSO。pSO的載體構建、酶切鑒定分別見圖4、5。其序列見序列表序列標識符號2。
實施例3鮭魚降鈣素類似物基因的人工合成我們根據植物偏愛的密碼子、GC含量和所需的酶切位點設計了相應的基因序列，進行了鮭魚降鈣素類似物msCT基因的人工合成(共138bp)。此基因的G/C含量為51.5％，克隆載體為pBluescriptSK。在BamHI/XhoI位點插入msCT基因后的克隆載體命名為pCT。pCT載體的構建及酶切鑒定見圖6、7。
實施例4中間載體pNOPM的構建提取pNOP的質粒DNA，以HindIII/PstI雙酶切，回收896 bp目的片段(油菜油體蛋白基因的啟動子)，連接到載體pMV上(圖21)，獲得中間載體pNOPM，經HindIII/PstI雙酶切鑒定證明連接正確。pNOPM中間載體的構建及酶切鑒定見圖8、9。
實施例5中間載體pNsOM的構建提取pSO質粒DNA，以PstI/BamHI雙酶切，回收440bp目的片段(芝麻油體蛋白基因)，將其連接到pNOPM上，獲得中間載體pNsOM，經PstI/BamHI雙酶切鑒定，酶切片段大小為440bp。pNsOM中間載體的構建及酶切鑒定見圖10、11。
實施例6中間載體pNOCM的構建提取pCT質粒DNA，用BamHI/XhoI雙酶切后回收138bp目的片段(鮭魚降鈣素類似物msCT基因)，連接到pNsOM載體上，獲得中間載體pNOCM(圖12)。經BamHI/XhoI雙酶切鑒定，酶切片段大小為138bp(圖13)。
實施例7植物表達載體pNOC121的構建提取pNOCM質粒DNA，用HindIII/EcoRI雙酶切，回收約2.0kb的DNA片段，將其連接到pBI121(購自CLONTECH公司)上(圖14)，HindIII/EcoRI雙酶切鑒定證實酶切片段大小為2.0kb(圖15)。至此完成了NOP/sOle/msCT植物表達載體pNOC121的構建。
實施例8農桿菌介導的油菜遺傳轉化1.pNOC121質粒DNA轉入農桿菌2微克pNOC121質粒DNA加入到100微升LBA4404感受態細胞中，混勻，冰浴5分鐘。液氮中冷凍5分鐘后迅速轉至37℃水浴中溫浴5分鐘。加入1毫升YEB液體培養基，在28℃搖床上250rpm振蕩培養4～5小時。取適量菌液涂布到含鏈霉素125mg/L和卡那霉素100mg/L的YEB固體培養基上，置28℃培養24～48小時，篩選獲得帶有pNOC121質粒DNA的農桿菌單菌落。2.農桿菌的活化從平板上挑取農桿菌單菌落，接種到5毫升YEB液體培養基中(含卡那霉素100mg/L，鏈霉素100mg/L)，振蕩培養過夜，取1毫升菌液接種到50毫升YEB液體培養基(含卡那霉素100mg/L，鏈霉素100mg/L)中，劇烈振蕩培養至OD600為0.4～0.5(約3～4小時)，5000rpm離心5分鐘，菌體用MS1(MS+6BA 1.0mg/L+NAA0.05mg/L)培養基洗一次，以MS0(不含任何激素及抗生素)重懸，使OD600為0.1～0.2。3.油菜的遺傳轉化切取發芽7天的油菜下胚軸，在上述MS0重懸的農桿菌菌液中浸泡1分鐘，放到MS1(MS+BA1mg/L+NAA 0.05mg/L)固體培養基上共培養4天，之后轉到含有卡那霉素10mg/L+噻孢霉素(Cef)100mg/L的MS1固體培養基上繼續進行芽分化選擇培養，約4周左右有抗性芽出現，待抗性芽伸長至1～2厘米時轉至生根培養基MS2(MS+NAA 0.1mg/L+Kan 100mg/L+Cef 100mg/L)上，一般10天左右即可生根。
