棒狀細菌的精氨酸阻遏物缺陷型菌株和制備l－精氨酸的方法

專利名稱：棒狀細菌的精氨酸阻遏物缺陷型菌株和制備l－精氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種能制備L-精氨酸的棒狀細菌以及利用該細菌制備L-精氨酸的方法。L-精氨酸是一種工業上有用的氨基酸，其作為肝功能促進劑、氨基酸輸注劑、廣泛的氨基酸藥物等的成分。
常規的經發酵制備的L-精氨酸是利用下列棒狀細菌得到的棒狀細菌的野生型菌株；對某些試劑(包括磺胺類藥、2-噻唑丙氨酸、a-氨基-a-羥基戊酸等)有抗性的棒狀細菌；除了對2-噻唑丙氨酸有抗性，而且對L-組氨酸、L-脯氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-蛋氨酸或L-色氨酸表現為營養缺陷型的棒狀細菌(日本專利待審公開54-44096)；對酮丙二酸、氟代丙二酸或一氟乙酸具有抗性的棒狀細菌(日本專利待審公開57-18989)；對精氨醇(argininol)具有抗性的棒狀細菌(日本專利待審公開62-24075)；對X-胍具有抗性的棒狀細菌(X表示脂肪酸的衍生物或脂族鏈，日本專利待審公開2-186995)等等。
另一方面，現有技術還公開了利用重組DNA技術制備L-精氨酸的方法。即公開了利用棒桿菌或短桿菌屬的微生物制備L-精氨酸的方法，其中使得所述細菌攜帶有包括載體DNA和含有以下基因的DNA片段的重組DNA，所述基因為來自屬于埃希氏菌屬微生物的乙酰鳥氨酸去乙酰基酶、N-乙酰谷氨酸-a-半醛脫氫酶、N-乙酰谷氨激酶(glutamokinase)和精氨琥珀酸酶(日本專利公開5-23750)。
另外，至于棒狀細菌，已經知道L-精氨酸生物合成體系的某些酶的合成受到L-精氨酸的抑制。而且，據報道，在L-精氨酸生物合成體系的某些酶受到L-精氨酸抑制的同時，在棒狀細菌的突變株中取消了L-精氨酸對這些酶的抑制，而顯示出L-精氨酸積累量的增加(Agric.Biol.Chem.，43(1)，105，1979)。
同時，對于大腸桿菌，L-精氨酸生物合成體系的阻遏物和編碼該阻遏物的基因被鑒定(美國科學院學報(1987)，84(19)，6697-701)，還研究了該阻遏物蛋白質的結合相互作用和L-精氨酸生物合成體系的各種基因(美國科學院學報(1987)，84(19)，6697-701，分子生物學雜志(1992)，226，367-386)。
但是，在棒狀細菌中還沒有確定L-精氨酸生物合成體系的任何阻遏物蛋白質。盡管在該阻遏物蛋白質基因(argR)的核苷酸序列和推測由其編碼的氨基酸序列登記在基因數據庫GnBank(AF049897)中，但該基因被命名為argR是因為在上述氨基酸序列和已知的精氨酸阻遏物之間有同源性。
如上所述，盡管研究了棒狀細菌的L-精氨酸生物合成體系的阻遏物蛋白質及其基因，但是該阻遏物蛋白質本身還未被確定，而且其功能等也根本沒有闡述。因此，本發明的一個目的是確定棒狀細菌中的L-精氨酸生物合成的阻遏物，提高棒狀細菌的L-精氨酸的生產率。
本發明的發明人從棒狀細菌中分離出在基因數據庫中以argR登記的基因(Genbank登記號為AF049897)的同系物，并且發現如果該基因在棒狀細菌中被擴增，L-精氨酸的生產能力將下降，另一方面，如果破裂了該基因，L-精氨酸的生產能力將增加，由此證實了L-精氨酸生物合成受到棒狀細菌(如大腸桿菌)中的阻遏物和上述編碼該阻遏物以argR登記的基因的抑制。因此，本發明得以完成。
本發明提供了以下的內容(1)一種棒狀細菌，其中精氨酸阻遏物不以通常的方式發揮作用，并且其具有L-精氨酸生產能力。
(2)如(1)所述的棒狀細菌，其中由于該細菌染色體上編碼精氨酸阻遏物的基因的破裂，精氨酸阻遏物不以通常的方式發揮作用。
(3)如(2)所述的棒狀細菌，其中精氨酸阻遏物具有在SEQ ID NO18中所示的氨基酸序列或者表現出與該氨基酸序列同源的氨基酸序列。
(4)一種制備L-精氨酸的方法，包括在培養基中培養如(1)至(3)中任一項所述的棒狀細菌，以在該培養基中產生和積累L-精氨酸，并且從該培養基中收集L-精氨酸。
在本發明中，“精氨酸阻遏物”指的是一種具有抑制L-精氨酸生物合成作用的蛋白質，如果編碼該蛋白質的基因的表達量在棒狀細菌中增加，L-精氨酸的生產能力將下降，如果該表達量下降或該蛋白質消失，那么L-精氨酸生產能力將增加。此后，編碼該精氨酸阻遏物的基因也被稱為argR基因。另外，用于本發明的“L-精氨酸生產能力”指的是，當本發明的微生物在培養基中培養時，其在該培養基中積累L-精氨酸的能力。
根據本發明，具有L-精氨酸生產能力的棒狀細菌的L-精氨酸的生產能力得到提高。


圖1表示質粒pK1的構建過程。
圖2表示質料pSFLK6的構建過程。
圖3表示質粒pSFKT2的構建過程。
下面將對本發明作詳細的闡述。
