專利名稱：一種類人膠原蛋白及其生產方法
技術領域：
本發明涉及一種類人膠原蛋白及通過基因工程菌生產類人膠原蛋白的方法。
膠原蛋白是人體固有蛋白之一，它在皮膚里的含量最多，由于膠原蛋白固有的生物兼容性、生物降解性和吸收性、促新細胞形成及促上皮細胞形成功能，膠原蛋白在醫學領域、美容、化妝品、保健品行業的潛在用途不斷拓寬，但是，動物體膠原蛋白是一種硬蛋白(水不溶)，并且隨著年齡的增長，內部雙鍵越來越多，同時也越來越硬。一般，經酶解獲得的膠原蛋白為水不溶性蛋白，也不可能在不改變分子量情況下重溶解。因此，可加工性能很弱，直接限制了許多潛在用途的開發。另外，來自動物體的膠原蛋白不可能排除病毒隱患，同時始終帶有牛膠原的特性，為了降低其免疫排異反應，科學家們曾想法從人胎盤中獲取膠原蛋白，但是，該研究受到世界人權組織及FDA的阻力，因為，不能確切檢測每個胎盤組織的病毒和細菌。
在現有技術中，國內外市場小批量膠原蛋白的生產均來自動物皮、跟腱、軟骨和人胎盤的提取物。其提取工藝分三步，一、溶解；二、酶處理；三、純化。但通過動物皮提取類膠原蛋白可能帶有各種病毒，因此動物皮及臟器提取物的各種產品直接用于人體會造成嚴重隱患。
國外報道用重組技術生產膠原蛋白研究有重組酵母細胞生產準人膠原蛋白II，重組哺乳動物細胞生產準人膠原蛋白I，II，III型，重組啤酒酵母細胞生產準人膠原蛋白VI，重組昆蟲細胞生產準人膠原蛋白II，表達量為50mg/ml，人腫瘤細胞生產準人纖維膠原1A1和1A2，由于動物細胞培養成本昂貴，周期長，一般15天甚至更長，另外培養規模只能限于實驗規模，要滿足產業化、大批量需求幾乎是完全不可能。另外，這些重組類膠原蛋白都必須有后轉化酶的參與，必須有一個后轉化工藝，到目前為止，用重組動物細胞生產膠原蛋白必須8種后轉化酶的參與，轉化工藝相當復雜。
本發明目的是提供一種能在單細胞內取得高表達的類人膠原蛋白，其具有優于動物體膠原蛋白的獨特的化學結構和性能，同時提供該膠類人原蛋白的生產方法。
為達到上述目的，本發明所采用的技術方案為一種類人膠原蛋白，其特殊之處在于其序列如下HDP VVL QRR DWE NPG VTQ LNR HLA HAH PPF ASD HPM GAPGPA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSAGAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAPGPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPPGAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAPGPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPAGPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAH GPA GAL GAHGPA GPL GPA GPP GSA GAP GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAHGPA GPL GAH GPA GPL GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPAGPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSAGAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAPGPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPPGAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAPGPA GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSAGAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAPGPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPPGAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAPGPA GPP GSA GAP GPP GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPAGPL