專利名稱：抗iv型膠原酶單鏈抗體與力達霉素輔基蛋白的融合蛋白的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種融合蛋白scFv-LDP的構建產生，它是一種新型兼具細胞毒和抑制侵襲轉移的雙功能小型化單抗導向藥物。
本發明的目的主要是從小型化、高效化以及選用新型靶點著手研制新型單抗導向藥物。本發明目前未見類似報道。
酵母屬于單細胞低等真核生物，一方面具有原核生物易于培養、生長繁殖快、便于基因工程操作等特性，另一方面又具有真核生物的蛋白翻譯后加工能力。因此，用酵母表達體系高效表達真核外源蛋白目前受到廣泛研究和應用。本發明是在甲醇營養型酵母Pichia pastoris中生產重組融合蛋白。
本項發明的內容和要點包括以下步驟1.抗IV型膠原酶單抗片段scFv基因的克隆構建本部分使用Pharmacia公司的重組噬菌體抗體系統試劑盒產生scFv片段。以抗IV型膠原酶雜交瘤細胞3D6mRNA為模板，分別擴增出抗體輕、重鏈可變區基因。然后用一段編碼(GGGGS)3的linker序列，經重組PCR將抗體輕、重鏈可變區基因連接構建成scFv片段(
圖1)。將此基因片段克隆進質粒pCANTAB5E(Pharmacia公司)構建重組噬菌體抗體庫。用IV型膠原酶對文庫進行兩輪免疫淘選后得到一株對抗原有最高親和力的重組噬菌體抗體43#。ScFv-43基因片段由上海生工生物工程公司進行序列測定，全長744bp，編碼248個氨基酸。該基因序列與專利99121668.7中的scFv基因序列92.2％同源(圖2)。兩個scFv片段都是抗IV型膠原酶，但本發明所涉及的scFv片段的起源雜交瘤細胞3D6比專利99121668.7中的scFv片段的起源雜交瘤細胞C2H5對抗原具有更強的親和力，因此具備更高的腫瘤靶向性。
2.ScFv-LDP融合基因的構建重組質粒pCANscFv、pC由本實驗室構建，分別含有scFv和LDP基因片段。PCR引物由上海生工生物工程公司合成。PH1(scFv 5’端引物)5’ATCTCGAGAAAAGAGAGGCCCAGGTGAAGCTG 3’XhoIPL2(scFv 3’端引物)5’CGCCATGGTGAACCGCCTCCACCACGTTTGATTTC3’Nco I spacerPLD1(LDP 5’端引物)5’CATGCCATGGGCGCCCGCCTTCTCCGTCAGTC 3’Nco IPLD2(LDP 3’端引物)5’GTGAATTCTCAGCCGAAGGTCAGAGCCAC 3’EcoR I以質粒pCANscFv為模板，PH1、PL2為引物進行PCR擴增，獲得長約800bp的scFv基因片段(圖3)，分離純化后用Xho I和Nco I雙酶切。同時以質粒pC為模板，PLD1和PLD2為引物PCR擴增LDP基因，獲得約340bp的擴增片段(圖3)，分離純化后用Nco I和EcoR I雙酶切。將上述兩個片段與經Xho I和EcoRI酶切的質粒pPIC9(Invitrogen公司)進行連接，獲得重組質粒pPIC9-Fv1027。由上海生工生物工程公司進行序列測定，融合基因讀碼框插入正確，整個基因全長1095bp，編碼365個氨基酸。通過分析計算機同源模建的scFv三維結構以及LDP的X-衍射三維結構，在scFv的C-端和LDP的N-端附加一段小肽spacer，以使兩部分的空間構象不至于相互影響。為了以后克隆替換的方便，在兩個基因之間還引入Nco I酶切位點(圖9)。
3.融合蛋白在酵母中的產生本發明所使用的表達體系是甲醇營養型畢赤酵母Pichia pastoris GS115/pPIC9K(Invitrogen公司)。構建的融合基因兩端分別是Xho I、EcoR I酶切位點，但質粒pPIC9K有兩個Xho I酶切位點。因此首先是將融合基因經Xho I、EcoR I位點亞克隆至質粒pPIC9構建重組質粒pPIC9-Fv1027，然后選定Sph I、EcoR I酶切將含融合基因片段亞克隆至表達載體pPIC9K構建重組表達質粒pKFv1027(圖4)。重組質粒pKFv1027經酶切分析鑒定插入正確(圖5)。重組質粒pKFv1027經Bgl II酶切線性化并純化后，電轉化PichiapastorisGS115，用MD培養基(含YNB1.34％，生物素4×10-5％，葡萄糖1％)及含不同濃度G418的YPD培養基(含酵母浸出物1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％)平板篩選陽性多拷貝重組轉化子。挑取轉化子G34，提取基因組DNA，以5’AOX1引物(5’GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3’)和3’AOX1引物(5’GCAAATGGCATTCTGACATCC 3’)進行PCR鑒定(圖6)，表明外源融合基因通過5’AOX1序列和3’AOX1序列雙交換同源重組整合進酵母基因組中，其表型為His+Muts。將G34接種至50ml BMGY培養基(Invitrogen公司)，30℃振蕩培養至OD600約3。離心收集菌體，用5ml BMMY培養基(Invitrogen公司)重懸，30℃振蕩培養進行誘導表達。每隔24小時補加甲醇至終濃度1％，4天后離心收集上清。用抗LDM單抗F9(本實驗室構建)做為一抗進行Western blot分析，G34成功地表達了可溶性重組融合蛋白(圖7)。