本發明的微生物是具有L-精氨酸生產能力的棒狀細菌，其中精氨酸阻遏物不以通常的方式發揮作用。本發明的棒狀細菌可以是具有L-精氨酸生產能力的微生物(因為精氨酸阻遏物在其中不以通常的方式發揮作用)或是一種經培育使得在其中精氨酸阻遏物不會以通常的方式發揮作用的微生物。另外，其還可以是經培育的微生物，其中使精氨酸阻遏物不會在其中以通常的方式發揮作用，然后賦予其L-精氨酸生產能力。
棒狀細菌包括迄今已被劃分到短桿菌屬但目前并入棒桿菌的細菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1981))，并且包括與棒桿菌密切相關的屬于短桿菌屬的細菌。這些棒狀細菌的例子包括下面的細菌。
嗜乙酰乙酸棒桿菌醋谷棒桿菌corynebacterium alkanolyticum美棒桿菌谷氨酸棒桿菌百合花棒桿菌(谷氨酸棒桿菌)corynebacterium melassecola熱產氨棒桿菌力士棒桿菌乳發酵短桿菌(谷氨酸棒桿菌)黃色短桿菌(谷氨酸棒桿菌)Brevibacterium immariophilum乳發酵短桿菌(谷氨酸棒桿菌)玫瑰色短桿菌解糖短桿菌生硫短桿菌Brevibacterium album蠟狀短桿菌嗜氨短桿菌具有L-精氨酸生產能力的棒狀細菌不特別限定，只要它們具有L-精氨酸生產能力，它們包括，例如，棒狀細菌的野生型菌株；對某些試劑(包括磺胺類藥、2-噻唑丙氨酸、a-氨基-羥基戊酸等)具有抗性的棒狀細菌；除了對2-噻唑丙氨酸有抗性，而且對L-組氨酸、L-脯氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-蛋氨酸或L-色氨酸表現出營養缺陷的棒狀細菌(日本專利待審公開54-44096)；對酮丙二酸、氟代丙二酸或一氟乙酸具有抗性的棒狀細菌(日本專利待審公開57-18989)；對精氨醇(argninol)具有抗性的棒狀細菌(日本專利待審公開62-24075)；對X-胍具有抗性的棒狀細菌(X表示脂肪酸的衍生物或脂族鏈，日本專利待審公開2-186995)等等。
特別是以下的菌株作為舉例。
黃色短桿菌AJ11169(BP-6892)谷氨酸棒桿菌AJ12092(FERM BP-6906)黃色短桿菌AJ11336(BP-6893)黃色短桿菌AJ11345(BP-6894)谷氨酸棒桿菌AJ12430(FERM BP-2228)AJ11169菌株和AJ12092菌株是如日本專利待審公開54-44096所述的2-噻唑丙氨酸抗性菌株；AJ11336菌株是如日本專利公開62-24075所述的具有精氨醇(argininol)抗性和磺胺嘧啶抗性的菌株；AJ11345菌株是如日本專利公開62-24075所述的具有精氨醇抗性、2-噻唑丙氨酸抗性、磺胺胍抗性以及表現出組氨酸營養缺陷的菌株；AJ12430菌株是如日本專利待審公開2-186995所述的具有辛基胍抗性和2-噻唑丙氨酸抗性的菌株。
AJ11169菌株于1977年8月3日保藏在國際貿易和工業部的工業科學和技術署的國家生物科學和人類技術研究所(現在是經濟、貿易和工業部的國家高級工業科學和技術研究院的國家生物科學和人類技術研究所)(郵政編碼305-8566，1-3Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本)，保藏號為HERMP-4161，并且基于布達佩斯條約在1999年9月27日從原先的保藏轉換至國際保藏，并已經以FERM BP-6892的保藏號進行保藏。
AJ12092菌株于1983年9月29日保藏在國際貿易和工業部的工業科學和技術署的國家生物科學和人類技術研究所，保藏號為FERM P-7273，并且基于布達佩斯條約于1999年10月1日從原先的保藏轉換至國際保藏，并已經以FERM BP-6906的保藏號進行保藏。
AJ11336菌株于1979年4月25日保藏在國際貿易和工業部的工業科學和技術署的國家生物科學和人類技術研究所，保藏號為FERM P-4939，并且基于布達佩斯條約于1999年9月27日從原先的保藏轉換至國際保藏，并已經以FERM BP-6893的保藏號進行保藏。
AJ11345菌株于1979年4月25日保藏在國際貿易和工業部的工業科學和技術署的國家生物科學和人類技術研究所，保藏號為FERM P-4948，并且基于布達佩斯條約于1999年9月27日從原先的保藏轉換至國際保藏，并已經以FERM BP-6894的保藏號進行保藏。
AJ12430菌株于1988年12月26日基于布達佩斯條約保藏在國際貿易和工業部的工業科學和技術署的國家生物科學和人類技術研究所，保藏號為FERM BP-2228。
