專利名稱：乙肝病毒抗原多肽與熱休克蛋白的復合物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及乙肝病毒抗原多肽與熱休克蛋白gp96和hsp78的復合物及其應用。
熱休克蛋白(hsp)gp96(glycoprotein 96)又稱作grp94(glucose-regulated protein 94)，是位于細胞內質網膜上hsp90家族中的成員，分子量約96 KDa，在細胞蛋白折疊和運輸過程中發揮重要作用。近幾年研究發現它還存在于某些癌細胞表面。gp96分子含有2個保守區，C端區為多肽結合區，能結合5-25個氨基酸的多肽序列，N端區能結合ATP，具有ATP酶活性。熱休克蛋白hsp78是細胞質中hsp70家族中的成員，分子量約78kDa，在細胞蛋白折疊和運輸過程中發揮重要作用。hsp78分子作為分子伴侶能與細胞中各種短肽結合，它有二個功能區N端區有ATP酶活性，C端區結合多肽底物。
近年來研究發現從腫瘤組織或病毒感染的細胞中分離純化的gp96和hsp78分子免疫動物后能引起機體產生針對該腫瘤或病毒的特異性免疫排斥反應，進一步研究表明gp96和hsp78能結合細胞內產生的全部肽庫，其中包括抗原多肽，這種特異性免疫反應取決于gp96分子和hsp78分子結合的多肽而非熱休克蛋白本身，來自腫瘤或病毒感染的細胞中的gp96分子和hsp78分子通常結合有腫瘤或病毒特異性多肽，gp96分子和hsp78分子能將其結合的抗原肽呈遞給主要組織相容性抗原(MHC)分子，從而激活細胞毒性T細胞(CTL)引發機體產生細胞免疫反應。由于gp96和hsp78在細胞抗原呈遞過程中發揮重要作用，因此gp96-多肽復合物和hsp78-多肽復合物可用于防治自體腫瘤和某些傳染性疾病。
美國紐約大學的Pramod K.Srivastava在自己的研究基礎上分別申請了6項美國專利(專利號為6017544,6017540,6007821,5837251,5830464)，這些專利主要內容是利用熱休克蛋白(hsp)與非共價結合的抗原分子二者形成的復合物對原發性和已轉移的腫瘤以及傳染性疾病進行治療，激發機體產生免疫反應，其中抗原分子既包括來自于體內與hsp結合的多肽，又包括在體外能與hsp形成復合物的體外抗原或免疫原性片段。Hsp主要包含hsp70,hsp90和gp96蛋白。
目前已證實gp96和hsp70分子能結合泡狀口炎病毒抗原區肽、鼠H-2Kb限制的卵清蛋白抗原表位肽和Ld限制的白血病CTL表位肽等抗原多肽。但目前為止未見從病毒感染的病人組織中分離鑒定與hsp結合的抗原多肽。
據估計全世界有3.5億人感染乙型肝炎病毒(HBV)，我國約有1.2億，HBV是導致慢性肝炎、肝硬化和肝癌的首要原因，因此它是一類嚴重危害我國人民生命健康的傳染病。由乙型肝炎繼發肝癌的幾率也很高，乙肝病毒核心抗原(HBcAg)在肝癌內和肝癌周圍組織中的陽性率分別為62.5％和29.2％。CTL引發的細胞免疫反應是機體清除病毒和治愈乙肝的主要途徑，在乙肝感染的病人體內HBV抗原多肽在肝細胞中被加工后呈遞給Ⅰ類MHC分子，激活特異CTL引發細胞免疫反應，目前已鑒定出人的一些HBV核心蛋白上的CTL表位，包括HLA-A2限制的HBcAg18-27,HLA-A11限制的HBcAg88-96等。因此研制預防和治療乙肝和乙肝繼發性肝癌的新型藥物，尤其是能主動激發機體產生CTL免疫反應的藥物具有非常重要的意義。
