從大腸桿菌中分離純化重組硫氧還蛋白融合蛋白的方法及其應(yīng)用的制作方法

專利名稱：從大腸桿菌中分離純化重組硫氧還蛋白融合蛋白的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從大腸桿菌中分離純化重組硫氧還蛋白融合蛋白的方法。
本發(fā)明還涉及上述方法的具體應(yīng)用，包括重組人干細(xì)胞因子的制備、重組抑肽酶的制備、重組胰島素樣生長(zhǎng)因子的制備以及重組瘦素的制備。
現(xiàn)有技術(shù)中，從大腸桿菌中分離純化重組硫氧還蛋白融合蛋白的方法有多種一種是常規(guī)純化方法破碎大腸桿菌后，離心取上清，用離子交換方法從上清中純化重組硫氧還蛋白融合蛋白。由于上清中還含有許多雜蛋白、核酸和多糖，核酸和多糖這些多聚陰離子物質(zhì)增高了溶液的粘稠度，低離子強(qiáng)度(目的蛋白吸附陰離子柱常使用的條件)時(shí)這些多聚陰離子物質(zhì)更容易吸附到陰離子柱上從而影響目的蛋白的吸附，而且多聚陰離子物質(zhì)吸附到陰離子柱后，陰離子柱的再生非常困難。因此初始純化步驟用離子交換方法并不非?？扇?。
另一種是滲透休克法用含蔗糖和EDTA的高滲溶液處理大腸桿菌細(xì)胞一段時(shí)間，然后將大腸桿菌懸浮在不含蔗糖的低滲溶液中，硫氧還蛋白融合蛋白釋放到低滲溶液中，然后用常規(guī)方法純化。硫氧還蛋白定位在大腸桿菌中稱為Bayer’s patches的區(qū)域，在這些區(qū)域，細(xì)胞壁上有空隙，而細(xì)胞膜和細(xì)胞壁在這些區(qū)域直接接觸，短暫的滲透休克使得硫氧還蛋白被釋放出去。此種方法的得率不高，而且硫氧還蛋白融合了外源蛋白后，其定位很可能發(fā)生改變，這種方法就不能使用。
第三種方法是熱處理法將大腸桿菌破碎液在80℃溫育一段時(shí)間使大多數(shù)雜蛋白變性，離心去除沉淀后用常規(guī)方法純化硫氧還蛋白融合蛋白。此種方法利用了硫氧還蛋白的熱穩(wěn)定性，同時(shí)要求外源蛋白也同樣是熱穩(wěn)定的，因此對(duì)熱不穩(wěn)定蛋白根本不能用此方法。
以上這些方法在專利W094/02502中作了詳盡描述。另外，在專利US5760189中描述了另一種方法只用金屬鏊和離子如EDTA、EGTA處理大腸桿菌，釋放硫氧還蛋白融合蛋白，然后用二價(jià)金屬離子和乙醇沉淀雜質(zhì)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供從大腸桿菌中分離純化重組硫氧還蛋白融合蛋白方法的應(yīng)用，提供利用本發(fā)明方法制備重組外源蛋白的方法。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，一種從大腸桿菌中分離硫氧還蛋白融合蛋白的方法，包括在適當(dāng)pH值條件下破碎含有重組硫氧還蛋白融合蛋白的大腸桿菌細(xì)胞，離心得到沉淀；以及用含適當(dāng)濃度的尿素溶解液溶解沉淀，離心獲得上清液，所述重組硫氧還蛋白融合蛋白存在于上清液中。本發(fā)明方法中，破碎大腸桿菌細(xì)胞的的破碎液pH條件為酸性條件，優(yōu)選為pH值4.5～6.5，最優(yōu)選為pH值5.6。溶解沉淀的溶解液中尿素濃度優(yōu)選為1.0～4.0M，更優(yōu)選尿素濃度為4.0M。
本發(fā)明進(jìn)一步包含從獲得的上清液中純化重組硫氧還蛋白融合蛋白的方法，可以將獲得的含有重組硫氧還蛋白融合蛋白的上清液用透析、超濾等方法去除尿素，再離心去除沉淀后，采用本領(lǐng)域的一些常規(guī)方法從上清液中分離純化獲得硫氧還蛋白融合蛋白。也可以先從上清液中分離純化硫氧還蛋白，再以透析或超濾等方法去除尿素。
用于本發(fā)明方法中與硫氧還蛋白融合的外源蛋白包括但不限于人干細(xì)胞因子、抑肽酶、胰島素樣生長(zhǎng)因子或瘦素。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種制備重組外源蛋白的方法，，包括將表達(dá)外源蛋白基因可操作地連接到含有硫氧還蛋白基因的表達(dá)載體上，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒；將所述表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌宿主，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下培養(yǎng)所述大腸桿菌宿主；在適當(dāng)?shù)膒H值條件下破碎大腸桿菌宿主細(xì)胞，離心得到沉淀；以及用含適當(dāng)濃度的尿素溶解液溶解沉淀，離心獲得上清液，含有所述重組外源蛋白的硫氧還蛋白融合蛋白存在于上清液中。
可以采用本領(lǐng)域的一些常規(guī)方法進(jìn)一步分離純化獲得的硫氧還蛋白融合蛋白，再將該硫氧還蛋白融合蛋白進(jìn)行切割等步驟分離獲得重組外源蛋白。
可以用本發(fā)明方法制備的外源蛋白包括但不限于人干細(xì)胞因子、抑肽酶、胰島素樣生長(zhǎng)因子或瘦素。
