專利名稱：一種dna提取方法及其在檢測食品中的轉基因成分中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種DNA提取方法及其在轉基因食品檢測中的應用。
因此，有必要開發適當的技術用于確認哪些食品必須加以標示。實踐當中，區分轉基因與非轉基因的最佳辦法是在DNA的水平上證明外來基因的存在與否。聚合酶鏈反應(PCR)可以用于檢測外來基因的存在。然而，在進行PCR分析之前必須把DNA從樣品中提取出來。許多的實驗方法已描述了如何提取DNA，但各種方法的復雜程度和所獲得的DNA的質量有很多的差別，并且不能夠用于一些食品如啤酒、高度發酵和經過深加工的產品如醬油中DNA的提取，并且所得到的DNA產物中含有很多的PCR反應的抑制劑。這些方法具體包括商業用途的樹脂提取方法，如美國Promega公司的Wizard方法、DNeasy方法(Qiagen，Switzerland)、Nucleon Phytopure方法(Scotlab Bioscience，USA)和核酸沉淀技術，包括CTAB方法(Tinker et al.Theor.Appl.Genet.(1993)85976-984)、ROSE方法(Steiner et al.Nucleic acids Res.(1995)232569-2570)、ROSEX方法、Alkali方法(Klimyuk et al.(1993)PlantJ 3493-494)、alkaliX方法、Chelex 100方法(Walsh et al.(1991)Biotechniques 10506-513)和SDS/蛋白酶K方法(Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning-A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，p6.15)。這些提取方法有不同的特性和用途。Wizard和Dneasy適于一般的DNA的提取，Nucleon Phytopure是特殊設計用于分析植物的，CTAB是一種為了經濟考慮的方法，Chelex100是用作鑒證分析的標準方法，ROSE和alkali是快速而簡便的方法，而ROSEX是ROSE方法加Chelex 100方法的組合，AlkaliX方法是Alkali方法和Chelex 100方法的組合。
用不同方法提取的DNA的性質不同。例如，用alkali，alkaliX或Chelex 100方法提取的DNA幾乎完全改變原有的性質，即呈現出單鏈結構。Wizard和Dneasy方法不能分離大分子量的DNA(Zimmermannet al.，1998)。DNA的提取方法影響DNA的回收率。CTAB，Wizard，Dneasy and Nucleon Phytopure方法的回收率低于20％(Zimmermann etal.，1998)。這些方法所丟失的DNA可能是由于DNA在氯仿沉淀期間的丟失或DNA沉淀的效率低。ROSE和ROSEX方法的回收率在70-80％之間(Zimmermann et al.，1998)。這些方法所丟失的DNA可能歸因于在離心時DNA和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的共同沉淀。Chelex100，alkali和alkaliX方法需要有沸騰這一步，這會影響到用于核酸定量的光密度計并導致計算數量的錯誤。
經提取的DNA的質量也非常重要，因為它影響到PCR方法檢測出是否有標記基因的效率、實驗的重復性、PCR的檢測極限。從食品中提取的DNA的檢測極限主要取決于1.食品中存在的抑制物質；2.DNA在食品經過處理和加工的過程中受到的損傷程度(如凈化、水解和碎化過程)；3.DNA在提取過程中的損傷程度。CTAB、Wizard、Dneasy和Nucleon Phytopure方法都可以得到高質量的DNA(Zimmermann et al.，1998)。Chelex 100，、alkali、alkaliX和ROSEX方法所得到DNA的質量較差。ROSE方法得到中等質量的DNA(Zimmermann et al.，1998)。所有這些方法可把DNA之外的RNA一并分離，而導致檢測極限比預期的低，因為RNA在PCR反應中不擴增。
提取DNA方法的成本也是商業應用的一個考慮因素。商用的DNA提取方法(Wizard、Dneasy和Nucleon Phytopure方法)最為昂貴。Alkali、alkaliX和ROSE方法花費最少(Zimmermann et al.，1998)。
為了提取出充足的測試用的DNA，處理食物樣品所需要的時間也是另一個重要的因素。Chelex 100、Wizard和Dneasy方法是非常耗時的。Alkali和alkaliX方法最快。其它方法所需的時間中等(Zimmermannet al.，1998)。最重要的是目前的方法不能適用于一些深加工制品和高度發酵產品如南乳和醬油等。而且這些方法不能把食品中的PCR抑制物質分離除去，以致所得到的DNA產物中含有PCR抑制物質。
