專利名稱：一種聯合制備高純度紫杉醇、三尖杉寧堿,10－脫乙酰基巴卡亭Ⅲ的方法
技術領域：
本發明涉及用紅豆杉科植物及其變種的樹葉、樹皮、樹枝作原料聯合制備純度達≥99.5％的紫杉醇(Taxol)、三尖杉寧堿、(Cephalmannine)巴卡亭III(10-deacetyl baccatinIII)的方法。
紫杉醇和一些半合成紫杉烷類衍生物如Taxotere已成為一類有效的抗癌藥物。10-脫乙酰基巴卡亭III和三類杉寧堿是半合成紫杉烷類藥物的主要原料，與紫杉醇一起存在于許多紅豆杉科植物的樹葉、樹皮、樹枝中，現代醫藥工業要求紫杉醇原料藥的純度達≥99.5％，三尖杉寧堿和10-脫乙酰巴卡亭III的純度也應達≥98％。
現已報道的從各種紫杉植物中提取紫杉醇的方法，需經過繁冗的分離過程，例如O.C.H.Huang等在J.Nat.Prod.49 665(1986)揭示的分離方法，仍是較流行的紫杉醇生產方法，該法是先用甲醇浸出粉碎后的短葉紫杉樹皮，將浸提液濃縮，用二氯甲烷萃取濃縮物，將二氯甲烷溶液與水進行萃取，再將二氯甲烷層干燥、溶縮制得浸膏。將浸膏溶解后制樣，用硅膠作固定相進行多次正相色譜分離，得到紫杉醇濃縮物，再經過氧化，色譜法提純，重結晶得到紫杉醇產品。這類方法收率低，許多付產品，如三尖杉寧堿經氧化后，已被分解，10-脫乙酰基巴卡亭III也不易回收。
中國專利公開號CN1140170A提出了一種用多孔高分子填料為固定相的反相液相色譜法，從紫杉植物體的浸膏中回收紫杉醇的方法。該方法選擇性好，回收率高，有可能在生產紫杉醇時，綜合回收其它付產品。但用該方法在制備浸膏時，仍用二氯甲烷(或氯仿)萃取紫杉樹皮或樹葉的甲醇提取物，此階段10-脫乙酰巴卡亭III會流失于水相中，造成該付產品損失。該方法揭示，在從洗脫液中分離出紫杉醇等有效成分時，采用濃縮干燥的方法在工業上操作不便，易造成紫杉醇產品的降解。在該方法應用中發現，由于某些存放年代較久的樹皮或樹葉的浸膏中會產生了大量的降解產物，這些降解產物與紫杉醇的保留值相近，干擾了反相色譜法制備紫杉醇，影響了產品的純度。至今，未見制備三尖杉寧堿純品的報道。
作為本發明的主題，本發明者發明了一種適合于以各種紫杉植物的樹葉、樹皮，或樹枝作原料聯合制備高純度紫杉醇、10-脫乙酰基巴卡亭III和三尖杉寧堿的方法，方法回收率高，產品純度好，實現了對紫杉植物原料的綜合利用。
本發明的方法包括1、用甲醇或乙醇滲濾浸出研磨后的紫杉植物的樹葉、樹皮或樹枝，將濾液過濾后，減壓濃縮至干，用乙酸丁酯(或乙酸乙酯)溶解殘余物，過濾，往得到的乙酸丁酯(或乙酸乙酯)溶液中加入5％碳酸氫鈉(或碳酸鈉)水溶液進行反萃取，分出有機相，再用水洗滌有機相至水相呈中性，分出乙酸丁酯(或乙酸乙酯)層用無水硫酸鈉干燥后，減壓蒸發至干，用乙腈溶解殘渣，在0-5°下放置24小時，10-脫乙酰基巴卡亭III沉淀析出，過濾，洗滌沉淀，干燥后得到純度85-90％的10-脫乙酰基巴卡亭III產品，產品在二氯甲烷/石油醚中重結晶得到純度99％的10-脫乙酰基巴卡亭III。
