專利名稱：從長春花中提取抗癌活性成份的新工藝的制作方法
技術領域：
本發明屬天然藥物技術領域。具體涉及一種從長春花中提取具有抗癌作用的活性成份長春堿、長春新堿和熊果酸的新工藝。
背景技術：
長春花[Catharanthus roseus(L.)G.Don.]系夾竹桃科多年生草本植物，原產非州東部。我國南方各省廣為栽培，多作行道、花壇、盆景觀賞用，能周年開花，又名日日春、日日新、四季春等。株高20-60cm，莖枝綠色或紅褐色、類柱形、髓空；葉對生，長橢圓形或倒卵形，長3-6cm，寬1.5-2.5cm，先端純園、羽狀葉脈，主脈清晰；聚傘花序腋生或頂生，有花2-3朵，花冠高腳碟狀，5裂，花色紫紅、桃紅、白或白瓣紅心；果為蓇葖果，長園筒形，種子細小、黑色，無種毛，兩端截平上有顆粒狀瘤凸(陳俊愉、程緒珂中國花經、上海文化出版社，1990，P.484；薛聰賢；宿根草花150種，云南科技出版社，1999)1958年Noble，RL，1961年Svoboda，GH先后從長春花中分離到長春堿(Vinblastine，VLB)和長春新堿(Vincristine，VCR)，1967年和1969年中國科學院上海藥物研究所用國產長春花亦提取到此兩種吲哚類生物堿并轉由杭州制藥廠生產(Noble RL et alAnn N.Y.Acad.Sci.1958，76，P.882；Svoboda，GHJ.Am.Pharm.Assoc.Sci.Ed 1958.47.P.834；Svoboda，GHLloydia 1961.24.P.173)。長春堿和長春新堿在腫瘤治療上應用已三十余年，迄今仍是腫瘤臨床上的主要用藥。
六十年代周韻麗研究員在提取長春堿和長春新堿的廢液中曾分離到一個萜類化合物，現經鑒定為熊果酸(Ursolic acid)。熊果酸(Ursolic acid)是近年新發現的抗癌活性成分，它不僅能強烈抑制白血病、纖維肉瘤、乳腺癌、肺癌、皮膚癌、黑色素瘤等腫瘤細胞的生長且能誘導畸胎瘤細胞逆轉為正常細胞，是現代腫瘤藥物篩選的新熱點。(Young，HS et alBiol.Phar.Bull.1994，17(7)P.990；Huang，MT etalCancer Res.1994，54(3)P.701；董鏡、孫燕中國新藥雜志1997，6(2)P.101)熊果酸和長春堿、長春新堿是兩類不同類型的化合物，熊果酸系α-amyrin型三萜酸，后兩者為吲哚類生物堿。熊果酸不溶于水和石油醚，而溶于熱甲醇、熱乙醇，可溶于苯、氯仿。長春堿和長春新堿亦不溶于水而溶于甲醇、氯仿、苯等溶劑。因此，用熱甲醇、熱乙醇、苯等溶劑都可從長春花中提取得熊果酸、長春堿和長春新堿。但長春堿和長春新堿又不同于熊果酸，生物堿在酸性條件下可形成鹽而溶于水，熊果酸則不能。
目前熊果酸提取自車前草(Plantago major L.)或香茶菜[Robdosiaamethystoiles(Benth)Haro](陳德昌，中藥化學對照品工作手冊，中國醫藥科技出版社；虞瑞生植物學報1984，6；675)。車前草和香茶菜均系野生植物，收集不便。迄今發現含熊果酸的車前草僅為一種——大車前。其它普通車前草如車前(P.asiatica L.)、平車前(P.depressaL.)等未見含熊果酸報道。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在于研制從長春花中提取具有抗癌作用的活性成份。