實施例9轉基因油菜的PCR檢測提取轉基因油菜基因組DNA，分別以npt5/npt3和sOle/msCT兩對引物進行PCR擴增檢測，各引物序列為npt5GAACAAGATGGATTGCACGCnpt3AGAAGGCGATAGAAGGCGATGsOleTGGCGGACGAACCCCACGACCmsCTCTTACTCAGCCTCGAGTTACTATCCTnpt5/npt3的PCR反應條件為94℃ 30秒，52℃ 30秒，72℃ 1分鐘；sOle/msCT的PCR反應條件為94℃ 30秒，62℃ 30秒，72℃1分鐘。35個循環后均在72°延伸10分鐘。分別擴增出預期的750bpnptII及578bp的芝麻oleosin-msCT目的片段。PCR檢測照片分別見圖16和17。
實施例10海島棉海7124的花粉管通道法轉化大量提取pNOC 121質粒DNA，用無菌的重蒸水稀釋成0.02μg/μl，在北京當海7124開花約24小時時，將稀釋好的DNA溶液以每朵花10微升的量(0.2微克DNA)注入棉花子房內，并在蕾柄處涂抹1％的赤霉素，以防止蕾鈴脫落。共收獲了5公斤約5萬粒棉花種子，送海南南繁，播種后在苗期以5000ppm的卡那霉素溶液涂抹葉片，篩選出101株卡那霉素抗性(KanR)植株。
實施例11海7124轉基因棉花T2代植株的卡那霉素抗性(KanR)檢測海南南繁KanR株上收獲的T2代種子，在北京播種，4葉期及現蕾前分兩次在各株行的每一株葉片上涂抹5000ppm的卡那霉素，兩次田間調查各株行KanR及Kans(卡那霉素敏感)株的結果列于表1。
表1北京T2代植株田間Kan抗性調查表
實施例12 T2代轉基因棉花的PCR-S0uthern檢測提取KanR株的基因組DNA，以npt5/npt3及sOle/msCT兩對引物對基因組DNA進行PCR擴增。PCR的反應條件為npt5/npt394℃ 30秒，52℃ 30秒，72℃ 1分鐘；sOle/msCT94℃ 30秒，62℃ 30秒，72℃ 1分鐘。35個循環后均在72℃下延伸10分鐘。結果表明，有63株為nptII陽性，在這63株中有44株為sOle/msCT陽性。
取T2代nptII及sOle/msCTPCR均為陽性的轉基因棉花32株，以pNOC121質粒DNA/HindIII+EcoRI雙酶切的片段為探針，進行PCR-Southern雜交，結果29株為陽性(圖18)。
實施例13棉籽中oleosin油體蛋白-calcitonin目的蛋白的Western檢測提取棉籽中的油體蛋白，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。經轉膜后用山羊抗鮭魚降鈣素的多克隆抗體進行Western分析。結果表明，在轉基因棉花351株系的種子中有鮭魚降鈣素類似物蛋白的表達，表達產物大小約為19kD，與預期的大小一致(芝麻Oleosinn蛋白15.5kD+msCT蛋白3.45kD)，如圖19所示。
實施例14油體蛋白與鮭魚降鈣素類似物的分離1.棉籽中油體蛋白-鮭魚降鈣素類似物融合蛋白的提取(1)取棉花種子10粒去掉外殼，加約3倍體積的緩沖液A(0.15MTricine-KOH pH7.5，10mM KCl，1mM MgCl2，1mM EDTA，0.6M蔗糖)研磨，5000xg、4℃離心10分鐘。
(2)上清用含0.6M蔗糖的緩沖液A重懸。
(3)液面上覆以等體積的含0.1M蔗糖的緩沖液A。
(4)18000xg、4℃離心20分鐘，重復兩次，取上清。
注；至此將油體與種子中的其它成份分開。油體的成份包括中性脂類、磷脂、油體蛋白。
(5)上清中加2倍體積的乙醚，13600xg離心4分鐘，上部的乙醚層中多為中性脂類，磷脂留在下面的水相中，取中間的蛋白層。
(6)以250微升含0.1M蔗糖的緩沖液A重懸蛋白，加750微升氯仿/甲醇(2∶1)混合物，抽提2～3次。
(7)取中間蛋白層，用乙醚抽提一次，-70℃冰箱中凍干保存。2.油體蛋白與鮭魚降鈣素類似物的分離(1)將油體蛋白-鮭魚降鈣素類似物的融合蛋白溶于盡可能少的無菌水中。
