專利名稱：蜘蛛拖牽絲蛋白基因在轉基因家蠶中時空表達系統的構建方法
技術領域：
本發明專利涉及蜘蛛拖牽絲和家蠶絲蛋白L鏈的氨基酸序列及其空間結構，更具體涉及一種蜘蛛拖牽絲蛋白基因在轉基因家蠶中高效時空表達系統的構建方法。
目前，國外在大腸桿菌和酵母菌中成功地表達了蜘蛛絲蛋白基因，但不能形成具有天然纖維特殊機械性能的產物。對由蛋白到天然絲纖維的分泌加工過程人們了解得不多，這是人造蛛絲纖維的最大障礙。因此，上述技術路線，短期內難以達到產業化的程度。家蠶作為生物反應器合成具有經濟價值的多肽、蛋白等，已引起眾多研究者和投資者的極大興趣。但目前，在以家蠶作為外源基因受體的研究中，還存在一些不足之處(1)大多數的研究均有外源基因整合不穩定、傳種接代不穩定的缺點；(2)家蠶絲心蛋白的合成加工、運輸、分泌機理還不太明了，因而應用上受到限制，技術操作上工作量大，外源基因的家蠶轉化多為非穩定整合的瞬間表達。
本發明專利的目的是提供了一種蜘蛛拖牽絲蛋白基因在家蠶中時空表達系統的構建的方法，將來自Trichoplusia ni的轉座子pigg-yBac改造成為轉基因載體，能夠穩定地將目的基因轉移并整合在家蠶基因組中，操作方便，轉化率高。
為了達到上述目的，本發明采用以下技術措施構建的家蠶轉基因載體系統，包括兩個質粒，其中之一含有一個目的基因表達單元和一個GFP基因標記單元，以便于轉基因家蠶的篩選和外源基因的表達。該DNA區域兩側各有一段轉座子的末端重復序列，以便于轉座酶的識別，實現在家蠶基因組中的高頻率整合。另一個載體為帶有轉座酶編碼區的輔助質粒。該載體系統的特征在于基因轉移系統的構建，蜘蛛拖牽絲基因與蠶絲蛋白L鏈cDNA融合，并置于L鏈基因啟動子之后；家蠶轉座因子被改造成為整合型載體，形成家蠶基因轉移系統，人工合成多克隆位點區和兩末端重復序列。蜘蛛融合基因在家蠶中得到時空表達。將蜘蛛絲蛋白基因4.4Kb的DNA片段插入0.7Kb的蠶絲蛋白L鏈cDNA片段末端，再將形成的融合片段置于L鏈基因5’端的1.5Kb的啟動子區域后；家蠶轉基因系統來自Trich-oplusia ni的轉座子pigg-yBac改造成為家蠶轉基因載體，轉座子的兩末端重復序列之間的序列被GFP基因取代，并加上多克隆位點，轉座酶基因的DNA片段克隆至另一載體中。人工合成轉座子pigg-yBac的兩端重復序列，包括在PCR引物中，其中上游引物的重復末端后還接上一個帶有一段長為20bp的多克隆位點區的人工接頭。
圖1基因轉移載體的物理圖譜示意2融合基因的構建示意3轉基因家蠶的篩選示意4轉基因家蠶的Southern雜交分析示意圖下面結合附圖對本發明作進一步的詳細描述依據圖1可知，載體的構建路徑如下首先根據已知的GFP基因序列設計一對用于擴增GFP基因的PCR引物，將轉座因子兩端重復序列設計在PCR上、下游引物的末端，引物的核苷酸序列為上游引物5’-GTGAATTCCCCTAGAAAGATACC GCGGCTGCAGATGAGCAAGGGCG-3’下游引物5’-TCGAATTCCCCTAGAAAGATACT GCAGCCTTGTACAGCTCG-3’擴增出片段后，再在片段上游加上一個帶有一段長20bp的多克隆位點區(MCS)的人工接頭；其次，將該擴增DNA片段克隆在載體pBS中，并在GFP基因編碼區前面加入家蠶組成型表達的基因啟動子，其后面接相應的終止子序列，構建成功家蠶基因的運載質粒；第三，將轉座子中的轉座酶編碼區序列采用PCR技術克隆至質粒pUC18中，編碼區前邊加上基因啟動子，后面接相應的終止子序列，即為基因轉移的輔助質粒。二者共同構成了家蠶基因轉移系統。該系統可以確保外源目的基因在家蠶基因組中的多拷貝、高頻率整合，進一步提高外源基因的表達水平。因此，研制的整合載體，通過轉座的方式，可實現外源基因在家蠶基因組中高頻率的整合，轉化頻率可達0.5％；按照圖2所知，顯示的是融合基因的構建過程，首先提取家蠶后部絲腺中的mRNA，根據已知的家蠶絲心L鏈蛋白基因的序列，設計上、下游引物，RT-PCR擴增，從而獲得家蠶絲心蛋白L鏈cDNA，大約為0.7Kb，從家蠶總DNA中，根據已知的L鏈5’端設計上、下游引物，擴增出L鏈5’端及其上游的啟動子區域的DNA片段，其中包括信號肽序列，將上述片段按正確的讀碼框連接成融合的L鏈基因，將已有的蜘蛛拖牽絲基因SP14.4kb片段插入到L鏈的3’末端區域第7個外顯子之中，構建成L-SP1融合片段，根據已知的L鏈基因終止子序列合成PCR上下游引物，PCR擴增出L鏈基因基因終止子片段，大小為0.5Kb，將該終止子片段插入到L-SP1融合基因編碼區后，形成完整的L-SP1融合基因。