具體說來，傳統的Sambrook等的DNA提取方法中，首先是用裂解液裂解樣品，然后用苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)萃取去除蛋白、脂肪等雜質，然后用乙醇沉淀DNA(Sambrook J，et al.，(1989)Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，p6.15)。但該方法提取的DNA的質量不高。Wizard DNA提取方法，是在用裂解液裂解樣品后用樹脂吸附DNA，然后將DNA從樹脂上洗脫下來，然后用乙醇沉淀DNA。該方法提取的DNA的質量仍不能達到要求，所達到的DNA產物中仍含有許多抑制PCR的雜質。
考慮到假陰性和假陽性結果的影響，從待測食品中提取的DNA的質量是非常重要的。因此，就需要一種能夠從各種各樣的食品中快速和高質量地提取DNA的方法。
本發明的另一個目的在于提供一種快速和準確的檢測食品中的轉基因成分的方法。
本發明的再一個目的在于提供一種快速和準確的檢測食品中的轉基因成分的試劑盒。
在本發明的一個方面，本發明提供了一種DNA的提取方法，該方法包括如下步驟(1).用裂解液處理樣品并離心得到含有DNA的上清；(2).過濾步驟(1)中的上清得到濾液；(3).向上述(2)的濾液中加入萃取劑處理并離心得到上清液；(4).向上述(3)中的上清中加入樹脂用于吸附DNA；(5).洗脫吸附于樹脂上的DNA并離心得到含有DNA的濾液；(6).沉淀濾液中的DNA。
在本發明的另一方面，本發明提供了一種檢測食品中的轉基因成分的方法，該方法包括A.用上述的方法提取DNA；B.用PCR方法擴增和檢測其中的至少一種轉基因成分。
在本發明的再一方面，本發明還提供了一種用于檢測食品中的轉基因成分的試劑盒。
用本發明的方法所提取的DNA的質量高，基本上不含有抑制PCR反應的物質，因此可以通過PCR方法方便有效地檢測食品中的轉基因成分。
圖2示本發明的方法的流程圖。
圖3和圖4示本發明的DNA提取方法的流程圖。
圖5示本發明的DNA擴增方法的流程圖。
圖6示花椰菜花葉病毒35S啟動子序列的檢測結果。其中的樣品為1.大豆(美國)、2.大豆(墨西哥)、3.杯裝面條1、4.杯裝面條2、5.袋裝面條1、6.袋裝面條2、7.豆漿(香港)。
圖7示根癌農桿菌胭脂堿合成酶(NOS)序列的檢測結果。其中的樣品為1.調味粉1、2.調味粉2、3.調味粉3、4.調味粉4、5.碗裝面條1、6.碗裝面條2、7.速食通心米粉、8.速食通心米粉、9.DNA分子標記、10.NOS陽性對照0.1％、11.NOS陽性對照0.5％、12.NOS陰性對照。
圖8示新酶素磷酸轉移酶II(NPTII)的檢測結果。其中的樣品為1.菜籽油1、2.菜籽油2、3.菜籽油3、4.菜籽油4、5.菜籽油5、6.DNA分子標記、7.NOS陽性對照0.1％、8.NOS陽性對照0.5％、9.NOS陰性對照。
圖9示18S rRNA的檢測結果。其中的樣品為1.大豆1、2.大豆2、3.玉米1、4.玉米2、5.杯裝面條1、6.杯裝面條2、7.醬油1、8.醬油2、9.爆谷1、10.爆谷2、11.豆漿1、12.豆漿2、13.18S陽性對照、14.DNA分子標記、15.18S陰性對照。
發明的
具體實施例方式
用傳統的食品分析技術并不容易確定食品中是否含有轉基因成分。然而通過檢測食品中的DNA的方法卻可以有效地確定食品中是否含有轉基因成分。本發明的方法適用于任何含有DNA的食品樣品。本發明中所說的食品包括各種食品原料和加工的食品。例如，食品原料包括大豆、玉米、馬鈴薯、番茄、大米、大麥和油菜籽。加工后的食品包括大豆制品，例如豆腐、豆漿、豆汁、大豆蛋白、發酵的豆腐、素食(例如素魚)；玉米制品，例如玉米餅干、玉米片、玉米粉、玉米湯、玉米油、爆玉米；番茄制品，例如番茄醬、番茄湯、番茄汁、番茄味的馬鈴薯片；馬鈴薯制品，例如馬鈴薯片、炸薯片、馬鈴薯面粉、馬鈴薯淀粉；大麥制品，例如啤酒、面包、面粉、面條、麥片。其它加工制品有冰淇淋、菜籽油和巧克力等。
以DNA檢測技術就能確定出食品是否含有轉基因成分，或經過基因改造。在食品樣品中，轉基因DNA的含量很低，并且可能含有一些可能抑制PCR反應的物質。要檢測轉基因成分，首先要將這些含量很低的DNA提取出來，并將DNA純化，并盡量把抑制PCR反應的物質去除。
