專利名稱：一種溶菌酶蛋白生產工藝及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體而言，本發明涉及一種用人LYC7核苷酸生產人溶菌酶蛋白的方法。本發明還涉及用上述工藝生產人溶菌酶所需的載體、重組質粒、宿主細胞、獲得的溶菌酶蛋白產物及該生產方法的應用。
背景技術：
隨著生物技術的發展，獲得蛋白的方法越來越多，經典的蛋白質分離純化過程通常包括以下步驟(1)破碎生物組織，用適當的緩沖液將蛋白質抽提出來；(2)用離心法將細胞的亞細胞顆粒(如細胞核、線粒體、微粒體或核糖體等及細胞碎片去除；(3)應用鹽析法或有機溶劑法將有關蛋白質組分沉淀下來；(4)進一步應用層析法或電泳使各種蛋白質分開；(5)如果用可能的話，將蛋白質結晶或制成凍干粉。用該方法獲得人源蛋白需考慮以下問題第一，人組織來源少，而目的蛋白含量高、活性高可溶性穩定性好的組織來源就更少了；第二，每個分離純化的步驟都會損失一定量的蛋白及蛋白活性，但是分離步驟太少又不能達到一定的純度；第三，每個分離純化的步驟中所用的試劑及相關參數對不同的蛋白的適用范圍都是不同的；第四，不同蛋白的精確定性定量通常需要特定的方法。
隨著生物化學的發展，肽的人工合成已成為可能，然而這種方法只適合于合成最多含有幾百個氨基酸殘基的小蛋白，況且化學儀器中合成的蛋白是否與天然存在的蛋白具有一致的構象與功能還有待于進一步研究。
目前，運用基因工程技術也可以在大腸桿菌、酵母、昆蟲和哺乳動物等多種表達體系中高效表達，但是這種生產蛋白的方法同樣涉及到分離純化的問題。
溶菌酶是分解粘多糖的多肽類免疫抗菌分子。它具有耐熱、耐酸的理化特性，可溶于水、乙醇、油脂類溶劑，通過裂解細胞壁而達到裂解革蘭氏陽性細菌的效果。對溶菌酶殺菌能力研究表明極微量的溶菌酶即可殺滅溶壁微球菌、藤黃球菌、巨大芽孢桿菌、棒狀桿菌、乳酸桿菌、細球菌、八迭球菌、葡萄球菌等自然界常見細菌。目前市場上的溶菌酶都是來源于其他種屬動物機體，對人體而言是異體蛋白，有很強的抗原性，副作用大。
本發明的人溶菌酶技術解決了異源性溶菌酶用于人體內的抗原性問題，更重要的是，人體中的溶菌酶活性最高，本發明提供的蛋白生產工藝與傳統工藝相比，分離純化步驟簡單易行，能得到較高的蛋白投入產出比，為人溶菌酶蛋白的工業化生產提供了一個高效的生產工藝。
本發明的另一個目的是提供一種用上述核苷酸序列生產人溶菌酶蛋白的方法。
本發明的再一個目的是提供一種重組載體，該載體含有人LYC7核酸序列并可以通過轉化宿主細胞，如大腸桿菌、酵母細胞，表達出溶菌酶蛋白。
本發明的再一個目的是提供一種宿主細胞，該含有人LYC7核苷酸序列的重組質粒并可表達具有溶菌酶活性的蛋白。
本發明還提供了這種生產方法以及用該方法生產出的溶菌酶蛋白的應用。
在本發明的一個方面，提供了一種用LYC7核苷酸序列生產具有人溶菌酶活性蛋白的方法，該方法包括(1).將分離純化的編碼具有人溶菌酶蛋白活性多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，形成人溶菌酶蛋白表達載體；(2).將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，篩選出表達人溶菌酶蛋白的重組細胞；(3).高密度培養步驟(b)中的重組細胞；(4).分離出具有人溶菌酶活性的蛋白，并將其制成凍干粉。
在本發明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”溶菌酶蛋白(或多肽)編碼序列是指，該序列或片段已從天然狀態下位于其兩側的序列中分離出來，還指該序列或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
在本發明中，術語“溶菌酶蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有溶菌酶蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的編碼框核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.1中核苷酸序列同源性低至約92％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.2所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.1中核苷酸序列雜交的核苷酸序列，更佳地能在高度嚴緊條件下與SEQ ID NO.1中核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，該術語還包括與SEQ ID NO.1中核苷酸序列的同源性至少92％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與人溶菌酶相同功能的蛋白的、SEQ IDNO.1序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
獲得上述溶菌酶蛋白(或多肽)編碼序列，可以通過人工化學合成、從現存的DNA庫擴增、從含有該序列的細胞、組織、器官中分離純化得到。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發明中，術語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞等。