本發明的一個目的是提供一種與gp96和hsp78結合的乙肝病毒抗原的復合物。所述的乙肝病毒抗原可以分別是乙肝病毒核心蛋白上第88至第94位的氨基酸序列，其序列可以是YVNTNMG，或其變異序列；乙肝病毒核心蛋白上第88至96位的氨基酸序列，其序列可以是YVNTNMGLK，或其變異序列；乙肝病毒核心蛋白上第141至151位的氨基酸序列，其序列可以是STLPETTVVRR，或其變異序列；乙肝病毒核心蛋白上第18至27位的氨基酸序列，其序列可以是FLPSDFFPSV，或其變異序列；乙肝病毒表面蛋白上第313至321位的氨基酸序列，其序列可以是IPIPSSWAF，或其變異序列；乙肝病毒表面蛋白上第355至363位的氨基酸序列，其序列可以是WLSLLVPFV，或其變異序列；乙肝病毒聚合酶蛋白上第575至583位的氨基酸序列，其序列可以是FLLSLGIHL，或其變異序列。
本發明的復合物既包括熱休克蛋白以非共價鍵與多肽結合，又包括熱休克蛋白以共價鍵與多肽結合。
本發明的再一個目的是提供一種制備本發明的如上所述乙肝病毒抗原多肽與熱休克蛋白gp96和hsp78的復合物的方法。
本發明的又一個目的是提供本發明的這些復合物在制備治療乙肝及乙肝繼發性肝癌的藥物中的應用。
本實驗室首次從六例HBV感染的人肝癌組織中與熱休克蛋白gp96結合的多肽中分離出一特異7肽，經氨基酸序列分析為“YVNTNMG，或YVNVNMG”，經查詢發現該序列位于HBV核心蛋白88-94位(HBcAg88-94)，人工合成該序列并與體外表達的gp96蛋白組裝，體外合成gp96-7肽復合物，將7肽與gp96-7肽復合物免疫小鼠，均能刺激小鼠產生特異性細胞毒性T細胞(CTL)，gp96-7肽復合物免疫原性比單獨使用肽高200倍以上。實驗結果表明gp96-7肽復合物可開發成為一種新型乙型肝炎及其繼發性肝癌的治療性藥物。
使用人工合成7肽“YVNTNMG，或YVNVNMG”和N端帶熒光素標記的7肽，在體外建立gp96蛋白與熒光素標記的7肽二者結合的反應體系，根據反應公式G+P---k2k1GP,]]>其中G代表gp96蛋白，P代表7肽，GP代表gp96蛋白-7肽復合物，k1、k2為反應正反方向的速度常數。該結合反應的平衡常數k可由以下關系式得出k=k1/k2=[GP]/[G][P][GP]、[G]和[P]分別表示反應產物GP和底物G、P的濃度。確定結合反應體系最佳的溫度、鹽濃度、pH值、添加劑與催化劑、gp96蛋白與7肽最佳反應濃度比等因子，測定反應常數，構建最佳反應體系。
在最佳反應體系條件下，體外合成gp96蛋白-7肽復合物。
本發明還提供了一種制備乙肝病毒抗原7肽與熱休克蛋白gp96的復合物的方法，包括將濃度為0.1-0.15μmol/L的gp96蛋白和濃度為2.5-3.5μmol/L的乙肝病毒抗原在含有5-10％(v/v)甘油的濃度不高于100mmol/L的低鹽緩沖液中，在30-39℃下反應10-30分鐘。
在本發明的方法中，反應溫度最好為37℃，反應時間最好為15分鐘。
在本發明的方法中，gp96蛋白的濃度最好為0.12μmol/L，乙肝病毒抗原的濃度最好為3.0μmol/L。
本發明還提供了該乙肝病毒抗原7肽與熱休克蛋白gp96以共價鍵形成的融合蛋白。人工合成對應于該肽的核酸序列，采用分子生物學常用的方法將該序列與gp96基因5’端連接后在大腸桿菌中融合表達。例如，引入限制性酶切位點BglⅡ將該7肽的核酸序列與gp96基因5’端用T4連接酶連接，連接產物的5’和3’端引入2個限制性酶切位點BamHⅠ和SacⅠ，連接到表達載體pET30a中在大腸桿菌中表達，表達產物是gp96與7肽的融合蛋白。
本發明的gp96蛋白-7肽復合物，包括上述gp96以非共價鍵與7肽體外結合形成的復合物，和上述gp96以共價鍵與7肽結合形成的融合蛋白，可以使用任何一種公知的免疫方式進行免疫，例如，通過皮下注射、皮內注射、腹腔注射等。gp96蛋白-7肽復合物免疫劑量可以是，例如0.01nmol、0.05nmol、0.10nmol和0.50nmol。當7肽被單獨用于免疫時，免疫劑量可以為0.2nmol、2nmol、20nmol。
gp96蛋白-7肽復合物和7肽在被用于免疫時可以不使用佐劑，或者使用任何公知的佐劑，例如弗氏佐劑、鉻明礬等。