其精氨酸阻遏物不以通常方式發揮作用的棒狀細菌可以通過修飾其argR基因獲得，使得該精氨酸阻遏物的活性降低或消除，或者argR基因的轉錄得到減少或取消。例如，得到這樣一種棒狀細菌的方法可以是，通過例如基于基因重組技術的同源重組，用不以通常方式發揮作用的argR基因取代染色體argR基因(后文有時被稱為“破裂的argR基因”)(分子遺傳學實驗，冷泉港實驗室出版社(1972)；Matauyama，S.And Mizushima，S.，細菌學雜志，162，1196(1985))。
在同源重組中，當攜帶與染色體序列或其他類似物具有同源性的序列的質粒被引入相應的細菌細胞時，在同源序列的一個位點以一定的頻率發生重組，因此引入的質粒全部被整合進染色體中。然后，通過在染色體中的同源序列的位點再次進行重組，從該染色體中可以除去該質粒。但是，取決于發生重組的位置，該破裂基因可以保留在染色體上，同時原先正常的基因與質粒一起從染色體中除去。通過選擇這么一種細菌菌株，能夠得到其中正常的argR基因被破裂的argR基因取代的細菌菌株。
現在已經確定了這種基于同源重組的基因破裂技術，因此可以使用利用線性DNA的方法、利用溫度敏感質粒等的方法。ArgR基因還可以通過使用含有插入標記基因(如抗藥基因)的argR基因的質粒被破裂，并且在棒狀細菌的靶細胞中不會發生復制。也就是說，在已經被所述的質粒轉化而獲得抗藥性的轉化體中，所述的標記基因在染色體DNA中被整合。顯然，通過位于標記物兩側的argR基因和染色體上的argR基因的同源重組已經整合出該標記基因，因此能夠有效地選擇基因破裂的菌株。
特別地，用作基因破裂的破裂的argR基因可以通過以下方法獲得借助用限制酶的消化和重連接以缺失argR基因的某一區域；通過向argR基因中插入另一個DNA片段(標記基因等)，通過位點專一誘變(Kramer，W.與Frits，H.J.，Methods in enzymology，154，350(1987))或者用化學試劑如次硫酸鈉和羥胺處理(Shortle，D.，與Nathans，D.，美國科學院學報75，270(1978))等方法通過引入取代，缺失，插入，添加或轉化argR基因編碼區、啟動子區等的核苷酸序列中的一個或多個核苷酸，使得編碼的阻遏物的活性得以降低或消除，或者argR基因的轉錄得以減少或消除。在這些實施方案中，鑒于可靠性和穩定性，優選使用借助限制酶的消化和重連接來缺失argR基因的某一區域的方法，或者在argR基因中插入另一個DNA片段的方法。
通過使用含argR基因及其側翼區的質粒作為模板以及對應于argR基因末端部分或側翼區的引物進行PCR(聚合酶鏈式反應)以擴增出除argR基因內部或其全部之外的部分，并且使所得的擴增產物環化，可以制備出用于argR基因破裂的質粒。在以后所述的實施例中，用該方法破裂argR基因。
通過使用基于已知的argR基因的核苷酸序列制備的寡核苷酸作為引物進行PCR反應從棒狀細菌的染色體DNA獲得所述的argR基因。所述的argR基因也可以通過雜交技術從微生物的染色體DNA文庫中獲得，其具有嘌呤操縱子，其中使用了基于已知的argR基因的核苷酸序列制備的寡核苷酸作為探針。出于本發明的目的，因為該argR基因用作制備所述破裂的argR基因，它就不需要含有全長片段，它具有能引起基因破裂的長度即可。
該argR基因的來源不特別限定，只要它具有能夠與棒狀細菌的argR基因發生同源重組的同源性程度就可以。特別地，黃色短桿菌的argR基因(其具有在SEQ ID NO17中所示的核苷酸序列)和谷氨酸棒桿菌的argR基因(GenBank登記號為AF049897)用作棒狀細菌的argR基因。這些argR基因高度同源，但是認為，與argR基因被破裂的棒狀細菌不同屬或種的棒狀細菌的argR基因也可以用作基因破裂。
在本發明中，SEQ ID NO18中所示的氨基酸序列或與該氨基酸序列具有同源性的氨基酸序列指的是由具有下列同源性程度的argR基因編碼的氨基酸序列，其應當與編碼SEQ ID NO18中所示的氨基酸序列的argR基因發生同源重組(例如，具有SEQ ID NO17中所示的核苷酸序列的argR基因)。
對于用作PCR的引物，可以使用使argR基因擴增的任何引物。特定的實施例包括具有SEQ ID NO19和20中所示的核苷酸序列的寡核苷酸。
另外，標記基因的實施例包括抗藥基因，如卡那霉素抗性基因。卡那霉素抗性基因通過PCR擴增方法從已知的含有糞鏈球菌卡那霉素抗性基因的質粒獲得，例如pDG783(Anne-Marie Guerout-Fleury等人，基因，167，335-337(1995))。
當抗藥基因用作標記基因時，獲得argR基因破裂的菌株的方法是將抗藥基因插入到由質粒攜帶的argR基因的合適位點，用該質粒轉化微生物，選擇抗藥的轉化體。染色體上argR基因的破裂能夠借助DNA印跡法、PCR或其它類似方法通過分析染色體上的argR基因或標記基因進行確定。將卡那霉素抗性基因整合進入染色體DNA中可以通過采用使卡那霉素抗性基因擴增的引物通過PCR進行確定(例如，具有SEQ ID NO1和2中所示的核苷酸序列的寡核苷酸)。