本發(fā)明的方法簡(jiǎn)便，硫氧還蛋白融合蛋白的得率較高，分離純化容易，對(duì)融合的外源蛋白的性質(zhì)沒有任何影響，適于對(duì)重組外源蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)。
下面，結(jié)合附圖，通過對(duì)本發(fā)明較佳實(shí)施方式的描述，詳細(xì)說明本發(fā)明。


圖1示出了本發(fā)明表達(dá)載體pTrxFus的圖譜，標(biāo)明了硫氧還蛋白的編碼序列，復(fù)制子ColE1，氨芐青霉素抗性(AmpR)的bla基因，PL啟動(dòng)子，多克隆位點(diǎn)，aspA轉(zhuǎn)錄終止子。
圖2示出實(shí)施例三中的SDS-PAGE電泳圖譜。15％SDS-PAGE泳道1分子量標(biāo)準(zhǔn)14KD、20KD、24KD、29KD、36KD、45KD、66KD；泳道8菌體總蛋白；泳道7、6用Tris pH8.0作破碎液得到的上清和沉淀；泳道5、4用NaAc pH5.6作破碎液得到的上清和沉淀；泳道3、2用NaAc pH5.6作破碎液得到的沉淀溶解于4M尿素后透析得到的上清和沉淀。
圖3示出實(shí)施例三中的陽離子交換層析圖譜。
圖4示出實(shí)施例三中的SDS-PAGE電泳圖譜。15％SDS-PAGE泳道1羥胺切割液脫鹽后的樣品；泳道2過陽離子柱時(shí)的穿透液；泳道3、4、5相對(duì)于圖3中目的峰所對(duì)應(yīng)的各收集管；泳道7分子量標(biāo)準(zhǔn)14KD、20KD、24KD、29KD、36KD、45KD、66KD。
圖5示出實(shí)施例四中的SDS-PAGE電泳圖譜。15％SDS-PAGE泳道1分子量標(biāo)準(zhǔn)14KD、20KD、24KD、29KD、36KD、45KD、66KD；泳道8菌體總蛋白；泳道7、6用Tris pH8.0作破碎液得到的上清和沉淀；泳道5、4用NaAc pH5.6作破碎液得到的上清和沉淀；泳道3、2用NaAc pH5.6作破碎液得到的沉淀溶解于4M尿素后透析得到的上清和沉淀。
圖6示出實(shí)施例四中的陽離子交換層析圖譜。
圖7示出實(shí)施例四中的陽離子交換層析圖譜。15％SDS-PAGE泳道1用NaAc pH5.6作破碎液得到的沉淀溶解于4M尿素溶液中；泳道2羥胺切割液脫鹽后的樣品；泳道3、4、5、6、7相對(duì)于圖5中目的峰所對(duì)應(yīng)的各收集管；泳道8分子量標(biāo)準(zhǔn)14KD、20KD、24KD、29KD、36KD、45KD、66KD。
發(fā)明的
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明方法的建立是基于發(fā)明人這樣的發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中表達(dá)的重組硫氧還蛋白融合蛋白有一些奇特的性質(zhì)1.在pH＝8左右條件下破碎大腸桿菌，重組硫氧還蛋白融合蛋白存在于上清中，將上清的pH調(diào)至6.5以下時(shí)，最佳調(diào)至5.6，許多雜蛋白和硫氧還蛋白融合蛋白一起沉淀下來。
2.這種沉淀是不可逆的，將pH值回調(diào)，沉淀不能完全溶解。
3.沉淀可以溶解在含1-4M尿素，pH為8.0左右的溶解液中。
4.溶解液用透析、超濾等方法去除尿素，離心去除沉淀，重組硫氧還蛋白融合蛋白存在于上清中。
5.這些性質(zhì)只是某些蛋白具有，TrxA/Aprotinin、TrxA/IGF-1、TrxA/Leptin和TrxA/SCF(干細(xì)胞因子)就具有這種性質(zhì)，TrxA/BGTX(α銀環(huán)蛇毒素)就沒有這種性質(zhì)。
進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這種沉淀方法不同于等電點(diǎn)沉淀，等電點(diǎn)沉淀是可逆的，而在此描述的沉淀是不可逆的。另一方面，具有此種性質(zhì)的外源蛋白的等電點(diǎn)在比較寬的范圍內(nèi)波動(dòng)，有堿性蛋白(如Aprotinin、IGF-1)，中性偏酸蛋白(如Leptin)，酸性蛋白(如SCF)，但都在pH為5.6時(shí)獲得最佳沉淀，這很難用等電點(diǎn)沉淀來解釋。
這種沉淀方法也不等同于變性沉淀，雖然在不可逆方面與變性沉淀的性質(zhì)是一樣的，但與變性沉淀不同的是蛋白質(zhì)并沒有變性。體現(xiàn)在沉淀能完全溶解在低濃度的尿素溶液中，透析去除尿素后，許多雜蛋白發(fā)生沉淀，但目的蛋白并沒發(fā)生沉淀，有效去除了許多雜蛋白。
在此我們將這種沉淀方法稱為酸性沉淀。為進(jìn)一步簡(jiǎn)化步驟，在pH為5.6條件下進(jìn)行細(xì)胞破碎，也得到相同結(jié)果，在以下的實(shí)施例中將進(jìn)行具體說明。在實(shí)施例三、四和五中，用羥胺對(duì)重組硫氧還蛋白融合蛋白進(jìn)行切割，結(jié)合其它純化步驟，純化到重組抑肽酶、重組類胰島素樣生長(zhǎng)因子1和重組瘦素。