所用未加工食品原料和加工食品中都含有DNA。轉基因食品和非轉基因食品的區別即在于其中嵌入了轉基因成分。這個被嵌入的轉基因成分將被PCR方法快速、特異和精確地擴增。在轉基因生物體中存在著一些通用的、廣泛使用的轉基因成分。例如，花椰菜花葉病毒35S啟動子控制大多數商用轉基因植物的被嵌入的基因要素轉錄的開始。同樣地，農桿菌中胭脂堿基因終止子控制大多數轉基因植物的被嵌入的基因要素轉錄的有效終止。另外，NPTII經常被加入到轉基因植物的中用于早期的轉基因植物開發時從轉基因植物中篩選出成功轉基因的植物。這三個要素都是有效的區別轉基因植物和非轉基因要素的目標。而且，18S核糖體RNA存在于所有的真核細胞中。該分子可以作為DNA提取質量的標記。
圖1示本發明的轉基因食品的提取方法的概括的流程圖。圖2是本發明的檢測食品中的轉基因成分的流程圖。
首先，對本發明中所用的樣品來說，如果食品本身是固體如大豆、玉米等，只需要進行粉碎即可。如果食品是液體，如啤酒和豆漿，則如果直接進行提取，則DNA的含量太低，DNA產物的量不足于用于檢測。因此，對這類食品要首先進行冷凍干燥，得到濃縮的產品后再進行DNA的提取和檢測。冷凍干燥可以在普通的冷凍干燥儀上進行。
圖3和4是DNA提取的示意圖。首先向樣品中加入裂解緩沖液用于裂解細胞和釋放DNA分子(10)。樣品可被置于一個合適的容器中如1.5ml的微量離心管中。樣品的用量沒有具體的限制，優選不小于0.4g。為了使實驗結果更可靠，每個樣品可以重復一次。裂解緩沖液可以使用常規的裂解緩沖液。例如裂解緩沖液包括緩沖液A和B，其中緩沖液A包括10mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，2mM EDTA-Na和1％十二烷基硫酸鈉；緩沖液B包括5M的鹽酸胍。然后，充分混合，例如通過旋渦振蕩樣品以使樣品中的細胞充分裂解。細胞成分被溶解后，加入蛋白酶K(12)，分解食物的蛋白成分，其中蛋白酶K不含DNA。為了使樣品中的蛋白成分裂解完全，可將樣品在60℃水浴中溫育一段時間，優選1-3小時。然后樣品溶液被冷卻至室溫，并維持5分鐘。然后，離心去除混合物中不能溶解的物質和沉淀物。例如，離心速率為14000rpm，時間為10分鐘。把得到的含有DNA分子的上清溶液移到另一干凈的容器中，例如一個干凈的1.5ml的微量離心管。為了去除可能干擾PCR反應的微粒成分，將溶液通過含有微孔濾膜的無菌過濾器(14)得到濾液。其中，過濾器可以使用各種常用的過濾器如注射器式過濾器，前提條件是無菌和無致熱源。例如OSMONICS的CAMEO 25AS。微孔濾膜的孔徑大小優選為0.22μm。向得到的含有DNA的濾液中加入等量的萃取劑。優選萃取劑為苯酚∶氯仿∶異戊醇(混合溶劑)，優選比例為25∶24∶1。振蕩混合后離心(14000rpm)，將得到的上層水溶液移到另一干凈的容器中，例如一個干凈的1.5ml的微量離心管中。優選再向該溶液中加入等量的氯仿，并混合和分離(14000rpm)得到含DNA的水溶液。向得到的水層中加入樹脂(16)，將溶液和樹脂的混合物通過一個微量管柱(20)。其中，樹脂可以使用本領域常規的用于吸附DNA的樹脂，但前提是沒有可以破壞DNA的酶如Dnase，例如Promega公司的Wizard樹脂。例如，把溶液經由注射器推到微量管柱中，其中微量管柱為常規的微型管柱，如Promega公司的Wizard微量管柱。然后用80％的異丙醇洗滌，去除雜質。離心，去除液體。向微量管柱中加入洗脫緩沖液(焦碳酸二乙酯水，即DEPC水)。可以將柱子加熱到70℃并維持2分鐘以釋放所吸附的DNA分子。將收集到的流出液離心，得到含有DNA的溶液。向溶液中加入2倍體積的無水乙醇，在-80℃放置30分鐘沉淀DNA。離心收集DNA。DNA沉淀(24)用70％的酒精洗滌。離心得到純化的DNA沉淀，用DEPC水或TE(Tris-HCl，EDTA緩沖液)溶液，優選DEPC水溶解后。然后用常規方法在260/280nm測定DNA的濃度。
得到的DNA產物用常規的PCR擴增技術進行擴增，然后用凝膠電泳進行檢測。PCR反應可在普通的PCR熱循環儀上進行，如Strategene RoboCycler 96，德國。PCR反應中所使用的各種針對花椰菜花葉病毒35S啟動子、根癌農桿菌胭脂堿合成酶終止子和新霉素磷酸轉移酶II的引物是由發明人根據GenBank上公開的序列進行設計然后由Promega等公司進行商業合成的。各引物的具體序列請參見序列表中SEQ ID No.1-22的描述。具體地說，用于擴增35S序列的引物對包括引物A(SEQ ID NOs.1-2)和B(SEQ ID Nos.3-5)。用于擴增NOS的引物對包括引物C(SEQ ID NOs.6-7)和D(SEQ ID Nos.8-10)。用于擴增NPTII的引物對包括引物E(SEQ ID Nos.11-13)和F(SEQ IDNos.14-16)。而用于擴增真核生物標記的18sRNA的引物對包括引物G(SEQ ID Nos.17-19)和H(SEQ ID Nos.20-22)。PCR反應中所使用的示例性試劑的組成具體如下表所示。