4.融合蛋白scFv-LDP的免疫反應性將IV型膠原酶按1μg/100μl/孔包被96孔酶標板，以100μl 10％脫脂奶粉進行封閉。加入酵母表達上清，孵育后洗去。加入抗LDM單抗F9再次孵育，洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體，以鄰苯二氨為底物進行顯色，酶標儀測定490nm處吸光值。結果表明，融合蛋白仍保留了單抗對抗原IV型膠原酶的免疫反應性(圖8)。
5.融合蛋白scFv-LDP抑制血管生成將表達上清用截留分子量為10kDa的超濾濃縮膜濃縮20倍后，用雞胚尿囊膜法檢測對血管生成抑制作用。結果表明，在酵母中產生的融合蛋白scFv-LDP能抑制血管生成(表1)。
本發明的優點與積極效果是運用基因工程手段獲得小型化的單抗片段，在此基礎上構建產生融合蛋白scFv-LDP，這為加入LDC生成組裝型單抗導向藥物scFv-LDM奠定了基礎。該策略可以最大限度地確保維持LDM的活性。運用酵母表達體系可以經濟、方便、大量地生產融合蛋白，因而為研制兼具強烈殺傷腫瘤細胞活性和抑制侵襲轉移活性的雙功能小型化單抗導向藥物打下了基礎。
序列表<110>中國醫學科學院醫藥生物技術研究所<120>抗IV型膠原酶單鏈抗體與力達霉素輔基蛋白的融合蛋白<160>1<170><210>1<212>DNA<213>畢赤酵母(Pichia pastoris)<220><221>misc_feature<222><223><400>1atggcccagg tgaagctgca gcagtctgga actgaagtgg taaagcctgg ggcttcagtg 60aagttgtcct gcaaggcttc tggctacatc ttcacaagtt atgatataaa ctgggtgagg 120cagacgcctg aacagggact tgagtggatt ggatggattt ttcctggaga ggggagtact 180gaatacaatg agaagttcaa gggcagggcc acactgagtg tagacaagtc ctccagcaca 240gcctatatgg agctcactag gctgacatct gaggactctg ctgtctattt ctgtgctaga 300ggggactact ataggcgcta ctttgacttg tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360tcaggtggag gcggttcagg cggaggtggc tctggcggtg gcggatcgga catcgagctc 420actcagtctc cagcttcttt ggctgtgtct ctagggcaga gggccaccat atcctgcaga 480gccagtgaaa gtgttgatac ttatggcgat acttttatgt actggtacca gcagaaacca 540ggacagccac ccaaactcct catctatctt gcaaccaacc taggatctgg ggtccctgcc 600aggttcagtg gcagtgggtc taggacaaac ttcaccctca ccattgatcc tgtggaggct 660gatgatgctg caacctatta ctgtcagcaa aataatgagg atccgtacac gttcggaggg 720ggcaccaagc tggaaatcaa acgt74權利要求
1.抗IV型膠原酶單鏈抗體(scFv)與力達霉素輔基蛋白(LDP)的融合蛋白(scFv-LDP)，其特征是所說方案的實施包括以下步驟A.抗IV型膠原酶scFv基因的克隆構建；B.ScFv-LDP融合基因的構建；C.融合蛋白酵母表達質粒的構建；D.融合蛋白在酵母中的可溶性表達；E.融合蛋白的生物學活性測定。
2.按照權利要求1所述的融合蛋白，其特征是從抗IV型膠原酶雜交瘤細胞3D6中反轉錄PCR擴增抗體輕、重鏈可變區基因，然后用一段連接序列連接構建scFv基因。
3.按照權利要求1所述的融合蛋白，其特征是運用基因工程技術，用編碼一段柔性小肽的DNA序列將scFv基因與LDP基因連接成scFv-spacer-LDP形式的融合基因，同時，在spacer區引入相應酶切位點。
4.按照權利要求1所述的融合蛋白，其特征是融合基因克隆至酵母表達質粒，如pPIC9K等構建重組表達質粒pKFv1027。
5.按照權利要求1所述的融合蛋白，其特征是Bgl II線性化pKFv1027經電擊轉化酵母表達宿主系統如Pichia pastoris獲得陽性克隆轉化子，經誘導后表達可溶性融合蛋白。
6.按照權利要求1所述的融合蛋白，其特征是ELISA檢測產生的融合蛋白對抗原IV型膠原酶的結合能力，用雞胚尿囊膜法檢測融合蛋白抑制血管生成能力。
全文摘要
本發明涉及一種小型化融合蛋白scFv－LDP的構建產生，其實施方案是運用DNA分子重組技術、基因工程技術，構建了抗IV型膠原酶單鏈抗體(Single－chain Fv fragment，scFv)基因和力達霉素輔基蛋白(LDP)基因的融合基因，在甲醇營養型酵母Pichia pastoris中實現了分泌表達，表達的融合蛋白保留了對抗原IV型膠原酶的結合能力，同時對雞胚尿囊膜血管生成有抑制作用，該融合蛋白有望成為兼具強烈殺傷腫瘤細胞活性和抑制侵襲轉移活性的雙功能小型化單抗導向藥物。
文檔編號C07K14/36GK1403577SQ01131299
公開日2003年3月19日 申請日期2001年9月6日 優先權日2001年9月6日
發明者甄永蘇, 唐勇 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所