專利名稱：新型分泌表達載體及其在重組水蛭素表達技術中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種應用于基因工程領域的新型大腸桿菌高效分泌表達載體的組建及其實際用途，尤其在重組水蛭素的表達技術中的應用。
多肽蛋白的表達在基因工程技術中并沒有通用的法則，為了獲得有效的表達，不同的目的產物因其結構性質不同所采取的表達系統與表達方式也不同。大腸桿菌是應用最早的原核表達系統，其表達方式主要有三種形式非融合表達、融合表達以及分泌表達。非融合表達方式在復性過程中肽鏈的錯誤折疊、二硫鍵的錯配往往會造成活性產物得率大大降低。此外由于其N端不可避免地多出一個甲硫氨酸，這將嚴重影響某些多肽分子的生物活性。融合蛋白雖然容易得到高水平表達，然而融合蛋白的純化與切割卻存在一定問題，化學方法切割難以恢復其天然構象；而酶法切割的切割效率不高，產品的最終收率低。分泌表達方式則是將目的基因嵌合在信號肽基因下游，目的產物在信號肽介導下分泌至細胞外周質或培養基中，同時信號肽被信號肽酶識別并切除，從而可以直接獲得成熟的活性多肽產物。
現有的分泌表達載體，如PIN-Ⅲ-ompA，所采用的是大腸桿菌外膜蛋白(ompA)信號肽序列，其后是用來插入外源基因的多克隆位點，當外源基因插入后，信號肽基因與目的基因間往往存在一段多余的連接序列，這樣，為了得到N-端正確的目的產物，必須采用定點誘變技術，以去除信號肽基因與目的基因間的多余序列，操作十分繁鎖。
本發明的目的在于創建一種新型分泌表達載體，該載體優點之一是任何外源基因通過PCR技術在其5’端引入NheⅠ位點后都可直接與信號肽拼連，而且在信號肽基因與目的基因間不存在多余的連接片段；優點之二是可實現目的蛋白的高效分泌表達，表達產物無需通過變性復性等處理便具有生物活性。
本發明的目的還在于組建一種能夠將表達產物分泌至細胞周質或培養基中同時保持其生物活性的新型分泌表達載體，及其在實現目的基因的分泌表達中的應用，尤其是在基因重組水蛭素及其突變體中的應用。
本發明的實施方案如下
一種用于重組蛋白或多肽生產的原核分泌表達載體，其特征是含有tac強啟動子、L-門冬酰胺酶信號肽簡并基因以及pUC18高拷貝復制原點。
一種用于重組蛋白或多肽生產的原核分泌表達載體的應用，其特征在于用含有tac強啟動子、L-門冬酰胺酶信號肽簡并基因以及pUC18高拷貝復制原點的原核分泌表達載體中L-門冬酰胺酶信號肽簡并基因3’端與目的蛋白編碼基因5’端拼連組建成重組質粒，該質粒導入E.coli宿主細胞后，可實現目的基因的分泌表達。
一種用于重組蛋白或多肽生產的原核分泌表達載體在基因重組水蛭素及其突變體中的應用，其特征在于用含有tac強啟動子、L-門冬酰胺酶信號肽簡并基因以及pUC18高拷貝復制原點的原核分泌表達載體中L-門冬酰胺酶信號肽簡并基因3’端與目的蛋白水蛭素編碼基因5’端拼連組建成重組質粒，該質粒載體分泌表達基因重組水蛭素及其突變體。
這類載體設計的基本策略是根據L-門冬酰胺酶信號肽氨基酸序列及基因序列(Jennings M P and Beacham I R.1990.Journal of Bacteriology.172(3):1491-1498.)利用密碼子的簡并性設計出新的信號肽簡并基因，目的是在信號肽編碼基因3’端基因內引入NheⅠ限制酶切位點，以便利用該位點與目的蛋白編碼基因相拼連同時保證讀碼框架不變；將該信號肽-目的蛋白融合基因插入表達載體啟動子下游的多克隆位點便構建成表達該目的蛋白的重組分泌表達載體。
信號肽簡并基因的設計與合成原AsPsⅡ信號肽基因序列(Jennings M P and Beacham I R.1990.Journalof Bacteriology.172(3):1491-1498.)為Met Glu Phe Phe Lys Lys Thr Ala Leu Ala Ala Leu Val Met GlyATG GAG TTT TTC AAA AAG ACG GCA CTT GCC GCA CTG GTT ATG GGTTAC CTC AAA AAG TTT TTC TGC CGT GAA CGG CGT GAC CAA TAC CCAPhe Ser Gly Ala Ala Leu AlaTTT ACT GGT GCA GCA TTG GCAAAA TCA CCA CGT CGT AAC CGT