在冰上溶解PCR超級混合物和引物溶液。在加入其它成分之前，將PCR管在冰上冷卻5分鐘。根據上表，加入各反應試劑。除了樣品DNA，每個反應需要一個陰性和陽性對照。其中陽性對照是參照材料和測定研究院聯合研究中心歐洲委員會(Europe commission，JointResearch Centre，Institute for Reference Materials and Measurements(IRMM)，Geel(BE))的經公正的參照材料IRMM410*，陰性對照是DEPC水。PCR的反應條件如下所示。1.變性94℃，2分鐘2.變性94℃，1分鐘3.退火55℃，1分鐘4.延伸72℃，1分鐘(步驟2-4重復循環40次)5.延伸72℃，10分鐘6.結束6℃PCR反應的產物的檢測是在常規的瓊脂糖凝膠電泳上進行的。緩沖液是1×TAE(Tris，乙酸，EDTA緩沖液)。凝膠中含有0.3mg/ml的溴化乙錠。DNA分子標記為MBI Fermentas USA產品。每個泳道上樣為20μl。24mA恒流電泳30分鐘。
2〕PCR擴增和檢測如下表所示，向微量離心管中加入DNA樣品和PCR反應緩沖液，引物溶液和Taq聚合酶后在PCR熱循環儀中進行PCR反應，PCR反應的調節如上述材料和方法中所述。
PCR反應產物用3％(1×TAE)瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。其中凝膠中加入了0.3mg/ml的溴化乙錠(Amersham Pharmacia USA)。DNA分子標記為MBI Fermentas USA產品。每個泳道上樣為20μl。24mA恒流電泳30分鐘。陽性對照為IRMM410*，陰性對照為DEPC水。結果如圖7所示。結果為，泳道1(大豆，美國)，2(大豆，墨西哥)，3(杯裝面條)，5(袋裝面條1)和6(袋裝面條2)出現了162bp的35S帶，表明該食品中含有轉基因成分。實施例2.對根癌農桿菌胭脂堿合成酶(NOS)終止子的擴增和檢測DNA的提取方法和PCR擴增和檢測方法和實施例1相同。其中的樣品是1.調味粉1、2.調味粉2、3.調味粉3、4.調味粉4、5.碗裝面條1、6.碗裝面條2、7.速食通心米粉、8.速食通心米粉。其中所用的引物如SEQ ID Nos.6和8所示。陽性對照改為IRMM410*。陰性對照為DEPC水。結果如圖7所示。結果是樣品5.碗裝面條1、6.碗裝面條2、7.速食通心米粉、8.速食通心米粉出現了陽性的146bp的條帶。說明這些食品中有轉基因成分的存在。實施例3.對新霉素磷酸轉移酶II(NPTII)序列的擴增和檢測DNA的提取方法和PCR擴增和檢測方法和實施例1相同。其中所用的樣品為1.菜籽油1、2.菜籽油2、3.菜籽油3、4.菜籽油4、5.菜籽油5。其中所用的引物如SEQ ID Nos.11和14所示，陽性對照為IRMM410。結果如圖8所示。結果是樣品3和4中出現了194bp的陽性條帶，說明這2種食品中有轉基因成分的存在。實施例4.18SrRNA的檢測DNA的提取方法和PCR擴增和檢測方法和實施例1相同。其中所用的樣品為1.大豆1、2.大豆2、3.玉米1、4.玉米2、5.杯裝面條1、6.杯裝面條2、7.醬油1、8.醬油2、9.爆谷1、10.爆谷2、11.豆漿1、12.豆漿2。其中所用的引物如SEQ ID Nos.17和20所示，陽性對照為IRMM410。結果如圖9所示。18SrRNA是真核生物的標志，也是DNA提取過程成功的指示。結果所有的樣品都為陽性，都出現了137bp的條帶，說明DNA的提取是成功的。
大部分市場上出現的轉基因植物都用花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子作為轉基因的轉錄啟動因子。因此，35S陽性的結果表明所檢測的食品中有轉基因成分的存在。但如果食品中含有蕓苔屬植物(如cauliflower，Brussels，Sprouts，Parsley)的成分時，35S陽性并不能說明食品中是否含有轉基因成分的存在。這時要結合NOS和/或NPTII的檢測的結果。
實施例5.一種用于檢測食品中的轉基因成分的試劑盒如下的試劑存放于不同的相互隔離的容器中，并共同組成一個試劑盒用于檢測食品中的35S和/或NOS和/或NPTII的存在與否。
1×50μl 35S引物1×50μl NOS引物1×50μl NPTII引物1×50μl 18SrRNA引物3×0.8ml不含DNA的蛋白酶K3×1.2ml PCR反應的超級混合物1×100μl 35S和NOS的DNA陽性對照(1％w/v)1×50μl NPTII的DNA陽性對照(1％w/v)1×50μl 18SrRNA的DNA陽性對照(1％w/v)1×50ml緩沖液A1×6ml緩沖液B1×50ml樹脂50支微量管柱其中緩沖液A、B，PCR超級混合物以及樹脂和實施例1中的相同。