L-精氨酸能夠有效地在培養基中通過培養如上所述的具有L-精氨酸生產能力的棒狀細菌進行制備，其中精氨酸阻遏物不以通常的方式發揮作用，以便在培養基中產生和積累L-精氨酸，然后從該培養基中收集該L-精氨酸。
所使用的培養基可以選自常規的利用微生物進行發酵生產氨基酸的公知的培養基。也就是說，該培養基可以是含有碳源、氮源、無機離子和所需的其它有機成分的通常的培養基。
對于碳源，可以使用糖類如葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖或淀粉水解物，醇如甘油或山梨糖醇，或有機酸如富馬酸、檸檬酸或琥珀酸。
對于氮源，可以使用無機銨鹽如硫酸銨、氯化銨或磷酸銨，有機氮如大豆蛋白水解產物，氨氣、氨水等。
作為有機痕量營養物，希望在該培養基中添加適量的其它所需物質如維生素B1和L-高絲氨酸、酵母提取物等。除了上述營養物，磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、錳離子等也可以按需要少量地添加。
該培養基優選在需氧條件下培養1-7天，培養的溫度優選控制在24℃至37℃，在培養過程中，PH優選控制在5-9。無機或有機酸、堿或氨氣等可以作為PH調節劑。通過結合公知技術如離子交換樹脂技術和其它的技術，從發酵培養液中收集L-精氨酸。
完成本發明的最好的方式下面，本發明將參照實施例進行更詳細地闡述。
實施例1構建大腸桿菌和棒狀細菌的穿梭載體和溫度敏感載體首先，構建將argR基因引入棒狀細菌的載體和用于生產棒狀細菌的argR缺陷菌株的溫度敏感載體。
(1)構建含有糞鏈球菌抗藥基因的載體糞鏈球菌的卡那霉素抗性基因從已知的含有該基因的質粒通過PCR進行擴增。糞鏈球菌的卡那霉素抗性基因的核苷酸序列已經得到闡述(Trieu-Cuot，P.與Courvalin，P.基因，23(3)，331-341(1983))。基于該序列，合成SEQ ID NOS1和2中所示的引物，通過使用pDG783作為模板(Anne-Marie Guerout-Fleury等人，基因，167，335-337(1995))進行PCR，擴增含有卡那霉素抗性基因及其啟動子的DNA片段。
使用由Takara Shuzo有限公司制備的SUPREC02純化上述DNA片段，然后用限制酶HindIII和HincII進行充分消化使成為平端。使用由Takara Shuzo有限公司制備的平端化試劑盒進行平端化。將該DNA片段與另一DNA片段混合，其中所述另一DNA片段是通過采用SEQ ID NOS3和4中所示的引物并以pHSG399(參見S.Takeshita等人基因，61，63-74(1987))作為模板進行PCR的擴增產物經純化和平端化而獲得的，并且將這兩個片段連接。使用由TakaraShuzo有限公司制備的2型DNA連接試劑盒進行上述連接。大腸桿菌JM109的感受態細胞(由Takara Shuzo有限公司制備)用上述連接的DNA進行轉化，在含有10μg/ml的IPTG(異丙基-a-D-硫代半乳吡喃糖苷)、40μg/ml的X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-a-D-半乳糖苷)和25μg/ml的卡那霉素的L培養基(10g/L的Bacto胰蛋白胨，5g/L的Bacto酵母提取物，5g/l的NaCl，15g/L的瓊脂，PH7.2)上涂平板，并培養過夜。挑選所出現的藍色菌落，分離成單一的菌落，獲得轉化菌株。
通過堿性方法(Seibutsu Kogaku Jikkensyo(生物工程實驗教材)，由日本生物科學與生物工程協會編輯，P.105，Baifukan，1992)從轉化菌株制備質粒，并繪制限制酶圖譜。具有相當于圖1的限制酶圖譜的質粒被稱作pK1。該質粒穩定地攜帶在大腸桿菌中，賦予宿主以卡那霉素抗性。而且，由于它含有lacZ’基因，它適合用作克隆載體。
(2)構建穿梭載體pSFK6作為獲得溫度敏感復制控制區的原料，制備能夠在大腸桿菌細胞和棒狀細菌細胞中自主復制的質粒載體。從乳發酵短桿菌ATCC13869提取出的質粒pAM330(參見日本專利公開Kokai No.58-67699)被限制酶HindIII充分消化，并使其變成平端。將該片段與用限制酶BsaAI通過充分消化上述pK1獲得的片段相連接。乳發酵短桿菌ATCC13869用連接的DNA進行轉化。利用電脈沖方法進行轉化(參見日本專利公開No.2-207791)。在含有25μg/ml的卡那霉素的M-CM2B平板上(10g/L聚胨，10g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10μg/L的生物素，15g/L瓊脂，PH7.2)選擇轉化體。培養2天后，挑選菌落，分離成單一的菌落，得到轉化體。從該轉化體制備質粒DNA，繪制限制酶圖譜。具有與圖2限制酶圖譜相同的質粒被稱作pSFK6。該質粒能夠在大腸桿菌和棒狀細菌中自主復制，并賦予宿主以卡那霉素抗性。