以下通過實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明，實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，基本上都按照Sambrook等人編著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照產(chǎn)商所建議的條件。實(shí)施例一重組TrxA/BGTX表達(dá)和其酸性沉淀性質(zhì)的鑒定合成的編碼α銀環(huán)蛇毒素(BGTX)的DNA序列(SEQ ID NO.1)用KpnI和SalI酶切后，克隆入載體pTrxFus的KpnI和SalI酶切位點(diǎn)，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pTrxA/BGTX，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌GI698，在30℃用IMC(0.2％caseinhydrolyzate，0.5％glucose，1×M9)培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD660＝0.4，加入終濃度為100ug/ml的色氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，TrxA/BGTX累積到菌體總蛋白的20％以上。用50mM Tris pH8.0懸浮菌體，超聲破碎，離心，取樣作電泳，TrxA/BGTX存在于上清中。用50mM NaAc pH5.0，pH5.6，pH6.0分別懸浮菌體，破碎后取樣電泳，TrxA/BGTX存在于上清中，結(jié)果表明大腸桿菌中表達(dá)的TrxA/BGTX沒有酸性沉淀的性質(zhì)。實(shí)施例二重組TrxA/SCF表達(dá)和純化用SCFP1(SEQ ID NO.2)和SCFP2(SEQ ID NO.3)作為引物，從人外周血淋巴細(xì)胞中用RT-PCR方法擴(kuò)增出編碼人干細(xì)胞因子(SCF)1-165氨基酸的DNA序列(SEQ ID NO.4)，用KpnI和SalI酶切后，克隆入載體pTrxFus的KpnI和SalI酶切位點(diǎn)，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pTrxA/SCF，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌GI698，在30℃用IMC(0.2％casein hydrolyzate，0.5％glucose，1×M9)培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD660＝4，加入終濃度為300ug/ml的色氨酸，將培養(yǎng)溫度升至37℃繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)，TrxA/SCF累積到菌體總蛋白的20％以上。用50mM Tris pH8.0懸浮菌體，超聲破碎，離心，取樣作電泳，TrxA/SCF存在于上清中。
用50mM NaAc pH5.6破碎液以10％濃度懸浮菌體，冰浴超聲破碎，離心取沉淀(SDS-PAGE電泳結(jié)果表明80％以上的TrxA/SCF都在沉淀中)，用50mM NaAc pH5.6洗滌一次，然后用四分之一破碎液體積的4M Urea/20mMTris pH8.0溶解，離心取上清(SDS-PAGE電泳結(jié)果表明90％以上的TrxA/SCF都在上清中)，將上清對(duì)20mM Tris pH8.0透析去除尿素，離心取上清(SDS-PAGE電泳結(jié)果表明95％以上的TrxA/SCF都在上清中)，將上清過DEAE離子柱，DEAE柱預(yù)先用緩沖液(20mM Tris pH7.2)平衡好，然后以緩沖液為流動(dòng)相加0-0.5N NaCl梯度進(jìn)行梯度洗脫，分部收集，TrxA/SCF大約在0.2NNaCl洗脫峰處。
在此例中利用TrxA/SCF的酸性沉淀性質(zhì)，結(jié)合常規(guī)純化方法，純化到了TrxA/SCF。實(shí)施例三重組抑肽酶(Aprotinin)的制備合成的編碼牛抑肽酶的DNA序列(SEQ ID NO.6)用KpnI和SalI酶切后，克隆入載體pTrxFus的KpnI和SalI酶切位點(diǎn)，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pTrxA/Aprotinin，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌GI698，在30℃用IMC(0.2％caseinhydrolyzate，0.5％glucose，1×M9)培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD660＝8，加入終濃度為300ug/ml的色氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)，TrxA/Aprotinin累積到菌體總蛋白的10％以上。用50mM Tris pH8.0懸浮菌體，超聲破碎，離心，取樣作電泳，TrxA/Aprotinin存在于上清中(圖2)。