序列表<110>香港基因晶片開發有限公司<120>一種DNA提取方法及其在檢測食品中的轉基因成分中的應用<130>CPCH0163305<140><141><160>22<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物A35S提取序列<400>1atatagagga agggtcttgc gaagg25<210>2<211>125<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物A35S提取序列±50核苷酸<400>2gagagactgg tgatttcagc gtgtcctctc caaatgaaat gaacttcctt atatagagga 60agggtcttgc gaaggatagt gggattgtgc gtcatccctt acgtcagtgg agatatcaca 120tcaat 125<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物B35S提取序列<400>3ccgacagtgg tcccaaagat ggac24<210>4<211>124<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物B35S提取序列±50核苷酸<400>4caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcgttcaa gatgcctctg ccgacagtgg 60tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac 120gtct 124<210>5<211>164<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物B35S提取序列±70核苷酸<400>5agaaaaggaa ggtggcacta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcgttcaa 60gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa 120aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatg164<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物CNOS提取序列<400>6gaatcctgtt gccggtcttg cgatg25<210>7<211>125<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物CNOS提取序列±50核苷酸<400>7tcgaatttcc ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt 60gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgataagcatgtaataatt 120aacat 125<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物DNOS提取序列<400>8tcgcgtatta aatgtataat tgcgggactc 30<210>9<211>130<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物DNOS提取序列±50核苷酸<400>9caccgcgcgc gataatttat cctagtttgc gcgctatatt ttgttttcta tcgcgtatta 60aatgtataat tgcgggactc taatcataaa aacccatctc ataaataacg tcatgcacag 120ataggcctaa130<210>10<211>170<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物DNOS提取序列±70核苷酸<400>10cgatctagta acatagatga caccgcgcgc gataatttat cctagtttgc gcgctatatt 60ttgttttcta tcgcgtatta aatgtataat tgcgggactc taatcataaa aacccatctc 120ataaataacg tcatgcacag ataggcctaa cgcttgtcca agatctattc170<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物ENPTII提取序列<400>11ggtggtcgaa