(3)構建具有溫度敏感復制控制區的質粒在體外用羥胺處理pSFK6。根據已知的方法進行該羥胺處理(例如參見，G.O.Humpherys等人，Molec.Gen.Genet.，145，101-108(1976))。收集經受該處理后的DNA，用來進行乳發酵短桿菌ATCC13869菌株的轉化。在含有25μg/ml卡那霉素的CM2B平板上于低溫(25℃)下選擇轉化體。將出現的轉化體復制在類似的選擇平板上，在升高的溫度下(34℃)進行培養。獲得一種菌株，它不能在升高的溫度下在含有卡那霉素的選擇平板上生長。從該菌株，回收質粒并命名為p48K。
(4)測定溫度敏感復制控制區的核苷酸序列測定在具有野生型復制控制區的質粒psFK6和具有溫度敏感復制控制區的質粒p48K中的復制控制區片段的核苷酸序列。在全自動測序儀ABI310(ABI)上使用DNA測序試劑盒(ABI)測定核苷酸序列。結果發現，在野生型復制控制區和溫度敏感復制控制區之間存在6個核苷酸的取代。在棒狀細菌中發揮作用的包含在pSFK6中的溫度敏感復制控制區片段的核苷酸序列(來源于pAM330的全長序列)在SEQ ID NO5中所示；在棒狀細菌中發揮作用的包含在p48K中的溫度敏感復制控制區片段的核苷酸序列在SEQ ID NO7中所示。此外，由在這些核苷酸序列中包含的ORF所編碼的氨基酸序列在SEQ ID NOS6和8所示。在溫度敏感復制控制區中，第1255位的C突變為T，第1534位的C突變為T，第1866位的G突變為A，第2058位的G突變為A，第2187位的C突變為T，第3193位的G突變為A。其中，僅僅在第1534位置的突變伴隨有氨基酸突變，導致絲氨酸替代脯氨酸。
(5)構建具有溫度敏感突變的穿梭載體將p48K的6個突變中的每一個引入到穿梭載體pSFK6(參見圖3)。通過已知的方法進行該突變的引入(Mikaelian，I.，Sergeant，A.，核酸研究，20，376(1992))。具體的步驟將在下面涉及。為了引入第1534位的C至T的突變，使用SEQ IDNOS9和10中所示的混合引物(引物9和10)和SEQ ID NOS11和12中所示的混合引物(引物11和12)并且以pAM330作為模板進行PCR。將每種獲得的擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行純化，從凝膠中收集該產物。使用2型EASYTRAP(Takara Shuzo有限公司)從凝膠中收集DNA片段。純化的DNA以1∶1的摩爾比混合，并且用作通過采用SEQ ID NOS13和14中所示的引物(引物13和14)進行的PCR的模板。該擴增的產物用限制酶MluI充分消化，進行瓊脂糖凝膠電泳以回收約3.2kb的DNA片段。類似地，pSFK6也用限制酶MluI充分消化，進行瓊脂糖凝膠電泳以回收約3.8kb的DNA片段。將所得到的DNA片段進行混合和連接，用來轉化大腸桿菌JM109的感受態細胞(Takara Shuzo有限公司)。將這些細胞放在含有25μg/ml卡那霉素的L培養基中，進行過夜培養。挑選出現的菌落，分離單一的菌落，得到轉化菌株。通過堿性方法由該轉化菌株制備質粒，測定該質粒的核苷酸序列以證實在SEQ ID NO5所示序列中的第1534位的C被突變為T。該質粒稱為pSFKT2(圖3)。
實施例2棒狀細菌中arg-R基因的克隆及其擴增效果通過利用黃色短桿菌野生菌株2247(AJ14067)的染色體DNA作為模板，并以具有在SEQ ID NO15中所示的(在SEQ ID NO17中的第1717-1741位核苷酸的序列)和SEQ ID NO16(與在SEQ ID NO17中的第2386-2362位核苷酸序列互補的序列)所示的核苷酸序列的寡核苷酸作為引物(引物15和16)，進行PCR。使用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo有限公司)，進行PCR 30次循環，每個循環包括在98℃下反應10秒鐘，在58℃下反應1分鐘，在72℃下反應3分鐘。將所得到的擴增的片段插入到由實施例1獲得的穿梭載體pSFK6的SmaI位點，得到能夠在棒狀細菌中自主復制的質粒pWR。
為了研究argR基因在生產L-精氨酸的棒狀細菌中的擴增結果，將pWR引入到AJ113455菌株(FERM BP-6894)，該菌株是黃色短桿菌的L-精氨酸生產菌株。該質粒是通過電脈沖法引入的(日本專利公開No.2-207791)。在含有25μg/ml卡那霉素的CM2G瓊脂培養基上(在1L純水中含有5g葡萄糖，5g NaCl和15g瓊脂，PH7.2)選擇卡那霉素抗性菌株的轉化體，得到AJ11345/pWR。作為對照，類似地將pSFK6引入到AJ113455菌株中，得到轉化體AJ113455/pSFK6。