在本發明中，人LYC7的表達載體是如此獲得的首先，根據SEQ IDNO 1所述核苷酸序列及表達蛋白所使用的載體pPIC9序列，合成如SEQID NO 3所述核苷酸序列；將合成后的序列與pUCml9 T載體(上海SHANGON生物工程公司)連接形成Lyc7-pUCml9重組質粒。分別用限制性內切酶Xho I和EcoR I酶切Lyc7-pUCml9質粒和pPIC9質粒并分別進行膠回收。隨后用T4 DNA連接酶連接經過處理的目的片段和pPIC9質粒。最后將連接產物轉化大腸桿菌菌株DH5α，涂布LB-Amp平板，酶切鑒定轉化子，抽提質粒，測序驗證序列的正確性。
本發明中，表達人溶菌酶的甲醇酵母菌株是按如下方法獲得的抽提37℃培養18小時的Lyc7-pPIC9質粒，然后，用3-6ul限制性內切酶SacI切割100-200ug抽提的Lyc7-pPIC9質粒3-6小時，完全酶切后用與酶切體積相等的氯仿/異戊醇溶液(兩者體積之比為24∶1)純化酶切產物，之后用100％乙醇沉淀酶切的質粒，用10-30ul去離子水溶解沉淀并通過核酸電泳測定質粒濃度。制備酵母GS115菌株的感受態。取經限制性內切酶SacI切割后回收并定量的Lyc7-pPIC9質粒5～20ug(溶于5-10ul去離子水中)，加入80ul酵母GS115感受態細胞，轉至電轉化杯，電擊轉化。轉化參數為；電壓1500伏，電阻200歐姆，電容25微法。電擊后迅速加入800ul的1M山梨糖醇。取電擊液200-600ul涂MD(極限無水葡萄糖培養基)板，30℃培養至克隆長出。用50ml酵母培養基BMMY培養長出的克隆，30℃，取培養上清走SDS-PAGE電泳，篩選表達目的蛋白的克隆。
本發明中“MD培養基”按如下方法配制稱15g瓊脂粉溶于800ml水中，115℃滅菌20分鐘。待溶液涼至60℃，加入下列成份100ml 10×YNB(酵母基本氮)，2ml 500×B(生物素)，100ml 10×D(無水葡萄糖).每20ml倒一塊板。各成份的配制如下10×YNB稱34g YNB，100g(NH4)2SO4用水配成1升溶液，用0.22微米的膜過濾滅菌。500×B稱20mg生物素溶于100ml水中，用0.22微米的膜過濾滅菌。10×D溶解200g無水葡萄糖于1000ml水中，用0.22微的膜過濾滅菌。
本發明中“BMMY培養基”按如下方法配制溶解10g酵母提取物，20g peptone，于700ml水中115℃滅菌20分鐘，冷至室溫，加入100ml 1M磷酸緩沖液pH6.0，100ml 10×YNB，2ml 500×B，100ml 10×M(甲醇)。各成份的配制如下1M pH6.0磷酸緩沖液混合132ml 1M K2HPO4和868ml1M，KH2PO4，用KOH調pH＝6，121℃滅菌20分鐘。10×M量取5ml甲醇溶于95ml水中，用0.22微米的膜過濾滅菌。
本發明中“BMGY培養基”按如下方法配制溶解10g酵母提取物，20g peptone，于700ml水中115℃滅菌20分鐘，冷至室溫，加入100ml 1M磷酸緩沖液pH6.0，100ml 10×YNB，2ml 500×B，100ml 10×GY(甘油)。各成份的配制如下1M pH6.0磷酸緩沖液混合132ml 1M K2HPO4和868ml 1MKH2PO4，用KOH調pH＝6，121℃滅菌20分鐘。10×GY量取100ml甘油溶于900ml水中，121℃滅菌20分鐘。
本發明中“酵母GS115菌株感受態的制備”包括如下過程，將酵母GS115單克隆菌株接種于1ml YPD培養基，放于搖床上30℃，250轉/分鐘培養20-30小時。取100ul培養的上述細胞轉接于100ml YPD培養基中，在搖床上30℃，250轉/分鐘培養12-18小時，OD600＝1.3-1.5.將OD600＝1.3-1.5的細胞培養液平均分至兩個50ml離心管，在4℃下，5000轉/分鐘，離心8分鐘。棄上清，加40ml4℃無菌去離子水溶解沉淀，之后在4℃下，5000轉/分鐘，離心8分鐘。重復上一步操作一次。棄上清，一管加1M山梨糖醇2ml，另一管加3ml，震蕩，將兩管合并為一管，離心，4℃下，5000轉/分鐘，離心8分鐘。棄上清，加1M山梨糖醇200ul懸浮細胞一旦得到了含有目的蛋白編碼序列的人LYC7克隆，就可以進行高密度培養。該過程包括接種、上罐、發酵、飼喂甘油、飼喂甲醇等過程。
本發明中YPD按如下方法配置(1升)1％yeast extract(酵母提取物)；2％peptone(蛋白胨)；2％dextrose(無水葡萄糖)。稱10g yeast extract，20gpeptone，20g dextrose，溶于1000ml水中，115℃滅菌20分鐘。
本發明中的“接種”包括一級接種和二級接種。“一級接種”是指將篩選到的高表達酵母菌株接種于YPD培養基，30℃，250轉/分搖床培養36小時。本發明中的“二級接種”即將培養36小時的酵母菌轉至BMGY培養基(初始發酵體積的5～10％)，30℃，250轉/分培養至OD600＝2～6，離心，棄上清，用25～50％培養體積的水重新懸浮細胞。
本發明中的“上罐發酵”即將配制好的基本鹽培養基(50％發酵罐體積)倒入罐中，通熱蒸氣121℃滅菌20分鐘，冷至29℃，用氨水調PH至5-6，加入PTM 4-5ml/L基本鹽培養基。倒入上述的懸浮細胞，在29℃、400轉/分、0.2-0.4氧氣體積/升(起始發酵液體積)分鐘條件下培養。