本發明利用長春堿、長春新堿和熊果酸的不同特性從長春花中進行分離。
本發明提供了一種從長春花中提取具有抗癌作用的活性成份的新工藝。
本發明的工藝為(1)將長春花全草干料粉碎物，用少量水拌和后投入預先裝好苯的滲漉桶中，生藥粉與苯的比例為1∶5-10.0，加蓋浸提1-3天后開始滲漉，收集苯滲漉液；在上述苯滲漉液中加入3-10％酒石酸溶液作液—液逆相萃取，使長春堿和長春新堿以酒石酸鹽形式轉入酸水中，而熊果酸仍留于苯液。按下列流程1從酸不溶物(苯液)中提得熊果酸，按下列流程2從酸水液中提得長春堿和長春新堿(圖1、2、3)。
(2)收集長春花葉、曬干、粉碎，倒入提取缸中，加80％甲醇至料面高1-2cm，在提取缸夾套中通入蒸汽，使料液溫度上升至溶液沸騰，沸騰蒸汽經冷凝回流至提取缸。如此回流提取3hr，離心后得萃取液。萃取液經真空減壓濃縮得甲醇提取物，同時回收甲醇。
在甲醇提取物中添加IN H2SO4，使pH至3-4，并不時攪拌，靜置后離心，得酸不溶物和酸溶物。酸溶物按孫文基編著的天然藥物成分提取分離與制備一書(中國醫藥科技出版社，1999)所介紹的方法提取長春堿和長春新堿，并按中華人民共和國藥典二部(2000版P.855-856)作質量檢驗。上述酸不溶物可用5倍量氯仿萃取熊果酸，再經硅膠柱吸附，用環己烷/乙酸乙酯(10-6/1-3)洗脫，洗脫液濃縮后，其濃縮液可在無水乙醇中沉淀得白色熊果酸結晶(圖4)(3)長春花全草或葉或莖或地上部分，除可用苯、甲醇等溶劑萃取外，亦可用熱乙醇提取，乙醇濃度70-95％，由于熊果酸溶于熱乙醇中，故用乙醇萃取應取回流法。為求一草得三藥，提取液中應添加IN H2SO4使pH達3-4。這樣，我們即可從酸溶液中提取得可溶于水的硫酸長春堿和硫酸長春新堿，而從酸不溶物中提得熊果酸(圖5)熊果酸鑒定對從長春花苯或甲醇或乙醇提取液的酸不溶物中分離得的白色結晶，作如下鑒定1.薄層層析將樣品和熊果酸標準品(中國藥品生物品檢定所)分別點樣于薄層硅膠板上，用環己烷/氯仿/乙酸乙酯(20/5/8)層開劑展層，醋酐/硫酸(9/1)顯色，結果兩者顯色斑點處于同一位置，樣品的Rf×100值為32.2，熊果酸標準品為32.8。另將硅膠薄層板點樣后，用氯仿/丙酮(6/4)展層，結果樣品和熊果酸標準品的顯色斑點亦處于同一水平位置，Rf×100值分別為59.2和58.9；再取點樣的硅膠薄層板，用正丁醇/氯仿/乙酸乙酯(20/5/8)展層，顯色后樣品的Rf×100值為80.3，熊果酸標準品亦為80.3，兩者完全一致；可見樣品結晶與標準品為同一物質。(圖6)2.高效液相色譜(HPLC)將樣品(UA-M)作HPLC分析并與標準熊果酸(Sigma公司產，編號U653)作比較，HPLC儀Beckman Gold System，分析柱反相C18柱，流動相甲醇/水(95/5)結果樣品除溶劑峰外(延遲時間2.98分)，只出現一個主峰，其延遲時間為9.02分；標準熊果酸的主峰延遲時間為8.90分，兩者基本一致(圖7、8)。3.紫外光譜將樣品甲醇溶液作紫外光譜掃描(300-190nm)，只出現一個吸收峰，其最大吸收波長為203.3nm，與熊果酸標準品一致(202.5nm)。見圖(9、10)4.紅外光譜將樣品和熊果酸標準品用溴化鉀壓片法在紅外光譜儀上測定，結果兩者在3540cm-1、2952cm-1和1715cm-1出現完全相同的振動吸收峰。