為了克隆需要利用密碼子的簡并性將其設計成如下簡并基因Met Glu Phe Phe Lys Lys Thr Ala Leu Ala Ala Leu Val Met GlyATG GAG TTT TTC AAA AAG ACG GCA CTT GCC GCA CTG GTT ATG GGTTAC CTC AAA AAG TTT TTC TGC CGT GAA CGG CGT GAC CAA TAC CCAPhe Ser Gly Ala Ala Leu AlaTTT AGT GGT GCA GCG CTA GCTAAA TCA CCA CGT CGC GATCGA這樣在不改變AsPsⅡ信號肽原來氨基酸序列的基礎上在其編碼基因的3’端引入了NheⅠ限制性內切酶酶切位點GCTAGC。
為了組裝上述AsPsⅡ信號肽簡并基因，合成下列四條寡核苷酸S1-(1): 5’ AA TTC ATG GAG TTT TTC AAA AAG ACG GCA CTT GC 3’S1-(2): 5’ TGC GGC AAG TGC CGT CTT TTT GAA AAA CTC CAT G 3’S2-(1): 5’ C GCA CTG GTT ATG GGT TTT AGT GGT GCA GCG 3’S2-(2): 5’ C TAG CGC TGC ACC ACT AAA ACC CAT AAC CAG 3’將S1-(1)和S1-(2)為一組；S2-(1)和S2-(2)為另一組分別退火配對，T4多核苷酸激酶磷酸化，然后采用T4 DNA連接酶進行連接，便可得到5’端為EcoRⅠ、3’端為NheⅠ限制性內切酶粘性末端的AsPsⅡ信號肽簡并基因5’AAT TTC ATG GAG TTT TTC AAA AAG ACG GCA CTT GCC GCA CTG GTT3’G TAC CTC AAA AAG TTT TTC TGC CGT GAA CGG CGT GAC CAAATG GGT TTT AGT GGT GCA GCG 3’TAC CCA AAA TCA CCA CGT CGC GAT C 5’采用PCR技術便可以HV3基因5’端引入NheⅠ位點，酶切后將之與上述信號肽基因連接便可得到L-門冬酰胺酶信號肽-水蛭素融合基因。
用NruⅠ和PvuⅠ切取質粒pkk223-3的含啟動子及多克隆位點的片段用PvuⅡ和PvuⅠ切取質粒pvc18的含復制起始原點的片段，將上述兩片段進行連接，便得到質粒pTA。將L-門冬酰胺酶信號肽-水蛭素融合基因插入質粒pTA的多克隆位點便得到水蛭素分泌表達質粒pTASH。
本發明的有益效果表現在本發明中的分泌表達載體具有二大優點，一是任何外源基因通過PCR技術在其5’端引入NheⅠ位點后都可直接與信號肽拼連，且在信號肽基因與目的基因間不存在多余的連接片段；二是實現了高效分泌表達，表達產物無需變性復性等處理便具有生物活性。
本發明中，目的基因方便地置于信號肽基因下游并進行表達，目的產物表達水平較高；表達產物免除了N端甲硫氨酸延伸；避免了復性過程中多肽鏈的錯誤折疊及二硫鍵的錯配問題；表達產物在分泌過程中直接形成具有天然構象的活性分子，并分泌至細胞周質或培養基中，省卻了產物的變性、切割、復性等復雜的產物后處理程序，降低了產物損失，給目的產物的分離純化帶來極大的方便。
圖面說明
圖1重組質粒pUCH33中水蛭素HV3編碼基因序列圖2 pTASH質粒圖譜(Ptac:tac啟動子；SIG:L-門冬酰胺酶信號肽基因；HV水蛭素Ⅲ編碼基因；AP氨芐青霉素抗性基因；0ripUC18高拷貝復制原點)下面的優選例對本發明作詳細敘述，但并不意味著限制本發明的范圍。實施例中常規分子克隆操作參照文獻(《分子克隆實驗指南》第二版，金冬雁等譯，1995年，科學出版社)。
實施例1 L-門冬酰胺酶簡并信號肽基因的組裝DNA合成儀合成的寡核苷酸鏈5’端是羥基，在進行退火、連接前用T4多核苷酸激酶將其磷酸化。磷酸化反應參照Promega公司產品說明書進行，為減少激酶用量，適當延長反應時間。20ul反應體系組成如下寡核苷酸鏈200pmol；10×反應緩沖液2ul；ATP(5mM)1ul；H2O適量；T4多核苷酸激酶2ul。37℃反應2.0小時，70℃保溫10分鐘中止酶反應。