本發明中的“飼喂甘油”是指在上述培養24小時后，以18-20ml/小時/升(起始發酵液體積)的速度泵入50％甘油，時間是4-6小時。攪拌速度提高到600轉/分。須注意檢測發酵液中的溶解氧氣濃度，當溶解氧氣濃度低于20％時，停止加入甘油。當溶解氧氣濃度回升到20％以上時，恢復甘油供給。
本發明中的“飼喂甲醇”是指停止泵入甘油后，當溶解氧氣濃度升高到40％時，開始泵入甲醇溶液，速度為2-3ml/升(起始發酵液體積)/小時。當溶解氧氣濃度下降到30％后，提高甲醇速度至5-8ml/升(起始發酵液體積)/小時。當溶解氧氣濃度下降到20％以上時，提高甲醇速度至10ml/升(起始發酵液體積)/小時。維持此甲醇速度至發酵結束。加入甲醇的時間為3-6天。攪拌速度提高到800-1500轉/分，通氣量提高到甲醇的時間為3-6天。攪拌速度提高到800-1500轉/分，通氣量提高到0.6--2氧氣體積/升(起始發酵液體積)分鐘。注意檢測發酵液中的溶解氧氣濃度，當溶解氧氣濃度低于20％時，停止加入甲醇。當溶解氧氣濃度回升到20％以上時，恢復甲醇供給。
本發明中人溶菌酶蛋白分離純化包括以下步驟首先，發酵結束后，4000轉/分離心發酵液，收集上清。然后將發酵上清裝入透析袋中，對去離子水透析去鹽，4℃下24小時。過濾將透析過的發酵上清用0.45微米的膜過濾，然后用NaOH溶液調pH至8.0。隨后進行純化過程。
本發明中的純化過程包括(1)裝柱以每升發酵液10毫升CM-Sephrose FF裝柱，用0.05M Tris-HCl pH8.0平衡柱子5-8個柱床體積；(2)上樣將發酵液以10-100毫升/分鐘的流速上柱；(3)清洗上樣結束后，用0.05M Tris-HCl pH8.0洗脫未結合的蛋白，共洗脫4個柱床體積；(4)洗脫用含有0.15-0.20M NaCl的0.05M Tris-HCl pH8.0溶液洗脫；(5)透析將洗脫液對去離子水4℃透析24小時；(6)凍干將透析過的洗脫液在凍干機上凍干，得到基本純的人溶菌酶的白色干粉。
在本發明中，“基本純的”蛋白質或多肽是指其至少占樣品總物質的至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態下的伴隨其的組分。
在本發明中，術語“溶菌酶蛋白多肽”指具有溶菌酶蛋白活性的SEQID NO.4序列的多肽。該多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO 2中的氨基酸序列相比缺少氨基端18個氨基酸殘基，即1-18位的氨基酸。這18個氨基酸是SEQ ID NO 2所編碼蛋白的分泌肽序列，在蛋白的生物合成過程中被自行切除。該術語還包括具有與人溶菌酶相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括溶菌酶蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導蛋白、以及利用抗溶菌酶多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含溶菌酶多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了溶菌酶多肽的可溶性片段。通常，該片段具有溶菌酶多肽序列的至少約10個連續氨基酸，通常至少約30個連續氨基酸，較佳地至少約50個連續氨基酸，更佳地至少約80個連續氨基酸，最佳地至少約100個連續氨基酸。
發明還提供溶菌酶蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然溶菌酶多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
本發明還包括溶菌酶多肽編碼序列的反義序列。這種反義序列可與SEQ ID NO 1中核苷酸序列結合，從而用于抑制細胞內溶菌酶的表達。
本發明還包括一種探針分子，該分子通常具有溶菌酶多肽編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在LYC7核苷酸分子。
本發明還包括檢測LYC7核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產物，其中PCR擴增引物對應于溶菌酶多肽的編碼序列，可位于該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。
另一方面，本發明還包括對LYC7 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于LYC7基因產物或片段。較佳地，指那些能與LYC7基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合并抑制溶菌酶蛋白的分子，也包括那些并不影響溶菌酶蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的LYC7基因產物結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的LYC7基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達溶菌酶或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodiesand T Cell Hvbridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發明的抗體包括能阻斷溶菌酶功能的抗體以及不影響溶菌酶功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用LYC7基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與LYC7基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