本實驗室還人工合成了9肽“YVNTNMGLK”，按照上述最佳反應體系體外合成gp96蛋白-9肽復合物，使用任何一種公知的免疫方式進行免疫，例如皮下注射、皮內注射、腹腔注射等，gp96蛋白-9肽復合物免疫劑量可以是，例如0.01nmol,0.05nmol,0.10nmol和0.50nmol。當9肽被單獨用于免疫時，免疫劑量可以為0.2nmol、2nmol、20nmol。免疫時可以不使用佐劑，或者使用任何公知的佐劑，例如弗氏佐劑、鉻明礬等。gp96-9肽復合物和9肽用于免疫小鼠后均能刺激小鼠產生特異性細胞毒性T細胞(CTL)。gp96-9肽復合物免疫原性比單獨使用肽高300倍以上。實驗結果表明gp96-9肽復合物可開發成為一種新型乙型肝炎和乙肝繼發性肝癌的治療性藥物。
本實驗室還人工合成了11肽“STLPETTVVRR”，10肽“FLPSDFFPSV”；9肽“IPIPSSWAF”；9肽“WLSLLVPFV”；和9肽“FLLSLGIHL”。按照上述最佳反應體系體外合成gp96蛋白-多肽復合物，使用任何一種公知的免疫方式分別進行免疫，例如皮下注射、皮內注射、腹腔注射等，gp96蛋白-多肽肽復合物免疫劑量可以是，例如0.01nmol,0.05nmol,0.10nmol和0.50nmol。當多肽被單獨用于免疫時，免疫劑量可以為0.2nmol、2nmol、20nmol。免疫時可以不使用佐劑，或者使用任何公知的佐劑，例如弗氏佐劑、鉻明礬等。gp96-多肽復合物和多肽用于免疫小鼠后均能刺激小鼠產生特異性細胞毒性T細胞(CTL)。gp96-多肽肽復合物免疫原性比單獨使用肽高均在150倍以上。實驗結果表明gp96-多肽肽復合物可開發成為一種新型乙型肝炎和乙肝繼發性肝癌的治療性藥物。
本實驗室還將上述合成的多種多肽，包括“YVNTNMG”；“YVNTNMGLK”；“STLPETTVVRR”；“FLPSDFFPSV”；“IPIPSSWAF”；“WLSLLVPFV”；“FLLSLGIHL”。按照上述最佳反應體系體外合成hsp78蛋白-多肽復合物，使用任何一種公知的免疫方式分別進行免疫，例如皮下注射、皮內注射、腹腔注射等，hsp78蛋白-多肽復合物免疫劑量可以是，例如0.01nmol,0.05nmol,0.10nmol和0.50nmol。當7肽被單獨用于免疫時，免疫劑量可以為0.2nmol、2nmol、20nmol。免疫時可以不使用佐劑，或者使用任何公知的佐劑，例如弗氏佐劑、鉻明礬等。hsp78-多肽復合物和多肽用于免疫小鼠后均能刺激小鼠產生特異性細胞毒性T細胞(CTL)。hsp78-多肽復合物免疫原性比單獨使用肽高均在150倍以上。實驗結果表明hsp78-多肽肽復合物可開發成為一種新型乙型肝炎和乙肝繼發性肝癌的治療性藥物。
2．從gp96蛋白釋放非共價結合的多肽將純化的gp96蛋白加入三氟乙酸(TFA)使其終濃度達到0.2％(pH約2.0)，然后用超濾法(分子截留為10KDa,Pall Filtron公司)分離多肽，將多肽混合物進行MALDI-TOF質譜(PE公司Voyager-DE系統)分析，多肽分子量大多在600-1100 Da之間。
3．反相HPLC分析多肽多肽混合物凍干后溶于溶液A(0.065％TFA,2％乙腈)，上樣于C18反相柱(Sephasil peptide C18；5 nm粒度；4.6×250nm,Pharmacia公司)，從0至65％溶液B(0.05％TFA,100％乙腈)進行梯度洗脫，流速為1ml/min，用214nm波長檢測。比較肝癌組織和正常組織HPLC圖譜，發現一個三份肝癌組織共有而正常組織中沒有的肽峰。