用50mM NaAc pH5.6破碎液以10％濃度懸浮菌體，冰浴超聲破碎，離心取沉淀(SDS-PAGE電泳結(jié)果表明90％以上的TrxA/Aprotinin都在沉淀中，圖2)，用50mM NaAc pH5.6洗滌一次，然后用四分之一破碎液體積的4M Urea/20mM Tris pH8.0溶解，離心取上清(SDS-PAGE電泳結(jié)果表明90％以上的TrxA/Aprotinin都在上清中)，然后如實(shí)施例二中進(jìn)行常規(guī)分離純化，但為得到重組抑肽酶，我們直接進(jìn)行融合蛋白的切割。
將上清與等體積的4M羥胺溶液(pH9.0)混合，于37℃切割16小時(shí)，將pH調(diào)為6.0，離心去除沉淀，將上清用Sephadex G-25脫鹽，流動(dòng)相為20mMNaAc pH6.0，然后過SP柱，(SP柱預(yù)先用20mM NaAc pH6.0平衡好，用0-1N NaCl梯度進(jìn)行梯度洗脫(圖3)，部分收集，將含Aprotinin的收集管混合(圖4)，用截留分子量為3,500的膜片進(jìn)行超濾濃縮，濃縮液上樣至Sephadex G-50柱，柱子預(yù)先用平衡液(0.1M NaHCO3)平衡好，待樣品完全進(jìn)入膠中后，用平衡液從此凝膠過濾介質(zhì)中洗脫出蛋白質(zhì)，回收那些含Aprotinin的收集液，得到重組抑肽酶蛋白。
采用苯甲酰-L-精氨酸-對(duì)硝基苯胺為底物測(cè)定抑肽酶的胰蛋白酶酶活力抑制活性。將重組抑肽酶蛋白和胰蛋白酶混合，室溫溫育15分鐘，然后加入底物(苯甲酰-L-精氨酸-對(duì)硝基苯胺)，30℃溫育后在405nm測(cè)定吸光度，吸光度值比未加重組抑肽酶蛋白的實(shí)驗(yàn)組降低。結(jié)果表明重組抑肽酶蛋白有抑制胰蛋白酶的活性。
采用發(fā)色底物顯色法測(cè)定抑肽酶的胰蛋白酶酶活力抑制活性。取445ul緩沖液(0.1M NaCl/0.05M Tris-HCl，pH7.8)和40ul胰蛋白酶溶液(20ug/ml)，混勻，室溫平衡5分鐘后加入15ul底物S2302(HO-pro-phe-Arg-pNA·2HCl，1mg/ml)，A405測(cè)定2分鐘，由儀器軟件計(jì)算出空白反應(yīng)速率值blank。取相應(yīng)體積的緩沖液和適量體積的待測(cè)樣品以及40ul胰蛋白酶溶液混合(總反應(yīng)體積為485ul)，室溫平衡5分鐘后加入15ul底物S2302，A405測(cè)定2分鐘，由儀器軟件計(jì)算出樣品抑制反應(yīng)速率值S。用公式抑制率＝(blank-S/blank)×100％計(jì)算抑制率。結(jié)果如表1，從結(jié)果可知，制備的重組抑肽酶蛋白有很強(qiáng)的胰蛋白酶酶活力抑制活性。
表1 重組抑肽酶蛋白對(duì)胰蛋白酶的酶活力抑制樣品 抑制率對(duì)照0％抑肽酶(500ng) 100％抑肽酶(100ng) 92％抑肽酶(50ng) 50％抑肽酶(10ng) 20％實(shí)施例四重組人類胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)的制備合成的編碼人類胰島素樣生長(zhǎng)因子1的DNA序列(SEQ ID NO.8)用KpnI和SalI酶切后，克隆入載體pTrxFus的KpnI和SalI酶切位點(diǎn)，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pTrxA/IGF-1，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌GI698，在30℃用IMC(0.2％caseinhydrolyzate，0.5％glucose，1×M9)培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD660＝8左右，加入終濃度為300ug/ml的色氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)，TrxA/IGF-1累積到菌體總蛋白的20％以上。用50mM Tris pH8.0懸浮菌體，超聲破碎，離心，取樣作電泳，TrxA/IGF-1存在于上清中(圖5)。
用50mM NaAc pH5.6破碎液以10％濃度懸浮菌體，冰浴超聲破碎，離心取沉淀(SDS-PAGE電泳結(jié)果表明90％以上的TrxA/IGF-1都在沉淀中，圖5)，用50mM NaAc pH5.6洗滌一次，然后用四分之一破碎液體積的4M Urea/20mM Tris pH8.0溶解，離心取上清(SDS-PAGE電泳結(jié)果表明90％以上的TrxA/IGF-1都在上清中)，然后如實(shí)施例二中進(jìn)行常規(guī)分離純化，但為得到重組類胰島素樣生長(zhǎng)因子1，直接進(jìn)行融合蛋白的切割。