本發明的溶菌酶生產工藝還可用于生產溶菌酶家族的其他成員。
本發明的人溶菌酶蛋白屬于溶菌酶家族一員。溶菌酶是分解粘多糖的多肽類免疫抗菌分子。它具有耐熱、耐酸的理化特性，可溶于水、乙醇、油脂類溶劑，通過裂解細胞壁而達到裂解革蘭氏陽性細菌的效果。對溶菌酶殺菌能力研究表明極微量的溶菌酶即可殺滅溶壁微球菌、藤黃球菌、巨大芽孢桿菌、棒狀桿菌、乳酸桿菌、細球菌、八迭球菌、葡萄球菌等自然界常見細菌。
人溶菌酶技術可用于眼藥水、隱型眼鏡沖洗液、鼻腔沖洗液、除臭漱口液、痔瘡護理劑、直腸灌洗劑、胃腸道術后康復劑、腫瘤術后輔助治療劑、抗艾滋病輔助治療劑、沐浴液、護膚化樁品、仿人乳、流質食品添加劑、食品保鮮劑、各種保健食品添加劑、胃藥、餐巾紙和防菌濕紙巾、牙膏等二十多種產品的改良與升級換代。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。
如本發明所述方法高密度發酵生產人溶菌酶，其中，二級接種時將初始發酵體積的10％的酵母菌轉至BMGY培養基，30□，250轉/分培養至OD600＝6，離心，棄上清，用30％培養體積的水重新懸浮細胞；上罐時，將溶液酸度調至PH＝6后保持不變；加入甘油時，以18ml/小時/升(起始發酵液體積)的速度泵入；泵入甲醇溶液，速度為2.5ml/升(起始發酵液體積)/小時。
在人溶菌酶純化過程中，發酵液上樣速度為10毫升/分鐘。隨后按照本發明所述方法分離純化，得到溶菌酶蛋白。
實施例2實施例1所得到的人源性的溶菌酶蛋白具有基因產品的一般特點，即純度高、成本低等。同時由于該蛋白具有源自人的天然氨基酸序列，因此，與預計在施用于人時將具有很高的活性和/或很低的副作用(例如在人體內的免疫原性更低或沒有)。更重要的是，該產品具有抑制癌細胞粘附作用，可用于癌癥病人的腫瘤術后體腔清洗液以減少腫瘤細胞轉移的機會。
實施例3溶菌酶能更好的幫助眼球抵抗外界的感染。溶菌酶大量的存在于人體自然分泌的淚液中，是使眼淚起作用的重要物質。
實施例1所得到的人源性的溶菌酶蛋白具有源自人的天然氨基酸序列，因此，與預計在施用于人時將具有很高的活性和/或很低的副作用(例如在人體內的免疫原性更低或沒有)。將實施例1所得到的人源性的溶菌酶蛋白加入眼保健液和各類眼藥中，無疑將減輕大量眼病患者及視疲勞患者的痛苦。這不僅能為廣大眼病患者解除痛苦，還將帶來巨大的經濟效益。
實施例4將實施例1中的人溶菌酶蛋白產物用來免疫動物以產生抗體，具體如下。重組分子用層析法進行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應活性用它在體外沉淀LYC7基因翻譯產物的能力加以評估。
本發明所涉及的序列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度453bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)序列描述SEQ ID NO.1ATG AAG GCT TTG ATT GTC TTG GGT CTC GTT TTG CTC TCC GTC ACT GTT CAG GGT AAG GTCTTC GAG AGA TGT GAG TTG GCT AGA ACC TTG AAG AGA CTT GGT ATG GAC GGT TAC AGA GGTATT TCC TTG GCT AAT TGG ATG TGC TTG GCT AAG TGG GAG TCT GGC TAC AAT ACC AGA GCTACT AAC TAC AAC GCT GGT GAC AGA TCC ACT GAC TAC GGT ATT TTC CAG ATC AAT TCC CGTTAC TGG TGC AAC GAC GGT AAG ACC CCA GGC GCT GTC AAT GCT TGT CAC TTG TCC TGT TCCGCT TTG CTG CAA GAC AAT ATC GCT GAC GCC GTC GCC TGT GCC AAG AGA GTT GTT AGA GACCCA CAA GGT ATT AGA GCT TGG GTC GCT TGG AGA AAT AGA TGT CAA AAT AGA GAC GTT AGACAA TAC GTC CAA GGT TGC GGT GTC TAG TAA TGA(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度148個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(iii)序列描述SEQ ID