(2)加入50微升凝血酶酶切反應緩沖液(0.1M三乙醇氨pH8.4，0.5％肌氨酰)。
(3)加入0.02U凝血酶，37℃酶切過夜。
(4)經HPLC分離，獲得鮭魚降鈣素類似物。3.鮭魚降鈣素類似物的HPLC純化程序分析型反相柱C18(5μ，8×250mm，大連化學物理研究所)；紫外波長214nm；流動相A-0.1％三氟乙酸，B-70％乙腈(0.1％三氟乙酸)。梯度B在20分鐘內由0％升至60％，10分鐘內再降至0％，流速為0.5毫升/分鐘，收集鮭魚降鈣素類似物，凍干，-70℃保存。
序列表<110>中國農業科學院生物技術研究所<120>一種新型鮭魚降鈣素類似物及其在植物油體中表達的方法<160>4<170>PatentIn Version 2.1<210>1<211>896<212>DNA<213>油菜(Brassica campestris)<400>1ATTCAACGTTGTCGGATCATGACGTTTCCAGAAAACATCGAGCAAGCTCTCAAAGCTGACCTCTTTCGGATCGTACTGAACCCGAACAATCTCGTTATGCCCCGTCGTCTCCGAACAGACATCCTCGTAAGTAGGATTGTCGACGAATCCATGGCTATACCCAACCTCCGTCTTCGTCACGCCTGGAACCCTCTGGTAAGCCAATTCCGCTCCCCAGAAGCAACCGGCGCCGAATTGCGCGAATTGCTGACCAGGCGAAGGAACATCGTCGTCGGGTCCTTGTGCGATTGCGGAGGAAGCCGCCGGGTCGGGTTGGGGACGAGACCCGAATCCGAGCCTGGTGAATAGGTTGTTCATCGGAGATTTATAGACGGAGATGGATCGAGCGGTTTTGGGGAAAGGGGAAGTGGGTTTGGCTCTTTTGGATAGAGAGAGTGCAGCTTTGGCGAGAGACTGGAGAGGTTTAGAGAGAGACACGGCGGAGATTACCGGAGGAGAGGCGACGATAGATAGCATTATCGAAGGGACGGGAGAAAGAGTGACGTGGAGAAATAAGAAACCGTTAAGAGTCGGATATTTATTATATTAAAAGCCCACTGGGCCTAACCCATTTAAACAAGACAAGATAAATGGGCCGTGTGTGAGTGTTAACGTTCGGTTTCAAATGCCAACGCCATTGGAACAAAACAAACGTGTCCTCAAGTAAACCCCTGTCGTTTACACCTCAATGGCTGCATGGTGAAGCCATTAACACGTGGCGTAGAATGCATGACGACGCCATTGACACCTGACTCTCTTTCCTTCTCTTCATATATCTCTAATCAATTCAACACTCATTGTCATAGCTATTCGGAAAATATATACACATCCTTTTCTCTTCGATCTCTCTCAATTC<210>2<211>440<212>DNA<213>芝麻(Sesamum indicum L.)<400>2ATGGCGGacGAACCCCACGACCaGCGCCCCACCGACGTCATCaaGAGCTACCTCCCCGAAAaGGGTCCCTCCACCTCTCAAGTCCTCGCCGTCGTGACCCTCTTCCCCCTCGGCGCCGTCCTCCTCTGCCTAGCCGGTCTCATTCTTACCGGGACCATCATCGGCCTCGCCGTCGCCACCCCGCTCTTCGTCATCTTCAGCCCCATCTTGGTCCCCGCCGCCCTAACCATCGCCCTAGCCGTCACCGGTTTCTTGACCTCCGGAGCTTTCGGCATCACCGCCCTGTCCTCGATTTCGTGGTTGCTGAACTACGTTAGGCGAATGCGGGGGAGCTTGCCAGAGCaGCTGGATCATGCACGGCGGCGCGTGCaGGAGAcGGTGGGCCaGAaGACAAGGGAGGCGGGGCaGAGAAGCCAAGATGTAATAAGACCGTGA<210>3<211>138<212>DNA<213>人工序列<400>3GGATCCCATA