tgggcaggta gc 22<210>12<211>122<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物ENPTII提取序列±50核苷酸<400>12aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga tgtttcgctt ggtggtcgaa 60tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt gcatcagcca tgatggatac 120tt 122<210>13<211>162<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物ENPTII提取序列±70核苷酸<400>13tccagatcat cctgatcgac aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga 60tgtttcgctt ggtggtcgaa tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt 120gcatcagcca tgatggatac tttctcggca ggagcaaggt ga 162<210>14<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物FNPTII提取序列<400>14cacgacgggc gttccttgc 19<210>15<211>119<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物FNPTII提取序列±50核苷酸<400>15ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc 60gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctatt 119<210>16<211>159<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物FNPTII提取序列±70核苷酸<400>16ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat 60cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg 120gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagg159<210>17<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物G18S提取序列<400>17aatttgcgcg cctgctgcct tcctt 25<210>18<211>125<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物G18S提取序列±50核苷酸<400>18agtcccgtat tgttattttt cgtcactacc tccccgtgcc aggagtgggt aatttgcgcg 60cctgctgcct tccttggatg tggtagccgt ttctcatgct ccctctccgg aatcgaaccc 120tgatt 125<210>19<211>165<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物G18S提取序列±70核苷酸<400>19caattacggg gcctcgaaag agtcccgtat tgttattttt cgtcactacc tccccgtgcc 60aggagtgggt aatttgcgcg cctgctgcct tccttggatg tggtagccgt ttctcatgct 120ccctctccgg aatcgaaccc tgattccccg ttacccgtta caacc 165<210>20<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物H18S提取序列<400>20tctgccctat caactttcga tggta 25<210>21<211>125<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物H18S提取序列±50核苷酸<400>21aactttgtgc tgatcgcacg gcctcgcgcc ggcgacgtat ctttcaaatg tctgccctat 60caactttcga tggtacgtga