將上清與等體積的4M羥胺溶液(pH9.0)混合，于37℃切割16小時(shí)，離心去除沉淀，將上清用Sephadex G-25脫鹽，流動(dòng)相為20mM Tris pH8.0，然后過SP柱，(SP柱預(yù)先用20mM Tris pH8.0平衡好，用0-0.5N NaCl梯度進(jìn)行梯度洗脫(圖6)，部分收集，將含IGF-1的收集管混合(圖7)，用截留分子量為3,500的膜片進(jìn)行超濾濃縮，濃縮液上樣至Sephacryl S-200柱，柱子預(yù)先用平衡液(0.1M NaHCO3)平衡好，待樣品完全進(jìn)入膠中后，用平衡液從此凝膠過濾介質(zhì)中洗脫出蛋白質(zhì)，回收那些含IGF-1的收集液，得到重組類胰島素樣生長(zhǎng)因子1蛋白。
重組類胰島素樣生長(zhǎng)因子1蛋白用GOD-POD法測(cè)定其生物學(xué)活性(Okajima T etal，endocrinology，1992，130(4)2201)。HepG2細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消化分散，重懸于低糖無血清培養(yǎng)基，按2×104細(xì)胞每孔接種，同時(shí)加入一定濃度的重組類胰島素樣生長(zhǎng)因子1蛋白。37℃培養(yǎng)22小時(shí)后，加入50ul生色液(400U/L葡萄糖氧化酶、680U/L過氧化酶，360mg/L4-氨基安替比林，490mg/L N-乙基-N-硫丙基甲苯藍(lán)，溶于pH6.0的PBS中)，反應(yīng)30分鐘，然后在595nm下用酶聯(lián)儀測(cè)定光吸收值。測(cè)定結(jié)果如表2，可見用此種方法得到的重組類胰島素樣生長(zhǎng)因子1蛋白使HepG2細(xì)胞糖代謝能力增強(qiáng)。
表2 重組類胰島素樣生長(zhǎng)因子1蛋白對(duì)HepG2細(xì)胞的降糖效應(yīng)處理 培養(yǎng)基中葡萄糖(％對(duì)照)對(duì)照 100rhIGF-1(0.01ng/ml) 105rhIGF-1(1ng/ml) 98rhIGF-1(3ng/ml) 95rhIGF-1(10ng/ml) 90rhIGF-1(50nR/ml) 74rhIGF-1(100ng/ml)76實(shí)施例五重組人瘦素(Leptin)的制備用LepP1(SEQ ID NO.10)和LepP2(SEQ ID NO.11)作為引物，從人脂肪細(xì)胞中用RT-PCR方法擴(kuò)增出編碼人瘦素的DNA序列(SEQ ID NO.12)，用KpnI和SalI酶切后，克隆入載體pTrxFus的KpnI和SalI酶切位點(diǎn)，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pTrxA/Leptin，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌GI698，在30℃用IMC(0.2％caseinhydrolyzate，0.5％glucose，1×M9)培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD660＝8，加入終濃度為300ug/ml的色氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)，TrxA/IGF-1累積到菌體總蛋白的20％以上。用50mM Tris pH8.0懸浮菌體，超聲破碎，離心，取樣作電泳，TrxA/Leptin存在于上清中。
用50mM NaAc pH5.6破碎液以10％濃度懸浮菌體，冰浴超聲破碎，離心取沉淀(SDS-PAGE電泳結(jié)果表明90％以上的TrxA/Leptin都在沉淀中)，用50mM NaAc pH5.6洗滌一次，然后用四分之一破碎液體積的4M Urea/20mM Tris pH8.0溶解，離心取上清(SDS-PAGE電泳結(jié)果表明90％以上的TrxA/Leptin都在上清中)，然后如實(shí)施例二中進(jìn)行常規(guī)分離純化，但為得到重組瘦素，直接進(jìn)行融合蛋白的切割。
將上清與等體積的4M羥胺溶液(pH8.5)混合，于30℃切割24小時(shí)，離心去除沉淀，將上清用Sephadex G-25脫鹽，流動(dòng)相為20mM Tris pH8.0，然后過DEAE柱，(DEAE柱預(yù)先用20mM Tris pH8.0平衡好，用0-0.5N NaCl梯度進(jìn)行梯度洗脫，部分收集，將含Leptin的收集管混合，用截留分子量為10,000的膜片進(jìn)行超濾濃縮，濃縮液上樣至Sephacryl S-200柱，柱子預(yù)先用平衡液(20mM Tris pH8.0/0.1M NaCl)平衡好，待樣品完全進(jìn)入膠中后，用平衡液從此凝膠過濾介質(zhì)中洗脫出蛋白質(zhì)，回收那些含Leptin的收集液，得到重組瘦素蛋白。