NO.2MKALIVLGLVLLSVTVQGKVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRA60TNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRD120PQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCGV148(3)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長度435堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID N0.3TCT CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT AAG GTC TTC GAG AGA TGT GAGTTG GCT AGA ACC TTG AAG AGA CTT GGT ATG GAC GGT TAC AGA GGT ATTTCC TTG GCT AAT TGG ATG TGC TTG GCT AAG TGG GAG TCT GGC TAC AATACC AGA GCT ACT AAC TAC AAC GCT GGT GAC AGA TCC ACT GAC TAC GGTATT TTC CAG ATC AAT TCC CGT TAC TGG TGC AAC GAC GGT AAG ACC CCAGGC GCT GTC AAT GCT TGT CAC TTG TCC TGT TCC GCT TTG CTG CAA GACAAT ATC GCT GAC GCC GTC GCC TGT GCC AAG AGA GTT GTT AGA GAC CCACAA GGT ATT AGA GCT TGG GTC GCT TGG AGA AAT AGA TGT CAA AAT AGAGAC GTT AGA CAA TAC GTC CAA GGT TGC GGT GTC TAG TAA TGA GAA TTCCCT(4)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長度130個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(iii)序列描述SEQ ID NO.4KVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRSTDYGIFQIN60SRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRD120VRQYVQGCGV130
權利要求
1.一種產生具有溶菌酶蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有人LYC7核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，形成人溶菌酶蛋白表達載體；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，篩選出表達人溶菌酶蛋白的重組細胞；(c)高密度培養步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有人溶菌酶活性的蛋白，并將其制成凍干粉。
2.如權利要求1所述方法，其特征在于，它所使用的核苷酸序列與SEQID NO.3中核苷酸序列有至少92％的同源性。
3.如權利要求1所述方法，其特征在于，它能生產出一種分離純化的蛋白多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4氨基酸序列、其活性片段或其活性衍生物。
4.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括；編碼具有人溶菌酶蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列是SEQ ID NO.1中核苷酸序列，或者與SEQ ID NO.1中核苷酸序列有至少92％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.1中核苷酸序列雜交。
5.如權利要求4所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權利要求4所述的DNA。
7.一種用權利要求6所述載體轉化的宿主細胞。
8.如權利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，該細胞是真核細胞。
9.一種能與權利要求3所述的溶菌酶蛋白產物特異性結合的抗體。
10.一種探針分子，其特征在于，它含有權利要求3所述的DNA分子中約8-100個連續核苷酸。
全文摘要
本發明涉及一種人溶菌酶蛋白生產工藝。目前市場上的溶菌酶蛋白都來源于其他種屬動物機體,對人體而言是異種蛋白,有很強的抗原性,副作用大。本發明的生產的溶菌酶蛋白具有人源的天然氨基酸序列,解決了異源性溶菌酶用于人體內的抗原性問題。更重要的是,人體中的溶菌酶活性最高,本發明提供的蛋白生產工藝與傳統工藝相比,分離純化步驟簡單易行,能得到較高的蛋白投入產出比,為人溶菌酶蛋白的工業化生產提供了一個高效的生產工藝。本發明還涉及上述方法及其產物的應用。
文檔編號C07K16/40GK1366044SQ0113237
公開日2002年8月28日 申請日期2001年11月30日 優先權日2001年11月30日
發明者余龍, 郭澤坤, 唐麗莎, 蔣道軍, 張亞州 申請人:復旦大學