TGCTTGTTCC AAGGGGATCT TGG AGC AAC CTC AGC AGC TTC GTG CTC GGAAAG CTC AGC CAA GAG CTC CAC AAG CAA ACC TAC CCA AGG ACC AAC ACC GGA TCTGGA ACC CCA GGA TAG TAA CTCGAG
<210>4<211>31<212>PRT<213>人工序列<400>4Trp-Ser-Asn-Leu-Ser-Ser-Phe-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH權利要求
1.一種編碼鮭魚降鈣素類似物msCT(31aa)的基因msCT[Trp1，Ser6，Phe7，del-Leu19]，其編碼產物的氨基酸序列結構為Trp-Ser-Asn-Leu-Ser-Ser-Phe-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2，即將天然鮭魚降鈣素的第1位氨基酸Cys突變為Trp，第6位的Thr突變為Ser，第7位的Cys突變為Phe，第19位的Leu缺失。
2.一種重組載體，含有權利要求1所述的基因。
3.根據權利要求2所述的載體，該載體包括油體蛋白(oleosin)基因的啟動子、油體蛋白的結構基因及編碼鮭魚降鈣素類似物的基因。
4.一種制備降鈣素類似物的方法，包括(1)將權利要求1所述的基因插在油體蛋白基因的C端或N端；(2)將獲得的融合基因置于油體蛋白基因啟動子之后構建植物表達載體；(3)用構建的植物表達載體轉化受體植物；(4)獲得轉基因植物；(5)分離和純化在轉基因植物油體中表達出的目的蛋白。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其中所說的權利要求1的基因是編碼鮭魚降鈣素類似物msCT[Trp1，Ser6，Phe7，del-Leu19]的基因。
6.根據權利要求4所述的制備方法，其中所說的油體蛋白基因包括所有植物來源的油體蛋白基因。
7.根據權利要求4所述的制備方法，其中所說的油體蛋白基因的啟動子為所有植物來源的油體蛋白基因的啟動子。
8.根據權利要求4所述的制備方法，其中所說的受體植物和轉基因植物包括但不限于油菜、棉花的所有油料植物(如向日葵、大豆、花生、芝麻、油棕、油橄欖等草本及木本植物等)。
9.利用權利要求4-8所述的制備方法所獲得的表達目的蛋白的轉基因植物包括根、莖、葉、花、果、種子等所有植物體部分和細胞、組織等。
10.利用權利要求4-8所述的制備方法所獲得的表達的目的蛋白，包括鮭魚降鈣素類似物但不限于鮭魚降鈣素類似物的所有目的蛋白。
11.含有權利要求1所述的基因或含有權利要求2所述的重組載體的真菌、細菌、農桿菌、酵母等。
全文摘要
本發明采用基因工程技術，克隆了一種新型鮭魚降鈣素類似物的基因msCT(31 aa)，并建立了油體蛋白(oleosin)與目的蛋白融合的基因表達體系。其中包括(1)分離和克隆了油菜油體蛋白基因的啟動子及編碼芝麻油體蛋白的結構基因；(2)設計合成了編碼鮭魚降鈣素類似物msCT[Trp
文檔編號C07K14/575GK1424399SQ0114425
公開日2003年6月18日 申請日期2001年12月14日 優先權日2001年12月14日
發明者賈士榮, 劉昱輝 申請人:中國農業科學院生物技術研究所