將上述的每種菌株涂平板，其中的瓊脂培養基含有0.5g/dl葡萄糖、1g/dl聚胨、1g/dl酵母提取物和0.5g/dl NaCl，在31.5℃下培養20小時。將一鉑環所述的細胞接種至含有4g/dl葡萄糖、6.5g/dl硫酸銨、0.1g/dl KH2PO4、0.04g/dlMgSO4、0.001g/dl FesO4、0.001g/dl MnSO4、5μg/dl維生素B1、5μg/dl的生物素和大豆蛋白水解產物(以N量計算為45mg/dl)的培養基中，在振蕩下在燒瓶中于31.5℃下培養50小時。測量每種培養肉湯中的L-精氨酸的積累量(濃度，g/dl)。結果列在表1中。結果顯示argR擴增的菌株很難積累L-精氨酸。這說明argR基因產物起到了精氨酸阻遏物的作用。
表1
在pWR中克隆的插入片段的核苷酸測序結果在SEQ ID NO17中所示。可以由該核苷酸序列編碼的氨基酸序列在SEQ ID NO18中所示。
實施例3構建棒狀細菌的argR破裂菌株和精氨酸阻遏物缺失的結果(1)用于argR破裂的質粒的構建通過使用黃色短桿菌的野生菌株2247菌株(AJ14067)的染色體DNA作為模板，并以具有SEQ ID NO19所示的核苷酸序列(在SEQ ID NO17的第4-28位核苷酸的序列)和SEQ ID NO20所示的核苷酸序列(與在SEQ ID NO17的第4230-4211位核苷酸的序列互補的序列)的寡核苷酸作為引物(引物19和20)，進行PCR。使用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo有限公司)，PCR進行30次循環，每次循環包括在98℃下反應10秒鐘，在58℃下反應1分鐘，在72℃下反應3分鐘。將所得到的擴增的片段插入到克隆載體pHSG399的多克隆位點的SmaI位點。
為了從插入的DNA片段中缺失掉被認為是編碼精氨酸阻遏物的完整的ORF，使用具有SEQ ID NO21所示的核苷酸序列(在SEQ ID NO17的第2372-2395位核苷酸的序列)和SEQ ID NO22所示的核苷酸序列(與在SEQ IDNO17的第1851-1827位核苷酸序列互補的序列)的寡核苷酸作為引物(引物21和22)并以插入了擴增片段的pHSG399作為模板，進行PCR。通過該PCR產物的自身連接作用構建pssER。
然后，將用限制酶SmaI和SalI消化pssER獲得的片段以及在實施例1中所得的并用SmaI和SalI消化獲得的溫度敏感質粒pSFKT2進行連接，得到用于argR破裂的質粒pssERT，其在棒狀細菌中的自主復制能力變成溫度敏感。
(2)通過同源重組構建棒狀細菌的精氨酸阻遏物缺陷菌株將上述得到的質粒pssERT引入到乳發酵短桿菌AJ13029菌株中(FERMBP-5189)。利用電脈沖方法引入該質粒(日本專利公開2-207791)。因為該質粒的自主復制能力在乳發酵短桿菌中是溫度敏感的，所以僅有通過同源重組將該質粒摻入所述染色體的菌株能夠在34℃下作為卡那霉素抗性菌株被選擇，該溫度為不使所述質粒進行復制的溫度。在含有25μg/ml卡那霉素的CM2G平板(在1L水中含有10g/L聚胨，10g/L酵母提取物，5g/L葡萄糖，5g/LNaCl和15g/L瓊脂，pH7.2)上用于argR破裂的質粒整合入染色體的菌株作為卡那霉素抗性菌株被選出。在該步驟中，來自該染色體的普通的argR基因和來自其中OFR被缺失的質粒的argR基因順序出現在該染色體的質粒部分的兩邊。
然后，使該重組菌株再次進行同源重組，選擇在34℃下變得對卡那霉素敏感的菌株作為其中一個argR基因缺失的菌株，所述的溫度是不讓質粒進行復制的溫度。這些菌株包括在所述染色體上保留了普通argR基因的菌株和在該染色體上保留了所述破裂的argR基因的菌株。從這些菌株中，選擇僅具有破裂的argR基因的菌株。通過制備在34℃下變得對卡那霉素敏感的菌株的染色體、利用該染色體作為模板并以具有在SEQ ID NOS19和20所示的核苷酸序列的寡核苷酸作為引物(引物19和20)進行PCR，并且證實了所述的PCR產物要比通過類似方法利用來源于親代菌株的染色體作為模板進行PCR得到的產物短了約600bp，確定了在該染色體上的argR基因是破裂型的。
上述選擇的argR基因破裂的菌株的PCR產物進行直接測序，以證實該argR基因被合乎要求的破裂，由此得到AJ13029ΔR菌株。
(3)用argR破裂的菌株制備L-精氨酸將AJ13029ΔR菌株在瓊脂培養基上涂平板，該培養基含有0.5g/dl葡萄糖，1g/dl聚胨，1g/dl酵母提取物，0.5g/dl NaCl，在31.5℃下培養20小時。將一鉑環所述的細胞接種至含有3g/dl葡萄糖、6.5g/dl硫酸銨、0.1g/dl KH2PO4、0.04g/dlMgSO4、0.001g/dl FesO4、0.001g/dl MnSO4、300μg/dl維生素B1、200μg/dl的生物素和大豆蛋白水解產物(以N量計算為165mg/dl)的培養基中，用NaOH調整培養基至PH7.0，在31.5℃下作為種子培養物培養24小時。