tatgcctacc atggttgtaa cgggtaacgg ggaatcaggg 120ttcga 125<210>22<211>165<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物H18S提取序列±70核苷酸<400>22tcggattggt gatactggat aactttgtgc tgatcgcacg gcctcgcgcc ggcgacgtat 60ctttcaaatg tctgccctat caactttcga tggtacgtga tatgcctacc atggttgtaa 120cgggtaacgg ggaatcaggg ttcgattccg gagagggagc atgag 16權利要求
1.一種從含有DNA的樣品中提取DNA的方法，該方法包括如下步驟(1).用裂解液處理樣品并離心得到含有DNA的上清；(2).過濾步驟(1)中的上清得到濾液；(3).向上述(2)的濾液中加入萃取劑處理并離心得到上清液；(4).向上述(3)中的上清中加入樹脂用于吸附DNA；(5).洗脫吸附于樹脂上的DNA并離心得到含有DNA的濾液；(6).沉淀濾液中的DNA。
2.權利要求1的方法，其中過濾步驟(2)中所用的濾膜的孔徑為0.22μm。
3.權利要求2的方法，其中過濾是用針管式過濾器進行的。
4.權利要求1的方法，其中步驟(3)中所用的萃取劑是苯酚氯仿異戊醇(混合溶劑)。
5.權利要求4的方法，其中步驟(3)得到的上清液還用氯仿進行萃取一次后再用于步驟(4)。
6.一種檢測食品中的轉基因成分的方法，該方法包括(1).用權利要求1的方法提取所說食品中的DNA；(2).用PCR方法擴增和檢測所述DNA中的至少一種轉基因成分。
7.權利要求6的方法，其中的轉基因成分選自花椰菜花葉病毒35S啟動子序列、根癌農桿菌胭脂堿合成酶終止子序列和新霉素磷酸轉移酶II基因。
8.權利要求7的方法，其中的轉基因成分是花椰菜花葉病毒35S啟動子序列。
9.權利要求7的方法，其中的轉基因成分是根癌農桿菌胭脂堿合成酶終止子序列。
10.權利要求7的方法，其中的轉基因成分是新霉素磷酸轉移酶II基因。
11.權利要求8的方法，其中用具有如序列表中SEQ ID Nos.1-3之一所示序列的引物A和具有序列表中SEQ ID Nos.4-5之一所示序列的引物B組成的引物對擴增花椰菜花葉病毒35S啟動子序列。
12.權利要求9的方法，其中用具有如序列表中SEQ ID Nos.6-7之一所示序列的引物C和具有序列表中SEQ ID Nos.8-10之一所示序列的引物D組成的引物對擴增根癌農桿菌胭脂堿終止子序列。
13.權利要求10的方法，其中用具有如序列表中SEQ ID Nos.11-13之一所示序列的引物E和具有序列表中SEQ ID Nos.14-16之一所示序列的引物F組成的引物對擴增新霉素磷酸轉移酶II基因。
14.一種用于檢測食品樣品中的轉基因成分的試劑盒，該試劑盒包括(1).用于擴增轉基因成分的引物溶液；(2).用于吸附DNA的樹脂。
15.權利要求14的試劑盒，該試劑盒還包括用于純化DNA的微量管柱。
16.權利要求15的試劑盒，該試劑盒該包括用于對樣品進行處理的樣品裂解緩沖液。
17.權利要求16的試劑盒，該試劑盒還包括轉基因成分的陽性對照。
18.權利要求17的試劑盒，其中還包括蛋白酶K。
19.權利要求18的試劑盒，其中還包括PCR緩沖液。
20.權利要求16的試劑盒，其中的裂解緩沖液包括緩沖液A和B，其中緩沖液A的組成為10mM Tris HCl pH8，150mM NaCl，2mM EDTA，1％SDS；緩沖液B為5M鹽酸胍。
21.權利要求14的試劑盒，其中用于擴增轉基因成分的引物的序列如序列表中SEQ ID No.1-22所示。
22.一種DNA序列，它包括序列表中SEQ ID Nos.1-22之一所示的序列。
全文摘要
本發明涉及一種DNA提取方法以及該DNA提取方法在檢測食品中的轉基因成分中的應用。現有技術中的DNA提取方法所得到DNA質量不高，含有抑制PCR反應的物質。本方法的綜合使用了樹脂吸附和蛋白變性萃取以及過濾步驟進行DNA的提取，使得到的DNA可以用于PCR方法檢測食品中的轉基因成分。本發明的DNA提取方法包括以下步驟(1)用裂解液處理樣品并離心得到含有DNA的上清；(2)過濾步驟(1)中的上清得到濾液；(3)向上述(2)的濾液中加入萃取劑處理并離心得到上清液；(4)向上述(3)中的上清中加入樹脂用于吸附DNA；(5)洗脫吸附于樹脂上的DNA并離心得到含有DNA的濾液；(6)沉淀濾液中的DNA。
文檔編號C07H21/04GK1420124SQ0114250
公開日2003年5月28日 申請日期2001年11月21日 優先權日2001年11月21日
發明者于常海, 劉樂庭, 高龍生 申請人:香港基因晶片開發有限公司