4．多肽微量測序與序列分析收集該特異肽峰用MALDI-TOF質譜(PE公司Voyager-DE系統)鑒定其純度，只發現分子量為798 Da的單一峰。對該肽微量測序(ProciseTM491蛋白測序儀，PE公司)，其氨基酸序列為“YVNTNMG，或YVNVNMG”，三份肝癌組織得到的序列一致。將該序列在PubMed網上蛋白數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)查詢，發現它位于HBV核心蛋白88-94位。
5．gp96基因克隆采用寶生物工程(大連)有限公司的RNA提取試劑盒(Catrimox-14TMRNA Isolation Kit Ver.2.11)從0.5mL經42℃熱激2小時的人血液中用異硫氰酸胍法提取總RNA,步驟按試劑盒說明。
采用逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)克隆人gp96基因，使用寶生物工程(大連)有限公司的RT-PCR試劑盒(TaKaRa RNA LA PCRTMKitAMV Ver.1.1)，步驟按試劑盒說明，所用引物為引物1:5′CCGGATCCGAACTTGATGTGGATGGTACA 3′引物2:5′CCGAGCTCCCAAATGGTGAGAGTATAATTTAC 3′PCR反應條件如下94℃ 4分鐘；94℃ 50秒，55℃ 50秒，72℃ 3分鐘，共30循環；72℃ 5分鐘。
PCR產物為約2.4 Kd的片段，片段的5′端和3′端人為引入二個酶切位點BamHⅠ和SacⅠ，將擴增片段進行測序，gp96基因包含2343 bp，堿基序列與文獻報導(Maki,RG,et al.GeneBank，編號003299)一致。
6．gp96基因及gp96基因與乙肝病毒抗原多肽核酸的連接片段在大腸桿菌中表達與蛋白純化將擴增片段經BamHⅠ與SacⅠ酶切后連接到表達載體pET30a(+)轉化大腸桿菌BL21。同時人工合成下列多肽對應的核酸序列“YVNTNMG”；“YVNTNMGLK”；“STLPETTVVRR”；“FLPSDFFPSV”；“IPIPSSWAF”；“WLSLLVPFV”；“FLLSLGIHL”。并在上述核酸序列兩端引入限制性酶切位點BglⅡ，插入到含有gp96基因的pET30a(+)中。
將構建的載體經1mM IPTG誘導4小時后產物表達，以10％SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色檢測表達產物分子量約100Kda，與理論值基本一致。
將gp96蛋白和gp96蛋白與乙肝病毒抗原多肽的融合蛋白用Ni親和層析柱(Pharmacia公司)親和層析和POROS 20QE(PE公司BioCAD灌注層析系統)進行陰離子層析純化，以10％SDS-PAGE電泳和銀染鑒定純度，得到大于95％純度的gp96蛋白及其融合蛋白。表達的gp96蛋白產物和gp96蛋白與乙肝病毒抗原多肽的融合蛋白用gp96/grp94單克隆抗體(NeoMarkers公司)進行Westem鑒定。
7．gp96蛋白與人工合成的多肽體外組裝條件試驗人工合成N端帶有熒光素標記的7肽“YVNTNMG，或YVNVNMG”(委托賽百盛生物工程公司合成)，將gp96蛋白與多肽體外組裝，進行以下一系列試驗以確立最佳反應條件反應體系溫度試驗55℃、39℃、37℃、30℃、或28℃反應體系鹽濃度試驗低鹽緩沖液(20mmol/L HEPES,pH7.9,20、100或500mmol/L NaCl,2mmol/L MgCl2)，高鹽緩沖液(20mmol/LHEPES,pH7.9,0.5、1.0、或2.2mol/L NaCl,2mmol/L MgCl2)反應體系pH值試驗pH6.0、pH7.0、pH7.9和pH9.0反應體系添加劑與催化劑10mmol/L ADP,10mmol/L ATP,和10％(V/V)甘油gp96蛋白與7肽最佳反應濃度及其濃度比率反應體系7肽濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5μmol/L，反應體系gp96蛋白濃度分別為0.06、0.09、0.12、0.15、0.18、0.21μmol/L。