2、將上步得到的乙腈濾液中加入多孔高分子填料，在回轉蒸發器中減壓蒸發除去乙腈后得到固相上樣物料，將此固相上樣物料置于填充有多孔高分子填料固定相的反相色譜柱的床層頂端，用不同濃度的甲醇水溶液進行洗脫，三尖杉寧堿，紫杉醇順次序餾出，分別收集三尖杉寧堿和紫杉醇餾分，加水稀釋后在0-5℃下放置一天，三類杉寧堿和紫杉醇分別沉淀出，過濾得到兩者的粗產品，分別再用上述反相色譜法進行分離，沉淀和干燥，得到三尖杉磷堿純品(純度99％)和紫杉醇純品(根據原料不同，純度在95-98％范圍)。
3、將紫杉醇純品溶于二氯甲烷中，注入—以硅膠作固定相的正相色譜柱內，用環己烷/乙酸乙酯(7∶3V/V)進行洗脫，收集紫杉醇餾分，減壓蒸出溶劑后，將殘渣在甲醇/水中重結晶，得到高純紫杉醇，在凍干機內干燥后，其純度達99.6％。
本發明可以用各種紫杉植物的樹葉、樹皮或樹枝部分的醇提取物來聯合生產高純度紫杉醇，10-脫乙酰基巴卡亭III和三尖杉寧堿。
本發明的特征在于用乙酸丁酯(或乙酸乙酯)，溶解紫杉樹葉，樹皮或樹枝的醇提取物，然后用碳酸氫鈉(或碳酸鈉)水溶液反萃取除去色素等酸性雜質后，蒸發除去溶劑，用乙腈溶解殘渣，冷凍結晶得到10-脫乙酰基巴卡亭III。
本發明的特征在于從沉淀了10-脫乙酰巴卡亭III的母液作原料，用以高分子填料為固定相的反相色譜法分離和純化獲得三尖杉寧堿和紫杉醇。
本發明的特征在于在所述及的反相色譜法運作中，采用冷凍結晶法分離洗脫液中有效成分，再結合以國產硅膠為固定相的正相色譜法深度純化紫杉醇產品，獲得99.6％以上純度的紫杉醇。
以下實施例詳述本發明取30kg云南紅豆杉干樹葉，粉碎后用300L甲醇在室溫下攪拌浸提8小時，離心過濾，用100L甲醇洗滌濾渣，合并濾液，在40℃下，減壓蒸出溶劑。用20升乙酸乙酯溶解殘留物，加1Kg硅藻土，攪拌后過濾。將濾液與20L 5％NaHCO3水溶液一起放入一攪拌槽中進行攪拌萃取，分層后棄去水相，再加入20L 5％NaHCO3水溶液，攪拌萃取后棄去水相，用水洗滌有機相，至水相呈中性，分出有機相，往其中加入無水硫酸鈉干燥過液，在40℃下減壓蒸發有機溶劑，得到210克固體殘渣，用1.5L乙腈將渣溶解，溶液在0-5℃下放置24小時，10-脫乙酰巴卡亭III沉淀析出，沉淀再在二氯甲烷/己烷混合液中重結晶得到6.8克純度為99.0％白色粉末狀10-脫乙酰基巴卡亭III。
過濾后得到的乙腈母液，加入300克A05型聚苯乙烯—二乙烯基苯高分子固定相(粒徑50-70微米，比表面積400m2/g，平均孔徑150A°，發明者研制，參見Liu kailu et al，J.Liquid Chrom.16(14)3083-3092(1993))，減壓蒸發除去溶劑，得到負載有浸出物的高分子固定相，將此負載浸出物高分子固定相加至—反相色譜柱的床層頂端，此不銹鋼色譜柱直徑Φ80mm，色譜床層高1500mm，色譜固定相為A05型聚苯乙烯—二乙烯基苯高分子固定相，按順序用50％，60％，70％(V/V)甲醇—水溶液來洗脫色譜柱，有色雜質，葉綠素，10-deacetyl-7-Epi-baccatinIII，10-deacetyl taxol，三尖杉寧堿和紫杉醇順次餾出，分別進行收集。