見圖(11、12)5.質譜將樣品作質譜分析，分子經電子撞擊呈現和標準熊果酸相似的RDA裂解，兩者在質譜圖上除均出現末裂解的分子離子峰(m/e 456)外，另均有熊果酸裂解碎片質子峰m/e 248，m/e207、m/e 189和m/e133。見圖(13、14)6.核磁共振譜將樣品作氫(1H)核磁共振和碳(13C)核磁共振譜分析，儀器AVANCE 500 Bruke Co.，工作頻率1H-MMR 500 MH2，13C-NMR127MH2。溶劑DMSO，測定溫度300K。對照品標準熊果酸。結果樣品的1H-MMR譜和13C-NM譜與標準熊果酸基本一致，樣品1H-NMR譜中的3.4ppm和2.50ppm豐度較高。前者是樣品中水的質子峰，后者為溶劑DMSO的共振信號。因此樣品NMR譜與標準熊果酸的NMR譜無本質差異。(圖15、16、17、18)小結綜合以上分析可證實從長春花的苯或甲醇或乙醇提取液的酸不溶物中所提得的結晶為熊果酸。
使用本發明的工藝可以從長春花中提取長春堿、長春新堿和熊果酸三個抗癌成份，大大降低生產成本，可規模化工業生產。
具體實施例方式
實施例一將長春花全草干料粉碎物，加0.3％水拌和后投入預先裝好苯的滲漉桶中，生藥粉與苯的比例為1∶8，加蓋浸提3天后開始滲漉，收集苯滲漉液；在上述苯滲漉液中加入6％酒石酸溶液作液—液逆相萃取，使長春堿和長春新堿以酒石酸鹽形式轉入酸水中，而熊果酸仍留于苯液。
熊果酸提取將上述苯液濃縮后加氯仿萃取，濾過，再經減壓濃縮后得氯仿濃縮物。然后，分批加樣于硅膠層析柱上，用正己烷/乙酸乙酯(1/1)洗脫，洗脫液經減壓濃縮至干，加氯仿使溶，用活性炭脫色，過濾，將濾液抽干，加無水乙醇，即得白色熊果酸結晶。(圖1、2)長春堿和長春新堿的提取從上述酸水液中可按圖3提取得長春堿和長春新堿，具體步驟如下1.將酸水液置分液漏斗中，先加入0.4倍的氯仿，然后加約14％的氨水調節pH至6.5，振搖，靜置分層后放出氯仿層，在水層中加0.2倍體積的氯仿提取三次，氯仿提取液靜置后去水，減壓蒸干，然后加少量丙酮抽松，得總弱生物堿。
2.將總弱生物堿加甲醇1.5倍溶解，過夜后，濾去結晶狀物質，甲醇濾液，減壓蒸干，抽松，后加無水乙醇0.5倍溶成濃液，然后加5％硫酸乙醇溶液至pH3.8，放置過夜，析出混合長春堿硫酸鹽。濾出，加蒸餾水1.5倍溶解，移入分液漏斗中，先加1.5倍量氯仿，然后加氨水調節到pH7.5，振搖，將游離堿提入氯仿，氯仿提取液加無水硫酸鈉干燥，濾出，減壓蒸干，得純化游離弱堿。
3.將上述純化游離弱堿，在真空干燥器中干燥后，按1克用30克氧化鋁的比例，在氧化鋁柱上層析分離，用重蒸的苯-氯仿混合溶劑(比重1.30)洗脫，分段收集，用簿層層析法檢查，合并相當流份。將柱層析前段洗脫液減壓蒸去溶劑，抽干，放P2O5的真空干燥器中抽干12小時，稱重，加無水乙醇2倍溶解，再加5％H2SO4，使無水乙醇溶液至pH3.8，密塞，在25℃以下放置48小時，析出長春堿硫酸鹽結晶，濾出，少量無水乙醇洗后，立即移置真空干燥器中干燥，即為硫酸長春堿粗品。
將柱層析后段洗脫液經層析板檢查，合并相同流份，減壓，蒸去溶劑，抽干，置真空干燥器干燥，稱重，加無水乙醇2倍溶解，加4％H2SO4無水乙醇溶液至pH3.8，塞緊，在25℃以下放置48小時，即析出長春新堿的硫酸鹽粗品。