測定反應常數k。gp96蛋白含量由以下公式計算，c=1.45A280-0.74A260,c為蛋白濃度，A280和A260分別為280nm和260nm光吸收。熒光素標記的7肽含量以378nm處的吸收值計。結合反應后用超濾法(分子截留為10KDa,Pall Filtron公司)去除未結合的7肽，gp96蛋白-7肽復合物的含量以378nm處的吸收值計。
8．gp96蛋白與人工合成的多肽體外組裝最佳反應體系構建通過多組分方差分析優化反應條件，確定最佳反應條件。
人工合成7肽“YVNTNMG，或YVNVNMG”(委托賽百盛生物工程公司合成)，建立最佳體外結合反應體系20mmol/L HEPES,pH7.9,20mmol/L NaCl,2mmol/L MgCl2,10％(V/V)甘油，3.0μmol/L 7肽，0.12μmol/L gp96蛋白，37℃反應15分鐘，超濾法(分子截留10KDa,Pall Filtron公司)去除未結合的多肽。通過分析測定gp96與7肽在體外有較高的親和力，該結合反應的平衡常數k約為5-10。
9．gp96蛋白-7肽穩定性分析將體外組裝的gp96蛋白-7肽復合物于磷酸緩沖液(PBS)中4℃、-20℃、-70℃保存均不穩定，以10％SDS-PAGE電泳和銀染鑒定，30天后gp96蛋白開始形成二聚體或多聚體。冷凍干燥后于4℃保存，復合物穩定性較好，90天后用10％SDS-PAGE電泳和銀染以及反相HPLC檢測，其降解率＜5％。
10．免疫小鼠選用生長12-16周的BALB/cJ小鼠(H-2d)用于本實驗。
免疫方式采用將樣品溶于100μl的PBS中頸背皮下注射。皮內注射雖然需要的免疫劑量較低，但不易操作，故沒有采用。腹腔注射則要求免疫劑量較大，約需0.5nmol才有效，故也沒有采用。
gp96蛋白-7肽復合物的最適免疫劑量為0.1nmol。
免疫時間為第一次免疫一周后進行第二次免疫效果優于免疫一次的效果。
免疫佐劑使用實驗發現gp96蛋白-7肽復合物使用弗氏不完全佐劑(FIA)、弗氏完全佐劑、使用鉻明礬不僅沒有免疫增效作用，而且使其免疫原性降低，原因可能佐劑對gp96蛋白-7肽復合物結構有破壞作用。對于7肽使用弗氏佐劑、使用鉻明礬均能顯著提高其免疫活性，弗氏佐劑效果優于鉻明礬。
因此采用皮下注射免疫，將7肽溶于緩沖液(90％PBS,10％DMSO/0.1％TFA)，gp96-7肽復合物溶于PBS中，注射前劇烈振蕩1分鐘，每支小鼠免疫劑量7肽分別為0.2nmol,2nmol和20nmol，將肽與弗氏佐劑乳化后免疫小鼠。gp96-7肽復合物免疫劑量分別是0.01nmol,0.05nmol,0.10nmol和0.50nmol，采用頸背皮下注射，第一次免疫一周后進行第二次加強免疫，7天后進行細胞毒性分析。每一處理使用10只小鼠。
11．細胞毒性(CTL)分析小鼠免疫7天后，從每只小鼠收獲得約3×107脾細胞懸于含有10mMHEPES緩沖液、5×10-5M巰基乙醇，抗生素和10％(V/V)FCS培養液中，于培養瓶中與經幅射(4500 Rad)的同源LPS-刺激的B淋巴細胞(3∶1)和1μg/ml肽在完全培養基中37℃培養。6天后收集脾細胞進行4小時標準51Cr釋放實驗(具體方法見Kuhrober,A,et al.1997.InternationalImmunology,9(8):1203-1212)測定細胞毒性活性。簡而言之，靶細胞用10ug/ml肽于37℃致敏30分鐘后加入不同數量的效應細胞，反應體系為100ul的完全培養基。37℃共培養4小時后收集上清測定特異裂解率。