GAH GPA GPL GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSAGAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GSA GAP GPP GAP GPAGPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSAGAP GPP GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAM GAPGAT GLS AGA THG LVT CGL其結構為三鏈、三螺旋結構，其核酸長度為1071bp。
一種類人膠原蛋白的生產方法，其特殊之處在于它包括以下步驟1)、類人膠原蛋白的工程菌的構建；2)、工程菌的發酵培養；3)、類人膠原蛋白的誘導及表達；4)、類人膠原蛋白的提純。
一種類人膠原蛋白的生產方法，其特殊之處在于所述類人膠原蛋白的工程菌的構建如下1)、將人體已知膠原蛋白序列的一段基因抽提出來并進行修飾后，再特定重復，然后進行縫合，DNA重組；2)、將重組DNA轉入到大腸桿菌；一種類人膠原蛋白的生產方法，其特殊之處在于所述工程菌的發酵培養基為酵母粉10-30g/L 葡萄糖 15-38g/LNaHPO42.5-8.7g/L(NH4)2SO43.6-5.6g/LFeCl30.8-1.6g/LCoCl2.6H2O 0.1-0.3g/LZnSO40.1-0.3g/L一種類人膠原蛋白的生產方法，其特殊之處在于所述工程菌的發酵培養條件為培養溫度34℃，PH7.0溶氧DO 20％，空氣流量為1VVM-4VVM，攪拌轉速450r/min-1000r/min，接種量5％，種子培養基，LB培養基、卡那霉素0.5mg/L、葡萄糖5g/L，以葡萄糖濃度控制1.5％為宜，用DO量控制為40％為宜，當OD600的值為150時收獲細胞。
一種類人膠原蛋白的生產方法，其特殊之處在于所述類人膠原蛋白的提純如下細胞經離心收集后經高壓細胞勻將，然后用緩沖液抽提，經過第一次甲酸緩沖液鹽析后，接著進行離子交換，再經金屬離子螯合吸附，精制和除熱源，精品去冷凍干燥。
下面結合具體實施例，詳細描述本發明如下類人膠原蛋白的生產方法包括類人膠原蛋白的工程菌的構建；工程菌的發酵培養和誘導；膠原蛋白的提純，獲得目的蛋白。
一、類人膠原蛋白的工程菌的構建(一)、從E.coLi菌株制備質粒DNA在小規模制備時質粒DNA從1.5ml大腸桿菌培養物經酸溶解法制備。
在大規模制備時載體菌株在含有抗菌素的培養基上培養過夜，離心收集細胞、離心速度10000r/min 5分鐘，然后重新懸浮于10ml冰冷的TE緩沖液溶液(10ml EDTA，pH8，)再離心，再懸浮于4ml TES(TE及20％的蔗糖液中)，加入溶解酶培養5分鐘后加入2ml0.5M EDTA，培養10分鐘后加入蛋白溶解酶及溶解緩沖液，后經培養、離心收集(35000r/min收集2hr)后上清液轉入離心管按比例加入CsCl等。
(二)、DNA醇析在DNA樣品中加入10％的醋酸鈉(pH7.5)及3倍體積的冷乙醇，-70℃培養30min，此時DNA析出。4℃離心5min后將上清液重新醇析(用80％的冷乙醇)，之后重新溶入DNA緩沖液中。
(三)、DNA限制性內切酶消化將DNA用限制性內切酶在其相應的緩沖液中用酶消化，DNA濃度維持4％，37℃培養3hr，緩沖液配比(0.37mol/L Tris，0.74mol/L醋酸鉀)，0.2mol/L乙酸鎂0.05mol/L DTT(二硫蘇糖醇)，PH＝8.0(四)、DNA電泳分析于DNA樣品中加入電泳緩沖液，50V恒壓下運行20hr。緩沖液配比同常規電泳緩沖液。
實施例1D1型膠原蛋白用限制性內切酶HindIII合成PPD1121質粒進行消化，然后用瓊脂糖分離，取膠原蛋白基因片段，純化后與消化后的質粒PSC101縫合，縫合DNA轉入大腸桿菌BL21或HB101中，用卡納霉素進行克隆選擇。將克隆株重新培養，用SDS-Page進行抗性識別和蛋白表達分析。
(五)、DNA縫合在DNA縫合粘合劑作用下于室溫下反應2hr。對鈍端反應劑為每微克DNA加入MgCl25mmol/μg、Tris-HCl 20-25mmol/μg、DTT 5-10mmol/μg、BSA 180-220mg/μg、ATP 0.5-0.75mmol和400-450單位。T4 DNA鏈接酶，縫合反應室溫下1hr-2hr。
(六)、DNA瓊脂糖縫合將瓊脂糖溶解(65℃)，降至37℃時，加入縫合緩沖液，室溫縫合1hr.