以上對(duì)本發(fā)明的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變和變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明的范圍。
SEQUENCE LISTING<110>上海漢殷藥業(yè)有限公司昆明博賽科技有限公司<120>從大腸桿菌中分離純化重組硫氧還蛋白融合蛋白的方法及其應(yīng)用<130>PI011239<160>13<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>248<212>DNA<213>人工序列<400>1gcggtaccta acggtatcgt ttgccacacg actgctactt ccccgatttc tgcagtaact 60tgcccgcctg gtgaaaacct ctgctaccgt aaaatgtggt gcgacgcatt ctgctcttcc120cgtgggaaag tagtagaact ggggtgtgca gctacctgcc cgtctaagaa accgtacgaa180gaagtaacct gttgctccac cgataagtgc aaccctcatc cgaaacaacg tccaggctaa240gtcgaccg 248<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>引物<222>(1)..(24)<223><400>2gcggtaccta acggtatcgt ttgc24<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><221>引物<222>(1)..(30)<223><400>3cggtcgactt aggctgcaac agggggtaac30<210>4<211>521<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(16)..(510)<223>編碼人干細(xì)胞因子1-165氨基酸<400>4gcggtaccta acggt gaa ggg atc tgc agg aat cgt gtg act aat aat gta 51Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg Val Thr Asn Asn Val1 5 10aaa gac gtc act aaa ttg gtg gca aat ctt cca aaa gac tac atg ata99Lys Asp Val Thr Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro Lys Asp Tyr Met Ile15 20 25acc ctc aaa tat gtc ccc ggg atg gat gtt ttg cca agt cat tgt tgg147Thr Leu Lys Tyr Val Pro Gly Met Asp Val Leu Pro Ser His Cys Trp30 35 40ata agc gag atg gta gta caa ttg tca gac agc ttg act gat ctt ctg195Ile Ser Glu Met Val Val Gln Leu Ser Asp Ser Leu Thr Asp Leu Leu45 50 55 60gac aag ttt tca aat att tct gaa ggc ttg agt aat tat tcc atc ata243Asp Lys Phe Ser Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Ser Ile Ile65 70 75gac aaa ctt gtg aat ata gtc gat gac ctt gtg gag tgc gtc aaa gaa291Asp Lys Leu Val Asn Ile Val Asp Asp Leu Val Glu Cys Val Lys Glu80 85 90aac tca tct aag gat cta aaa aaa tca ttc aag agc cca gaa ccc agg339Asn Ser Ser Lys Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys Ser Pro Glu Pro Arg95 100 105ctc ttt act cct gaa gaa ttc ttt aga att ttt aat aga tcc att gat387Leu Phe Thr Pro Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe Asn Arg Ser Ile Asp110 115 120gcc ttc aag gac ttt gta gtg gca tct gaa act agt gat