從51Cr釋放實驗可以看出7肽和gp96-7肽復合物均可刺激小鼠產生特異性細胞毒性T細胞，但gp96-7肽復合物免疫原性為7肽的200倍以上，每只小鼠免疫0.1nmol(約10ug)的gp96-7肽復合物即能誘發機體產生強烈的細胞免疫反應，細胞毒性測定靶細胞的裂解率在60％以上。實驗結果表明gp96-7肽復合物可開發成為一種新型抗HBV感染和HBV感染的肝癌的治療藥物。實施例12．其它gp96-多肽復合物的免疫活性測定除上述抗原7肽之外，我們又選取其它6個乙肝病毒抗原多肽與gp96體外組裝并測定其免疫活性，這6個抗原多肽分別是(1)核心抗原多肽“YVNTNMGLK”(位于核心蛋白氨基酸序列88-96位)；(2)核心抗原多肽“STLPETTVVRR”(位于核心蛋白氨基酸序列141-151位)；(3)核心抗原多肽“FLPSDFFPSV”(位于核心蛋白氨酸酸序列18-27位)；(4)表面抗原多肽“IPIPSSWAF”(位于表面蛋白氨基酸序列313-321)；(5)表面抗原多肽“WLSLLVPFV”(位于表面蛋白氨基酸序列355-343)；(6)聚合酶抗原多肽“FLLSLGIHL”(位于聚合酶蛋白氨基酸序列575-583)。分別人工合成這6種多肽，采用實施例8中所述的最佳反應體系在體外與gp96結合，這6種多肽與gp96均有較高的親和力，通過測定結合反應平衡常數K,6種肽與gp96結合反應中K值均在5以上。采用實施例10中所述的方法用上述6種乙肝病毒抗原多肽與gp96形成的復合物，和上述gp96與7種乙肝病毒抗原多肽的融合蛋白分別免疫小鼠，并采用實施例11中所述的方法分別對這6種復合物進行CTL分析，從51Cr釋放實驗可以看出這6種乙肝病毒抗原多肽與gp96形成的復合物均可刺激小鼠產生特異性細胞毒性T細胞，6種多肽與gp96形成的復合物的免疫活性比單獨多肽高150-300倍。每只小鼠免疫劑量為0.1nmol(約10μg)時即能誘發機體產生強烈的細胞免疫反應，通過對這6種多肽與gp96形成的復合物的細胞毒性測定發現靶細胞的裂解率在60％-85％之間。
以上實驗結果表明gp96與乙肝病毒抗原多肽體外組裝合成的復合物可開發成為一種新型抗HBV感染和HBV感染的肝癌的治療藥物。由于實驗條件所限本發明專利不可能對每一種乙肝病毒抗原多肽進行體外組裝及免疫活性測定，但我們通過選取7種有代表性的乙肝病毒核心抗原、表面抗原及聚合酶抗原作研究對象，在體外與gp96結合并進行免疫活性測定，大量實驗表明gp96與這些乙肝病毒抗原多肽形成的復合物均能刺激小鼠產生強烈的免疫反應，gp96可作為乙肝病毒抗原多肽的新型良好佐劑，可開發成為一種新型治療疫苗。因此，除上述7種乙肝病毒抗原多肽之外，其它任何乙肝病毒抗原多肽與gp96結合作為新型疫苗也應當在本發明的保護范圍之內。實施例13．熱休克蛋白hsp70基因克隆與表達采用寶生物工程(大連)有限公司的RNA提取試劑盒(Catlimox-14TMRNA Isolation Kit Ver2.11)從200mg的人肝癌組織中用異硫氰酸法提取總RNA，步驟按試劑盒說明。采用逆轉錄一聚合酶鏈式反應(RT-PCR)克隆人hsp70家族中hsp78，使用寶生物工程(大連)有限公司的RT-PCR試劑盒，步驟按試劑盒說明。所用引物為引物1:GG GGATCC ATG AAG TTC ACT GTG GTG GCG GCG引物2:GG GTCGAC CTA CTA CTC ATC TTT TTC TGA TGTPCR反應條件如下94℃ 4分鐘；94℃ 50秒，55℃ 50秒，72℃ 2分鐘，其30循環；72℃ 5分鐘。PCR產物為約2.0kb的片段，片段的5′端和3′端人為引入二個酶切位點BamHⅠ和SalⅠ，將擴增片段進行測序，hsp78基因包含1965bp，堿基序列與文獻報導(Mech.Ageing Dev.1998,104(2):149-158)一致。