收集的富三尖杉寧堿餾分，加入等體積的水，在0-5℃下放置24小時，有結晶析出，過濾得到三尖杉寧堿粗品2.7g，含量85％。將此粗品溶于70％甲醇中，注入一直徑Φ40mm，長1000mm的不銹鋼反相色譜柱內，色譜固定相為A05型高分子固定相(30-40微米粒徑)用70％醇/水溶液進行洗脫，將含有有效成分的餾分加水后，冷凍結晶，得到純度為99％三尖寧堿產品2.1g。
將富紫杉醇餾分加入等體積水，在-5℃下放置24小時，過濾沉淀，得紫杉醇2.8克，用70％甲醇溶解此產品，注入上述Φ40mm，長100mm色譜柱中，用70％甲醇/水溶液進行洗脫，餾出的富紫杉醇餾分，加水稀釋，在-5℃下冷凍結晶，干燥后得紫杉醇2.1克，純度為98.0％。
將上述產品用二氯甲烷溶解，注入一直徑Φ40mm，長50mm的不銹鋼色譜柱中，固定相為青島海洋化工廠生產色譜級硅膠，粒徑30-40微米，用7∶3(V/V)的環己烷/乙酸乙酯洗脫，得到的紫杉醇餾分在減壓下蒸發至干，殘余物用少許甲醇溶解，加入水進行重結晶，得到白色絮狀晶體，經真空凍干得產品1.8克，純度為99.6％。
實例2按實例1所述方法，用300L95％乙醇在室溫下浸提30Kg粉碎后的云南紅豆杉樹皮，過濾，用100L95％乙醇洗濾渣，合并濾液，在40℃下減壓蒸發除去溶劑，得4.85Kg的醇提取物。按實例1所述方法，得到5.6克純度99％10-脫乙酰基巴卡亭III，三尖杉寧堿6.2克，純度為98.1％，紫杉醇6.8克，純度為99.7％。
權利要求
1.一種從紫杉植物的葉、樹皮或樹枝的醇提取物中聯合生產高純紫杉醇、10-脫乙酰基巴卡亭III和三尖杉寧堿的方法。其特征是用乙酸丁酯(或乙酸乙酯)來溶解此醇提取物，得到的乙酸丁酯(或乙酸乙酯)溶液經碳酸氫鈉(或碳酸鈉)水溶液反萃取去除雜質后，蒸發除去溶劑，用乙腈溶解殘渣，冷凍結晶得到10-脫乙酰巴卡亭III。以結晶母液作原料，用以高分子填料為固定相的反相色譜法分離和純化獲得三尖杉寧堿和紫杉醇。
2.權利要求1的方法，其特征是在所述及的反相色譜法中，采用冷凍結晶法分離洗脫液中有效成分，再結合以國產硅膠為固定相的正相色譜法深度純化紫杉醇產品，獲得純度達99.6％以上紫杉醇。
全文摘要
本發明提供一種從紫杉植物的樹葉、樹皮或樹枝的醇提取物中聯合生產高純紫杉醇、10－脫乙酰基巴卡亭III和三尖杉寧堿的方法,用乙酸丁酯溶解醇提取物后,用碳酸氫鈉溶液反萃取去除雜質將有機相減壓蒸發除去溶劑,用乙腈溶解殘渣,冷凍結晶得到10－脫乙酰基巴卡亭III,以結晶母液作原料,用以高分子填料為固定相的反相色譜法分離,純化獲得三尖杉寧堿和紫杉醇,用冷凍結晶法從反相色譜洗脫液中分離出有效成分,再結合以硅膠為固定相的正相色譜法深度純化紫杉醇產品,其純度達99.6%以上。
文檔編號C07D305/00GK1377882SQ01110208
公開日2002年11月6日 申請日期2001年4月2日 優先權日2001年4月2日
發明者劉開祿, 袁斯鳴, 劉進 申請人:北京普瑞孚天然藥物現代純化和分離研究所有限公司