tgt gtg gtt435Ala Phe Lys Asp Phe Val Val Ala Ser Glu Thr Ser Asp Cys Val Val125 130 135 140tct tca aca tta agt cct gag aaa gat tcc aga gtc agt gtc aca aaa483Ser Ser Thr Leu Ser Pro Glu Lys Asp Ser Arg Val Ser Val Thr Lys145 150 155cca ttt atg tta ccc cct gtt gca gcc taagtcgacc g 521Pro Phe Met Leu Pro Pro Val Ala Ala160 165<210>5<211>165<212>PRT<213>Homo sapiens<400>5Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg Val Thr Asn Asn Val Lys Asp Val Thr15 10 15Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro Lys Asp Tyr Met Ile Thr Leu Lys Tyr20 25 30Val Pro Gly Met Asp Val Leu Pro Ser His Cys Trp Ile Ser Glu Met35 40 45Val Val Gln Leu Ser Asp Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys Phe Ser50 55 60Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu Val65 70 75 80Asn Ile Val Asp Asp Leu Val Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser Lys85 90 95Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys Ser Pro Glu Pro Arg Leu Phe Thr Pro100 105 110Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys Asp115 120 125Phe Val Val Ala Ser Glu Thr Ser Asp Cys Val Val Ser Ser Thr Leu130 135 140Ser Pro Glu Lys Asp Ser Arg Val Ser Val Thr Lys Pro Phe Met Leu145 150 155 160Pro Pro Val Ala Ala165<210>6<211>200<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(16)..(189)<223>編碼牛抑肽酶<400>6gcggtaccga acggt aga cct gac ttc tgc ctt gag cct ccg tac act ggt5lArg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly1 5 10cca tgc aaa gca cgt atc atc cgt tac t tc tac aat gct aaa gct ggt99Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly15 20 25ctc tgt cag acc ttc gtt tac ggt ggt tgc aga gct aag cgt aac aac147Leu Cys Gln Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn30 35 40ttc aag tct gct gaa gac tgc atg cgt acc tgt ggc ggt gcc189Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala45 50 55taagtcgacg c 200<210>7<211>58<212>PRT<213>人工序列<400>7Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala15 10 15Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gln Thr20 25 30Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala35 40 45Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala50 55<210>8<211>248<212>DNA<213>人工合成<220><221>CDS<222>(13)..(240)<223>編碼人類胰島素樣生長(zhǎng)因子1<400>8gcggtaccta ac ggt atc gtt tgc cac acg act gct act tcc ccg att tct51Gly Ile Val Cys His Thr Thr Ala Thr Ser Pro Ile Ser1 5 10gca gta act tgc ccg cct ggt gaa aac ctc tgc tac cgt aaa atg tgg 99Ala Val Thr Cys Pro Pro Gly Glu Asn Leu Cys Tyr Arg Lys Met Trp