4.取硫酸長春堿粗品，加蒸餾水和甲醇使在60℃加熱全溶，濾過，容器用甲醇洗，濾液合并，減壓回收甲醇，立即將150倍量預先熱至沸的無水乙醇加入，迅速搖勻后放置，很快析出白色針晶，濾出干燥，即得硫酸長春堿精品。
5.另取硫酸長春新堿粗品，加少量甲醇溶解，過濾，減壓濃縮后加入30倍量無水乙醇，搖勻，放置過夜，濾出析出的結晶，放干燥器抽干，即得硫酸長春新堿純品。實施例二收集長春花葉、曬干、粉碎，過80目篩孔倒入提取缸中，加工業甲醇至高出料面2cm，在提取缸夾套中通入蒸汽，使料液溫度上升至溶液沸騰，沸騰蒸汽經冷凝回流至提取缸。每次回流提取3hr，重復2次，離心后得萃取液。萃取液在60±5℃下減壓濃縮得甲醇提取物，同時回收甲醇。
在甲醇提取物中添加IN H2SO4，使pH至3.5，并不時攪拌，靜置后離心，得酸不溶物和酸溶物。上述酸不溶物可用5倍量氯仿多次萃取熊果酸，濃縮萃取液，分批上樣至硅膠層析柱，然后用環己烷/乙酸乙酯(10/3)洗脫，洗脫液經減壓濃縮至干后，加無水乙醇中在室溫下靜置，即可析出白色熊果酸結晶(圖4)上述酸溶物用氯水調節pH至6.5，用氯仿抽提，減壓濃縮，回收氯仿并抽松得總生物堿。
總生物堿加甲醇放置過夜，過濾得甲醇液，減壓回收甲醇并抽松，得純化總生物堿，純化總生物堿加無水乙醇及5％硫酸無水乙醇溶液溶解，放置待析出結晶后再放置2日過濾，結晶主要系硫酸長春堿和長春新堿混合物。
將以上結晶水溶，氨水堿化，氯仿萃取，氯仿液用無水硫酸鈉脫水，濃縮，抽松，干燥，上樣于氧化鋁層析柱，用苯、氯仿混合液(1∶2)洗脫，分段收集流出液，前段含長春堿，后段含長春新堿。后段流出液經蒸干后加4％硫酸無水乙醇溶液，即得硫酸長春新堿成品，前段流出液經蒸干后，加4％硫酸無水乙醇溶液，制成其硫酸鹽，即為硫酸長春堿成品。實施例三長春花全草或葉或莖或地上部分，除可用苯、甲醇等溶劑萃取外，亦可用熱乙醇提取，乙醇濃度95％，由于熊果酸溶于熱乙醇中，故用乙醇萃取應取回流法。為求一草得三藥，提取液中應添加IN H2SO4使pH達3.0。這樣，我們既可從酸溶液中提取得可溶于水的硫酸長春堿和硫酸長春新堿，又可從酸不溶物中提得熊果酸(圖5)，具體方案如下在長春花乙醇提取液的酸溶物中，用氨水調pH至7.0，使長春堿和長春新堿等生物堿從鹽轉變為游離堿，并溶于苯；苯液經濃縮蒸干后上樣于硅膠柱，用正己烷/乙酸乙酯(3∶1)，洗脫液洗脫，收集前段洗脫液，經濃縮蒸干后加含4％硫酸的無水乙醇即得長春堿硫酸鹽，同樣收集后段洗脫液經濃縮蒸干后，加4％硫酸無水乙醇溶液，即得硫酸長春新堿。
另取長春花乙醇提取液的酸不溶物，加5倍量熱苯提取，苯液經減壓濃縮至干，然后上樣于硅膠色譜柱作層析分離。先用低沸點石油醚沖洗，至不再有蠟狀物洗出為止，以除去類脂雜質。然后再用含有2％乙醇的石油醚繼續沖洗，這時熊果酸及熊果酸相似的齊墩果酸被緩緩洗脫。洗脫液經低溫(60±2℃°)真空濃縮后蒸干，加甲醇并加熱煮沸，趁熱過濾，由于齊墩果酸易溶于甲醇，過濾后存在于濾液中，而熊果酸微溶于熱甲醇，故仍留于濾渣中，取濾渣蒸干后加無水乙醇，置室溫下24小時，即可析出熊果酸結晶。