將1ml的上述種子培養肉湯接種至含有4g/dl葡萄糖、6.5g/dl硫酸銨、0.5g/dlKH2PO4、0.04g/dl MgSO4、0.001g/dl FesO4、0.01g/dl MnSO4、5μg/dl維生素B1、5μg/dl的生物素和大豆蛋白水解產物(以N量計算為45mg/dl)的培養基中，用NaOH調整培養基至pH7.0，在31.5℃下于搖動中在燒瓶中培養50小時。測量在每個菌株的培養肉湯中的L-精氨酸的積累量(濃度，mg/dl)。結果列在表2中。結果表明，與親代菌株相比，該argR破裂的菌株積累的L-精氨酸的量顯著增加。
表2
(序列表的說明)SEQ ID NO1用于糞鏈球菌的卡那霉素抗性基因的擴增引物SEQ ID NO2用于糞鏈球菌的卡那霉素抗性基因的擴增引物SEQ ID NO3用于pHSG399的載體部分的擴增引物SEQ ID NO4用于pHSG399的載體部分的擴增引物SEQ ID NO5pSFK6的復制控制區的核苷酸序列
SEQ ID NO6可能由pSFK6中ORF編碼的氨基酸序列SEQ ID NO7p48K的復制控制區的核苷酸序列SEQ ID NO8可能由p48K中ORF編碼的氨基酸序列SEQ ID NO9用于將第1534位的C突變至T引入pSFK6的第一次PCR的引物SEQ ID NO10用于將第1534位的C突變至T引入pSFK6的第一次PCR的引物SEQ ID NO11用于將第1534位的C突變至T引入pSFK6的第一次PCR的引物SEQ ID NO12用于將第1534位的C突變至T引入pSFK6的第一次PCR的引物SEQ ID NO13用于將第1534位的C突變至T引入pSFK6的第二次PCR的引物SEQ ID NO14用于將第1534位的C突變至T引入pSFK6的第二次PCR的引物SEQ ID NO15用于argR基因擴增的引物SEQ ID NO16用于argR基因擴增的引物SEQ ID NO17含有argR基因的DNA片段的核苷酸序列SEQ ID NO18可以由上述DNA片段編碼的氨基酸序列SEQ ID NO19用于argR基因擴增的引物SEQ ID NO20用于argR基因擴增的引物SEQ ID NO21用于擴增含有argR基因的質粒中除argR基因ORF之外的部分的引物SEQ ID NO22用于擴增含有argR基因的質粒中除argR基因ORF之外的部分的引物序列表<110>Ajinomoto有限公司<120>棒狀細菌的精氨酸阻遇物缺陷型菌株和制備L-精氨酸的方法<130>OP1018<140><141>2001-04-<150>JP2000-129167<151>2000-04-28<160>22<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述作為擴增糞鏈球菌的卡那霉素抗性基因的引物<400>1cccgttaact gcttgaaacc caggacaata ac 32<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述作為擴增糞鏈球菌的卡那霉素抗性基因的引物<400>2cccgttaaca tgtacttcag aaaagattag 30<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述作為擴增大腸桿菌克隆載體PHSG399的引物<400>3gatatctacg tgccgatcaa cgtctc 26<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述作為擴增大腸桿菌克隆載體PHSG399的引物<400>4aggccttttt ttaaggcagt tattg 25<210>5<211>4447<212>DNA<213>乳發酵短桿菌<220><221>CDS<222>(1318)..