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1.一種從大腸桿菌中分離重組硫氧還蛋白融合蛋白的方法，包括1)用適當(dāng)pH值的破碎液懸浮含有硫氧還蛋白融合蛋白的大腸桿菌，破碎大腸桿菌，離心獲得沉淀；以及2)用含適當(dāng)濃度尿素的溶解液溶解沉淀，離心獲得上清液；所述上清液中含有所述硫氧還蛋白融合蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述破碎液的pH值為4.5～6.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述破碎液的pH值為5.6。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述溶解液含有1.0～4.0M的尿素。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述溶解液含有4.0M的尿素。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述硫氧還蛋白融合蛋白選自硫氧還蛋白人干細(xì)胞因子融合蛋白、硫氧還蛋白抑肽酶融合蛋白、硫氧還蛋白胰島素樣生長(zhǎng)因子融合蛋白或硫氧還蛋白瘦素融合蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中進(jìn)一步包括3)將所述上清液純化，獲得硫氧還蛋白融合蛋白。
8.一種制備重組外源蛋白的方法，包括a)將表達(dá)所述重組外源蛋白基因可操作地連接到含有硫氧還蛋白基因的表達(dá)載體上，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒；b)將所述表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌宿主，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下培養(yǎng)所述大腸桿菌宿主；c)用適當(dāng)pH值的破碎液懸浮所述大腸桿菌，破碎大腸桿菌，離心獲得沉淀；d)用含適當(dāng)濃度尿素的溶解液溶解沉淀，離心獲得上清液，所述上清液中含有所述重組外源蛋白的硫氧還蛋白融合蛋白；以及e)從所述硫氧還蛋白融合蛋白中分離所述外源蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述破碎液的pH值為4.5～6.5。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述破碎液的pH值為5.6。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述溶解液含有1.0～4.0M的尿素。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述溶解液含有4.0M的尿素。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述外源蛋白選自人干細(xì)胞因子、抑肽酶、胰島素樣生長(zhǎng)因子或瘦素。
全文摘要
本發(fā)明涉及從大腸桿菌中分離純化重組硫氧還蛋白融合蛋白的方法，包括用適當(dāng)pH值的破碎液懸浮含有硫氧還蛋白融合蛋白的大腸桿菌，破碎大腸桿菌，離心獲得沉淀；以及用含適當(dāng)濃度尿素的溶解液溶解沉淀，離心獲得上清液；所述上清液中含有所述硫氧還蛋白融合蛋白。本發(fā)明還涉及利用上述方法制備重組外源蛋白的方法。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)便，硫氧還蛋白融合蛋白的得率較高，分離純化容易，對(duì)融合的外源蛋白的性質(zhì)沒有任何影響，適于對(duì)重組外源蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K14/265GK1417226SQ0113216
公開日2003年5月14日 申請(qǐng)日期2001年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月9日
發(fā)明者趙彬, 徐林, 楊上川 申請(qǐng)人:上海漢殷藥業(yè)有限公司, 昆明博賽科技有限公司