圖1長春花提取熊果酸、長春堿和長春新堿的工藝流程圖2從長春花苯滲漉液中提取熊果酸圖3從長春花苯滲漉液中提取長春堿和長春新堿圖4從長春花甲醇回流液中提取熊果酸、長春堿和長春新堿圖5從長春花乙醇溶液中提取熊果酸、長春堿和長春新堿圖6熊果酸標準品和長春花熊果酸的薄層層析圖薄層板硅膠GF(上海市藥品檢驗所、上海東方藥品科技實業有限公司產品)展開劑1.環己烷∶氯仿∶乙酸乙酯＝20∶5∶82.正丁醇∶氯仿∶乙酸乙酯＝20∶5∶83.氯仿∶丙酮＝6∶4顯色醋酐∶硫酸＝9∶1，110℃烘5分鐘，日光下觀察(以上試劑均為國產分析純)樣點1.UA-S(熊果酸標準品)(中國藥品生物制品鑒定所產品)2.UA-M(長春花熊果酸)結果展開劑1UA-S Rf＝0.328，UA-M Rf＝0.322展開劑2UA-S Rf＝0.803，UA-M Rf＝0.803展開劑2UA-S Rf＝0.592，UA-M Rf＝0.589圖7熊果酸標準品的HPLC色譜8長春花熊果酸的HPLC色譜9熊果酸標準品的紫外光譜10長春花熊果酸的紫外光譜11熊果酸標準品的紅外光譜12長春花熊果酸的紅外光譜13熊果酸標準品的質譜14長春花熊果酸的質譜15熊果酸標準品的1H核磁共振譜圖16長春花熊果酸的1H核磁共振譜圖17熊果酸標準品的13C核磁共振譜圖18長春花熊果酸的13C核磁共振譜
權利要求
1.一種從長春花中提取長春堿、長春新堿和熊果酸的新工藝，其特征在于該工藝包括下列步驟(1)將長春花全草干料粉碎物，用少量水拌和后投入預先裝好苯的滲漉桶中，生藥粉與苯的比例為1∶5-10.0，加蓋浸提1-3天后開始滲漉，收集苯滲漉液；在上述苯滲漉液中加入3-10％酒石酸溶液作液一液逆相萃取，使長春堿和長春新堿以酒石酸鹽形式轉入酸水中，而熊果酸仍留于苯液，按下列流程1從酸不溶物(苯液)中提得熊果酸，按下列流程2從酸水液中提得長春堿和長春新堿；(2)收集長春花葉、曬干、粉碎，倒入提取缸中，加80％甲醇至高出料面1-2cm，在提取缸夾套中通入蒸汽，使料液溫度上升至溶液沸騰，沸騰蒸汽經冷凝回流至提取缸，如此回流提取3hr，離心后得萃取液，萃取液經真空減壓濃縮得甲醇提取物，同時回收甲醇；在甲醇提取物中添加IN H2SO4，使pH至3-4，并不時攪拌，靜置后離心，得酸不溶物和酸溶物，酸溶物按孫文基編著的天然藥物成分提取分離與制備一書(中國醫藥科技出版社，1999)所介紹的方法提取長春堿和長春新堿，并按中華人民共和國藥典二部(2000版P.855-856)作質量檢驗，上述酸不溶物可用5倍量氯仿萃取熊果酸，再經硅膠柱吸附，用環己烷/乙酸乙酯(10-6/1-3)洗脫，洗脫液濃縮后，其濃縮液可在無水乙醇中沉淀得白色熊果酸結晶；(3)長春花全草或葉或莖或地上部分，除可用苯、甲醇等溶劑萃取外，亦可用熱乙醇提取，乙醇濃度70-95％，由于熊果酸溶于熱乙醇中，故用乙醇萃取應取回流法，為求一草得三藥，提取液中應添加IN H2SO4使pH達3-4，這樣，我們即可從酸溶液中提取得可溶于水的硫酸長春堿和硫酸長春新堿，而從酸不溶物中提得熊果酸。
全文摘要
本發明屬天然藥物技術領域。具體涉及從長春花中提取具有抗癌作用的活性成份的新工藝。本發明在萃取溶劑中添加一定量的酒石酸或無機酸,從酸中分離到長春堿和長春新堿,從酸不溶物中分離到熊果酸。本發明工藝成本低,宜于工業化生產。
文檔編號C07D519/00GK1365978SQ0113198
公開日2002年8月28日 申請日期2001年10月24日 優先權日2001年10月24日
發明者周韻麗, 楊慶堯, 楊曉彤, 馮慧琴, 糜可 申請人:太平保健藥業(蛇口)有限公司