(2598)<400>5aagcttgtct acgtctgatg ctttgaatcg gacggacttg ccgatcttgt atgcggtgat 60ttttccctcg tttgcccact ttttaatggt ggccggggtg agagctacgc gggcggcgac 120ctgctgcgct gtgatccaat attcggggtc gttcactggt tcccctttct gatttctggc 180atagaagaac ccccgtgaac tgtgtggttc cgggggttgc tgatttttgc gagacttctc 240gcgcaattcc ctagcttagg tgaaaacacc atgsaacact agggaaacac ccatgaaaca 300cccattaggg cagtagggcg gcttcttcgt ctagggcttg catttgggcg gtgatctggt 360ctttagcgtg tgaaagtgtg tcgtaggtgg cgtgctcaat gcactcgaac gtcacgtcat 420ttaccgggtc acggtgggca aagagaacta gtgggttaga cattgttttc ctcgttgtcg 480gtggtggtga gcttttctag ccgctcggta aacgcggcga tcatgaactc ttggaggttt 540tcaccgttct gcatgcctgc gcgcttcatg tcctcacgta gtgccaaagg aacgcgtgcg 600gtgaccacga cgggcttagc 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275 280 285tcg tct tgg tca cgt ggg gct aag cgt gct ttg ggc att gat tac ata 2229Ser Ser Trp Ser Arg Gly Ala Lys Arg Ala Leu Gly Ile Asp Tyr Ile290 295 300gac gct gat gta cgt cgt gaa atg gaa gaa gaa ctg tac aag ctc gcc 2277Asp Ala Asp Val Arg Arg Glu Met Glu Glu Glu Leu Tyr Lys Leu Ala305 310315 320ggt ctg gaa gca ccg gaa cgg gtc gaa tca acc cgc gtt gct gtt gct 2325Gly Leu Glu Ala Pro Glu Arg Val Glu Ser Thr Arg Val Ala Val Ala325 330 335ttg gtg aag ccc gat gat tgg aaa ctg att cag tct gat ttc gcg gtt 2373Leu Val Lys Pro Asp Asp Trp Lys Leu Ile Gln Ser Asp Phe Ala Val340 345 350agg cag tac gtt cta gat tgc gtg gat aag gct aag gac gtg gcc gct 2421Arg Gln Tyr Val Leu Asp Cys Val Asp Lys Ala Lys Asp Val Ala Ala355 360 365gcg caa cgt gtc gct aat gag gtg ctg gca agt ctg ggt gtg gat tcc 2469Ala Gln Arg Val Ala Asn Glu Val Leu Ala Ser Leu Gly Val Asp Ser370 375 380acc ccg tgc atg atc gtt atg gat gat gtg gac ttg gac gcg gtt ctg 2517Thr Pro Cys Met Ile Val Met Asp Asp Val Asp Leu Asp Ala Val Leu385 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1.一種棒狀細菌，其中精氨酸阻遏物不以通常的方式發揮作用，并且其具有L-精氨酸生產能力。
2.根據權利要求1的棒狀細菌，其中由于在該細菌的染色體上編碼精氨酸阻遏物的基因的破裂，所述的精氨酸阻遏物不以通常的方式發揮作用。
3.根據權利要求2的棒狀細菌，其中所述的精氨酸阻遏物具有SEQ IDNO18所示的氨基酸序列或與該氨基酸序列同源的氨基酸序列。
4.一種制備L-精氨酸的方法，其包括在培養基中培養根據權利要求1-3中任一項的棒狀細菌，以便在該培養基中生產和積累L-精氨酸，并且從該培養基中收集該L-精氨酸。
全文摘要
通過在培養基中培養一種棒狀細菌以便在該培養基中產生和積累L－精氨酸并且從該培養基中收集所述的L－精氨酸來制備L－精氨酸,在該細菌中參與L－精氨酸生物合成的精氨酸阻遏物通過破裂編碼該阻遏物的基因而缺失,且該細菌具有L－精氨酸生產能力。
文檔編號C07K14/34GK1347982SQ0111965
公開日2002年5月8日 申請日期2001年4月28日 優先權日2000年4月28日
發明者菅美喜子, 朝倉陽子, 森由起子, 伊藤久生, 倉橋修 申請人:味之素株式會社