(七)、DNA純化及瓊脂糖DNA純化分別依據Millipore ultrafree-probind filter Unit處理，或用Bio-Spin 6 Column柱處理。
(八)、轉細菌方法1、E.coli細胞的制備接種大腸桿菌細胞BL21于無菌LB培養基中34℃振蕩培養，當OD600為0.5時，置于冰浴中10min，然后離心分離(6000r/min下10min)，細胞收集物重新懸浮于0.1MMgCl2溶液中冰浴40min中，離心收集，于細胞收集物中加入冰浴過的100mM CaCl22ml，無菌條件下，冰浴培養24hr，細胞被分到小離心管內-70℃保存。
2、E.coli轉化將細胞解凍并冰浴，每50μl細胞加1μg DNA，冰浴30分鐘，然后42℃水浴2分鐘，加入1ml LB培養基，將混合物轉入34℃振蕩培養2hr。此時10％的轉化物含有抗菌素。
(九)、蛋白表達分析在搖瓶內裝入10％LB培養液加入5％的卡那霉素于34℃培養過夜，當OD600達1時，將溫度調至42℃培養2hr后冰浴，以備免疫印標實驗用。
(十)、免疫印跡實驗依據蛋白電泳實驗程序，將凝膠一維電泳轉化到二維凝膠電泳，然后經過牛奶培養，用小鼠抗體IgG及磷酸絲氨酸抗體PSR-45進行免疫印跡實驗。
(十一)、氨基酸含量分析使用氨基酸分析儀，樣品經6N HCL水解。
(十二)、DNA序列分析使用DNA序列分析儀(十三)、氨基酸序列分析使用氨基酸序列分析儀二、工程菌的發酵培養和誘導發酵條件培養溫度34℃，pH7.0溶氧DO 20％，空氣流量為1VVM-4VVM，攪拌轉速450r/min-1000r/min，接種量5％，種子培養基，LB培養基、卡那霉素0.5mg/L、葡萄糖5g/L。
流加策略以葡萄糖濃度控制1.5％為宜，用DO量控制為40％為宜。
當OD600的值為100時將培養溫度調節到42℃誘導2小時收獲細胞。
發酵培養基為酵母粉10-30g/L 葡萄糖 15-38g/LNaHPO42.5-8.7g/L(NH4)2SO43.6-5.6g/LFeCl30.8-1.6g/LCoCl2.6H2o 0.1-0.2g/LZnSO40.1-0.3g/L發酵培養基的最佳方案為酵母粉20g/L， 葡萄糖 30g/LNaHPO46.7g/L (NH4)2SO45.6g/L
微量元素 FeCl31.2g/LCoCl2.6H2O 0.2g/LZnSO40.2g/L補料培養基10倍濃縮的發酵培養基三、類人膠原蛋白的提純分離純化工藝離心收集→細胞勻漿→緩沖液抽提→鹽析→離子交換→柱層析精制→冷凍干燥細胞經離心后加入緩沖液(Tis pH8.0，10mM EDTA)按5倍于細胞濕重加緩沖液體積。超聲破碎20min后，用甲酸緩沖液鹽析粗提后，用離子交換樹脂吸附以0.5M NaCl、20mM Tris pH8.0洗脫后，再用金離螯合柱吸附、洗脫，收集蛋白冷凍干燥。
本發明將人體已知序列的膠原蛋白的一段基因經修飾后進行特定重復而后克隆到大腸桿菌中，籍細胞的快速繁殖在特定條件下通過誘導獲得的，并經過對其水溶性、免疫排異性、穩定性、成膠性、吸收性等特性的改進，使其產品結構及性能在國內、外屬首創。該發明取得了膠原蛋白的高表達，其表達量為20-50％，其生成的類人膠原蛋白脯氨酸較動物體膠原蛋白少40％-60％，這給本發明生產的類人膠原蛋白增添了很多動物體膠原蛋白不具備的優勢，其化學活性氨基酸部位更多，其衍生物種類將更加多樣化，其性能將更能滿足不同行業的需求。
該技術所產生的類人膠原蛋白不但具有動物體膠原蛋白固有的生物兼容性及生物重吸收性，而且在特定溫度下具有熱可逆成膠的特性；具有低免疫排異反應和無病毒隱患的優點，它可以實現高分子膠原蛋白在單細胞內的高表達；它產生的類人膠原蛋白為螺旋結構，具有優于動物體膠原蛋白的獨特的化學結構和性能，如熱可逆成膠性，水溶性，低免疫排異反應等，例如，為了降低生物體膠原蛋白的免疫排異反應，我們使用的三肽鏈含有帶有簡單側鏈的甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、纈氨酸等并進行獨特的序列重復，這種重復序列來自生物體已知膠原蛋白序列的結構中的一部分，改進了生物體膠原蛋白的——GXY結構(這里的X，Y可以是任何氨基酸，)。動物體膠原蛋白由于旋轉、定型等不可能在不減少分子量條件下重溶解，因此類人膠原蛋白便可加工成手術縫合線人工皮膚、膠片涂層，人工器官涂層等，也可與鹵化銀、染料等結合形成具有優良表面粘性的涂料。
權利要求