將擴增片段經BamHⅠ與SalⅠ酶切連接到表達載體PET30a(+)轉化大腸桿菌BL21，同時人工合成下列多肽對應的核酸序列“YVNTNMG”；“YVNTNMGLK”；“STLPETTVVRR”；“FLPSDFFPSV”；“IPIPSSWAF”；“WLSLLVPFV”；“FLLSLGIHL”。并在上述核酸序列兩端引入限制性酶切位點BglⅡ，插入到含有hsp78基因的pET30a(+)中。將構建的載體經1mM IPTG誘導4小時后表達，以10％SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色檢測表達產物分子量約80 kDa，與理論值基本一致。將表達產物用ADP-Agarose親和層析(Sigma)和MonoQ(Pharmacia)陰離子層析純化，以10％SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色(電泳上樣量約5μg)鑒定純度，得到大于95％純度的蛋白。表達的HSP78極其融合蛋白用hsp70單克隆抗體(Sigma)進行Western鑒定。實施例14．hsp 78-多肽免疫原性測定將hsp78與7種多肽體外組裝形成的復合物，最佳反應體系同gp96(見實施例8)，將體外合成的復合物和hsp78與7種多肽的融合蛋白免疫小鼠。小鼠免疫方式、免疫劑量以及免疫程序同gp96(見實施例10)。細胞毒性(CTL)分析方法同gp96(見實施例11)。從51Cr釋放實驗可以看出hsp78-7肽復合物可刺激小鼠產生特異性細胞毒性T細胞，hsp78-7肽復合物的免疫原性為單獨7肽的150倍以上，每只小鼠免疫0.1nmol(約10μg)即能誘發機體產生強烈的細胞免疫反應，細胞毒性測定靶細胞的裂解率在50％以上。實驗表明hsp78-7肽復合物可開發成為一種新型抗HBV感染和HBV感染的肝癌的治療藥物。
權利要求
1．一種乙肝病毒抗原與熱休克蛋白gp96或hsp78的復合物。
2．按照權利要求1所述的復合物，其中，所述的乙肝病毒抗原為YVNTNMG,YVNVNMG,YVNTNMGLK,STLPETTVVRR,FLPSDFFPSV,IPIPSSWAF,WLSLLVPFV，和/或FLLSLGIHL。
3．按照權利要求1所述的復合物，其中，熱休克蛋白以非共價鍵與乙肝病毒抗原結合，或者熱休克蛋白以共價鍵與乙肝病毒抗原結合成融合蛋白。
4．一種制備權利要求1所述的乙肝病毒抗原與熱休克蛋白gp96或hsp78的復合物的方法，包括將濃度為0.1-0.15μmol/L的gp96蛋白和濃度為2.5-3.5μmol/L的乙肝病毒抗原在含有5-10％(v/v)甘油的濃度不高于100mmol/L的低鹽緩沖液中，在30-39℃下反應10-30分鐘。
5．按照權利要求4所述的方法，其中，反應溫度為37℃，反應時間為15分鐘。
6．按照權利要求4所述的方法，其中，gp96蛋白和hsp78的濃度均為0.12μmol/L，乙肝病毒抗原的濃度為3.0μmol/L。
7．權利要求1所述的乙肝病毒抗原與熱休克蛋白gp96或hsp78的復合物在制備治療乙肝及乙肝繼發性肝癌的治療性疫苗中的應用。
全文摘要
本發明提供了一類與熱休克蛋白結合的乙肝病毒抗原，包括核心抗原、表面抗原和聚合酶抗原。本發明還提供了乙肝病毒抗原與熱休克蛋白gp96和hsp78的復合物及其制備方法，復合物包括gp96和hsp78與抗原多肽以非共價鍵結合的復合體，和二者以共價鍵連接形成的融合蛋白。這種復合物可用于制備治療乙肝及乙肝繼發性肝癌的治療性疫苗。
文檔編號C07K19/00GK1316431SQ01104060
公開日2001年10月10日 申請日期2001年2月20日 優先權日2000年8月11日
發明者田波, 孟頌東, 高福 申請人:中國科學院微生物研究所