將等摩爾數的互補寡核苷酸鏈在80ul終體積退火緩沖液中混合覆蓋無菌石蠟油，95℃水浴保溫5分鐘，然后緩慢冷卻至室溫。將此退火混合物用乙醇沉淀后，采用垂直板非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠濃度為5-15％，電泳緩沖液為1×TBE，電壓為8v/cm，以pGEM-3Zf(+)/HaeⅢDNA Marker為標準，電泳完畢后回收，采用T4DNA連接酶進行連接，便得到大小為66bp左右的簡并信號肽基因。實施例2 L-門冬酰胺酶信號肽-水蛭素融合基因的制備設計如下一對引物(1) 5’AATGCTAGCTATCACCTACACTGACTGCACC 3’(引物1)(2) 5’CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG 3’(引物2，即GIBCOBRL公司pUC通用測序引物序列)以質粒pUCH33(本實驗室采用人工合成技術克隆的含有水蛭素HV3編碼基因的重組質粒，基因位于pUC18的SacⅠ/HindⅢ酶切位點間，序列見圖1)為模板進行PCR擴增，將擴增得到的片段用NheⅠ和HindⅢ雙酶切，得到5’端為NheⅠ粘性末端、3’端為HindⅢ粘性末端的水蛭素HV3編碼基因。采用T4DNA連接酶將該基因與實施例1得到的L-門冬酰胺酶簡并信號肽基因進行連接便得到L-門冬酰胺酶信號肽-水蛭素融合基因。
實施例3分泌表達載體的構建取質粒pkk223-3(參見Brosius,J.Proc.Acad.Sci.USA 1984,81:6929)用NruⅠ和PvuⅠ雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，回收含有tac啟動子的片段(片段1)；取質粒pUC18(購自上海華美生物工程公司)用PvuⅡ和PvuⅠ雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，回收含有pUC8復制起始原點的片段(片段2)。將片段1和片段2用T4DNA連接酶連接，連接產物轉化E.coliDH5 α便得到質粒pTA，將實施例2制備的L-門冬酰胺酶信號肽-水蛭素融合基因插入質粒pTA便得到重組質粒pTASH。
實施例4重組水蛭素HV3的分泌表達將重組質粒pTASH轉化E.coli ASl.357，挑取陽性克隆，接入50ml LBA液體培養基(蛋白胨1％，酵母膏0.5％，氯化鈉1％，氨芐青霉素100ppm,pH7.0)37℃振蕩培養16小時得到種液，按2％(V/V)比例將此種液接入發酵培養基(玉米漿5.0％，牛肉膏3.5％，谷氨酸鈉1.0％。氨芐青霉素100ppm,pH7.0)37℃搖瓶振蕩培養20小時，發酵液上清中抗凝血酶活力達700ATU/ml發酵液。
水蛭素生物活性測定參照Markwardt的凝血酶滴定方法(Markwardt FMethods in Enzymology 1970,19:924-932)進行。于酶標板小孔中加200ul 0.5％牛血纖維蛋白原(50mM Tris-HCl緩沖液(pH7.4)配制)，再加入10-l00ul水蛭素溶液，充分混勻。用微量進樣器吸取標準的凝血酶溶液(100NIH單位/ml)進行滴定，每次滴定量為5ul(0.5NIH單位)，時間間隔為1分鐘，若在1分鐘內纖維蛋白原發生凝固，即說明已達到滴定終點。由凝血酶的消耗量可以換算出水蛭素的單位數。由于水蛭素與凝血酶是1∶1結合，故每消耗一個凝血酶單位(NIHU)相當于一個抗凝血酶單位(ATU)。
權利要求
1.一種用于重組蛋白或多肽生產的原核分泌表達載體，其特征是含有tac強啟動子、L-門冬酰胺酶信號肽簡并基因以及pUC18高拷貝復制原點。
2.一種用于重組蛋白或多肽生產的原核分泌表達載體的應用，其特征在于用含有tac強啟動子、L-門冬酰胺酶信號肽簡并基因以及pUC18高拷貝復制原點的原核分泌表達載體中L-門冬酰胺酶信號肽簡并基因3’端與目的蛋白編碼基因5’端拼連組建成重組質粒，該質粒導入E.coli宿主細胞后，目的基因進行分泌表達。
3.一種用于重組蛋白或多肽生產的原核分泌表達載體在基因重組水蛭素及其突變體中的應用，其特征在于應用權利要求2所述的質粒載體分泌表達基因重組水蛭素及其突變體。
全文摘要
一種基于大腸桿菌(E.coli)L－門冬酰胺酶信號肽新型簡并基因的高效分泌表達載體及其在表達重組水蛭素中的應用,該載體包括tac強啟動子、L－門冬酰胺酶信號肽新型簡并基因以及pUC18高拷貝復制原點。將目的基因置于信號肽基因下游進行表達,目的產物便可形成正確的空間構象同時分泌至細胞外周質或/及培養液中,本發明對表達生物活性蛋白或多肽時保證分子內二硫鍵的正確構象、方便表達產物的下游提取與純化具有重要的意義。
文檔編號C07K14/81GK1319671SQ0111352
公開日2001年10月31日 申請日期2001年4月13日 優先權日2001年4月13日
發明者譚樹華, 吳梧桐 申請人:中國藥科大學