1.一種類人膠原蛋白，其特征在于其序列如下HDP VVL QRR DWE NPG VTQ LNR HLA HAH PPF ASD HPM GAPGPA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSAGAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAPGPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPPGAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAPGPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPAGPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAH GPA GAL GAHGPA GPL GPA GPP GSA GAP GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAHGPA GPL GAH GPA GPL GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPAGPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSAGAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAPGPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPPGAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAPGPA GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSAGAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAPGPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPPGAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAPGPA GPP GSA GAP GPP GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPAGPL GAH GPA GPL GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSAGAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GSA GAP GPP GAP GPAGPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSAGAP GPP GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAM GAPGAT GLS AGA THG LVT CGL所述結構為三鏈、三螺旋結構，其核酸長度為1071bp。
2.一種類人膠原蛋白的生產方法，其特征在于它包括以下步驟1)、類人膠原蛋白的工程菌的構建；2)、工程菌的發酵培養；3)、類人膠原蛋白的誘導及表達；4)、類人膠原蛋白的提純。
3.根據權利要求2所述的類人膠原蛋白的生產方法，其特征在于所述類人膠原蛋白的工程菌的構建如下1)、將人體已知膠原蛋白序列的一段基因抽提出來并進行修飾后，再特定重復，然后進行縫合，DNA重組；2)、將重組DNA轉入到大腸桿菌；
4.根據權利要求2所述的類人膠原蛋白的生產方法，其特征在于所述工程菌的發酵培養基為酵母粉10-30g/L 葡萄糖15-38g/LNaHPO42.5-8.7g/L (NH4)2SO43.6-5.6g/LFeCl30.8-1.6g/L CoCl2.6H2O 0.1-0.3g/LZnSO40.1-0.3g/L
5.根據權利要求2所述的類人膠原蛋白的生產方法，其特征在于所述工程菌的發酵培養條件為培養溫度34℃，pH7.0溶氧DO 20％，空氣流量為1VVM-4VVM，攪拌轉速450r/min-1000r/min，接種量5％，種子培養基，LB培養基、卡那霉素0.5mg/L、葡萄糖5g/L，以葡萄糖濃度控制1.5％為宜，用DO量控制為40％為宜，當OD600的值為100時收獲細胞。
6.根據權利要求2所述的類人膠原蛋白的生產方法，其特征在于所述類人膠原蛋白的提純如下細胞經離心收集后經高壓細胞勻將，然后用緩沖液抽提，經過第一次甲酸或乙酸緩沖液鹽析后，接著進行離子樹脂交換，再經金屬離子螯合吸附，精制和除熱源，精品去冷凍干燥。
全文摘要
本發明公開一種類膠原蛋白及通過基因工程菌生產類膠原蛋白的方法。其類人膠原蛋白的生產方法包括:類人膠原蛋白的工程菌的構建;將工程菌的發酵培養;再經類人膠原蛋白的誘導及表達,提純,獲得目的蛋白。該方法獲得的重組蛋白在單細胞內的表達高,其類膠原蛋白為螺旋結構,異于動物體原蛋白的交叉結構,因此它具有很好的可加工性而不改變其分子量,因此類人膠原蛋白可加工成手術縫合線、人工皮膚、膠片余層,人工器官涂層等,也可與鹵化銀、染料等結合形成具有優良表面粘性的涂料。
文檔編號C07K14/435GK1371919SQ0110675
公開日2002年10月2日 申請日期2001年2月21日 優先權日2001年2月21日
發明者范代娣 申請人:范代娣