根據圖3可知，顯示家蠶的基因轉化和篩選。把上述構建的基因轉移系統，用顯微注射儀注入家蠶蠶卵中，25℃培養，孵化，形成蟻蠶，用桑葉喂養，形成5齡幼蠶的第二天，即可用于轉基因家蠶的鑒定，初步鑒定出的轉基因家蠶，用于繼代培養，為孟德爾式遺傳。研究中，注射了2000只蠶卵中，形成795條幼蠶，420條能形成產卵的蛾子，G0代中0.7％顯示熒光蛋白陽性。用350nm-390nm熒光檢驗儀，初步鑒定轉基因蠶。對轉基因家蠶進行繼代培養，將獲得的熒光蛋白陽性家蠶進行回交和姊妹交配，將產下的蠶卵分為兩份，一份采用熒光蛋白基因的上下引物進行PCR擴增，若顯示陰性，棄去另一份蠶卵，若為陽性，則保留另一份，并于5齡以后第二天，再用熒光檢測，取其中部分陽性個體，提取總DNA，PCR快速分子鑒定，對陽性個體的總DNA進行Southern雜交分析(圖4為以蜘蛛拖牽絲基因特異性片段為探針進行的Southern雜交的結果)。對陽性個體進一步進行姊妹交，以純化轉基因家蠶至到G3代，獲得的G3后代陽性個體即為外源基因整合的轉基因家蠶。抽取后部絲腺的蛋白質，抽檢蠶繭中的蛋白質，進行SDS-PAGE分析等系列鑒定，結果表明蜘蛛絲蛋白含量高。
本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果方法易行，操作簡便，轉化率高，經檢測轉基因家蠶的蠶絲中蛛絲含量為30％，為獲得蜘蛛絲纖維開辟了新的途徑，具有顯著的社會和經濟效益。
權利要求
1.一種蜘蛛拖牽絲蛋白基因在家蠶中時空表達系統的構建方法，其特征在于基因轉移系統的構建，蜘蛛拖牽絲基因與蠶絲蛋白L鏈cDNA融合，并置于L鏈基因啟動子之后；轉座因子被改造成為整合型載體，形成家蠶基因轉移系統；人工合成多克隆位點區和兩末端重復序列。
2.按權利要求1所述的一種蜘蛛拖牽絲蛋白基因在家蠶中時空表達系統的構建方法，其特征在于將蜘蛛拖牽絲蛋白基因4.4Kb的DNA片段插入蠶絲蛋白L鏈cDNA 0.7Kb的DNA片段末端外顯子之中，再將形成的融合片段置于L鏈基因5’端1.5Kb的啟動子區域后。
3.按權利要求1所述的一種蜘蛛拖牽絲蛋白基因在家蠶中時空表達系統的構建方法，其特征在于家蠶轉基因系統來自Trichoplusia ni的轉座子pigg-yBac改造成為轉基因載體，轉座因子的兩個反向重復末端之間的序列被GFP基因取代，并加上多克隆位點，轉座酶基因的DNA片段克隆至另一載體中。
4.按權利要求1或3所述的一種蜘蛛拖牽絲蛋白基因在家蠶中時空表達系統的構建方法，其特征在于人工合成轉座子pigg-yBac的兩端重復序列，包括在PCR引物中，其中上游引物的重復末端后還接上一個帶有一段長為20bp的多克隆位點區的人工接頭。
全文摘要
本發明公開了一種蜘蛛拖牽絲蛋白基因在家蠶中時空表達系統的構建方法。應用DNA重組技術將蜘蛛拖牽絲蛋白基因與家蠶絲蛋白L鏈cDNA融合,并置于L鏈基因啟動子之后構建成完整的融合基因。將來自Trichoplusia ni的轉座子piggy－Bac改造成為轉基因的載體,包括兩個質粒,一個用于目的基因的轉運,一個用作輔助質粒。將構建的融合基因插入基因轉移載體,注射到蠶卵中,獲得多個轉基因家蠶,蜘蛛拖牽絲基因和GFP標記基因穩定整合于家蠶基因組中,拖牽絲基因獲得表達。本發明方法易行,操作簡便,轉化率高,家蠶的蠶絲中蛛絲含量為30%。
文檔編號C07K14/435GK1362520SQ0110640
公開日2002年8月7日 申請日期2001年1月2日 優先權日2001年1月2日
發明者劉天艷, 劉輝芬, 李維, 趙力賓 申請人:成都天友發展有限公司